本發(fā)明涉及一種蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物的制備方法，屬于食品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)具有特定功能特性及營養(yǎng)特性的蛋白質(zhì)的需求也在不斷的提高。蛋清蛋白具有優(yōu)異的營養(yǎng)和感官特性，廣泛應(yīng)用于食品中。通過物理、化學(xué)以及生物手段賦予蛋清蛋白具有抗氧化性和更好的功能性質(zhì)，可進(jìn)一步拓寬其在食品、生物和醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用。兒茶素是茶多酚中一類具有高活性的類黃酮的總稱，具有很強(qiáng)的抗氧化功能。但是通過混合法或者堿法制備蛋清蛋白-兒茶素復(fù)合物，蛋白質(zhì)與多酚相互作用較弱，不足以顯著提高蛋白質(zhì)的抗氧化性。因此亟需采用新的技術(shù)手段促進(jìn)蛋白質(zhì)和多酚分子之間的相互作用，形成具有強(qiáng)抗氧化性的復(fù)合物。
接枝聚合技術(shù)常用于開發(fā)具有特定理化結(jié)構(gòu)的新型材料，可賦予天然或合成高分子材料新的功能性質(zhì)，從而進(jìn)一步拓寬其在各領(lǐng)域的應(yīng)用。接枝聚合的目的是將一些具有特定功能特性的小分子物質(zhì)接枝到高分子結(jié)構(gòu)上獲得新型復(fù)合物，兼具兩種物質(zhì)的功能性質(zhì)。在接枝聚合研究中，引發(fā)劑的選擇是聚合的關(guān)鍵，在眾多引發(fā)劑中，一種不含金屬元素的氧化還原引發(fā)體系一一抗壞血酸和過氧化氫體系正逐步引起人們的重視。該體系操作簡單，條件溫和，常溫下即可進(jìn)行，而且不會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，在對(duì)安全性要求苛刻的食品領(lǐng)域具有十分重要的意義。
抗壞血酸和過氧化氫體系在合成蛋白-多酚復(fù)合物方面，目前還處于基礎(chǔ)研究的初始階段，在自由基存在的條件下蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用機(jī)理及該復(fù)合物在實(shí)際應(yīng)用體系中的功效等研究很少，國內(nèi)外也還沒有相關(guān)專利?，F(xiàn)有的研究主要是采用乳鐵蛋白、β-乳球蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等單一蛋白為主要原料。但這類蛋白原料價(jià)格高，來源稀少，生產(chǎn)成本太高，限制其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。此外，由于蛋白來源不一樣，與多酚的相互作用也就不一樣，如何提高蛋白-多酚復(fù)合物產(chǎn)品的性能也是目前急需解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了簡單快速提高蛋清蛋白的抗氧化性的方法，是一種蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物的制備方法。本發(fā)明方法以蛋清蛋白為原料，加入抗壞血酸和過氧化氫體系作為自由基引發(fā)劑，蛋白分子在羥基自由基作用下形成活性分子，有利于與兒茶素小分子相互作用形成具有強(qiáng)抗氧化性的蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物。而且蛋清蛋白具有原料來源廣泛、價(jià)格低廉、營養(yǎng)豐富等優(yōu)勢(shì)，市場(chǎng)前景廣泛。
本發(fā)明的蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物的制備方法，所述方法包括：先先預(yù)處理蛋清以除去蛋清中的粘蛋白，在蛋清溶液中加入自由基引發(fā)劑，然后添加兒茶素形成蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物，再對(duì)樣品溶液進(jìn)行透析處理以確保未反應(yīng)的游離兒茶素已完全去除，最后冷凍干燥后得到產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述蛋清預(yù)處理為：在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述兒茶素與蛋清溶液中的蛋白的質(zhì)量比為1:20～1:5。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述兒茶素的終濃度為0.5～2g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述自由基引發(fā)劑為過氧化氫和抗壞血酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述過氧化氫的終濃度為0.05～0.2mol/L，抗壞血酸的終濃度為1.25～10g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述蛋清蛋白溶液的體積為50mL；所述自由基引發(fā)劑為0.5-2.0mL 5M過氧化氫和0.0625-0.5g抗壞血酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述自由基引發(fā)劑與蛋清蛋白的反應(yīng)條件是25℃，2h。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述兒茶素的添加量是0.025-0.1g。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述兒茶素與蛋清蛋白的反應(yīng)條件是25℃，12～48h。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述透析處理是在4℃條件下繼續(xù)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述透析處理是透析12-60h，每隔6h換水一次。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述制備方法，具體包括：在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入0.5-2.0mL 5M過氧化氫和0.0625-0.5g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再加入0.025-0.1g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)12-48h，再對(duì)樣品在4℃下進(jìn)行透析12-60h(若是室溫條件進(jìn)行透析，超過24h，蛋白將變性沉淀)，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
本發(fā)明還要求保護(hù)所述方法得到的蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物，以及所述蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物在食品方面的應(yīng)用。
本發(fā)明制備的蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物需在4℃條件下進(jìn)行透析。
本發(fā)明的有益效果：
(1)本發(fā)明采用的自由基接枝法操作簡單，條件溫和，而且不會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物。
(2)與蛋清蛋白和堿法制備的復(fù)合物相比，本發(fā)明制備的蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物，其抗氧化性得到顯著提升，其DPPH自由基清除率為65.29％，ABTS自由基清除率為94.17％，還原力最高可達(dá)0.649Abs。
(3)與已報(bào)道的明膠-兒茶素自由基接枝物的制備方法，本發(fā)明采用的自由基引發(fā)劑和兒茶素的添加量較少，即可達(dá)到明膠-兒茶素自由基接枝物的抗氧化性。在相同工藝條件下，本發(fā)明采用蛋清蛋白為主要原料制備的蛋白-兒茶素具有更高的抗氧化性。
具體實(shí)施方式
(1)DPPH自由基清除能力的測(cè)定
稱取DPPH粉末4mg，用無水乙醇溶解并定容至100mL，配制成最終濃度為0.1mM的DPPH乙醇溶液，放置于棕色瓶中，并保存在暗處備用。將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使樣品進(jìn)行分析時(shí)其吸光值最好在0.7以下為準(zhǔn)。取2mL DPPH乙醇溶液與2mL樣品(1mg/mL)在具塞試管中混合，混合后及時(shí)放置暗處，30min后于517nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)以無水乙醇作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并按下式計(jì)算DPPH自由基的清除率：
式中，A0空白為空白樣在517nm處的吸光值，A為待測(cè)樣品在517nm處的吸光值。
(2)ABTS+·清除能力的測(cè)定
將7mM ABTS溶液和2.45mM過硫酸鉀溶液等體積混合制成ABTS工作母液，室溫避光存放16h，使用前用5mM pH 7.4磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，要求ABTS工作液的吸光度減去磷酸鹽緩沖液空白對(duì)照后，為0.70±0.02。準(zhǔn)確量取2.5mL樣品溶液(0.5mg/mL)與2.5mL的ABTS工作液混勻，室溫反應(yīng)15min后測(cè)定其在734nm波長下的吸光值，同時(shí)以磷酸鹽緩沖液作為空白對(duì)照，平行試驗(yàn)三次。ABTS+·清除率的計(jì)算公式如下：
式中：A0為空白樣與ABTS+·反應(yīng)后的吸光值；A為樣品與ABTS+·反應(yīng)后的吸光值。
(3)鐵離子還原能力的測(cè)定
量取1.0mL樣品液(10mg/mL)，加入0.2moL/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5mL和1％的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合物于50℃水浴保溫30min，然后加入2.5mL 10％(w/v)三氯乙酸溶液，在3000g轉(zhuǎn)速下離心10min，準(zhǔn)確移取上清液2.5mL，依次加入2.5mL去離子水和0.5mL 0.1％的三氯化鐵溶液，反應(yīng)10min后在700nm處測(cè)吸光值(吸光值越大，還原力越強(qiáng))。以去離子水為陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，求平均值。
實(shí)施例1：蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入1.0mL 5M過氧化氫和0.25g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再加入0.025g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
實(shí)施例2：蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入0.5mL 5M過氧化氫和0.0625g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再加入0.05g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
實(shí)施例3：蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入2.0mL 5M過氧化氫和0.5g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再加入0.1g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)繼續(xù)增大兒茶素與蛋白的比例，會(huì)導(dǎo)致體系中出現(xiàn)大量沉淀，反應(yīng)無法繼續(xù)進(jìn)行。發(fā)明人也嘗試了使用卵白蛋白作為主要原料，發(fā)現(xiàn)卵白蛋白含量為1％時(shí)，在100ml溶液中，過氧化氫添加量超過1mmol或者抗壞血酸添加量超過0.04g時(shí)，卵白蛋白將變性沉淀，影響反應(yīng)的進(jìn)行。因此，卵白蛋白不適合作為蛋白-多酚自由基接枝物的主要原料。
對(duì)照例1：蛋清蛋白空白樣的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例2：蛋清蛋白對(duì)照樣的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，加入1.0mL 5M過氧化氫和0.25g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再置于25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例3：蛋清蛋白-兒茶素堿法復(fù)合物的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，調(diào)節(jié)pH至10.0，加入0.025g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例4：蛋清蛋白-兒茶素堿法復(fù)合物的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，調(diào)節(jié)pH至10.0，加入0.05g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例5：蛋清蛋白-兒茶素堿法復(fù)合物的制備
在蛋清中加入9倍體積的水稀釋，最終蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％，調(diào)節(jié)pH至5.0左右，攪拌10-20min，自然沉淀1h，然后過濾去除不溶的蛋白成分。取50mL蛋清溶液于100mL三角瓶中，調(diào)節(jié)pH至10.0，加入0.1g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例6：明膠空白樣的制備
配制1％明膠溶液于45℃熱水中，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解。取50mL明膠溶液于100mL三角瓶中，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例7：明膠-兒茶素自由基接枝物的制備
配制1％明膠溶液于45℃熱水中，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解。取50mL明膠溶液于100mL三角瓶中，加入0.5mL 5M過氧化氫和0.0625g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再加入0.05g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
對(duì)照例8：明膠-兒茶素自由基接枝物的制備
配制1％明膠溶液于45℃熱水中，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解。取50mL明膠溶液于100mL三角瓶中，加入2.0mL 5M過氧化氫和0.5g抗壞血酸，攪拌均勻后置于室溫下2h，再加入0.1g兒茶素，25℃條件下反應(yīng)24h，再對(duì)樣品進(jìn)行透析48h，每隔6h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去，最后冷凍干燥后得到樣品。
此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，明膠作為主要原料時(shí)，當(dāng)明膠含量高于1％時(shí)，體系溫度為室溫時(shí)，在反應(yīng)過程中明膠將形成凝膠，影響反應(yīng)的進(jìn)行。因此，明膠的含量需要控制在1％及以下。
檢測(cè)了按照實(shí)施例1-3以及對(duì)照例1-8的方法得到的樣品的抗氧化性，結(jié)果如表1所示。
表1樣品的抗氧化性
DPPH法、ABTS法和鐵還原力法常用于抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)，DPPH和ABTS自由基清除率越高，鐵還原力的吸光值越高，表示樣品的抗氧化性越強(qiáng)。由表1可知，按照本發(fā)明的方法制備的蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物，蛋清蛋白與過氧化氫、抗壞血酸、兒茶素之間協(xié)同作用，具有更強(qiáng)的抗氧化性，明顯優(yōu)于對(duì)照組。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。