相關申請

本專利申請要求2010年11月18日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/IB2010/003158的優(yōu)先權，其通過引用以其整體并入本文。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及細胞凋亡抑制劑和它們的用途，特別是在醫(yī)療中的用途。

發(fā)明背景

冠心病是全世界范圍內主要的死亡原因，造成每年報道380萬男性死亡和340萬女性死亡。隨著人口老化和并發(fā)癥(例如，肥胖癥和代謝綜合癥)變得更加普遍，如在近些年中，由缺血性心臟疾病引起的巨大的公共健康負擔甚至可能進一步增加(在Yellon等，N Engl J Med，2007；357：1121-1135中綜述)。

冠心病是指冠脈循環(huán)不能為心肌和周圍組織提供充足的血液供應。冠心病最常見的原因是冠狀動脈壁內動脈粥樣斑塊(即，脂肪沉積物)的聚集。冠狀動脈的阻塞限制血液流入心臟，導致心肌細胞的缺血(即，缺氧繼發(fā)的細胞饑餓)并且可能導致心肌細胞死亡，其被稱為心肌梗死(MI)或急性心肌梗死(AMI)-通常被稱為心臟病發(fā)作。AMI在歐洲和美國都是主要的死亡原因，并且仍然為常見的(在美國每年多于150萬新病例)和致殘(導致心臟衰竭)的疾病。梗塞面積是AMI后心肌功能恢復和死亡的主要決定因素。目前，限制梗塞面積的最有效的方式是通過使用冠狀動脈的血管成形術或溶栓方法盡快再灌注受損的心肌并且使用抗血小板治療預防冠狀動脈的再阻塞。再灌注，或向缺血心肌恢復血流，通過溶解血栓的溶栓治療或通過經(jīng)皮的冠狀動脈血管成形術擴張阻塞的動脈來實現(xiàn)。通常，再灌注對于挽救心肌細胞和心臟功能是必需的。然而，再灌注啟動了導致“再灌注損傷”的事件級聯(lián)。這也在搭橋手術期間心臟的心臟停搏恢復后發(fā)生。再灌注損傷的特征為心律失常、導致無復流現(xiàn)象的內皮功能障礙和心肌頓抑(心肌收縮的可逆性喪失)。

再灌注損傷最終導致在就在心肌再灌注之前存活的心肌細胞的凋亡性死亡。在心肌缺血/再灌注期間涉及高度調節(jié)形式的細胞死亡可導致在再灌注階段中新的治療干預。然而，在心肌缺血/再灌注期間涉及的體內細胞凋亡信號傳導途徑還未完全被闡明。

因此，尋找用于抑制細胞凋亡(即，“程序細胞死亡”)，特別是用于治療心肌梗死和再灌注損傷的新的治療構成了保護心臟功能并且拯救生命的現(xiàn)實挑戰(zhàn)。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：有可能通過抑制Fas信號傳導途徑在心肌梗死之后減少心肌細胞的凋亡。Fas受體在結合FasL(Fas配體)后三聚化并通過稱作DD(死亡結構域(Death Domain))的胞質結構域誘導細胞凋亡，所述胞質結構域與信號傳導銜接蛋白例如FAF-1(Fas相關因子-1)、FADD(Fas相關死亡結構域)、DAXX(死亡結構域相關蛋白)、FAP-1、FLASH(FLICE相關巨蛋白)和RIP(受體相互作用蛋白)相互作用。DAXX和FADD獨立地結合Fas，并激活明顯不同的細胞凋亡途徑。DAXX可通過激活JNK激酶級聯(lián)來增強Fas介導的細胞凋亡，從而最終完成轉錄因子例如c-Jun的磷酸化和激活。相反，通過信號傳導半胱天冬酶的級聯(lián)，F(xiàn)ADD引發(fā)線粒體促凋亡因子如CytoC(細胞色素-C)和SMAC(第二線粒體源的半胱天冬酶激活劑(second mitochondria-derivedactivator of caspase)(也稱作Diablo)的釋放。

發(fā)明人已表明抑制Fas受體與DAXX(SEQ ID NO：1)或與FADD(SEQ ID NO：8)的相互作用導致心肌梗死之后心肌細胞的細胞凋亡的強烈減少。此外，本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)DAXX和FADD的小片段分別保留了完整蛋白DAXX和FADD的抗凋亡能力。

因此，本發(fā)明涉及一種由以下片段組成的肽：

-SEQ ID NO：1的DAXX蛋白的16、17、18、19、20、21、22、23或24個連續(xù)氨基酸殘基的片段，其中所述片段包含SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列，或

-SEQ ID NO：8的FADD蛋白的9、10、11、12、13、14、15、16或17個連續(xù)氨基酸殘基的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，

其中所述肽能夠抑制細胞凋亡。

在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列組成的DAXX蛋白片段。在其它實施方案中，抗凋亡肽為由SEQ ID NO：21-44任一所示的氨基酸序列組成的DAXX片段。

在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列組成的FADD蛋白片段。在其它實施方案中，抗凋亡肽為由SEQ ID NO：45-57任一所示的氨基酸序列組成的FADD片段。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽的擬肽。

在又一方面，本發(fā)明提供一種包含與細胞穿膜肽連接的本發(fā)明的抗凋亡肽或擬肽的偶聯(lián)物。細胞穿膜肽可以為Tat、RXR、Bpep或Pip2b。

在某些實施方案中，細胞穿膜肽通過接頭連接至肽或擬肽上。

在某些實施方案中，細胞穿膜肽選自Tat、RXR、Bpep和Pip2b。

特別地，在某些優(yōu)選的實施方案中，偶聯(lián)物由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列組成。

在又一方面，本發(fā)明涉及一種包含至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑和有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種肽或至少一種擬肽或至少一種偶聯(lián)物的藥物組合物。

在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物進一步包含至少一種另外的生物活性劑。特別地，所述生物活性劑可選自環(huán)孢霉素A、BH4及其組合。

在再另一方面，本發(fā)明提供用于治療人或動物體的方法中，特別是用于抑制人或動物體中細胞凋亡的方法中的根據(jù)本發(fā)明的肽、擬肽、偶聯(lián)物和藥物組合物。

在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽、擬肽、偶聯(lián)物和藥物組合物用于治療人或動物體的急性心肌梗死(AMI)、腦梗塞、器官移植、心臟介入術(體外循環(huán)和臨時血管阻塞)或急性循環(huán)擾動(休克狀態(tài))的方法。

在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽、擬肽、偶聯(lián)物和藥物組合物用于治療人或動物體的局部缺血，特別是心肌缺血、腎臟缺血、缺血性結腸炎、腸系膜缺血、腦缺血、肢體缺血或皮膚缺血的方法中。

在再其它的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽、擬肽、偶聯(lián)物和藥物組合物用于治療人或動物體的再灌注損傷的方法中。

在相關的方面，本發(fā)明也提供一種用于治療與受試者的細胞凋亡相關的疾病或病癥的方法，包括步驟：向所述受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種肽、或至少一種擬肽、或至少一種偶聯(lián)物或至少一種藥物組合物。

在某些實施方案中，所述方法進一步包括向所述受試者施用至少一種選自環(huán)孢霉素A、BH4及其組合的另外的生物活性劑的步驟。

如上所述，在這些治療方法中，與細胞凋亡相關的疾病或病癥可選自急性心肌梗死(AMI)、腦梗塞、器官移植、心臟介入術、急性循環(huán)擾動、再灌注損傷和局部缺血。

第1項.一種由以下組成的肽：

-SEQ ID NO：1的DAXX蛋白質的16、17、18、19、20、21、22、23或24個連續(xù)氨基酸殘基的片段，其中所述片段包含SEQID NO：5所示的氨基酸序列，或

-SEQ ID NO：8的FADD蛋白質的9、10、11、12、13、14、15、16或17個連續(xù)氨基酸殘基的片段，其中所述片段包含SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列，

其中所述肽能夠抑制細胞凋亡。

第2項.根據(jù)第1項的肽，其中所述肽是DAXX蛋白質片段，并且由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17-44中任一所示的氨基酸序列組成。

第3項.根據(jù)第1項的肽，其中所述肽是FADD蛋白質片段，并且由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：45-57中任一所示的氨基酸序列組成。

第4項.一種第1-3項任一項的肽的擬肽。

第5項.一種包含與細胞穿膜肽連接的根據(jù)第1-3項任一項的肽或根據(jù)第4項的擬肽的偶聯(lián)物。

第6項.根據(jù)第5項的偶聯(lián)物，其中所述肽或所述擬肽類通過接頭與細胞穿膜肽連接。

第7項.根據(jù)第5項或第6項的偶聯(lián)物，其中所述細胞穿膜肽選自Tat、RXR、Bpep和Pip2b。

第8項.根據(jù)第7項的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60或SEQ IQ NO：61所示的氨基酸序列組成。

第9項.一種藥物組合物，包含有效量的至少一種根據(jù)第1-3項任一項的肽或至少一種根據(jù)第4項的擬肽或至少一種根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物，和至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑。

第10項.第9項的藥物組合物，進一步包含至少一種另外的生物活性劑。

第11項.根據(jù)第10項的藥物組合物，其中所述至少一種另外的生物活性劑選自環(huán)孢霉素A、BH4及其組合。

第12項.根據(jù)第1-3項任一項的肽、或根據(jù)第4項的擬肽、根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物或第8-10項任一項的藥物組合物，用于治療人或動物體的方法中。

第13項.根據(jù)第1-3項任一項的肽、或根據(jù)第4項的擬肽、根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物或第8-10項任一項的藥物組合物，用于抑制人或動物體中的細胞凋亡的方法中。

第14項.根據(jù)第1-3項任一項的肽、或根據(jù)第4項的擬肽、根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物或第9-11項任一項的藥物組合物，用于治療人或動物體的急性心肌梗死(AMI)、腦梗塞、器官移植、心臟介入術(體外循環(huán)和臨時血管閉塞)或急性循環(huán)擾動(休克狀態(tài))的方法中。

第15項.根據(jù)第1-3項任一項的肽、或根據(jù)第4項的擬肽、根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物或第9-11項任一項的藥物組合物，用于治療人或動物體的局部缺血，特別是心肌缺血、腎臟缺血、缺血性結腸炎、腸系膜缺血、腦缺血、肢體缺血或皮膚缺血的方法中。

第16項.根據(jù)第1-3項任一項的肽、或根據(jù)第4項的擬肽、根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物或第9-11項任一項的藥物組合物，用于治療人或動物體的再灌注損傷的方法中。

第17項.根據(jù)第12-16項任一項的肽、其衍生物、其偶聯(lián)物或其藥物組合物，其中所述方法還包括向所述人或動物體施用環(huán)孢霉素A和/或BH4的步驟。

第18項.一種治療受試者中與細胞凋亡相關的疾病或病癥的方法，包括步驟：

-向所述受試者施用有效量的至少一種根據(jù)第1-3項任一項的肽、或根據(jù)第4項的擬肽、或根據(jù)第5-8項任一項的偶聯(lián)物或根據(jù)第9-11項任一項的藥物組合物。

第19項.根據(jù)第18項的方法，進一步包括步驟：向所述受試者施用至少一種選自環(huán)孢霉素A、BH4及其組合的另外的生物活性劑。

第20項.根據(jù)第18或19項的方法，其中所述與細胞凋亡相關的疾病或病癥選自急性心肌梗死(AMI)、腦梗塞、器官移植、心臟介入術、急性循環(huán)擾動、再灌注損傷和局部缺血。

本發(fā)明的這些和其它目的、優(yōu)點和特征對于已閱讀了以下優(yōu)選實施方案的詳述的本領域技術人員而言將變得顯而易見。

附圖簡要說明

圖1：通過SPOT合成確定DAXX表位。(A)將DAXX的氨基酸序列分割成重疊肽陣列(肽掃描(pepscan)；具有三個氨基酸位移的15聚體肽)并且在酶聯(lián)印跡中分析。黑色長方形顯示四個最亮的點并示出了相應的表位序列。溫育條件：Fas受體的His-標記的細胞內區(qū)域[10μg/ml]；抗體：抗-His-(小鼠)(Sigma H1029；1∶6,000)/抗-小鼠-HRP(Calbiochem 401207；1∶2,000)，暴露時間：1分鐘。(B)包含16-merKKSRKEKKQTGSGPLG的人DAXX序列(＝SEQ ID NO：5的DAXXp)與其它物種(小鼠、大鼠、狗(CANFA)和綠猴(CHLAE))的DAXX序列的比對。

圖2：通過SPOT合成確定DAXX表位(＝DAXXp)的最佳長度。(A)(分別為SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的)DAXXp-211和DAXXp-209肽在N-端、C-端和在N-和C-端兩者連續(xù)縮短一個氨基酸殘基并且使用酶聯(lián)印跡進行分析。由箭頭指示的點表現(xiàn)出最高的信號強度(BLU)。溫育條件：Fas受體的His-標記的細胞內區(qū)域[10μg/ml]；抗體：抗-His-(小鼠)(Sigma H1029；1∶6,000)/抗-小鼠-HRP(Calbiochem 401207；1∶2,000)，暴露時間：1分鐘。(B)肽序列DAXXp-211和DAXXp-209的比對；對應于最亮的點，以確定最佳DAXX肽序列。

圖3：Tat-DAXXp和Pip2b-DAXXp蛋白酶能力的評價。Tat-DAXXp和Pip2b-DAXXp偶聯(lián)物(A)在胎牛血清(FBS，BioWest)中和(B)在新鮮制備的小鼠血清(MS)中的穩(wěn)定性測量。將肽與20％的血清在37℃下溫育0h、1h、2h、4h、8h、24h和48h，并且將50μl的溫育混合物在100μl的在H₂O/CH₃CN(50/50)中的10％二氯乙酸(DCA)中沉淀。將樣品混合并且保持在-20℃下。通過離心(14000rpm，10分鐘)分離沉淀的血清蛋白并且通過反相HPLC分析上清液(以mV*sec測量峰面積)。對于每一條件n≥2。在小鼠血清中2h溫育之后，超過70％的肽仍然完整，而在24小時后，所有的肽被降解。

圖4：細胞分布取決于溫育時間。將原代心肌細胞與CF-標記的Tat-DAXXp偶聯(lián)物(綠色熒光)的1μM溶液一起溫育1h、4h或6h。用Hoechst染料(藍)將細胞核染色。白色的條表示10μm。在溫育1h后CF-Tat-DAXXp的細胞內分布顯示細胞溶質中的斑點圖案(其為肽通過內吞作用內在之后的內涵體包裹(endosomal entrapment)特征)且未檢測到核定位。溫育4h后，CF-Tat-DAXXp似乎能夠逸出內涵體囊泡，從而產生更擴散性的標記圖案。此外，觀察到核積聚。在更長的溫育時間(6小時)后，CF-標記的肽被包封在大囊泡(白色箭頭)中并且從細胞中消除。

圖5：CPPs和CPP-偶聯(lián)物抗凋亡活性的體外評價。在(A)C2C12細胞、(B)原代心肌細胞、(C)H9c2細胞和(D)NG108-15細胞中DNA片段化的工作流程和量化。將數(shù)據(jù)針對100％STS標準化。顯示的數(shù)據(jù)為平均值±SEM，其中n≥5。將細胞接種在24孔板上并且生長過夜。第二天，將細胞與單獨的STS或與STS+1μM肽一起溫育培養(yǎng)(在OptiMEM中)(對于各種細胞的STS濃度和溫育時間在圖中給出)。其后，將溶液移除，用完全培養(yǎng)基替代并且再溫育40h。再生期之后，將細胞裂解并且根據(jù)制造商的說明檢測DNA片段化(細胞死亡檢測ELISA^PLUS試劑盒-Roche Diagnostics)。

圖6：Tat-DAXXp序列變體在原代心肌細胞上的抗凋亡活性。如在圖5的說明中描述的，評價DAXXp序列的不同類似物(參見表2)對于STS的抗凋亡性能(細胞死亡檢測ELISA^PLUS試劑盒-Roche Diagnostics)。沒有一種類似物能夠保護原代心肌細胞-確認16聚體DAXXp具有對于最高心臟保護作用的最佳長度和序列的事實。

圖7：就C2C12細胞、原代心肌細胞和H9c2上的抗凋亡活性而言，鼠/大鼠DAXXp和人DAXXp序列的比較。就針對STS的抗凋亡性能而言(細胞死亡檢測ELISA^PLUS試劑盒-Roche Diagnostics)，將連接到Tat上的鼠DAXXp序列(Tat-mDAXXp-SEQ ID NO：61)(其與大鼠DAXXp序列相同(參見圖1B))與人構建體(Tat-DAXXp)相比較。使用的C2C12細胞和原代心肌細胞來自小鼠，H9c2細胞來自大鼠。在所有的細胞中，由于鼠或大鼠的細胞類型，使用鼠Tat-mDAXXp序列觀察到抗凋亡效應的提高。

圖8：FADDp15的測定及其在心肌細胞中抗凋亡作用。(A)將FADD的蛋白序列分割成重疊肽陣列(肽掃描；具有三個氨基酸位移的15聚體肽)并且使用酶聯(lián)印跡進行分析。黑色長方形顯示三個最亮的點和示出相應的表位序列，下方提供點編號和信號強度(BLU)。(B)FADDp-11的肽序列(＝FADDp15＝SEQ ID NO：9)在C-端、N-端或在C-和N-端兩者連續(xù)縮短一個氨基酸殘基并且使用酶聯(lián)印跡進行分析。由箭頭指示的點表現(xiàn)最高信號強度(BLU)。最短的FADD表位(具有序列KRKLERVQS(＝FADDp＝SEQ ID NO：12)的9聚體)對應于點No.24。溫育條件：Fas受體的His-標記的細胞內區(qū)域[10μg/ml]；抗體：抗-His-(小鼠)(Sigma H1029；1∶6,000)/抗-小鼠-HRP(Calbiochem 401207；1∶2,000)，暴露時間：1分鐘。

圖9：就原代心肌細胞和H9c2細胞中的抗凋亡活性而言，F(xiàn)ADDp構建體與Tat-DAXXp的比較。在(A)原代心肌細胞和在(B)H9c2細胞中DNA片段化的量化。將數(shù)據(jù)針對100％STS標準化。顯示的數(shù)據(jù)為平均值±SEM，其中n≥5。將細胞接種在24孔板上并且生長過夜。第二天，將細胞與單獨的STS或與STS+1μM肽一起溫育(在OptiMEM中)(在圖中給出了STS濃度和在圖5中給出了溫育時間)。其后，將溶液移除，用完全培養(yǎng)基替代并且再溫育40h。再生期之后，將細胞裂解并且根據(jù)制造商的說明檢測DNA片段化(細胞死亡檢測ELISA^PLUS試劑盒-Roche Diagnostics)。據(jù)發(fā)現(xiàn)短的Tat-FADDp序列的有效性低于Tat-DAXXp，但是較長Tat-FADDp15具有相同的(在H9c2中)或提高的(在原代心肌細胞中)抗凋亡效應。

圖10：在原代心肌細胞和在H9c2細胞中Tat-DAXXp和Tat-FADDp15單獨和組合的比較。當與1μM單獨的肽相比時，發(fā)現(xiàn)與0.5μM Tat-DAXXp和0.5μM Tat-FADDp15二者的溫育導致相同或甚至更高的抗凋亡作用。此外，與1μM的兩種肽一起溫育導致在兩種細胞類型中最高的保護，表明Tat-DAXXp和Tat-FADDp15的組合可能是有希望的應用。

圖11：體內實驗方案。使C57B16小鼠經(jīng)受心肌缺血-再灌注(IR)手術方案。黑框表示小鼠接受的缺血時間。梗死面積或細胞死亡測量在各方案的手術結束時(用↑指示)進行。IR_60’：40分鐘的缺血，60分鐘的再灌注。IR_24h：40分鐘的缺血和24小時的再灌注。

圖12：Tat-DAXXp(1mg/kg-IV)在經(jīng)受IR_60’的小鼠中的心臟保護作用。梗死面積(處于危險中的面積的％)和由ELISA測定的核小體間DNA片段化在經(jīng)受IR_60’并用Tat、Tat-DAXXp或Tat-scrDAXXp(1mg/kg)以及用DAXXp(10mg/kg)處理(在再灌注前5分鐘靜脈注射(IV))的小鼠中量化。以平均值±SEM作圖：(A)：處于危險中的面積/LV質量(左心室)，(B)：梗死面積(處于危險中的面積的％)和(C)：(I/NI比率)，其對應于LV組織的缺血部分對非缺血部分中可溶性核小體的比率。使用單因素ANOVA分析通過用于多重比較的Neuman-Keuls事后檢驗進行統(tǒng)計學分析(GraphPad Prism軟件)。相對于Tat-DAXXp的P＜0.05，P＜0.01和P＜0.001分別標記為*、**和***。對于P＞0.05，P＝ns(不顯著)。

圖13：在經(jīng)受IR_60’的小鼠中對于Tat-DAXXp和DAXXp的劑量響應。梗死面積(處于危險中的面積的％)和通過ELISA測定的核小體間DNA片段化在經(jīng)受IR_60’并在再灌注之前5分鐘用靜脈注射Tat(1mg/kg)、Tat-DAXXp(0.1、1和10mg/kg)或DAXXp(0.1、1和10mg/kg)處理的小鼠中量化。以平均值±SEM作圖：(A)：處于危險中的面積/LV質量(左心室)，(B)：梗死面積(處于危險中的面積的％)和(C)：(I/NI比率)，其對應于在LV組織的缺血部分對非缺血部分中可溶性核小體的比率。

圖14：Tat-DAXXp(1mg/kg-IV)在經(jīng)受IR_24h的小鼠中的心臟保護作用。梗死面積(處于危險中的面積的％)和由ELISA測定的核小體間DNA片段化在經(jīng)受IR_24H并用Tat、Tat-DAXXp或Tat-scrDAXXp(1mg/kg)以及用DAXXp(10mg/kg)處理(在再灌注前5分鐘靜脈注射(IV))的小鼠中量化。以平均值±SEM作圖：(A)：處于危險中的面積/LV質量(左心室)，(B)：梗死面積(處于危險中的面積的％)和(C)：(I/NI比率)，對應于在LV組織的缺血部分對非缺血部分中可溶性核小體的比率。使用單因素ANOVA分析通過用于多重比較的Neuman-Keuls事后檢驗進行統(tǒng)計學分析(GraphPad Prism軟件)。相對于Tat-DAXXp的P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001分別標記為*、**和***。對于P＞0.05，P＝ns(不顯著)。

圖15：在經(jīng)受IR_24h的小鼠中對于Tat-DAXXp和DAXXp的劑量響應。在經(jīng)受IR_24h并通過在再灌注之前5分鐘靜脈注射Tat(1mg/kg)、Tat-DAXXp(0.1、1和10mg/kg)或DAXXp(0.1、1和10mg/kg)處理的小鼠中測定處于危險中的面積和梗死面積(處于危險中的面積的％)。以平均值±SEM作圖：(A)：處于危險中的面積/LV質量(左心室)，(B)：梗死面積(處于危險中的面積的％)。

圖16：Tat-DAXXp構建體在心肌中的可視化。在再灌注時用1mg/kg CF-Tat-DAXXp構建體(CF：羧基熒光素)注射小鼠。在2小時的多聚甲醛固定之后(在磷酸鹽緩沖液中的4％PFA)用振動切片機獲得LV切片(20μm)。2μm共焦圖像清楚地顯示肌細胞中的綠色標記，表明在細胞溶質中肽構建體的存在。圓圈突出顯示如在少數(shù)情況中觀察到的肽構建體在DAPI-陽性核中的存在(油浸X40)。

圖17：在腎臟移植期間冷缺血/再灌注損傷的初步數(shù)據(jù)。腦死亡和延長的冷缺血導致來自死亡供體腎臟移植體的較差長期移植結果的主要因素，而如果使用了擴展標準供體(‘邊緣器官’)，甚至影響更大。靶向缺血-再灌注(IR)損傷相關的移植體內(intragraft)炎癥對于改善這些移植的結果是引人注目的理念。(A)在大鼠腎臟移植期間冷缺血/再灌注的工作流程。在24h冷缺血之后，使用標準顯微外科技術將腎臟移植體同位移植到雄性LEW受體中。在再灌注之后立即將肽以1mg/kg的單一i.v注射來注射。移植三天后，收獲移植體進行RT-PCR分析(n＝3)。(B)將總RNA反轉錄成cDNA并且利用GeneAmp 5700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，Weiterstadt，德國)進行定量實時RT-PCR。ICAM-1、IFN-γ、TNF-α、白細胞介素(IL)-6和bcl-2(由Metabion，Martinsried，德國合成)的Taqman-PCR反應在25μl的最終體積中進行。這些初步數(shù)據(jù)顯示在Tat-DAXXp的存在下，IFN-γ和ICAM-1的mRNA表達降低在移植三天后的腎臟移植體中發(fā)生。

定義

在整個說明書中，采用在以下段落中定義的幾個術語。

術語“蛋白質”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用，是指以其中性(不帶電荷)形式或作為鹽的形式、未修飾的或通過糖基化、側鏈氧化或磷酸化修飾的多種長度的氨基酸序列。在某些實施方案中，氨基酸序列為全長天然蛋白質。然而，在優(yōu)選實施方案中，氨基酸序列為全長蛋白質的片段。在再其它的實施方案中，氨基酸序列通過連接于氨基酸側鏈的另外的取代基，例如糖基單元、脂質或無機離子(例如磷酸根)以及與鏈的化學轉化(例如巰基的氧化)相關的修飾來進行修飾。因此，術語“蛋白質”(或其等價術語)意欲包括全長天然蛋白質、或其片段的氨基酸序列，其發(fā)生那些不顯著改變其特定性質的修飾。特別地，術語“蛋白質”包括蛋白質異形體，即由相同基因編碼但其pI或MW或二者均不同的變體。這種異形體的氨基酸序列可以不同(例如作為選擇性剪接或限制性蛋白水解的結果)，或者這些異形體可由差異的翻譯后修飾(例如，糖基化、?；⒘姿峄?產生。

當在本文中用于指蛋白質或多肽時，術語“類似物”是指具有與該蛋白質或多肽相似或相同的功能但不是必定包含與該蛋白質或多肽的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列或者不是必定包含與該蛋白質或多肽的結構相似或相同的結構的肽。優(yōu)選地，在本發(fā)明的情況中，類似物具有與該蛋白質或多肽的氨基酸序列至少30％相同，更優(yōu)選地，至少約35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在某些優(yōu)選的實施方案中，蛋白質類似物具有與該蛋白質的氨基酸序列至少80％相同或至少85％相同，優(yōu)選至少90％相同，和最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列。

當在本文中涉及蛋白質或多肽而使用時，術語“片段”是指包含該蛋白質或多肽的至少5個連續(xù)的氨基酸殘基和少于30個連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列的肽，例如該蛋白質或多肽的7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個連續(xù)的氨基酸殘基，優(yōu)選該蛋白質或多肽的9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個連續(xù)的氨基酸殘基，和更優(yōu)選該蛋白質或多肽的9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個或17個連續(xù)的氨基酸殘基。在本發(fā)明的情況中，蛋白質或多肽的片段保留全長蛋白質或多肽的功能活性。

如本文所用，術語“同源的(homologous)”(或“同源性(homology)”)與術語“同一性(identity)”同義，是指兩個多肽分子間的序列相似性。當在兩個對比的序列中的位置被相同氨基酸殘基占據(jù)時，則相應分子在該位置處是同源的。如本文所用，序列同一性百分比是指氨基酸序列間的比較，并通過在比較窗口內比較兩個最佳對準的序列來確定，其中與基準序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗口中的氨基酸序列部分可包含添加或缺失(即，空位)以獲得兩個序列的最佳對準。百分比可通過以下方法計算：確定在兩個序列中出現(xiàn)相同的氨基酸殘基的位置數(shù)以得到匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗口中總位置數(shù)并將結果乘以100以得到序列同一性百分比?；蛘撸俜直瓤赏ㄟ^以下方法計算：確定在兩個序列中出現(xiàn)相同的氨基酸殘基的位置數(shù)或氨基酸殘基與空位對準的位置數(shù)以得到匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗口中總位置數(shù)并將結果乘以100以得到序列同一性百分比。本領域技術人員了解存在著許多已建立的算法可用于比對兩個序列。用于比較的序列最佳比對可例如，使用Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48：443的同源性比對算法、使用Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.ScL USA 85∶2444的相似性檢索方法，利用這些運算法則的計算機執(zhí)行程序(GCG Wisconsin Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或使用目視檢查(通常參見，Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等編輯，Current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，(1995增刊)(Ausubel))來進行。適于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的實例為BLAST和BLAST 2.0算法，其分別描述于Altschul等，1990，J.MoI.Biol.215：403-410和Altschul等，1977，Nucleic Acids Res.3389-3402中。

同源的氨基酸序列共有相同或類似的氨基酸序列。在本發(fā)明的情況中，相似的殘基是基準序列中相應氨基酸殘基的保守置換或基準序列中相應氨基酸殘基的“允許的點突變”?；鶞市蛄兄袣埢摹氨Ｊ刂脫Q”是與相應基準殘基在物理上或功能上相似的置換，例如，具有相似尺寸、形狀、電荷、化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力，等。特別優(yōu)選的保守置換為滿足Dayhoff等為“可接受的點突變”所定義的標準的那些(“Atlas of Protein Sequence and Structure”，1978，Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington，DC，Suppl.3，22：354-352)。

在本發(fā)明的情況中，術語“治療”用以表征目的在于延遲或預防疾病或病癥的發(fā)作、減緩或停止病癥癥狀的進展、加重或惡化、改善病癥癥狀和/或治愈病癥的方法。治療可在疾病或病癥發(fā)作之前施用以用于預防性或防止作用。替代地或額外地，其可在疾病或病癥開始之后施用以用于治療作用。

如本文所用，術語“受試者”指人或動物，特別是哺乳動物(例如，靈長類動物、狗、貓、山羊、馬、豬、小鼠、大鼠、兔等)，其可受與細胞凋亡相關的疾病或病癥所影響，但可以患有或未患有該疾病或病癥。在本發(fā)明的許多實施方案中，受試者為人類。在這樣的實施方案中，受試者經(jīng)常稱為“個體”。術語“個體”不指定特定年齡，并因此包括兒童、青少年和成人。

本文將“藥物組合物”定義為包含有效量的本發(fā)明的肽，和至少一種藥學上可接受載體或賦形劑。

如本文所用，術語“有效量”是指足以實現(xiàn)其預期目標，例如，細胞、組織、系統(tǒng)或受試者中所需的生物或醫(yī)學反應的肽、化合物、試劑、或組合物的任何量。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，該目標可為：抑制、預防或減少細胞凋亡，例如與再灌注損傷或器官移植相關的細胞凋亡；和/或預防或治療與細胞凋亡相關的疾病或病癥。

術語“藥學上可接受載體或賦形劑”是指不干擾活性成分的生物活性的效力并在其施用的濃度下對主體不具有明顯毒性的載體介質。該術語包括溶劑、分散體、介質、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這種介質和試劑用于藥學活性物質是本領域所熟知的(參見例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，E.W.Martin，第18版，1990，Mack Publishing Co.：Easton，PA，其通過引用以其整體并入本文)。

優(yōu)選實施方案的詳述

如上所述，本發(fā)明涉及具有抗凋亡性質的肽，其可用作治療和/或預防與細胞凋亡相關的大量疾病或病癥的治療劑。

抑制細胞凋亡的肽

本發(fā)明的肽包括具有抗凋亡活性的DAXX片段和FADD片段。

術語“DAXX”和“DAXX蛋白質”在本文中可互換使用。它們是指稱為死亡相關蛋白質6的蛋白質，所述死亡相關蛋白質6在人中通過位于染色體6的短臂(p)上的21.3位處的DAXX基因(RefSeq(mRNA)：NM_001141969.1)編碼。在優(yōu)選實施方案中，DAXX具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。然而，DAXX蛋白質可為SEQ ID NO：1的DAXX蛋白質的異形體并因此可具有由人DAXX基因編碼的任何氨基酸序列。

術語“FADD”和“FADD蛋白質”在本文中可互換使用。它們是指稱為具有死亡結構域的Fas相關蛋白質的蛋白質，所述Fas相關蛋白質在人中由位于染色體11的長臂(q)上的13.3位處的FADD基因(RefSeq(mRNA)：NM_003824.3)編碼。在優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)ADD具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。然而，F(xiàn)ADD蛋白質可為SEQ ID NO：8的FADD蛋白質的異形體并因此可具有由人FADD基因編碼的任何氨基酸序列。

發(fā)明人已表明，由SEQ ID NO：5(“DAXXp”)、SEQ ID NO：6(“DAXXp-14”)或SEQ ID NO：2(“DAXXp-15”＝“DAXXp-211”)所示的氨基酸序列組成的肽(其全部為DAXX蛋白質(SEQ IDNO：1)的片段)與Fas受體相互作用，但僅DAXXp能夠減少細胞凋亡。類似地，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)由SEQ ID NO：9(“FADDp15”)和SEQ ID NO：12(“FADDp”)所示的氨基酸序列組成的肽(其均為FADD蛋白質(SEQ ID NO：8)的片段)與Fas受體相互作用并減少細胞凋亡。

因此，在特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為由SEQ IDNO：5組成的16個連續(xù)氨基酸殘基的DAXX片段。在另一個特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個連續(xù)氨基酸殘基的DAXX片段。優(yōu)選地，這種抗凋亡肽具有選自下組的氨基酸序列：

SEQ ID NO：17(KKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：18(KKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：19(KKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：20(KKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：21(CKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：22(PCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：23(PPCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：24(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：25(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLG)，

SEQ ID NO：26(CKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：27(CKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：28(CKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：29(CKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：30(PCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：31(PCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：32(PCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：33(PCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：34(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：35(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：36(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：37(PPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：38(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：39(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，

SEQ ID NO：40(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)，

SEQ ID NO：41(GPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSYV)，

SEQ ID NO：42(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGN)，

SEQ ID NO：43(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNS)，和

SEQ ID NO：44(SGPPCKKSRKEKKQTGSGPLGNSY)。

在特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為由SEQ ID NO：12組成的9個連續(xù)氨基酸殘基的FADD片段。在另一個特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為由SEQ ID NO：9組成的15個連續(xù)氨基酸殘基的FADD片段。在再其它的特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽為包含SEQ ID NO：12的9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個或17個連續(xù)氨基酸殘基的FADD片段。優(yōu)選地，這種抗凋亡肽具有選自下組的氨基酸序列：

SEQ ID NO：45(KRKLERVQSG)，

SEQ ID NO：46(KRKLERVQSGL)，

SEQ ID NO：47(KRKLERVQSGLD)，

SEQ ID NO：48(KRKLERVQSGLDL)，

SEQ ID NO：49(RKRKLERVQS)，

SEQ ID NO：50KRKRKLERVQS)，

SEQ ID NO：51(GKRKLERVQSG)，

SEQ ID NO：52(GKRKLERVQSGL)，

SEQ ID NO：53(GKRKLERVQSGLD)，

SEQ ID NO：54(GKRKLERVQSGLDL)，

SEQ ID NO：55(VGKRKLERVQSG)，

SEQ ID NO：56(VGKRKLERVQSGL)，和

SEQ ID NO：57(VGKRKLERVQSGLD)。

如上所述，在某些實施方案中，DAXX蛋白質為SEQ ID NO：1的DAXX蛋白質的異形體。在這樣的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽可以是與SEQ ID NO：1的DAXX蛋白質中SEQ ID NO：5的片段對應的16個連續(xù)氨基酸殘基的DAXX片段。

類似地，如上所述，在某些實施方案中，F(xiàn)ADD蛋白質為SEQ ID NO：8的FADD蛋白質的異形體。在這樣的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡肽可以是與SEQ ID NO：8的FADD蛋白質中SEQ ID NO：12的片段對應的9個連續(xù)氨基酸殘基的FADD片段；或可以是與SEQ ID NO：8的FADD蛋白質中SEQ ID NO：9的片段對應的15個連續(xù)的氨基酸殘基的FADD片段。

DAXX異形體和FADD異形體優(yōu)選具有分別與SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性，和更優(yōu)選分別與SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的至少95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的肽以及其衍生物和偶聯(lián)物(見下文)能夠抑制、預防和/或減少細胞凋亡，特別是心肌細胞的細胞凋亡。這種能力可使用技術人員已知的任何適合方法來評價，例如使用細胞凋亡檢測試劑盒。適用于測量細胞凋亡的試劑盒的實例為細胞死亡檢測試劑盒(Cat.No.11 774 425 001，Roche Applied Science)。

根據(jù)本發(fā)明的肽的衍生物

本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的肽的生物活性衍生物?！吧锘钚匝苌铩笔侵副Ａ袅吮景l(fā)明的肽抑制、預防或減少細胞凋亡的能力的本發(fā)明肽的任何衍生物。

在某些實施方案中，生物活性衍生物具有經(jīng)過化學和/或生物修飾的本發(fā)明抗凋亡肽的氨基酸序列。

衍生物的實例為其中具有以下特征的根據(jù)本發(fā)明的肽：

-肽的至少一個氨基酸殘基被置換或刪除，

-至少一個另外的氨基酸殘基被插入肽中，和/或

-肽的至少一個氨基酸殘基被化學改變或衍生化。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的生物活性衍生物包含選自置換、插入、缺失、改變或衍生化的僅一個或僅兩個氨基酸殘基修飾。在某些優(yōu)選實施方案中，生物活性衍生物含有一個保守置換或兩個保守置換。在某些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的DAXX片段的衍生物具有影響SEQ ID NO：5之外的氨基酸殘基(即，其不包含于SEQ ID NO：5內)的一個或兩個修飾；和根據(jù)本發(fā)明的FADD片段的衍生物具有影響SEQ ID NO：12之外的氨基酸殘基(即，其不包含于SEQ ID NO：12內)的一個或兩個修飾。

適合的“化學改變或衍生化的”氨基酸包括，例如，天然存在的氨基酸衍生物，例如對于脯氨酸的4-羥基脯氨酸、對于賴氨酸的5-羥基賴氨酸、對于絲氨酸的高絲氨酸、對于賴氨酸的鳥氨酸等。其它“化學改變或衍生化的”氨基酸包括連接于例如標記物(例如熒光素、四甲基若丹明或青色染料Cy5.5)的氨基酸；或帶有一個或多個翻譯后修飾(例如乙酰化、酰胺化、甲?；?、羥基化、甲基化、磷酸化、硫酸化、糖基化或脂化)的氨基酸殘基。事實上，某些化學修飾，特別是N-端糖基化，已顯示增強了肽在人血清中的穩(wěn)定性(Powell等，Pharma Res 1993：10：1268-1273)?！盎瘜W改變或衍生化的”氨基酸也包括具有有通過N-肉豆蔻?；@得的增強的膜滲透性的那些氨基酸(Brand等，Am J Physiol Cell Physiol 1996；270：C1362-C1369)。

根據(jù)本發(fā)明的肽的其它衍生物為所述肽的擬肽。擬肽是指具有根據(jù)本發(fā)明的肽的基本上相同的結構和/或功能特性的合成化合物。該模擬物(mimetic)可完全由合成的、非天然氨基酸類似物組成，或可以為包括一個或多個天然氨基酸和一個或多個非天然氨基酸類似物的嵌合分子。模擬物也可整合任何數(shù)目的不破壞模擬物活性的天然氨基酸保守置換。采用根據(jù)本發(fā)明的測試A，常規(guī)測試可用于測定模擬物是否具有所需的活性。當涉及模擬物或擬肽而使用時，短語“基本上相同”是指模擬物或擬肽具有所指分子的一種或多種活性或功能，特別是抑制細胞凋亡。用于開發(fā)擬肽的技術是常規(guī)的。例如，肽鍵可被非肽鍵或非天然氨基酸(其允許該擬肽采取與原始肽類似的結構并由此具有類似的生物活性)替代。也可通過用具有類似結構的其它化學基團替代氨基酸的化學基團來進行進一步的修飾。可通過NMR譜學、結晶學和/或計算機輔助分子建模確定原始片段/肽的三級結構來輔助擬肽的開發(fā)，所述初始片段/肽為游離的或者結合至Fas受體的細胞內區(qū)域上。一旦鑒定了潛在的擬肽化合物，則可將其合成并且可分析其抑制細胞凋亡的能力。

擬肽可含有非天然結構成分的任何組合，所述非天然結構成分通過來自三種結構基團：除天然胺鍵(“肽鍵”)連接之外的殘基連接基團；代替天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基；誘導二級結構擬態(tài)(例如，β轉角、γ轉角、β折疊、α螺旋構型)的殘基；或賦予抗蛋白質水解抗性的其它改變。例如，賴氨酸模擬物可通過與丁二酸酐或其它羧酸酐的反應來產生。賴氨酸和其它含α-氨基的殘基的模擬物也可通過與酰亞胺酯如甲基吡啶亞胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氫化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮的反應及與乙醛酸的轉酰胺基酶-催化的反應來產生。

也可和具有相反手性的氨基酸(或擬肽殘基)替代一個或多個殘基。因此，可用相同但具有相反手性的氨基酸或模擬物(稱為D-氨基酸，但其也可稱為R-或S-型)替代任何天然以L-構型存在的氨基酸(取決于化學實體的結構，其也可稱為R或S)。

如本領域技術人員所理解的，本發(fā)明的擬肽也可包括一個或多個本文所描述的用于“化學改變或衍生化的”氨基酸的修飾，例如，標記物或一個或多個翻譯后修飾。

可使用本領域何已知的任方法制備和分離肽、衍生物和擬肽?？墒褂贸Ｒ?guī)化學方法整體或部分地合成肽。產生肽和擬肽文庫的技術是公知的，并包括例如，多針(multipin)、茶袋、分裂偶聯(lián)混合技術和SPOT合成。

偶聯(lián)物

本發(fā)明也涉及包含與細胞穿膜肽或CPP連接的本發(fā)明的肽或其衍生物的偶聯(lián)物。

事實上，為了促進根據(jù)本發(fā)明的肽或其衍生物跨越細胞膜(例如細胞質膜)的吸收，發(fā)明人已證明將那些肽或其衍生物與“細胞穿膜肽”(CPP)偶聯(lián)是非常有用的。CPP是可與運送的物質偶聯(lián)以促進跨膜轉運的公知的肽。CPP例如Lebleu B.等，Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008)517-529和Hassane F.等，Cell.Mol.Life Sci.(2010)67：715-726描述。任何CPP可用以改善根據(jù)本發(fā)明的片段或其衍生物的胞質遞送。

可與根據(jù)本發(fā)明的DAXX或FADD片段或其衍生物偶聯(lián)的CPP的實例包括，但不限于：

其中：

-X＝氨基己基、β-丙氨?；?、對氨基苯甲?；?、異哌啶甲?；?isonipecotyl)或4-氨基丁酰基

-B＝β-丙氨酸

-小寫字母＝D-氨基酸(D-氨基酸可被L-氨基酸替代)。

CPP通常具有兩個或更多個陽離子氨基酸，以疏水氨基酸或間隔基團分隔某些陽離子氨基酸。例如，陽離子氨基酸為精氨酸(R)。再通常地，CPP一般具有至少3或4個精氨酸殘基。在某些實施方案中，CPP含有5、6或更多個精氨酸殘基。

CPP通常連接至根據(jù)本發(fā)明的肽或其衍生物的N-端或C-端，優(yōu)選連接至C-端?；瘜W連接可通過任何化學鍵例如二硫鍵、硫醚或硫醇-馬來酰亞胺連接實現(xiàn)。

在特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽或其衍生物通過接頭連接至CPP。技術人員可使用任何類型的接頭，只要所述接頭允許肽或其衍生物化學與CPP連接。多種接頭是可能的，包括具有允許形成二硫鍵、硫醚或硫醇-馬來酰亞胺連接的C-端半胱氨酸殘基的氨基酸序列。將根據(jù)本發(fā)明的肽或其衍生物連接至CPP的其它方式包括使用C-末端醛以形成肟。另外的其它接頭使用Click化學作用(Click chemistry)。

適合的接頭的實例包括，但不限于選自下組的氨基酸或氨基酸序列：C、BC、XC、GC、BBCC、BXCC、XBC、X、XX、B、BB、BX和XB，

其中：

-X＝氨基己基、β-丙氨?；Π被郊柞；?、異哌啶甲?；?-氨基丁酰基

-B＝β-丙氨酸。

應用

本發(fā)明還涉及用于治療人或動物體的方法中的如本文所述的肽、其衍生物及其偶聯(lián)物，并涉及相應的治療方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于治療人或動物體中與細胞凋亡相關的疾病或病癥和/或用于抑制人或動物體中細胞凋亡的方法的肽、其衍生物及其偶聯(lián)物。本發(fā)明也提供用于在需要治療的受試者中治療與細胞凋亡相關的疾病或病癥和/或抑制細胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和/或其偶聯(lián)物的步驟。在某些實施方案中，向受試者施用至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡DAXX-肽和至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡FADD-肽。

如本文所用，術語“與細胞凋亡相關的疾病或病癥”是指任何由細胞凋亡引起、導致細胞凋亡或包括細胞凋亡的疾病或臨床病癥。在某些實施方案中，疾病或病癥與Fas受體介導的細胞凋亡相關。術語“與細胞凋亡相關的疾病或臨床病癥”也包含任何引起細胞凋亡、導致細胞凋亡或誘導細胞凋亡并由于受試者中疾病或臨床病癥的存在而進行的醫(yī)學過程。

因此，根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和其偶聯(lián)物及治療方法可用以治療人或動物體中的急性心肌梗死(AMI)、腦梗塞或急性循環(huán)擾動(休克狀態(tài))，且特別地可用于抑制或減少與這些疾病相關的細胞凋亡。根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和其偶聯(lián)物及治療方法也可用以治療進行器官移植(例如，肝臟、心臟、腎臟、胰島和小腸移植物)、心臟介入術(再灌注治療、體外循環(huán)例如作為心肺旁路和臨時血管阻塞)的受試者，且特別地可用于抑制或減少由這些醫(yī)療過程所引起的細胞凋亡。

根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和其偶聯(lián)物及治療方法可用于治療人或動物體中的局部缺血，例如心肌缺血、腎臟缺血、缺血性結腸炎、腸系膜缺血、腦缺血、肢體缺血或皮膚缺血，且特別地可用于抑制或減少與缺血相關的細胞凋亡。

根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和其偶聯(lián)物及治療方法可用于治療正在接受或已接受再灌注的受試者，且特別地可用于抑制或減少與再灌注損傷相關的細胞凋亡。

所有根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和其偶聯(lián)物可在局部缺血之前或期間、在再灌注之前、同時或之后施用。

通過Fas受體介導的細胞凋亡也已被證實涉及人肝臟疾病，包括病毒性肝炎、威爾森氏癥、酒精肝、膽汁淤積性肝病，和涉及自體免疫性疾病(綜述于，例如，Ehrenschwender等，Adv.Exp.Med.Biol.，2009，647：64-93中)。因此，根據(jù)本發(fā)明的肽、其衍生物和其偶聯(lián)物及治療方法也可用于治療這些疾病。

在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中，肽、其衍生物或其偶聯(lián)物可與其它治療劑，特別是用于治療細胞凋亡、局部缺血和/或再灌注損傷的藥劑聯(lián)用。特別地，與靶向于細胞凋亡的內源性途徑(即線粒體途徑)的試劑的聯(lián)合治療是令人非常感興趣的。因此，在相關方面中，本發(fā)明提供與其它治療劑，特別是用于治療細胞凋亡、局部缺血和/或再灌注損傷的藥劑聯(lián)合用于根據(jù)本發(fā)明治療方法中的肽、其衍生物或其偶聯(lián)物。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療方法還包括向所述人或動物體施用環(huán)孢霉素A和/或BH4肽的步驟。事實上，環(huán)孢霉素A證明抑制線粒體PTP開放，和減少AMI患者和動物模型中的梗死面積(Gomez等，Cardiovasc Res.2009；83(2)：226-33；Piot等，N Engl J Med.2008；359(5)：473-81；Mewton al，J Am Coll Cardiol.2010 Mar 23；55(12)：1200-5)。來自抗凋亡Bcl-xl蛋白的BH4已報道作為Tat蛋白質的偶聯(lián)物在再灌注時施用時，有效減少在缺血-再灌注期間的細胞凋亡(Ono等，Eur J Cardiothorac Surg.2005，27(1)：117-121；Donnini等，細胞Cycle 2009；8(8)：1271-1278；Boisguerin等，J.Control Release，2011，doi：10.1016/jjconrel.2011.07.037)。

在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中，可使用許多合適途徑中的任何一種施用所有化合物(肽、衍生物、偶聯(lián)物、組合產品)，包括但不限于靜脈內、腸胃外、動脈內、肌內、口服和經(jīng)鼻。本發(fā)明的肽、其衍生物或其偶聯(lián)物以所施用量對于預期目標有效的劑量施用。施用途徑、制劑(見下文)和施用劑量將取決于所需的治療效果、待治療病癥(如果已經(jīng)存在)的嚴重性、任何感染的存在、患者的年齡、性別、體重和總體健康狀況以及取決于所用肽、衍生物或偶聯(lián)物的效力、生物利用度和體內半衰期、伴隨治療的使用(或不使用)以及其它臨床因素。這些因素可在治療過程中由主治醫(yī)師容易地確定。

根據(jù)本發(fā)明的治療可由單劑量或多劑量組成。因此，肽、其衍生物或偶聯(lián)物的施用可以對于某些時期段是恒定的、或者是周期性和按照特定時間間隔(例如，每小時、每天、每周(或某些其它多天間隔)等)。或者，施用對于某些時期可以是連續(xù)遞送的，例如，靜脈內遞送。

藥物組合物

如上所述，本發(fā)明的肽、其衍生物或其偶聯(lián)物可以本身施用或作為藥物組合物施用。因此，本發(fā)明提供包含有效量的至少一種本發(fā)明的抗凋亡肽(或其衍生物或其偶聯(lián)物)和至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在某些實施方案中，該組合物進一步包含至少一種另外的生物活性劑。在某些實施方案中，藥物組合物包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡DAXX-肽和至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗凋亡FADD-肽。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以對于實現(xiàn)所需預防和/或治療效果有效的任意量和使用任何施用途徑來施用。最佳藥物制劑可根據(jù)施用途徑和所需劑量而變化。這種制劑可影響所施用的活性成分的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內釋放速率和體內清除速率。

本發(fā)明的藥物組合物可以配制為單位劑型以方便施用和實現(xiàn)劑量的均勻性。如本文所用，表述“單位劑型”是指至少一種本發(fā)明的肽(或至少一種其衍生物或其偶聯(lián)物)和至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑的物理上分離的單元。然而，應理解組合物的每日總劑量將由主治醫(yī)師在合理醫(yī)療判斷的范圍內決定。

制劑?？筛鶕?jù)已知技術、使用適合的分散或潤濕劑和懸浮劑配制可注射制劑，例如，無菌注射水性或油性懸浮液。無菌注射制劑也可為于非毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液、懸浮液或乳液，例如，作為2，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的溶媒和溶劑為水、林格氏液(Ringer’s solution)、U.S.P.和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油常規(guī)地用作溶液或懸浮介質。為此目的，可使用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成單-或二-甘油酯。脂肪酸例如油酸也可用于可注射制劑的制備中。無菌的液體載體可用于腸胃外施用的無菌液體形式組合物中。

可注射制劑可進行滅菌處理的，例如，通過經(jīng)細菌截留過濾器的過濾或通過引入可在使用前溶解于或分散于無菌水或其它無菌注射介質中的無菌固體組合物形式的殺菌劑。作為無菌溶液或懸浮液的液體藥物組合物可通過，例如，靜脈內、肌內、腹膜內或皮下注射施用。注射可經(jīng)由單次推注或通過逐步輸注進行。當必需或希望時，組合物可包含局部麻醉劑以減輕注射部位的疼痛。

為了延長活性成分的效果，通常希望延緩成分自皮下或肌內注射的吸收。腸胃外施用的活性成分的延遲吸收可通過將成分溶解或懸浮于油溶媒中實現(xiàn)?？勺⑸涞膬煨问酵ㄟ^在可生物降解的聚合物例如聚乳酸-聚乙交酯中形成活性成分的微包被基質來制備。取決于活性成分與聚合物的比例和所用具體聚合物的性質，可控制成分的釋放速率。其它可生物降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲庫型注射制劑也可通過將活性成分封閉于與身體組織相容的脂質體或微乳液中來制備。

用于口服施用的液體劑型包括，但不限于，藥學上可接受乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿、酏劑和加壓組合物。除了活性成分，液體劑型可含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如，水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特別地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑，口服組合物也可包括佐劑例如潤濕劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、增稠劑、色素、粘度調節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透壓調節(jié)劑(osmo-regulator)。用于口服施用的適合的液體載體的實例包括水(可能含有如上添加劑，例如，纖維素衍生物，例如羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括單元醇和多元醇例如二醇類)和它們的衍生物，和油(例如，分餾椰子油和花生油)。對于加壓組合物，液體載體可為鹵代烴或其它藥學上可接受的推進劑。

用于口服施用的固體劑型包括，例如，膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒劑。在這種固體劑型中，本發(fā)明的肽(或其衍生物或其偶聯(lián)物)可與至少一種惰性的、生理上可接受的賦形劑或載體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和以下一種或多種組分混合：(a)填充劑或填料例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑例如甘油；(d)崩解劑例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(e)溶液緩凝劑(solution retarding agent)例如石蠟；吸收促進劑例如季銨化合物；(g)潤濕劑，例如，十六烷醇和甘油單硬脂酸酯；(h)吸附劑例如高嶺土和膨潤土；和(i)潤滑劑例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和其混合物。其它適用于固體制劑的賦形劑包括表面改性劑例如非離子和陰離子表面改性劑。表面改性劑的代表性實例包括，但不限于，泊洛沙姆188、苯扎氯銨、硬脂酸鈣、十六十八醇、聚西托醇乳化蠟、山梨聚糖酯、膠體二氧化硅、磷酸鹽、十二烷基硫酸鈉、硅酸鋁鎂和三乙醇胺。在膠囊、片劑和丸劑的情況中，劑型也可包含緩沖劑。

利用這類賦形劑如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等，相似類型的固體組合物也可用作軟質和硬質填充明膠膠囊中的填充劑?？芍苽渚哂邪潞屯鈿だ缒c溶包衣、控釋包衣和其它藥物配制領域所熟知的包衣的片劑、糖錠劑、膠囊、丸劑和顆粒劑的固體劑型。它們可任選地包含遮光劑并也可以是組合物以使得它們僅或優(yōu)選地在腸道的特定部分中、任選地以延遲的方式釋放活性成分?？捎玫陌窠M合物的實例包括聚合物質和蠟。

在某些實施方案中，可能期望在需要治療的區(qū)域(例如，心肌)中局部施用本發(fā)明的抗凋亡肽(或其衍生物或其偶聯(lián)物)。這可以例如但不限于，通過在經(jīng)皮冠狀動脈腔內成形術期間或在冠狀動脈搭橋手術期間的局部輸注來實現(xiàn)。

對于局部施用，藥物組合物優(yōu)選配制成凝膠、藥膏、洗劑、或霜劑，其可包括載體例如水、甘油、醇、丙二醇、脂肪醇、三甘油酯、脂肪酸酯或礦物油。其它局部載體包括液體石油、棕櫚酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、水中的聚氧乙烯單月桂酸酯(5％)或水中的十二烷基硫酸鈉(5％)。需要時可添加其它物質例如抗氧劑、濕潤劑、粘度穩(wěn)定劑和類似試劑。

此外，在某些情況中，預期本發(fā)明組合物可置于放置在皮膚之上、之中或之下的透皮裝置內。這種裝置包括貼片、植入物和注射劑，其通過被動或主動釋放機制釋放活性成分。透皮施用包括跨越身體表面和身體通道內襯(包括上皮和粘膜組織)的全部施用方式。這種施用可使用洗劑、霜劑、泡沫劑、貼片、懸浮液、溶液和栓劑形式的本組合物來實現(xiàn)。

用于生產各種制劑的材料和方法是本領域已知的并可適用于實施本發(fā)明。用于遞送抗體的適合的制劑可見于，例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，E.W.Martin，第18版，1990，Mack Publishing Co.：Easton，PA中。

另外的生物活性劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的肽是本發(fā)明藥物組合物中的唯一活性成分。在其它實施方案中，藥物組合物進一步包含一種或多種生物活性劑。適合的生物活性劑的實例包括，但不限于，抗凋亡劑、抗炎劑、免疫調節(jié)劑、止痛劑、抗微生物劑、抗菌劑、抗生素、抗氧化劑、防腐劑及其組合。

在某些實施方案中，另外的生物活性劑選自環(huán)孢霉素A、BH4及其組合。

在這種藥物組合物中，本發(fā)明的抗凋亡肽(或其衍生物或其偶聯(lián)物)和另外的治療劑可以以一種或多種用于的同時、分別或順次施用不同成分的制劑組合。更具體地，本發(fā)明組合物可以以使得肽(或其衍生物或其偶聯(lián)物)和治療劑可以一起施用或彼此獨立施用的方式配制。例如，肽(或其衍生物或其偶聯(lián)物)和治療劑可以一起配制成單一組合物?；蛘?，它們可單獨地保存(例如，在不同的組合物和/或容器中)和施用。

實施例

以下實施例描述了得到和實施本發(fā)明的一些優(yōu)選的方式。然而，應當理解這些實施例僅用于說明目的，并且不意味著限制本發(fā)明的范圍。

膜結合的反相肽陣列的合成

肽在N-修飾的CAPE-膜上合成(Bhargava等，Mol.Recognit，2002，15：145)并且通過MultiPep SPOT-機器人(INTAVIS Bioanalytical Instruments AG，Cologne，德國)制備。在內置軟件LISA 1.71的幫助下進行陣列設計。使用標準方案以點定義開始合成[Frank，Tetrahedron，1992，48：9217]，隨后是Fmoc-半胱氨酸-(Trt)-Opfp(0.3M)的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液和Fmoc-丙氨酸-Opfp的偶聯(lián)(雙重偶聯(lián)，各15分鐘反應)。用DMF(20％)中的哌啶進行Fmoc切割后，添加溶于二甲基甲酰胺(DMF，0.6M溶液)中并且用EEDQ(1.1當量)活化的4-羥甲基苯氧乙酸(HMPA)，并且將樣品直接點樣在膜上(4x偶聯(lián)，各15分鐘反應)。將該膜用DMF(2％)中的乙酸酐乙?；?，用DMF(5x3分鐘)、乙醇(2x3分鐘)和二乙醚(2x3分鐘)洗滌，并且最終空氣干燥。將用1，1’-碳基二咪唑(CDI，3當量)活化的Fmoc-氨基酸-OH(0.4M)的DMF溶液點樣在膜上(4x偶聯(lián)，各15分鐘反應時間)。將脯氨酸、酪氨酸和谷氨酸用1，1’-碳基二(1，2，4-三唑)(CDT)活化。Fmoc基團從點樣點移除，并且使用標準SPOT合成方案完成肽序列(Frank，Tetrahedron，1992，48：9217)，隨后用β-丙氨酸進行N-末端標記。

對于標準SPOT合成，使用帶有以下側鏈保護的Fmoc-aa-Opfp：E-、D-(OtBu)；C-、S-、T-、Y-(tBu)；K-、W-(Boc)；N-、Q-、H-(Trt)；R-(Pbf)。對于硫醚環(huán)化，所有的肽用在DMF(1M)中的溴乙酸2，4-二硝基苯基酯進行N-?；p重偶聯(lián)，各15分鐘反應時間。

將該膜用DMF(3x3分鐘)和二氯甲烷(DCM，3x3分鐘)洗滌并且干燥。為使得能夠環(huán)化，用在DCM中的三氟乙酸(TFA，7％)、水(2％)(1x5分鐘)和隨后用在DCM中的TFA(7％)、TIBS(3％)、水(2％)切割半胱氨酸的三苯甲基側鏈保護基。用DCM(3x3分鐘)、DMF(2x3分鐘)和DMF(2x3分鐘)洗滌該膜。通過用25％Cs₂CO₃/DMF(1∶1)水溶液處理將肽環(huán)化過夜。用DMF(2x3分鐘)、H₂O(2x3分鐘)、乙醇(2x3分鐘)和二乙醚(2x3分鐘)洗滌該膜并且空氣干燥。

通過在不振搖的情況下用在DCM中的TFA(60％)、TIBS(3％)和水(2％)處理2.5小時的一次處理實現(xiàn)水解和側鏈脫保護，隨后是洗滌步驟(DCM 3x3分鐘，DMF 3x3分鐘，乙醇3x3分鐘，二乙醚2x3分鐘)，隨后在不振搖的情況下用在DCM中的TFA(90％)、TIBS(3％)和水(2％)處理30分鐘。用DCM(3x3分鐘)，DMF(3x3分鐘)、乙醇(2x3分鐘)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，0.1M，2x3分鐘)、水(2x3分鐘)、乙醇(2x3分鐘)和二乙醚(2x3分鐘)洗滌該膜并且空氣干燥。

根據(jù)本發(fā)明的片段的設計和遞送

將DAXX蛋白(SEQ ID NO：1)的初級序列分割成重疊的15聚體肽(3個氨基酸位移)，并且通過上述的SPOT合成在纖維素膜上合成所有肽(243個肽)。肽文庫與Fas受體(Sigma)的His-標記的細胞內區(qū)域一起溫育。使用抗-His(小鼠)/抗-小鼠-HRP的夾心法測定Fas和肽之間的相互作用，并且使用如圖1A所示的LumiImager(羅氏)顯示信號。發(fā)現(xiàn)點No.211(SEQ ID NO：2)顯示最高的信號強度且發(fā)現(xiàn)點No.209、210和212(分別為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7)包括最小表位序列(KSRKEKKQT)。

然而，15聚體序列KSRKEKKQTGSGPLG(點211，SEQ ID NO：2)和SGPPCKKSRKEKKQT(點209，SEQ ID NO：3)的序列長度分析表明不可能將序列任意縮短至圖1中發(fā)現(xiàn)的最小表位。使用如以上所提到的SPOT合成，通過在N-端、C-端和在兩個方向上縮短給定的序列來分析肽長度的影響(圖2A)。顯示最高信號強度的肽序列在圖2B中顯示。

進行了DAXXp-211和DAXXp-209(其對應于16聚體肽(KKSRKEKKQTGSGPLG)，稱為DAXX肽或DAXXp(SEQ ID NO：5))的最高信號強度的合并組合。發(fā)現(xiàn)DAXXp具有重要的體外和體內抗凋亡活性。

按照以下事實有可在C-端延長肽：顯性陰性蛋白(DAXX-DN)[Roubille等，Circulation，2007；116：2709-2717]包括由DAXXp-211肽延伸直至DAXX蛋白的C-端的區(qū)域(圖1B)。

在AMI中的應用

測試了與CPP偶聯(lián)或未偶聯(lián)的DAXXp肽在原代心肌細胞中的抗凋亡活性和它們在全身施用后在小鼠手術I/R模型中降低梗死面積的能力。

體外評價

在第一步中，表1中列出的肽的細胞攝取使用流式細胞術測量(FACS-具有CF標記的肽)在小鼠心肌細胞的原代細胞培養(yǎng)中測量，并且驗證了不存在任何細胞毒性。

表1：在本研究中使用的CPP和CPP-DAXXp偶聯(lián)物

X＝氨基-己酸；B＝β-丙氨酸，r＝D-精氨酸；對于FASC測量，肽用(5，6)-羧基熒光素(CF)進行N-端標記；所有的肽進行C-端酰胺化。scr＝DAXXp的錯義形式；mDAXXp為人DAXXp的小鼠同源物。

已經(jīng)研究的其它CPP-DAXXp衍生物顯示于下表2中。

表2：研究的其它CPP-DAXXp衍生物。

此外，使用表面等離子體共振(SPR)技術(Biacore Life Science，Sweden)通過測量結合親合力(Kd)交叉驗證片段與Fas受體的細胞內區(qū)域的潛在相互作用。單獨和與CPP結合的片段的結合親合力在表3中總結。

表3：使用的結構體的結合親合力(Kd，μM)的測量

所有的實驗在Biacore儀器上進行。對于各種條件，將三個獨立實驗的平均值和相應的標準差作圖。

其后，評價了這些肽抑制由十字孢堿誘導的細胞凋亡的能力。使用測量DNA片段化的細胞死亡檢測ELISA^PLUS試劑盒(羅氏)測定細胞凋亡。

在大多數(shù)公開出版物中，現(xiàn)有技術中目前可獲得的抗凋亡肽在細胞凋亡誘導之前3-4小時施用，其與臨床應用的相關性較差。出于這一原因，在本研究中使用的方案包括將肽和十字孢堿一起施用。圖5B分別清楚地顯示了使用Tat-DAXXp在原代心肌細胞中DNA片段化降低了44％和使用Pip2b-DAXXp在原代心肌細胞中DNA片段化降低了55％。這在單獨CPP或在Tat-scrDAXXp或Tat-ncDAXXp的陰性對照中沒有觀察到。富集因子如供應商所建議的計算(處理細胞的DNA片段化/未處理細胞的片段化)。為了更好地比較結果，將DNA片段化(通過富集因子描述)與十字孢堿處理的細胞(＝100％)相關聯(lián)。

還在鼠NG118-15(神經(jīng)元細胞的模型)(圖5D)中、在鼠C2C12(肌肉細胞的模型)(圖5A)中和在大鼠H9c2(心肌細胞的模型)(圖5C)中分析了肽的抗凋亡作用。使用Bpep-DAXXp在NG118-15中觀察到DNA片段化的最高的降低(降低66％)，使用Tat-DAXXp在C2C12中觀察到DNA片段化的最高降低(降低24％)和使用Pip2b-DAXXp在H9c2中觀察到DNA片段化的最高降低(降低31％)。這清楚地表明最佳CPP選擇對于適當?shù)膽没蛏锉尘暗闹匾浴?/p>

此外，如上對于DAXX表位所述(詳見上文)確定了FADD蛋白(SEQ ID NO：8)的結合表位。如圖8A所示，對應于肽FADDp15(VGKRKLERVQSGLDL；SEQ ID NO：9)的點no.11具有較高的信號強度且點no.10和12(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)與FADDp15共有最小表位序列。

表4：來自與Tat CPP偶聯(lián)的FADD蛋白的序列

利用分割該長度的肽文庫，確定對應于FADDp(SEQ ID NO：12；KRKLERVQS)的FADDp15的最小片段(參見圖8B)。在心肌細胞中，使用Tat-FADDp的偶聯(lián)物，細胞凋亡的降低為35％，使用Tat-FADDp-15細胞凋亡的降低為57％(圖9)。

體內評價

在第二步中，在心肌缺血-再灌注的體內模型中評價DAXXp的心臟保護作用。急性心肌缺血和再灌注在經(jīng)歷可逆性冠狀動脈阻塞的手術模型的C57B16小鼠中進行。麻醉雄性小鼠(22-28g)并且使用哈佛嚙齒動物呼吸器通過氣管插管通氣。通過熱調節(jié)的手術臺將體溫保持在36.8℃至37.0℃。通過左側開胸術打開胸腔并且將可逆冠狀動脈網(wǎng)羅阻塞器(snare occluder)圍繞左冠狀動脈設置。將小鼠隨機分配到兩個不同的心肌缺血-再灌注的手術方案中(圖11)。再灌注結束時，將動脈再阻塞并且將酞菁藍染料注入左心室腔中并且允許灌注心肌的非缺血部分。為了測定DAXXp對心肌梗死面積的影響，在缺血-再灌注的手術方案期間在再灌注之前5分鐘靜脈內(尾靜脈)施用肽。對照組用Tat或Pip2b肽(對于單獨CPP)處理。選擇1mg/kg的劑量(μ摩爾范圍)并測試了對于0.1和10mg/kg的劑量響應。

再灌注結束時，將小鼠再次麻醉，確定地收緊冠狀動脈綁扎，注射藍色染料并且將收獲的左心室用于梗死面積(TTC方法，Schwartz等，J Thromb.Thromb.，2000；10：181-187)或DNA片段化測量(細胞死亡檢測ELISA^PLUS試劑盒，Roche Diagnostics)以研究對抗缺血-再灌注損傷的心臟保護作用。獲得的結果在圖12-15中顯示。

當將Tat-DAXXp(1mg/kg)體內靜脈注射時，在14、時再灌注后測量的梗死面積相對于單獨Tat肽降低了53.4％(p＜0.01)(在各組間處于危險中的面積是相當?shù)?；p＝ns-圖12A)。相對于注射Tat的小鼠，在注射Tat-DAXXp的小鼠左心室中這種心臟保護與特定DNA片段化(細胞凋亡的標志)的急劇降低相關(參見圖12B)。這種心臟保護在Pip2b-DAXXp或單獨CPP或在陰性對照Tat-scrDAXXp中未觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖13顯示了當以0.1、1和10mg/kg注射時對于Tat-DAXXp的劑量響應，并且表明對于1mg/kg的劑量獲得了最大的效應。單獨注射的DAXXp(10mg/kg)(沒有CPP)能夠通過減少梗死面積和DNA片段化保護心肌，達到與Tat-DAXXp相同的程度。

當再灌注持續(xù)時間從1小時延長到24小時時，Tat-DAXXp的心臟保護作用得到維持(參見圖14和15)。

共焦成像顯示CF-Tat-DAXXp(1mg/kg)被定位于左心室中心肌細胞的細胞溶質和細胞核中(圖16)。

在腎移植模型(大鼠)中進行的體內評價所獲得的初步結果表明Tat-DAXXp(1mg/kg)能夠對抗其它臨床應用中的缺血-再灌注損傷。

在整個本申請中，各種參考文獻描述了本發(fā)明所屬的技術領域的狀況。這些參考文獻的公開內容在此通過引用并入到本發(fā)明的公開內容中。