亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

RHAMM結合肽的制作方法

文檔序號:11931394閱讀:318來源:國知局
RHAMM結合肽的制作方法與工藝

技術領域

本發(fā)明涉及新肽,以及它們在用于鑒定表達RHAMM的細胞的組合物和方法中的用途,以及它們在治療RHAMM/配體復合物形成所致的病癥或病況的組合物和方法中的用途。



背景技術:

在本申請的全文中,多種參考文獻在方括號中引用,以更充分地描述本發(fā)明所述領域的現有技術水平。

乙酰透明質酸(HA,葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺的重復單元的陰離子型聚合物)是基質的一種胞外基質(ECM)組分,其與癌癥的進展相關:在癌癥患者中腫瘤HA積累增加預示著后果不良[1, 2, 3]。HA在體外刺激癌細胞運動性,表明其在體內在癌細胞侵襲中的重要性。已牽涉癌癥進展的2種HA細胞受體是CD44和RHAMM (HA-介導的運動性的受體)。

目前公認祖細胞或“腫瘤起始細胞”不成比例地促進白血病的腫瘤形成潛力。新近已描述了在乳癌(BC)和其它實體瘤中的一種類似現象,并且這些腫瘤細胞亞類的表型已被部分地表征為CD44+/CD24-/ESA+。盡管這些細胞亞類與臨床后果間準確的關系尚有爭論,但是經FAGS從原代BC中分選出的CD44+細胞表達預測不良臨床后果的基因標簽。RHAMM mRNA和蛋白過量表達也發(fā)生在原代人乳瘤細胞亞類中并且這些RHAMM陽性亞類在BC中的存在預示著不良臨床后果和外周轉移的風險增加。盡管CD44在許多正常組織中都表達,但在這些組織中未檢出RHAMM的表達,而是出現在創(chuàng)傷修復之后和病理過程例如癌癥進展期間。因此CD44-陽性和RHAMM-陽性腫瘤細胞亞類的成像在鑒定處于不良后果的風險之中的患者方面是相關的。然而,直到本文件寫成之日,還未對這些和/或其它腫瘤祖細胞直接成像。因此,可有利的是,找到能夠靶向RHAMM的分子成像探針,以提供對祖細胞狀態(tài)進行非侵襲性成像的方法。這種靶向方法也可提供用治療藥劑選擇性靶向祖細胞的方法,或直接通過配體-受體相互作用,或間接通過將治療性有效載荷(payload)遞送給靶細胞。例如,可以將發(fā)射粒子的同位素遞送到祖細胞,或可將化療藥遞送到細胞(例如順鉑)。本發(fā)明提供用于靶向RHAMM的新肽配體,這是以前未報道過的。



技術實現要素:

本發(fā)明涉及能結合RHAMM的新肽的發(fā)現。

因此在一個實施方案中,本發(fā)明提供分離的肽,其包含選自至少以下氨基酸序列的至少一種氨基酸序列:SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17。

另一方面,本發(fā)明提供分離的DNA,所述DNA包含編碼SEQ ID No. 1至SEQ ID NO: 17的肽的核酸序列(nucleic sequence)。

本發(fā)明還涉及以一定的特異性和親和力與RHAMM結合的肽的發(fā)現,其中所述肽源自微管蛋白。一方面,本發(fā)明的RHAMM-結合肽源自微管蛋白的羧基端尾。

依照一個實施方案,本發(fā)明提供RHAMM-結合肽,其中所述RHAMM-結合肽包含選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17的至少一種氨基酸序列。

依照另一實施方案,本發(fā)明提供RHAMM-結合肽,其特征在于所述RHAMM-結合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列,其中X選自丙氨酸或甘氨酸,Z選自酪氨酸或谷氨酸。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供藥物組合物,其特征在于所述藥物組合物包含有效量的一種或多種本發(fā)明RHAMM-結合肽和藥學上可接受的載體。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供探針,其包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供對受試者組織或器官中的RHAMM表達進行成像的方法,其特征在于所述方法包括:(a) 給予包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針;和(b) 應用成像技術以在受試者組織或器官中檢測所述標記。

在另一實施方案中,提供測定細胞中RHAMM的存在情況的方法,其特征在于所述方法包括使細胞與包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針接觸,和應用成像技術以在細胞中檢測所述標記,其中細胞中所述標記的檢出表示細胞中RHAMM的存在。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供對受試者的腫瘤祖細胞進行成像的方法,其特征在于所述方法包括將包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針給予所述受試者并將成像技術用于在受試者中檢測所述標記,其中受試者中所述標記的檢出表示受試者中腫瘤祖細胞的存在。

在另一個實施方案中,本發(fā)明是對動物細胞、組織或器官中的腫瘤祖細胞進行成像的方法,其特征在于所述方法包括使所述細胞、組織或器官與包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針接觸,和應用成像技術以在細胞、組織或器官中檢測所述標記,其中細胞、組織或器官中所述標記的檢出表示細胞、組織或器官中腫瘤祖細胞的存在。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供確定癌癥患者的預后的方法,其特征在于所述方法包括:(a) 從所述患者獲取腫瘤組織樣品;(b) 使所述樣品與包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針接觸;(c) 應用成像技術以在所述樣品中檢測所述標記;和(d) 確定所述患者的預后,其中所述預后預測患者的癌癥侵占性(aggressiveness)或轉移的可能性,和其中所述樣品中RHAMM表達的檢出表示不良預后。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供確定用于癌癥患者的療程的方法,其特征在于所述方法包括:(a) 從所述患者獲取腫瘤組織樣品;(b) 使所述樣品與包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針接觸;(c) 應用成像技術以在所述樣品中檢測所述標記;和(d) 確定所述患者的預后,其中所述預后預測患者的癌癥侵占性的可能性,和其中所述樣品中RHAMM表達的檢出表示不良預后;并根據所述預后而確定用于所述患者的療程。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供用于診斷與RHAMM在細胞中表達相關的病癥或病況的患者的方法,其特征在于所述方法包括:(a) 從所述患者獲取組織樣品;(b) 使所述樣品與包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和能通過檢測技術而檢測的可檢測標記的探針接觸;和(c) 應用成像技術以在所述樣品中檢測所述標記;其中所述樣品RHAMM表達的檢出表示所述病癥或病況的陽性診斷。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供用于治療患有與RHAMM在細胞中表達相關的病癥或病況的受試者的方法,其特征在于所述方法包括給予所述受試者有效量的組合物,所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子和藥學上可接受的載體,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列,其中X選自丙氨酸或甘氨酸,Z選自酪氨酸或谷氨酸。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供用于治療患有與RHAMM在細胞中表達相關的病癥或病況的受試者的方法,其特征在于所述方法包括給予所述受試者有效量的組合物,所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子以及藥學上可接受的載體,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽選自SEQ ID NOs. 1-17。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供抑制表達RHAMM的細胞增殖的方法,其特征在于所述方法包括使所述細胞與有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子接觸,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列,其中X選自丙氨酸或甘氨酸,Z選自酪氨酸或谷氨酸。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供抑制表達RHAMM的細胞增殖的方法,其特征在于所述方法包括使細胞與有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子接觸,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽選自SEQ ID NOs: 1-17。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供抑制表達RHAMM的細胞運動性的方法,其特征在于所述方法包括使所述細胞與有效量(effective)的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子接觸,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列,其中X選自丙氨酸或甘氨酸,Z選自酪氨酸或谷氨酸。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供抑制表達RHAMM的細胞運動性的方法,其特征在于所述方法包括使所述細胞與有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子接觸,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽選自SEQ ID NOs: 1-17。

在本發(fā)明的多個方面,所述表達RHAMM的細胞是癌細胞。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供在癌癥患者中預防轉移的方法,其特征在于所述方法包括給予所述患者有效量的包含一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子的組合物,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列,其中X選自丙氨酸或甘氨酸,Z選自酪氨酸或谷氨酸。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供在癌癥患者中預防轉移的方法,其特征在于所述方法包括給予所述患者有效量的包含一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子的組合物,其中所述一種或多種RHAMM-結合肽選自SEQ ID NOs: 1-17。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供RHAMM-結合肽在治療、改善或預防RHAMM表達相關病癥或病況中的用途,其特征在于所述RHAMM-結合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列,其中X選自丙氨酸或甘氨酸,Z選自酪氨酸或谷氨酸。

在另一實施方案中,本發(fā)明提供RHAMM-結合肽或編碼所述RHAMM-結合肽的核酸在治療、改善或預防RHAMM表達相關病癥或病況中的用途,其特征在于所述RHAMM-結合肽選自SEQ ID NOs: 1-17。

在本發(fā)明的多個方面,所述RHAMM表達相關病癥或病況是組織瘢痕形成。在本發(fā)明的多個方面,所述RHAMM表達相關病癥或病況是癌癥。

在本發(fā)明的多個方面,本發(fā)明的肽可在肽的一端或兩端添加半胱氨酸,從而通過二硫鍵形成、磷基團和乙?;姆绞蕉h(huán)化。

在本發(fā)明范圍之內的還有本發(fā)明的任何肽的功能類似物以及本發(fā)明肽的多聚體例如本發(fā)明肽的二聚體或三聚體。本發(fā)明的多聚體可以是由多個相同的肽組成的同型多聚體或由不同的肽組成的異型多聚體。本發(fā)明肽的特征性氨基酸序列可側接隨機氨基酸序列。優(yōu)選的是對肽具有穩(wěn)定作用、因而增加其生物利用度的側翼序列。側翼序列也可用于改進藥物動力學行為。在本發(fā)明范圍之內的還有融合肽和peg化(pegylated)肽,其可改進代謝穩(wěn)定性,增加生物利用度,降低對蛋白水解的敏感性。

在本發(fā)明范圍之內的還有這樣的肽:其特征為至少一個氨基酸被具有類似化學性質的另一氨基酸取代;至少一個氨基酸被非天然氨基酸取代,所述非天然氨基酸例如N-甲基化氨基酸、D-氨基酸或其它非天然氨基酸構建體;在N-端或/和C-端存在至少一個額外氨基酸;至少一個氨基酸缺失;和至少一個氨基酸被化學修飾。

附圖說明

根據本文給出的詳細描述和附圖,將會更充分理解本發(fā)明,所述描述和附圖都是以說明性方式給出而并非限制本發(fā)明預期范圍。

圖1A顯示72 kDa RHAMM蛋白的圖,所述蛋白含有RHAMM/乙酰透明質酸(HA)相互作用所必需的HA-結合結構域(氨基酸殘基718-750, SEQ ID NO: 19)。

圖1B說明分子成像探針的設計和優(yōu)化的流程圖。

圖2A顯示以下的通用結構:(a)未經修飾的微管蛋白-衍生的肽,(b)與N-乙酰半胱氨酸綴合的微管蛋白-衍生的肽,和(C)與異硫氰酸熒光素綴合的微管蛋白-衍生的肽。

圖2B是17種合成的微管蛋白-衍生的肽的表,包括用熒光素或N-乙酰半胱氨酸衍生的肽、微管蛋白片段種類、計算的和實測的質譜m/z值(m表示分子量或原子量,z表示離子攜帶的元電荷數量)、%純度和結合常數Kd。圖2B按照出現的順序分別公開了SEQ ID NOs: 1、24-25、2-3、26-27、4-9、28-29、10-11、30-31、12、32-33、13-14、34-35和15-17。

圖3A是一個表,說明RHAMM-CT固定在表面等離振子共振(SPR)傳感器板的pH依賴性。根據6次測量的平均SPR反應測定配體密度。對于RHAMM pI = 10.1,用碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.7)作為對照運行。用EDAC (100 mM)和磺基-NHS (25 mM)將蛋白質偶聯到傳感器板。

圖3B說明針對RHAMM,對純化的微管蛋白-衍生的肽(SEQ ID NOs: 1-17)的基于表面等離振子共振(SPR)的篩選,以測定高親和力配體。篩選得到6種對RHAMM具有高親和力的配體(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)。

圖3C是證實經SPR篩選后的6種肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)的親和力的ELISA結合測定,說明熒光素-標記的本發(fā)明肽與RHAMM的結合。從每次測量中減去陰性對照(未固定的RHAMM)。

圖4A說明7組傳感圖,顯示每組特定肽-RHAMM相互作用的總體擬合,并有陰性對照和參比傳感圖。抗RHAMM mAb用作陽性對照。每組傳感圖都對應3個RHAMM濃度(1000 nM、750 nM和500 nM)與固定化肽的相互作用的反應。

圖4B是一個表,說明所選微管蛋白-衍生的肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)和RHAMM單克隆抗體(mAb)的動力學概況。該表顯示計算的締合速率(KON)、解離速率(KOFF)和結合常數(KD)。誤差是平均KD的標準差。

圖5A是一幅圖,顯示6種所選熒光素-標記的本發(fā)明RHAMM-結合肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (分別對應于SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)被HA (0、1.25、2.5、5和10 μg/mL)競爭性置換(competitive displacement)到固定化RHAMM-CT。數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值。

圖5B是一幅圖,顯示染料-標記的HA被6種所選非標記的本發(fā)明RHAMM-結合肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)競爭性置換到固定化RHAMM-CT。數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值。

圖5C是一幅圖,顯示6種熒光素-綴合的本發(fā)明RHAMM-結合肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (分別對應于SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)和純化的CD44或RHAMM-CT的ELISA結合測定。數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值。

圖6A是顯微照片,說明在乳瘤細胞(MDA-MB-231)中使用熒光成像,對熒光素-綴合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)攝取的顯現(visualization)。DAPI通道表示核,而FITC通道說明熒光素-標記的肽的定位。

圖6B是一幅圖,說明在乳瘤細胞(MDA-MB-231)中熒光素-綴合的SEQ ID NOs: 1、9和14 (SEQ ID NOs: 25、29、35)攝取的定量測定。每一柱形代表來自3個實驗的每一個的1048次測量的平均值。與接受抗RHAMM治療的組相比,所有治療組顯著更高(p< 0.001)。用ANOVA分析數據,誤差是平均值的標準差。

圖7是顯微照片,說明在乳瘤細胞(MDA-MB-231)中使用熒光成像,FITC-綴合的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NOs: 25和29)攝取的顯現。DAPI通道表示核,而FITC通道說明熒光素-標記的肽的定位。

圖8A是RHAMM的HA-結合結構域的氨基酸序列(aa 716-750;SEQ ID NO: 19)。HA結合所需的堿性氨基酸殘基用下劃線標出。

圖8B是4種RHAMM-結合肽(SEQ ID NOs: 1、3、9和11)的氨基酸序列比對。相同序列用灰色突出顯示,而半保守殘基用白色框標出。可與RHAMM上的堿性氨基酸殘基通過離子鍵合相互作用的酸性氨基酸殘基用下劃線標出。

圖9說明SEQ ID NOs: 1、3、9、10、12和14的血清穩(wěn)定性研究。圖顯示%完整肽(經RP-HPLC檢測),以30分鐘的增量,共11小時。數據擬合到一級衰減曲線。

圖10A是一幅圖,說明丙氨酸-取代的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)與RHAMM (分別為SEQ ID NOs: 1和36-47,從左欄到右欄)的親和力。星號表示觀測到的熒光顯著降低(p<0.01),因為對RHAMM-結合而言重要的殘基的丙氨酸取代(從每次測量中減去未固定的RHAMM并且所有數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值)。

圖10B說明12種丙氨酸-取代的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)被HA競爭性置換到固定化RHAMM (分別為SEQ ID NOs: 1和36-47,從左到右)。陰性對照(從每次測量中減去未固定的RHAMM并且所有數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值)。

圖11是一幅圖,說明在不同濃度(1 μm和10 μm)的RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 1存在下,人上皮卵巢癌(EOC)細胞的增殖測定。在該測定中,在第一天處理細胞,然后增殖6天。

圖12是一幅圖,說明本發(fā)明的Rhamm-結合肽SEQ ID NO: 3降低了腹水-來源的人EOC細胞的活力(p<005)。

圖13是顯微照片,說明使用熒光顯微術,卵巢瘤細胞對熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)的攝取。DAPI通道表示核,而FITC通道說明熒光素-標記的肽的定位。

圖14 A顯示(a) 使用熒光顯微術,PC3mLN4人前列腺癌細胞對本發(fā)明熒光素-綴合的SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 29)的攝取,(b) 對熒光素-SEQ ID NO: 9的攝取未被特異性抗CD44 mAb封閉,然而,(c) 對熒光素-綴合的SEQ ID NO: 9的攝取卻被特異性抗RKAMM mAb封閉。

圖14 B顯示PC3mLN4人前列腺癌細胞對本發(fā)明SEQ ID NO: 9攝取的定量測定。數據顯示接受無抗體治療的細胞(a)和用抗CD44封閉的細胞(b)間無統(tǒng)計學差異。在用抗RHAMM抗體治療的細胞中對探針的攝取極大地下降(c)。

圖15 A說明Ga-DOTA-綴合的SEQ ID NO: 1肽的合成。

圖15 B是純化的Ga-DOTA-綴合的SEQ ID NO: 1肽在9.73分鐘的RP-HPLC色譜圖。

圖15C是純化的Ga-DOTA-綴合的SEQ ID NO: 1肽的ESI質譜。

圖16A說明Re(CO)3+ -配位的SEQ ID NO: 1肽的合成。

圖16B是純化的Re(CO)3+ -配位的SEQ ID NO: 1肽在11.06分鐘的RP-HPLC色譜圖。

圖16C是純化的Re(CO)3+ -配位的SEQ ID NO: 1肽的ESI質譜。

圖17A說明丙氨酸-取代的熒光素-綴合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO;35)肽與RHAMM (分別為SEQ ID NOs: 48-55,14和56-58,從左欄到右欄)的親和力。星號表示觀測到的熒光顯著降低(p<0.01),這是由于對RHAMM-結合而言重要的殘基的丙氨酸取代(從每次測量中減去未固定的RHAMM并且所有數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值)所致。

圖17B說明11種丙氨酸-取代的熒光素-綴合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)肽被HA競爭性置換到固定化RHAMM (分別為SEQ ID NOs: 48-55、14和56-58,從左到右)。陰性對照(從每次測量中減去未固定的RHAMM并且所有數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值)。

具體實施方式

定義

氨基酸殘基的以下標準單字母和三字母縮寫可用于本說明書全文:A, Ala--丙氨酸;R, Arg-精氨酸;N, Asn--天冬酰胺;D, Asp--天冬氨酸;C, Cys--半胱氨酸;Q, Gln--谷氨酰胺;E, Glu--谷氨酸;G, Gly--甘氨酸;H, His--組氨酸;I, lIe--異亮氨酸;L, Leu--亮氨酸;K, Lys--賴氨酸;M, Met--甲硫氨酸;F, Phe-苯丙氨酸;P, Pro--脯氨酸;S, Ser--絲氨酸;T, Thr--蘇氨酸;W, Trp色氨酸;Y, Tyr--酪氨酸;和V, Val-纈氨酸。

“類似物”包括具有與本發(fā)明RHAMM-結合肽序列基本相同的氨基酸殘基序列的任何肽,其中一個或多個殘基已被功能類似的殘基保守取代和其表現出模擬HA結合肽的能力。

“衍生物”是指一個或多個殘基通過功能性側基反應而化學衍生的肽。這樣的衍生分子可包括例如這樣的分子:其中游離氨基被衍生而形成胺的鹽酸鹽、對甲苯磺?;?、芐氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲?;?。游離羧基可被衍生而形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼。游離羥基可被衍生而形成O-?;騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生而形成N-im-芐基組氨酸。衍生物還包括含有20種標準氨基酸的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如: 4-羥脯氨酸可取代脯氨酸;5-羥賴氨酸可取代賴氨酸;3-甲基組氨酸可取代組氨酸;同型絲氨酸可取代絲氨酸;和鳥氨酸可取代賴氨酸。

術語“片段”是指所具有的氨基酸殘基序列比其氨基酸殘基序列已在本文顯示的肽更短的任何主題肽。

術語“分離的肽”或“分離的DNA”視情況而定可定義為肽或DNA分子,其可與可天然伴隨肽和DNA分子的其它細胞組分基本分離。該術語包括但不限于重組或克隆的DNA分離物和經化學合成的類似物或經異源系統(tǒng)生物合成的類似物。

本文所用的術語“肽”定義為通常具有確定序列的氨基酸殘基鏈。本文所用的術語“肽(peptide)”與術語“肽(peptides)”和“蛋白”互相包含。

在本文件中“RHAMM”是指透明質酸介導的運動性的受體,也稱為CD168。RHAMM為非整合細胞表面(CD168)和胞內乙酰透明質酸結合蛋白,其在體外促進細胞運動性并且其表達在侵占性腫瘤中被強烈上調(WO 2008/140587]。

本文所用的術語“RHAMM-結合肽”是指能結合RHAMM的肽。

“受試者”或“患者”是指需要治療病況、病癥或疾病的動物,包括人。

概述

本發(fā)明涉及可能夠結合RHAMM的肽和編碼所述肽的核酸序列。本發(fā)明還涉及在可能與RHAMM在細胞中表達相關的疾病、病況或病癥的治療中使用所述RHAMM-結合肽和編碼所述RHAMM-結合肽的核酸序列的方法。本發(fā)明的RHAMM-結合肽可用于探針,所述探針可能夠鑒定表達RHAMM的細胞。本發(fā)明還涉及使用RHAMM-結合肽來鑒定可能包含表達RHAMM的細胞的樣品的方法。

本發(fā)明的優(yōu)勢包括:(a) 已經發(fā)現與RHAMM特異性結合的新的小肽;(b) 按照本發(fā)明人的了解,腫瘤祖細胞尚不能直接成像。所述新肽可用作分子成像探針,用于對祖細胞狀態(tài)進行無侵襲性成像;(c)可利用所述新肽特異性結合RHAMM的能力,從而用治療藥劑選擇性靶向祖細胞,或者直接通過配體-受體相互作用,或間接通過將治療性有效載荷遞送給靶細胞;(d) 本發(fā)明肽與RHAMM的結合增加了表位暴露和抗RHAMM Mab的結合,其可允許增強成像以及治療性靶向RHAMM陽性細胞。

根據以下詳述,本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。然而,應當理解,表示本發(fā)明實施方案的詳述和具體實施例僅通過說明的方式給出,因為根據所述詳述,在本發(fā)明精神和范圍內的各種改變和修飾對于本領域技術人員來說都將是顯而易見的。

結合肽

本發(fā)明人已經分離、測序和表征了大約6-14個氨基酸殘基的新肽。因此,在一個實施方案中,本發(fā)明提供編碼肽的分離的DNA,所述肽具有選自SEQ ID NO: 1至17的氨基酸序列。在另一個實施方案中,本發(fā)明提供包含選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的分離的肽。

本發(fā)明的新肽可能夠結合RHAMM。在本發(fā)明的多個方面,本發(fā)明的新RHAMM-結合肽可能夠特異性結合RHAMM。在本發(fā)明的多個方面,本發(fā)明的新的RHAMM-結合肽可能夠以顯著高親和力結合RHAMM。在本發(fā)明的多個方面,本發(fā)明的新的RHAMM-結合肽可能夠以顯著高親和力特異性結合RHAMM。

在一個實施方案中,本發(fā)明的新的RHAMM-結合肽可包含下式(1)的序列:

(1) EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)

其中X選自A或G,Z選自Y或E。

在另一個實施方案中,本發(fā)明的新的RHAMM-結合肽可包含選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17的序列。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供RHAMM-結合肽,其中所述肽選自SEQ ID NOs: 1、3、9、10、11、12和14。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供RHAMM-結合肽,其中所述肽選自SEQ ID NOs: 1、9和14。

在一個實施方案中,本發(fā)明的肽可源自微管蛋白的羧基端尾(CTT)區(qū)。在另一個實施方案中,RHAMM-結合肽可源自與微管蛋白的CTT區(qū)緊鄰的序列。意想不到的是,本發(fā)明人發(fā)現RHAMM與維持有絲分裂紡錘體所必需的蛋白質共享結構和功能相似性。此外,本發(fā)明人發(fā)現RHAMM的HA結合結構域可顯示與許多驅動蛋白和微管相關蛋白(MAP)的微管蛋白結合結構域的序列同源性。微管蛋白的CTT區(qū)已經證明與常規(guī)驅動蛋白和MAP相互作用。

舉例而言,當與染料-綴合的本發(fā)明肽一起孵育時,已知表達RHAMM的人乳癌細胞系MDA-MB-231顯示出胞內熒光,如圖6A和圖7所示。用抗RHAMM封閉的細胞的胞內熒光減少大約65%至大約85%,如圖6B所示。當與本發(fā)明的RHAMM肽一起孵育時,其它表達RHAMM的癌細胞例如PC3mLN4和患者來源的卵巢瘤細胞也顯示胞內熒光,如圖13和圖14所示。

本發(fā)明人還發(fā)現本發(fā)明的RHAMM-結合肽與RHAMM結合可增加表位暴露和抗RHAMM單克隆抗體(mAb)結合。本發(fā)明RHAMM結合肽的這種增加向抗RHAMM mab的表位暴露的能力,可在治療上使用并用于增強成像。因此,本發(fā)明的肽可用于例如“活化”現存的RHAMM,例如在腫瘤(但不限于該病)中。因此,可給予治療的或成像(例如Fab片段)的抗RHAMM mAb并可更有效地靶向表達RHAMM的(腫瘤)細胞。

總的來說,本發(fā)明證明了一組RHAMM-結合肽,其在某些方面可衍生自微管蛋白序列的CTT,而在其它方面可基于人工肽序列。

本發(fā)明的肽可如下被修飾:在肽的一端或兩端添加半胱氨酸殘基,從而通過形成二硫鍵而使肽環(huán)化。本發(fā)明的肽可通過添加磷基和乙?;恍揎?。磷酸化是發(fā)生在動物細胞中的最常見的蛋白修飾之一[4]。它最常發(fā)生在蘇氨酸殘基、絲氨酸殘基和酪氨酸殘基上并且在許多細胞過程的調節(jié)中起關鍵作用,所述細胞過程包括:細胞周期、生長、細胞凋亡和分化[4]。該過程是可能的,因為本發(fā)明的某些肽含有酪氨酸和因為可將酰基加到N-端氨基酸上[5]。本發(fā)明肽中的芳族氨基酸即苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被其它芳族氨基酸取代,以評價它們對肽活性的影響。同樣,本發(fā)明肽中的脂族氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸可被其它脂族氨基酸取代,以評價它們對肽活性的影響。

本發(fā)明肽的長度可以是大約6至大約14個氨基酸和可包含其中的任何長度范圍(即6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-11、10-12、10-13和10-14),正如本領域技術人員所理解的那樣。長度超過大約14個氨基酸的肽也可包括在本發(fā)明內。肽的長度僅受其結合RHAMM的能力的限制。本發(fā)明的肽也可包括肽的二聚體和三聚體以及額外的穩(wěn)定的側翼序列,正如本領域技術人員所理解的那樣并描述于例如美國專利號5,824,315和美國專利號6,184,204 (其公開內容通過引用全部結合到本文中)。本發(fā)明的多聚體可以是由多個相同的肽組成的同型多聚體或由不同的肽組成的異型多聚體。如所述的,本發(fā)明肽的氨基酸序列可側接隨機氨基酸序列??蔀閮?yōu)選的是對肽具有穩(wěn)定作用,因而增加它們的生物利用度的側翼序列。另外,其它肽模擬物(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽也可包括可能已通過例如磷酸化、糖基化、peg化或脂質化而修飾的肽。

此外,本發(fā)明的肽也可包括本發(fā)明肽的功能上等價的變體或類似物。因此,這可包括但不限于具有部分序列同源性的肽、具有一個或多個特定保守和/或非保守氨基酸改變的肽以及不改變所述肽的生物或結構性質(即結合RHAMM的能力)的肽綴合物。

就功能類似物而言,本領域技術人員完全理解,生物功能肽類似物的定義中所固有的概念是:對于在分子的限定部分內可進行改變的數量存在限制,并且仍然產生具有可接受水平的等價生物活性(在本文的情況下,將包括結合RHAMM的能力)的分子。可以容易地制備具有不同取代的多個獨特肽/蛋白并可用于本發(fā)明。也可理解,某些殘基對于蛋白或肽的生物或結構性質而言特別重要,所述殘基例如受體識別區(qū)內的殘基,其中這樣的殘基通??刹槐唤粨Q。

功能類似物可通過保守或非保守氨基酸取代而產生。氨基酸取代通??筛鶕被醾孺溔〈南鄬ο嗨菩?,例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。因此,在本發(fā)明的范圍之內,保守氨基酸改變是指特定位置上的氨基酸改變,其可以是與原先存在的類型相同:即疏水性氨基酸交換為疏水性氨基酸,堿性氨基酸交換為堿性氨基酸等。保守取代的實例可包括但不限于非極性(疏水性)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代為另一種氨基酸,一種極性(親水性)殘基取代為另一種(例如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間的取代),或者一種堿性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代為另一種,一種酸性殘基例如天冬氨酸或谷氨酸取代為另一種,支鏈氨基酸例如異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸取代為另一種,一種芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代為另一種。這樣的氨基酸改變可產生功能類似物,其中它們可不顯著地改變肽的總電荷和/或構型。這類保守改變的實例是本領域技術人員眾所周知的并在本發(fā)明范圍之內。保守取代也可包括使用經化學衍生的殘基代替非衍生殘基,條件是所得肽是本發(fā)明肽的生物功能等價物。因此,本發(fā)明的肽可包括其氨基酸序列不同于SEQ ID NOs: 1-17的肽。本發(fā)明的肽也可包括其氨基酸序列因單個突變而不同于SEQ ID NOs: 1-17的肽,其中該單突變代表一個氨基酸缺失、插入或取代。

圖10A和圖10B,例如,說明了就RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 1而言,位置1、3、5、6和11的丙氨酸取代看來不影響取代的RHAMM-結合肽與RHAMM的適當結合。

圖17A和圖17B,例如,說明了就RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 14而言,位置1、4、7、8、11和12的丙氨酸取代看來不影響取代的RHAMM-結合肽與RHAMM的適當結合。

結合肽的制備

本發(fā)明的肽可通過本領域技術人員已知方法來制備,最特別且優(yōu)選的方法是通過化學合成,使用蛋白質化學眾所周知的技術,例如固相合成[6, 7, 8, 其通過引用結合到本文中]或在均質溶液中合成[9, 其通過引用結合到本文中],以產生合成肽。

或者,本發(fā)明的肽可通過使用本領域技術人員已知的重組DNA技術來制備。

還考慮的是,本發(fā)明包括可包含編碼至少一種本發(fā)明肽的核酸的載體。

結合肽的分離

可通過測定結合RHAMM的肽的樣品,分離RHAMM-結合肽。檢測蛋白-蛋白相互作用的任何測定系統(tǒng)或試驗方法都可使用,包括但不限于免疫共沉淀、交聯以及通過梯度或色譜柱而共-純化??蓽y試生物樣品和市售文庫中的RHAMM-結合肽。例如,帶標記的RHAMM可用于探測噬菌體展示文庫,正如實施例1中更詳細描述的那樣。另外,針對本發(fā)明肽而制備的抗體可用于分離具有RHAMM-結合親和力的其它肽。例如,帶標記的抗體可用于探測噬菌體展示文庫或生物樣品。

另外,編碼RHAMM蛋白的DNA序列可用于探測生物樣品或文庫中的編碼HA-結合蛋白的核酸。

組合物

在一個實施方案中,本發(fā)明提供可包含一種或多種本發(fā)明RHAMM-結合肽的組合物,所述組合物用于以適于體內給藥的生物相容形式給予受試者。在另一個實施方案中,本發(fā)明提供可包含一種或多種RHAMM-結合肽的組合物,所述組合物用于在體外研究樣品??墒褂玫臉悠钒ǖ幌抻诩毎⒔M織和器官。

所謂“適于體內給藥的生物相容形式”是指所給予物質的形式,其中療效比任何毒性效應更重要。可將物質給予任何動物,優(yōu)選人。治療活性量的本發(fā)明藥物組合物或“有效量”的給予,可定義為達到在人體內引發(fā)免疫應答所需結果所必需的劑量和時間而有效的量。合適的給藥途徑可以是肌內注射、皮下注射、靜脈內注射或腹膜內注射、口服和鼻內給予。

可接受的載體是本領域技術人員眾所周知的并包括例如無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和去離子水。

此外本發(fā)明的組合物可包含一種或多種穩(wěn)定劑,例如碳水化合物(包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖)、蛋白質(例如白蛋白或酪蛋白)和緩沖劑(例如堿性磷酸鹽)。此外,本發(fā)明的組合物可包含可增強本發(fā)明肽的抗細胞增殖性能的一種或多種輔助劑。

注射用組合物可包含(但非排它性地)本發(fā)明的肽或核酸以及一種或多種藥學上可接受的溶媒或稀釋劑,并包含在合適pH和與生理流體等滲的緩沖液中。任何藥學上合適的稀釋劑都可用于注射用組合物:蒸餾水、生理溶液或鹽溶液、和/或緩沖液。注射用組合物可按常規(guī)體積-重量方法來制備??捎孟♂寗┗蛉軇⒁欢康碾南♂屩帘匾w積。然后溶液可通過無菌濾器過濾,裝瓶或裝入安瓿(ampouled)。所得溶液可以是穩(wěn)定的透明液體,并且可不含任何化學物或其它雜質。

檢測探針

可用合適探針,對樣品(包括但不限于細胞、組織或器官)中的RHAMM表達進行檢測。探針可至少包含本發(fā)明RHAMM-結合肽和可檢測標記。可檢測標記可能夠通過檢測手段而被檢測。檢測手段可以是對可檢測標記可能提供任何可測量反應的任何檢測技術。在本發(fā)明的多個方面,可以圖像形式提供可測量反應??蓹z測標記可允許使用合適檢測手段來檢測RHAMM陽性細胞的位置。本發(fā)明的探針可允許跟蹤RHAMM陽性細胞的運動和顯像(development)。因此,在一個實施方案中,本發(fā)明的探針可用于但不限于在診斷和預后方法中研究RHAMM陽性細胞。

制備探針的方法是本領域技術人員眾所周知的[10, 11, 其通過引用結合到本文中]。

標記方法是本領域技術人員眾所周知的。優(yōu)選的標記可以是適用于體內成像的那些。在檢測之前可對抗RHAMM探針進行可檢測標記?;蛘?,可使用可結合雜交產物的可檢測標記。這類可檢測標記可包括但不限于具有可檢測的物理或化學性質并且在免疫測定領域內已被良好開發(fā)的任何材料。用于本發(fā)明的標記可以是可通過檢測手段而檢測的任何組合物,所述手段包括但不限于光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段。

可用于本發(fā)明的標記包括基于生物素的標記、磁標記(例如DYNABEADSTM)、放射性標記(例如3H、11S、32P、51Cr或125I)、熒光標記(例如熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等)、電子-致密試劑(例如金)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或ELISA中常用的其它酶)、地高辛配基(digoxigenin)或半抗原以及其抗血清或單克隆抗體可得到的蛋白質(例如可通過將放射性標記摻入本發(fā)明肽中而使得本發(fā)明肽可檢測,并用于檢測與肽特異性反應的抗體)。本發(fā)明的RHAMM-結合肽可與載體一起提供,例如與牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin)偶聯。

可將RHAMM-結合肽與金或聚苯乙烯的微球體、玻片、芯片等固體載體,或與微量滴定板壁共價或非共價偶聯??捎脴擞浿苯踊蜷g接地標記RHAMM-結合肽,所述標記選自但不限于生物素、熒光素和酶例如辣根過氧化物酶。

所用的具體標記對本發(fā)明而言并非關鍵,只要它不干擾RHAMM/RHAMM-結合肽復合物的形成。然而,在一個實施方案中,成像組分可以是放射性核素(例如18F、11C、13N、64Cu、88Ga、123I、111In、99mTC等),因為SPECT、CT和PET成像等技術容易使用,用于體內檢測RHAMM/RHAMM-結合肽復合物和腫瘤祖細胞。用于SPECT或PET成像試劑的合適成像成分的判定也可通過放射性核素是否是由發(fā)生器或回旋加速器產生或者是螯合劑或有機/鹵化物而確定。圖15和圖16說明Ga-DOTA綴合的肽SEQ ID NO: 1和Re(CO)3+-配位的肽SEQ ID NO: 1的合成和質譜表征。

本文所用的直接標記的探針可以是連接可檢測標記的探針。因為直接標記已經與探針連接,所以無需后續(xù)步驟將探針與可檢測標記締合。相反,間接標記的探針可以是攜帶了某一部分的探針,所述部分在隨后(通常在RHAMM-結合肽與靶RHAMM雜交之后)與可檢測標記結合。

在另一個實施方案中,也可制備和使用可識別任何本發(fā)明RHAMM-結合肽的單克隆抗體(mAb),以檢測樣品中RHAMM-結合肽的存在情況。Mab可提供檢測本發(fā)明組合物品質的快速而簡單的方法。一般而言,制備抗體的方法是眾所周知的。例如,產生特異性識別本發(fā)明RHAMM-結合肽的mAb的方法是本領域技術人員眾所周知的。一般而言,用弗氏佐劑中的肽注射小鼠。在3周時間內注射9次之后,取出小鼠脾臟并重懸于磷酸緩沖鹽水(PBS)。脾細胞可作為淋巴細胞來源,其中的一些可產生具有合適特異性的抗體。然后可將這些細胞與永久生長的骨髓瘤伙伴細胞融合,并且可在選擇試劑例如HAT存在下將融合產物鋪板到多個組織培養(yǎng)孔中。然后篩選各孔,以通過ELISA鑒定那些含有制造有用抗體的細胞。然后將這些細胞用于新鮮鋪板。經過生長周期之后,這些孔可再次經篩選而鑒定產生抗體的細胞。可進行若干克隆程序,直到超過90%的孔都含有抗體產生為陽性的單克隆。從該程序中,可建立穩(wěn)定克隆系,其產生mAb。然后通過親和力色譜,使用蛋白A或蛋白G瓊脂糖而純化mAb (另見美國專利號4,609,893;4,713,325;4,714,681;4,716,111;4,716,117;和4,720,459)。

結合肽的應用

本發(fā)明可包含檢測、成像、診斷和治療性策略,所述策略可包括但不限于用本發(fā)明RHAMM-結合肽靶向RHAMM,其可破壞RHAMM/配體復合物的形成,并可起到刺激配體-RHAMM介導的細胞運動性反應的作用。這些方法可與治療病原性病況、炎癥和病原性感染相關的病癥的其它已知療法聯用。

陽性細胞的檢測

參考圖9,本發(fā)明的RHAMM-結合肽已經證明在生物環(huán)境中具有適度穩(wěn)定性(大約110至大約250分鐘的半衰期),這足夠長,有利于體外或體內成像。

在本發(fā)明的一個實施方案中,RHAMM-結合肽可用于鑒定 RHAMM陽性細胞的方法。鑒定RHAMM陽性細胞的方法可包括使細胞接觸本發(fā)明探針并應用合適的檢測技術來檢測細胞中的可檢測標記。根據用檢測技術對可檢測標記進行檢測,可確定對RHAMM陽性細胞的鑒定。

在另一個實施方案中,提供了在受試者組織或器官中檢測RHAMM表達的方法。所述方法可包括:(a)將本發(fā)明的探針給予受試者;(b)應用檢測技術來檢測受試者組織或器官中的標記。

因為致瘤祖細胞可通過RHAMM表達而得以表征,在另一個實施方案中,本發(fā)明的RHAMM-結合肽可用于確定樣品例如腫瘤活檢中是否可能包含致瘤祖細胞的診斷方法,致瘤祖細胞可使癌癥患者處于發(fā)展轉移的風險之中。一種這樣的診斷方法可包括使用一種或多種RHAMM-結合肽來檢測樣品中RHAMM的存在情況。RHAMM陽性樣品可表示該樣品中含有癌癥祖細胞。

依照本發(fā)明的一個實施方案,診斷癌癥患者的方法可包括:(a) 從所述患者獲取組織樣品;(b) 使所述樣品與本發(fā)明的探針接觸;(c) 應用檢測技術以在所述樣品中檢測探針的可檢測標記。樣品中RHAMM表達的檢出可表示癌癥診斷。

依照本發(fā)明另一個實施方案,診斷癌癥患者的方法可包括:(a) 將本發(fā)明的探針給予受試者;和(b) 應用檢測技術以在受試者的組織或器官中檢測探針的標記。受試者中RHAMM的檢出可表示癌癥診斷。

依照本發(fā)明另一個實施方案,確定癌癥患者的預后的方法可包括:(a) 從患者獲取腫瘤組織樣品;(b) 使所述樣品與本發(fā)明的探針接觸;(c) 應用檢測技術以在所述樣品中檢測探針的標記;和(d) 確定患者的預后。預后可預測患者的癌癥侵占性或轉移的可能性。樣品中RHAMM表達的檢出可表示不良預后。

在另一個實施方案中,本發(fā)明提供確定癌癥患者的療程的方法。所述方法可包括:(a) 從患者獲取腫瘤組織樣品;(b) 使所述樣品與本發(fā)明的探針接觸;(c) 應用檢測技術以在所述樣品中檢測探針的標記;和(d) 確定患者的預后。預后可預測患者的癌癥侵占性或轉移的可能性。因此,樣品中可測量RHAMM表達的檢出可表示不良預后;并根據預后而確定用于患者的療程。

在本發(fā)明診斷和預后方法的一方面,可將樣品中的RHAMM表達與已知陰性對照或已知標準進行比較。相對于陰性對照或已知標準而言,樣品中可測量RHAMM表達的檢出可表示:樣品中RHAMM的存在,癌癥的診斷,或不良預后,視情況而定。

圖6和圖7說明使用熒光素-綴合的RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 14 (圖6A;SEQ ID NO: 35)和SEQ ID NOs: 1和9 (圖7;SEQ ID NOs: 25和29),人乳癌細胞的顯現。

圖13說明使用熒光素-綴合的RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25),人卵巢癌細胞的顯現,而圖14表明使用熒光素-綴合的RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 9 (SEQ 1D NO: 29),人前列腺癌細胞的顯現。

如圖14所說明的,侵占性侵襲和轉移的PC3mLN4人前列腺癌系對于熒光染色是強陽性,表示HA肽模擬物SEQ ID NO: 9的快速攝取。

本發(fā)明RHAMM-結合肽的細胞攝取可被特異性抗RHAMM mAb封閉,但不被特異性抗CD44 mAb封閉,但后者可封閉HA與CD44的結合(參見圖6, 7, 13和14)。這些結果可表明本發(fā)明的HA肽模擬物可通過RHAMM依賴性機制與前列腺癌細胞、乳癌細胞和卵巢癌細胞締合并被這些細胞所攝取。

治療藥

參考圖9,本發(fā)明的RHAMM-結合肽在生物環(huán)境中可具有顯著穩(wěn)定性(substantial stability) (大約110至大約250分鐘的半衰期),這可為足夠長,有利于將它們用于治療性方法。

本發(fā)明的RHAMM-結合肽可用于在哺乳動物中預防或治療涉及細胞運動性的病理性病況例如癌癥、炎性和自身免疫病癥和組織創(chuàng)傷及其恢復相關的纖維化病癥。

本發(fā)明的RHAMM-結合肽可用于通過破壞所述RHAMM/配體復合物的形成而治療RHAMM/配體復合物的形成所致的病癥或病況的組合物和方法。

在一個實施方案中,本發(fā)明可提供用于治療可能患有RHAMM在細胞中表達相關的病癥或病況的受試者的方法。所述方法可包括至少給予所述受試者有效量的組合物,所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結合肽的核酸分子和藥學上可接受的載體。

在一個實施方案中,本發(fā)明提供預防或減少組織瘢痕形成的方法。所述方法可包括至少給予有需要的受試者有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或編碼所述一種或多種本發(fā)明RHAMM-結合肽的核酸分子。

RHAMM-結合肽抑制癌細胞增殖的能力可涉及它們在預防腫瘤轉移中的有效性和它們作為癌癥化療藥劑的效用。因此,本發(fā)明提供預防或減少腫瘤轉移的方法,所述方法包括將有效量的RHAMM-結合肽或編碼本發(fā)明的RHAMM-結合肽的核酸分子給予有需要的受試者。

因此,本發(fā)明的RHAMM-結合肽可用于治療RHAMM表達相關的癌癥,包括但不限于肺癌、胃腸癌、乳癌、膀胱癌、皮膚癌(黑素瘤和非黑素瘤)、腦癌、宮頸癌和白血病。因此,本發(fā)明可提供在受試者中預防或治療癌癥的方法。該方法可包括至少給予有需要的受試者有效量的一種或多種RHAMM-結合肽或者編碼所述一種或多種本發(fā)明RHAMM-結合肽的核酸分子。

在一個實施方案中,本發(fā)明的RHAMM-結合肽可與現有療法聯用,以降低RHAMM表達相關病癥或病況例如癌癥的患者的發(fā)病率和死亡率。因此,在本發(fā)明的一個實施方案中提供的是用于在患者中治療RHAMM表達相關病癥或病況的方法。所述方法可包括至少給予受試者本發(fā)明的RHAMM-結合肽并聯合用于所述RHAMM相關病癥的至少一種其它療法。RHAMM-結合肽和至少一種其它療法的聯用可增加疾病治療的功效。例如,就癌癥治療而言,也可給予受試者可能夠顯著降低血管生成的療法,例如小分子藥物、siRNAs、反義療法(antisense therapy)或其任何組合,其可靶向一種或多種生長因子(其可作為血管生成的開關),并為滋養(yǎng)層和內皮細胞提供增殖信號。生長因子對于多種癌癥的生長和存活而言可能是需要的并且對癌癥進展而言可能是必需的。因此,可將使用RHAMM-結合分子的本發(fā)明抗癌方法與靶向一種或多種生長因子(包括VEGF、FGR和hCG)的療法聯合。也可將本發(fā)明的RHAMM-結合肽與放療或化療聯合。這樣的聯合療法促進治療癌癥的協(xié)同作用。

本發(fā)明人已經證明,例如,本發(fā)明的RHAMM-結合肽可能夠抑制人上皮卵巢癌(EOC)細胞的增殖(參見圖11)。本發(fā)明人也已證明本發(fā)明的RHAMM-結合肽可能夠降低人EOC細胞的活力(參見圖12)。

通過如上所提出的方法鑒定癌癥祖細胞,本發(fā)明的檢測方法可允許開發(fā)新的治療藥,以選擇性殺傷這些祖細胞或迫使其末端分化。例如,本發(fā)明的技術可用于可含有高度致瘤的祖細胞亞類的腫瘤的體內成像,其可允許選擇性治療具有轉移風險的患者,相對于沒有風險的患者而言。最重要的是,本發(fā)明的技術可用于將抗癌藥遞送給原發(fā)性癌癥例如乳癌中存在的高度致瘤的祖細胞亞類。例如,可將肽與細胞毒劑綴合,以使得能夠將細胞毒劑靶向遞送至表達RHAMM的細胞。通過同樣的機制,其它治療實體的遞送也是可能的,包括但不限于烷化劑、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、激素治療藥、核苷類似物或其前體藥物。此外,可預見放療藥,其中可將本發(fā)明的RHAMM-結合肽與發(fā)射粒子的放射性核素連接,從而提供將細胞破壞性實體選擇性遞送給RHAMM陽性細胞的機制。治療性放射性核素可包括發(fā)射β的放射性核素,例如90Y或186Re;發(fā)射β/γ的放射性核素,例如47Sc、153Sm、177Lu或186Re;發(fā)射α的放射性核素,例如213Bi、223Ra或225Ac;或發(fā)射Auger的放射性核素,例如67Ga或111In。

給藥和劑量

可采用本領域已知的任何途徑將本發(fā)明的探針和/或肽直接給予哺乳動物受試者,所述途徑包括但不限于例如注射(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌內或皮內)、吸入、透皮施用、直腸給藥、鼻內或口服給藥。在一個實施方案中,可經皮下給予本發(fā)明的檢測探針和/或肽。在另一個實施方案中,可經靜脈內給予本發(fā)明的檢測探針和/或肽。在另一個實施方案中,有效量的探針或RHAMM-結合肽可通過非系統(tǒng)性的局部給藥而給予,例如通過外周給藥,包括外周肌內、腺體內和皮下給藥途徑,并且允許探針和/或肽在體內經數小時而攜帶到具有表達RHAMM的細胞和致瘤性細胞群體的位點。

本發(fā)明的另一實施方案可以是通過可植入裝置來給予RHAMM-結合肽。在本發(fā)明的多個方面,可植入裝置可能夠控制RHAMM-結合肽的釋放。

可按上文所述,全身性提供本發(fā)明的RHAMM-結合肽。正如本領域技術人員所理解的那樣,本發(fā)明的RHAMM-結合肽可用在常規(guī)脂質體、特化脂質體、脂質制劑和免疫脂質體中。

脂質體可以是單層或多層并可由選自以下的組分形成:磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿及其組合。多層脂質體可包括組成與單層囊泡類似、但可經制備從而產生多區(qū)室的多層囊泡,其中包埋銀組分/溶液或乳液。另外,其它輔助劑和改性劑也可包入脂質體制劑中,例如聚乙二醇或其它材料。

雖然脂質體制劑可包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿:膽固醇(1:1),但本領域技術人員了解,任何數量的脂質體雙層組合物都可用于本發(fā)明的組合物。脂質體可通過各種已知方法來制備,例如公開于以下文獻中的那些方法:美國專利號4,235,871和RRC, Liposomes: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1990, 第33-101頁,其通過引用結合到本文中。

含有RHAMM-結合肽的脂質體可具有修飾,例如具有與脂質體外部結合的非聚合物分子,例如半抗原、酶、抗體或抗體片段、細胞因子和激素和其它小蛋白、多肽或非蛋白分子,所述分子賦予脂質體所需的酶促或表面識別特征。優(yōu)先將脂質體靶向特定器官或細胞類型的表面分子包括例如能將脂質體靶向帶有特定抗原的細胞的抗體。將所述分子偶聯的技術是本領域技術人員眾所周知的(參見例如美國專利號4,762,915,其公開內容通過引用結合到本文中)?;蛘?,或同時,本領域技術人員將會理解,攜帶正或負凈電荷的任何數量的脂質都可用于改變脂質體膜的表面電荷或表面電荷密度。

脂質體也可摻入熱敏性或pH敏感性脂質作為脂質雙層的組分,以提供脂質囊泡膜的控制降解。

在本發(fā)明上下文中,給予患者的劑量可以是對RHAMM/RHAMM-結合配體復合物和致瘤細胞群體的位置有效成像并具有足夠特異性的合適劑量,從而使外科醫(yī)生可進行活檢或其它程序以除去通過對RHAMM/RHAMM-結合肽復合物成像而檢測的致瘤細胞群體。該劑量可根據所用的具體載體(例如肽或核酸)的功效和患者狀況、以及所治療患者的體重或表面積而確定。劑量大小也可根據在具體患者中伴隨給予探針的任何不良副作用的存在、性質和程度來確定。

對于給藥,本發(fā)明檢測探針可以由多肽或核酸的LD-50和不同濃度的多肽或核酸的副作用確定的比率給予,當考慮到患者的整體(mass)和總體健康時??赏ㄟ^單次或分次劑量來完成給藥,例如定期(例如每天)并持續(xù)一段時間(例如2、3、4、5、6天或1-3周或更長)給予的劑量。

在又一些實施方案中,可用公認的臨床標準和實踐,將大約5至大約2000 LD 50單位的標記的探針給予所述受試者。

以上公開內容一般性地描述了本發(fā)明。參考以下具體實施例可獲得更完整的理解。這些實施例僅以說明的目的而描述,并非意欲限制本發(fā)明范圍。當情況可暗示或使得有利時,考慮了形式上的改變和等價物取代。

盡管本文使用了具體術語,但這樣的術語旨在描述性意義而非限制性目的。

實施例

實施例是為了說明的目的而描述并且不得視為限制本發(fā)明的范圍。

實施例1 - BLAST搜索和序列比對

在基本搜索比對搜索工具(BLAST)中使用對應于RHAMM (SEQ ID NO: 19)的HA-結合結構域(aa 718-750)的查詢序列,以搜集顯示序列同源性的蛋白列表。圖1 B說明分子成像探針設計和優(yōu)化的流程圖。HA-結合結構域用作BLAST中的查詢序列,以確定同源蛋白序列。然后,闡明同源序列的推定的結合配偶體(配體)。根據截短的配體序列合成肽文庫并用表面等離振子共振(SPR)結合測定進行篩選,以確定高親和力配體。再用多種體外結合測定進一步評價候選肽配體。

RHAMM和MAP的微管結合結構域和驅動蛋白間的成對比較揭示出與RHAMM的HA結合結構域的適度序列同源性(使用ClustalX2 計算出大約17-24%[12]);然而,MAP和RHAMM在它們的微管蛋白結合位點的氨基酸序列方面共享類似的理化性質。換句話說,RHAMM和MAPS都具有推測與微管蛋白結合的堿性殘基段(stretch)。

此外,MAP的微管蛋白結合位點和RHAMM的乙酰透明質酸結合位點的二級結構具有同樣的螺旋程度并且都可以歸類為堿性-拉鏈結構域[13]。

據報道RHAMM使用通用結合位點與胞外表面的HA和胞質溶膠中的微管締合[14]。因為微管相關動力蛋白和MAP表現出與微管蛋白的CTT直接結合,所以本發(fā)明人假設RHAMM可顯示與代表不同微管蛋白亞類的CTT的合成肽的直接相互作用。因為HA與RHAMM主要通過其帶負電荷基團與RHAMM上的正電荷基團之間的離子相互作用而相互作用,所以具有類似的負電荷分布的分子原則上可作為HA模擬物。

例如,微管蛋白CTT上的Glu殘基和Asp殘基可模擬HA上的羧酸基。因此,合成CTT與RHAMM的HA結合結構域的結合可利用被認為對于HA結合而言重要的相同帶電荷側鏈。

實施例2 - 針對RHAMM的微管蛋白-衍生的肽的篩選

材料:所有溶劑無需進一步純化就可使用,并且都購自VWR、Fisher Scientific或Sigma Aldrich。對于肽合成,芴基甲氧基羰基(Fmoc) Rink amide MBHA (100-200目)樹脂、Fmoc氨基酸、Fmoc-保護的氨基己酸(Fmoc-Ahx)和HBTU (六氟磷酸2-(1H-苯并三唑1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)偶聯劑得自Peptides International。N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉鹽(磺基-NHS)、異硫氰酸熒光素(FITC)異構體I和胎牛血清(FBS)都購自Sigma Aldrich。NHS-生物素得自Nova BioChem。抗體例如抗RHAMM (Santa Cruz Biotechnology, USA)、抗CD44 (Pharmigen)和IgG ab (Santa Cruz Biotechnology USA)都市購獲得。

肽合成:使用固相肽合成,按照Fmoc方案,合成17種肽,其具有對應于不同微管蛋白亞類的CTT和H12區(qū)的12個氨基酸殘基。

在rink amide MBHA樹脂(0.1 mmol)上進行肽鏈延伸,使用自動化(APEX 396自動合成儀)和/或手動方法,使用標準固相肽合成,包括Fmoc脫保護和氨基酸偶聯循環(huán),每次循環(huán)用Kaiser試驗進行監(jiān)測[15, 16]。在整個合成中重復進行Fmoc脫保護(15和20分鐘周期),使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液。以30分鐘和90分鐘間隔使用0.05 M或更高濃度的Fmoc-保護的氨基酸和HBTU, 5當量N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)/DMF,進行所有氨基酸偶聯。每次脫保護和偶聯步驟之后,樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復洗滌。使用同樣參數偶聯Fmoc-Ahx。進行氨基端酰化(15和10分鐘),使用10%乙酸酐/DMF,接著Fmoc脫保護。進行熒光素偶聯,即通過使肽的氨基與FITC熒光染料(4當量)/DMF和DIPEA (2當量)反應4小時。

使用94% v/v三氟乙酸(TFA)、1% v/v三異丙基硅烷(TIPS)、2.5% v/v H2O和2.5% v/v 1,2-乙烷二硫醇(EDT)的溶液,對含半胱氨酸的肽進行完全脫保護,達1.0-1.5小時。使用88% V/v TFA、5% v/v水、5% m/v苯酚、2% v/v TIPS的溶液,對所有其它肽進行完全脫保護,達2-4小時。收集濾液,用冷的叔丁基甲醚沉淀并通過在3000 rpm在-5℃離心10分鐘而沉淀。再將沉淀物溶于蒸餾的去離子水并凍干,得到固體粉末。

蛋白純化: 通過反相HPLC將本項研究中所用的所有肽都純化至純度大于92%并通過ESI質譜來表征。

對肽進行純化,使用由H2O + 0.1% TFA (溶劑A)和CH3CN + 0.1% TFA (溶劑B)組成的梯度溶劑系統(tǒng),對分析型和制備型HPLC分別以線性流速1.5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(4.6 mm x 250 μm, 5 μm),進行分析型HPLC,并使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μm),進行制備型HPLC。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測器,在220 nm和254 nm波長處檢測吸光度。純化期間,收集各流分,凍干并通過ESI-MS (Waters Micromass Quattro MicroTM API)分析。

從攜帶重組質粒pPAL7-RHAMM的大腸桿菌BL21 (D3)菌株中分離重組蛋白RHAMM-CT (一種截短的RHAMM,僅對應于含有HA結合結構域的羧基端,氨基酸706-766, 序列: RDSYAQLLGH QNLKQKIKHV VKLKDENSQL KSEVSKLRSQ LVKRKQNELR LQGELDKALG I, M.W. 7.1 kDa, pI = 10.1;SEQ ID NO: 20)。將細菌在含氨芐青霉素(100 μg/ml)和0.5 %葡萄糖的LB培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)過夜,讓其生長到對數期中期。用2 mM IPTG在37℃誘導重組 RHAMM基因表達,持續(xù)4小時,然后通過在10,000 x g離心20 mm收獲細菌細胞。

將細菌細胞重懸于裂解緩沖液(由0.2 M磷酸鈉、0.2 M乙酸鉀、1% triton X-100和0.1 %蛋白酶抑制劑, pH = 7.0組成),超聲處理(60 s, 10 s/脈沖)并離心(4℃, 12000 x g, 20 mm)。將所得上清液移至干凈管中并過濾(使用0.45 μm濾器)。用Profinity eXact (Blo-Rad, USA) 親和力樹脂,依照制造商方案,對eXact標簽的-重組 RHAMM進行純化。對于本實驗,將裂解液上樣到填裝有Profinity eXact 親和力樹脂(4 mL樹脂, 柱15 x 1.5 cm)并用洗滌緩沖液(0.2M磷酸鈉, pH 7.0)平衡的重力柱。該柱用洗滌緩沖液洗滌以除去雜質,然后用洗脫緩沖液(由0.2 M磷酸鈉、0.1 M氟化鈉, pH 7.0組成)洗脫重組 RHAMM。然后使用Millipore濾器在由0.2M磷酸鈉和0.2 M乙酸鉀組成的緩沖液(pH = 7.0)中,對蛋白進行透析和濃縮(Millipore, USA, 截止3 kDa)。所分離蛋白的純度在1D SDS-PAGE上得以證實。使用抗RHAMM抗體,通過蛋白質印跡分析,對RHAMM進行鑒定和證實。

SPR (表面等離振子共振)篩選測定: ProteON XPR36系統(tǒng)用于針對RHAMM而對不同微管蛋白衍生的肽進行選擇和分級。對于RHAMM的固定,通過胺偶聯,使用100 mM EDAC和24 mM磺基-NHS使ProteON GLC傳感器芯片表面活化。以30 μl/mm的流速注射RHAMM (30 μg/mL的碳酸氫鈉緩沖液, pH 9.7)。將緩沖液樣品注入不同傳感器板上,用作參考。然后注射乙醇胺HCl (1M, pH 8.5)以使任何剩余表面基團失活。在3分鐘內,以50 μL/min將肽(在PBS-T中的10 μm, 2% DMSO)注射到RHAMM功能化表面,接著是10分鐘的解離(即注射PBS-T緩沖液)期。用兩次注射30 μL 1M NaCl使表面再生,然后再注射下一種肽。在所有實驗中,使用得自參考板(無RHAMM)和RHAMM功能化板的數據,減去參考。

使用熒光素-標記的肽的競爭性ELISA實驗:進行ELISA,以測試FITC-標記的微管蛋白-衍生的肽與HA競爭RHAMM結合位點的能力。將重組RHAMM (0.05M PBS中的100 μL、10 μg/mL, pH = 9)固定在96-孔ELISA板(終濃度1 μg/孔)并在4℃孵育過夜,得到最終蛋白量1 μg/孔。各板用(0.05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μL/孔)洗滌3次,用封閉緩沖液(5% 200 μL/孔, PBS-吐溫-20/孔)洗滌,然后在室溫下孵育1小時。如上所述洗滌3次之后,將FITC-標記的微管蛋白衍生的肽(終濃度1 μg/mL)和HA (100 μL/孔, M.W. 220 kDa, PBS中的10 μg/mL, 進行系列稀釋,得到HA=1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)加入各板并在4℃孵育過夜。如上所述洗滌各板,然后在485/535 nm處測量吸光度。

使用熒光素-標記的RHAMM的競爭性ELISA實驗:進行ELISA,以測試無標記的微管蛋白-衍生的肽與染料(Alexa Fluor 647)-綴合的HA競爭RHAMM的能力。將RHAMM (100 μ1, 10 μg/mL的0.05 M PBS, pH = 9)固定在96-孔 ELISA板(以達到最終量1 μg/孔)并在4℃孵育過夜。各板用(0.05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μL/孔)洗滌3次,再與封閉緩沖液(200 μ1/孔, 5 %吐溫-20的PBS)在室溫下孵育1小時。用(0.05 %) PBS-吐溫-20緩沖液洗滌3次之后,將微管蛋白-衍生的肽(10 μg/ml)和HA-綴合的Alexa Fluor 647(100 μg/孔, M.W. 220 kDa, PBS中的10μg/ml)加入各板并在4℃孵育過夜。陰性對照板接受無染料-綴合的HA并且所有實驗都一式三份地進行。如上所述地洗滌各板,然后在650 nm處測量熒光。

SPR (表面等離振子共振)結合測定:肽篩選之后,GWC SPRimager?系統(tǒng)用于測定結合動力學常數。將milliQ水中的1 nM濃度含Thiol肽固定在馬來酰亞胺-功能化的鍍金芯片上達3小時。用milliQ水洗滌除去過量肽。對于結合研究,將一系列濃度(500 nM、750 nM和1000 nM)的RHAMM注射到固定化肽。15 min解離期之后,通過用2次10 min脈沖注射(以100 mL/min)再生緩沖液(2 M NaCl的HBS-EP, pH 7.4)的處理,使傳感器芯片表面再生,用于下一種肽樣品注射。再生步驟之后,基線回到起始值,證實所有結合的分析物都除去。分析數據并通過非線性回歸擬合到Langmuir結合模型獲取相應的解離常數(kD)[17]。在所有實驗中,使用得自參考板(無肽)和肽功能化板的數據,減去參考。

血清穩(wěn)定性研究:評價微管蛋白CTT在血清中的穩(wěn)定性達11小時。將每種肽與預熱(37℃, pH 7.3 ±0.1)胎牛血清(FBS)混合,(最終樣品體積3 mL,肽濃度15 μm)。記錄開始時間,并在每個30分鐘時間點,從反應混合物中取出40 μL等分試樣并通過C18 反相(C18 Sep-Pak?)柱。用3 mL含0.1% TEA的乙醇(70% v/v)將肽從柱上洗脫下來,凍干并用分析型RP-HPLC (Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱4.6 x 250 mm, 5 μm)進行分析。該系統(tǒng)所用的流動相是0.1% TFA的水(洗脫液A)和0.1% TFA的CH3CN (洗脫液B)。對于每種肽樣品,使用在20分鐘內流速1.5 ml/min的10-95%洗脫液B的線性梯度。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測器,設置在220和254 nm處,檢測%完整肽并用ESI-MS鑒定。用GraphPad Prism 5.01版測定肽的半衰期。

細胞攝取研究:將對RHAMM-CT顯示出高親和力的候選肽與熒光染料(FITC)綴合,并使用細胞熒光成像測定評價它們對表達RHAMM的癌細胞(MDA-MB-231)的特異性。

將MDA-MB-231細胞在DMEM培養(yǎng)基和10% FBS中培養(yǎng)至90%匯合。然后將細胞接種在2 x 24-孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片(12 x 12 mm, 包被有50 μg/ml纖連蛋白)上(20000/孔的匯合),接種之后一天。用DMEM + 0.1% FCS在37℃過夜,進行饑餓步驟。然后吸出培養(yǎng)基并用DMEM + 0.1% FCS在37℃漂清過夜。細胞用3% BSA的DMEM + 0.1% FCS在室溫下封閉1小時。對于封閉實驗,加入抗體(稀釋度1:100, 小鼠 IgG ab, 山羊, 抗RHAMM mAb, 或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + 0.1% FCS培養(yǎng)基)并在37℃孵育1小時。用抗小鼠 IgG封閉的細胞作為陽性對照,因為該抗體顯示出對RHAMM無結合親和力。

然后吸出所得培養(yǎng)基,細胞用DMEM + 0.1% FCS在RT洗滌。加入熒光素-綴合的肽(50 μg/mL)并在37℃孵育30分鐘。細胞用DMEM + 0.1% FCS洗滌,再用PBS (pH = 7.6)洗滌。然后使用含Fluoro-gel 11的DAPI (Electron microscopy sciences, USA),通過制造商方案將細胞封固。用Olympus FluoView FV1000偶聯的Motorized Inverted System Microscope對細胞進行攝影。使用ImageJ (v1.42q)軟件分析Tiff圖像。將每幅圖像轉化為8-bit格式并經受閾值20和255。選擇對應于細胞體(n=15)的目標區(qū)(ROI)。再用8 bit所獲數據計算每一ROI的平均熒光。用Prism (GraphPad Software, San Diego, USA)統(tǒng)計程序,用單向ANOVA,分析數據。

結果

針對RHAMM,篩選微管蛋白-衍生的肽:

圖2 A顯示未經修飾的微管蛋白-衍生的肽(圖2 A a)、以及與N-乙酰半胱氨酸(圖2 A b)和異硫氰酸熒光素綴合的肽的通用結構(圖2 A c)。圖2 B是描述為本研究而制備的所有17種肽的表。17種合成肽的序列包括不同微管蛋白亞類的CTT以及直接側接(SEQ ID NOs: 6、7和8)和的序列(SEQ ID NOs: 13和14)。一個6碳接頭用于增加肽和額外肽修飾之間的距離。圖2 B也包括衍生的肽。制備衍生的肽,其具有熒光素(圖2B的肽1c、3c、9c、11c、12c、14c;SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)或N-乙酰半胱氨酸修飾的N-端(圖2B的肽1b、3b、9b、11b、12b、14b;SEQ ID NOs: 24、26、28、30、32和34)。

所有肽都通過ESI+質譜來表征并通過反相HPLC來分析其純度。圖2 B是說明使用ESI-MS和RP HPLC,分析17種合成的微管蛋白-衍生的肽的表。計算的和實測的m/z值基于經ES1測定的所觀測到的明顯信號。%純度經RP HPLC測定,在220 nm處檢測。

基于SPR (表面等離振子共振)的篩選方法用于快速而準確測定能識別RHAMM的HA-結合結構域的潛在候選肽。篩選17種微管蛋白-衍生的肽,所得傳感圖用于推測顯示出對RHAMM的親和力的肽。篩選之前,測定配體固定(在該情況下是RHAMM)到傳感器板的最佳條件。固定緩沖液的最佳pH平衡蛋白與傳感器板的靜電引力,同時使蛋白失活減至最小。在本研究中,用于固定的最佳pH經測定是產生最高配體密度的pH。使用不同pH的碳酸氫鈉緩沖液,流速30 μL/min和固定濃度的EDAC和磺基-NHS,將RHAMM偶聯到傳感器板。根據6次測量的平均SPR反應測定各pH固定條件的RHAMM配體密度,并且最大配體固定發(fā)生在pH 9.7 (圖3 A)。配體固定稍低于pH 10.1,部分地因為RHAMM上的凈電荷在其等電點損失。

RHAMM在SPR傳感器芯片上固定之后,將一系列微管蛋白衍生的肽進行注射。肽與RHAMM的締合進行3分鐘并且在無分析物緩沖液中進行解離10分鐘。圖3 B顯示在濃度為10 μm時得到的實驗傳感圖。對于每次肽注射,從試驗傳感圖中減去對照傳感圖(未固定的RHAMM和緩沖液注射),并在下一次肽注射之前使芯片表面再生,以除去任何殘余的結合肽。對17種肽進行篩選得到對RHAMM顯示出親和力增加的6種肽,即:1a (SEQ ID NO: 1)、3a (SEQ ID NO: 3)、9a (SEQ ID NO: 9)、11a (SEQ ID NO: 11)、12a (SEQ ID NO: 12)和14a (SEQ ID NO: 14)。

固定化微管蛋白衍生的肽對RHAMM的親和力:對以上部分得到的這6種肽與RHAMM的結合進行定量測定。截短研究表明CTT (即S-肽最后12個羧端殘基)足以誘導MAP-指導的微管裝配[18],因此將通過接頭部分間隔的標記放在CTT的氨基端,不會影響肽-蛋白相互作用。將肽固定在傳感器板并使不同濃度的RHAMM流過衍生的表面,恒定流速100μL/min。圖4 A描述所得傳感圖。同樣,每幅傳感圖都通過從參考傳感圖(數據得自無固定化肽的傳感圖)中減去各曲線而得以校正,以說明運行緩沖液和樣品溶液之間的折射指數差異。

用得自動力學模型的曲線擬合實驗傳感圖,用于1:1 Langmuir結合模型。圖4 B的表中給出了得自不同 RHAMM濃度的6種肽的KD平均值以及相應的標準誤差。作為陽性對照,也測量了抗RHAMM mAb的動力學概況,結果顯示對RHAMM的5.53 nM 親和力。肽SEQ ID NO: 1 (KD = 24 nM), SEQ ID NO: 9 (KD= 32 nM)和SEQ ID NO: 14 (KD = 30 nM)顯示出在低納摩爾范圍內的解離常數,表明對RHAMM的高親和力。

還使用ELISA測量了6種肽的每一種的相對結合親和力。在該測定中,肽用熒光素標記,通過加入氨基己酸接頭而使染料遠離肽。如圖3 C所示,ELISA結果也表明肽SEQ ID NOs: 1、9和14在所有濃度時都具有最高相對結合親和力??赡艿氖牵牡臒晒鈭F修飾可對配體-RHAMM相互作用或對非特異性結合有影響,因此SPR和ELISA結果可能并不準確匹配。

微管蛋白-衍生的肽被HA競爭性置換:進行競爭性ELISA,以測定肽對RHAMM的HA結合結構域的選擇性。在該測定中,使用熒光素-標記的肽并評價未標記的HA封閉肽與RHAMM結合的有效性。將熒光素-標記的肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14,對應于圖2B中的肽1c、3c、9c、11c、12c和14c (SEQ ID NO 25、27、29、31、33和35)加入到含固定化RHAMM的ELISA板,然后加入不同濃度的HA,其是RHAMM的天然配體??梢娝^測的熒光減少,因為HA置換了熒光素-標記的肽,如果它們競爭同一結合位點的話。圖5 A顯示肽與RHAMM的結合被HA競爭性置換,并在所有6種配體中都觀測到隨著HA競爭者濃度增加,熒光的濃度依賴性減少,其中最有效的相對置換發(fā)生在熒光素-標記的肽SEQ ID NOs: 1、12和14 (SEQ ID NOs: 25、33和35),盡管SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 29)的肽也被置換。

設計出備選的競爭性實驗,進一步評價肽配體,因為熒光素標記的存在可能影響這些低分子量肽的物理性質和所得結合潛力。使用ELISA,未標記的肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (對應于圖2B的肽1a、3a、9a、11a、12a和14a)用于與染料-標記的HA競爭。本測定消除了如下所致的混雜結果:染料標記和蛋白之間的相互作用或者因大量染料加入到肽配體中所導致的親和力變化。如圖5B所示,因熒光信號減少而容易觀測到標記的-HA被無熒光的微管蛋白衍生的肽置換。未標記的RHAMM配體或熒光素-標記的配體SEQ ID NO: 14和未標記的RHAMM配體或熒光素-標記的配體SEQ ID NO: 9尤其顯示出能夠一貫性地與HA競爭結合,因此支持了以下觀點:在肽的氨基端上的進一步修飾對與RHAMM的結合幾乎無影響。然而,與SEQ ID NO: 1的未修飾肽相比,含有序列SEQ ID NO: 1的熒光素-標記的α1a-CTT (肽1c;SEQ ID NO: 25),似乎更好地與HA競爭。

對RHAMM和CD44的特異性:先前的結果表明這些肽可能夠靶向RHAMM的HA結合結構域。然而,為了顯示這些HA模擬物是特異性靶向RHAMM的,有必要測試所述肽對其它透明質酸粘素(hyaladerin)例如CD44的親和力。為此,用CD44功能化表面進行固相肽結合測定 (ELISA),其在圖5 C中說明。如上所述,SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)的每種FITC-綴合的肽與每一種透明質酸粘素(RHAMM或CD44)孵育,并在充分洗滌方案后記錄所得熒光測量。正如所料,產生自RHAMM和熒光素-肽的熒光測量顯示最高信號,并且在加入HA之后,觀測到熒光明顯減少。相反,如熒光所表明的CD44和熒光素-肽相互作用,顯著更低并且在加入HA之后未顯示出預期的熒光測量的下降。因此,肽的結合是由與RHAMM的特異性相互作用所致,而它們顯示出與CD44有限的相互作用。

血清穩(wěn)定性:為了測試它們作為靶向實體或治療藥的潛力,需要研究RHAMM-結合肽在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性,在11小時的時間內評價了肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14的每一種的體外血清穩(wěn)定性,并且用RP-HPLC對剩余完整肽進行定量測定。在本測定中,在37℃讓肽經受胎牛血清,以30分鐘間隔取出等分試樣。在每個時間點,通過用三氟乙酸(TFA)沉淀血清蛋白而終止反應,并用離心以獲取含肽的粗制溶液。將溶液通過C18反相柱(C18 Sep-Pak?),以除去低分子量雜質。從柱子上洗脫完整肽,凍干并分析。如圖9所示,未經修飾的RHAMM-結合肽表現出血清穩(wěn)定性,且合理半衰期為大約 2-4小時。

細胞熒光測定(MDA-MB-231攝取研究):為了測定本發(fā)明微管蛋白衍生的肽對表達RHAMM的細胞的特異性以及它們作為靶向實體的潛力,使用經抗RHAMM抗體處理的MDA-MB-231細胞,進行細胞熒光測定。MDA-MB-231乳瘤細胞系顯示出RHAMM受體的高表達,因此該細胞系是評價合成微管蛋白肽的靶向和特異性的理想選擇。將MDA-MB-231細胞與熒光素-綴合的肽SEQ ID NOs: 1、9和14 (SEQ ID NOs: 25、29和35)一起孵育,并且測量細胞對探針的攝取。如圖6A (對于SEQ ID NO: 35)和圖7 (對于SEQ ID NOs: 25和29)所說明的,對于所有測試的肽,在未接受封閉處理的細胞以及在與非特異性抗體(lgG抗體)一起孵育的細胞中觀測到熒光信號的積累,表明對熒光標記的探針的高攝取。有趣的是,用抗CD44封閉的細胞顯示出無信號降低。然而,用抗RHAMM mAb封閉的細胞顯示出細胞熒光的顯著降低,證實肽SEQ ID NOs: 1、9和14對RHAMM的特異性(p <0.001)。如圖6 B所說明的,用抗RHAMM mAb封閉的細胞顯示出大約65%至大約85%的細胞熒光降低(熒光素-標記的SEQ ID NOs: 1、9和14分別顯示出大約85%、大約76%和大約65%的熒光降低)。

討論

RHAMM是在各種癌癥中過量表達的癌基因。另外,在表達RHAMM的癌細胞中HA (RHAMM的胞外配體)的積累增加是不良臨床后果的預后因素。因此,靶向RHAMM并能與HA競爭結合的低分子量配體可用于診斷和治療目的。在本研究中,本發(fā)明人尋求鑒定能靶向RHAMM的HA結合結構域的配體。本發(fā)明人理由充分地說明,因為含有HA結合結構域的RHAMM羧基端介導在細胞內的微管網絡上的定位,所以進行了數據庫搜索和RHAMM與已知微管蛋白相關蛋白(例如MAP)的微管結合結構域之間的成對比較。此外,因為這些蛋白表現出與微管蛋白的CTT直接結合,所以本發(fā)明人假設RHAMM可顯示出與代表不同微管蛋白亞類的CTT的合成肽的直接相互作用。因為MAP的微管蛋白結合結構域和RHAMM的HA-結合結構域之間的適度特異性,所以進行進一步研究,以測定微管蛋白的哪些肽片段與RHAMM相互作用。在本研究中,推導出RHAMM和新配體之間的特異性相互作用。

使用固相肽合成,合成衍生自不同微管蛋白亞類羧基端結構域(即CTT區(qū))的肽片段、以及直接接近上述結構域的序列。針對RHAMM,對所得肽進行篩選,以測定高親和力配體。為此,使用SPR篩選方法,其中將RHAMM蛋白固定到SPR傳感器板,并讓肽流過,以發(fā)現具有高親和力和特異性的配體。使用該方法,因為它允許使用單個RHAMM-帶電荷的傳感器板進行高通量篩選,并且SPR-結合的RHAMM可反映其作為細胞受體的天然膜結合狀態(tài)。篩選得到6種高親和力配體,其能與HA競爭經ELISA測定的RHAMM的HA結合區(qū)。進一步評價確定這些肽相較于CD44(一種已知也結合HA的透明質酸粘素)顯示出對RHAMM的更高特異性。

肽在生物環(huán)境(牛血清)中顯示出適度穩(wěn)定性(大約110-250分鐘的半衰期),這可為足夠長,有利于體外、離體或體內成像。通過在表達RHAMM的癌細胞中定量測定對配體的相對攝取,分析了對RHAMM具有更高親和力的3種HA肽模擬物(SEQ ID NOs:. 1、9和14)的特異性。為此,將SEQ ID NOs:. 1、9和14的肽與熒光素綴合(SEQ ID NOs: 25、29和35)并與MDA-MB-231細胞(過量表達RHAMM的細胞系)孵育。對于所有3種肽都觀測到細胞熒光,并且加入抗CD44或非特異性抗體(即IgG抗體)并未減少攝取。然而,當加入抗RHAMM抗體時觀測到探針攝取大大減少,表明對探針攝取的特異性封閉。因此,探針的高特異性與適度穩(wěn)定性聯合可允許進一步開發(fā)為診斷試劑,用于表達RHAMM的癌細胞。

該報告中顯示的所述結果表明RHAMM的HA結合結構域在微管蛋白可變羧基-端部分存在通用位點。在大多數候選肽中注意到重復的6肽基序,并且共享該酸性羧基-端區(qū)段的肽與RHAMM相互作用?;駿EXEEZ (其中X為A或G,Z為V或E;SEQ ID NO: 18)存在于合成的(SEQ ID NO:9)和(SEQ ID NO: 11)中,如圖8B所說明的。該結果與先前的報告是一致的,即短序列EEGEE (SEQ ID NO: 21) (Paschal等, 1989)可參與微管蛋白和MAP結合,是與RHAMM共享序列同源性的蛋白家族。

盡管酸性官能團在HA和RHAMM相互作用中的作用,結果也可表明在CTT區(qū)內的這些酸性殘基的隨機發(fā)生或增加,看來并不直接影響RHAMM-微管蛋白相互作用。意想不到的是,含有DEXEEZ (如在肽SEQ ID NOs: 2和4中所見) (SEQ ID NO: 22)和EEXEDZ (如在SEQ ID NO: 10中所見) (SEQ ID NO: 23)基序的肽未通過最初的篩選,表明第一和第五序列內的Asp殘基不可取代該基序中的類似酸性Glu殘基。這表明CTT與RHAMM的相互作用同時被靜電力和構象效應介導。

顯著性

本研究公開了至少6種與RHAMM的HA結合結構域相互作用的新配體的發(fā)現。這6種肽對RHAMM具有強親和力并且能夠被內源HA置換,因此顯示出特異性靶向HA-結合結構域。另外,在基于無細胞的(即ELISA)和基于細胞的(即細胞熒光)測定中,這些配體與RHAMM結合的傾向大于與另一種透明質酸粘素CD44,可證明其作為靶向實體的潛力。RHAMM的過量表達及其所導致的與HA的相互作用亦牽涉癌癥病理學。因此,這些肽可作為可封閉RHAMM-HA相互作用的拮抗劑,因此限制了RHAMM的轉化潛力。

實施例3 - 丙氨酸-取代的RHAMM-結合肽與RHAMM的親和力

材料:溶劑無需進一步純化就可使用,并且購自VWR, Fisher Scientific或Sigma Aldrich。對于肽合成,芴基甲氧基羰基(Fmoc)-Rink amide MBHA (100-200目)樹脂、Fmoc氨基酸、Fmoc-保護的氨基己酸(Fmoc-Ahx)和HBTU (六氟磷酸2-(1H-苯并三唑1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)偶聯劑得自Peptides International。

肽合成:使用自動化(APEX 396自動合成儀)和/或手動方法,使用標準固相肽合成,包括Fmoc脫保護和氨基酸偶聯循環(huán),在rink amide MBHA樹脂(0.1 mmol)上進行肽鏈延伸。使用20%哌啶在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液,在整個合成中重復進行Fmoc脫保護(15和20分鐘周期)。以30和90分鐘間隔使用0.05 M或更高濃度的Fmoc-保護的氨基酸和HSTU, 5當量N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)/DMF,進行所有氨基酸偶聯。每次脫保護和偶聯步驟之后,樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復洗滌。使用同樣參數偶聯Fmoc-Ahx。如下進行熒光素偶聯:使肽的氨基與FITC熒光染料(4當量)在含有DIPEA(2當量)的DMF中反應4小時。所得樹脂用由88% TFA和12%清除劑(5%水、5%三異丙基硅烷和2%苯酚)組成的裂解混合物處理。將所得樹脂在700 rpm振搖3小時并通過RP-HPLC純化。

ELISA結合測定:進行酶聯免疫吸附測定(ELISA),以測試熒光素-標記的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)或熒光素-標記的肽SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)中丙氨酸取代的影響,以確定對RHAMM結合而言重要的殘基。

將重組RHAMM (0.05M PBS中的100 μL、10 μg/mL, pH 9)加入到96孔板(終濃度1 pg/孔)并在4℃孵育過夜。

各板用(0.05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μL/孔)洗滌3次,然后在室溫下與BSA封閉液孵育1小時。加入熒光素-標記的肽(SEQ ID NO:25或SEQ ID NO: 35) (終濃度1 μg/mL),用(0.05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μL/孔)洗滌,然后在485/535 nm處測量吸光度。

競爭性ELISA:使用競爭性ELISA,測量丙氨酸取代的熒光素-標記的SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)或熒光素-標記的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)置換HA和競爭RHAMM的能力。如上所述地進行蛋白固定和3次洗滌之后,將熒光素-標記的微管蛋白衍生的肽(終濃度1 μg/mL)和HA (100μL/孔, M.W. 220 kDa, PBS中的10 μg/mL, HA = 1 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL)加入到各板并在4℃孵育過夜。洗滌方案之后,在485/535 nm處測量吸光度。

結果

圖10 A說明12種丙氨酸-取代的(丙氨酸掃描)熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)對RHAMM的親和力。數據表明SEQ ID NO: 1的殘基2、4、7-10和12對與RHAMM的適當結合可為重要的。圖10 B說明12種丙氨酸-取代的熒光素-標記的SEQ ID NO: 1肽(SEQ ID NO: 25)被HA競爭性置換到固定化Rhamm-CT。數據顯示在SEQ ID NO: 1的位置2、4、7-10和12的丙氨酸取代消除了所述肽與HA競爭的能力。從每次測量中減去陰性對照(未固定的RHAMM)并且所有數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值。

圖17 A說明11種丙氨酸-取代的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)對RHAMM的HA-結合區(qū)的親和力。數據表明SEQ ID NO: 14的殘基2、3、5、6、9和10對RHAMM的適當結合可為重要的。圖17 B說明11種丙氨酸-取代的熒光素-標記的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)被HA競爭性置換到固定化RHAMM-CT。數據顯示在SEQ ID NO: 14的位置2、3、5、6、9和10的丙氨酸取代消除了所述肽與HA競爭的能力。從每次測量中減去陰性對照(未固定的RHAMM)并且所有數據顯示在2個獨立實驗中的3次測量的平均值。

實施例4-人上皮卵巢癌細胞

材料:緩沖液和培養(yǎng)基購自Invitrogen、Sigma和VWR。AlamarBlue測定試劑盒購自Invitrogen。二甲亞砜(DMSO)購自Aldrich。上皮卵巢癌(EOC)細胞經患者同意后得自London Regional Cancer Center。

增殖測定:檢查了一種RHAMM-結合肽(SEQ ID NO: 1)限制患者來源的上皮卵巢癌腫瘤的增殖的能力和另一種RHAMM-結合肽(SEQ ID NO: 3)降低腹水-來源的人EOC細胞的活力的能力。在這些測定中,將上皮卵巢癌細胞(源自患者腹水)鋪板在96孔板中,密度為5,000細胞/孔,并讓其在37℃和5% CO2中生長24小時。在第一天將肽(1 μM和10 μM)加入細胞,并測量增殖達6天。每天將1/10體積的Alamar Blue試劑直接加入培養(yǎng)基內的細胞中,共6天。在570/590 nm處讀出熒光。數據得自兩次實驗的平均值。實驗中包括了僅用DMSO (二甲亞砜)處理的細胞和“無細胞”對照樣品。

EOC細胞攝取研究:將EOC細胞在DMEM培養(yǎng)基 + 10% FBS中培養(yǎng)至90%匯合。然后將細胞接種在2 x 24-孔組織培養(yǎng)板(20,000細胞/孔的匯合)。然后細胞用3% BSA的DMEM + 0.1% FCS在室溫下封閉1小時。對于封閉實驗,加入抗體(稀釋度1:100, 抗IgG, 山羊抗-Rhamm mAb或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + 0.1% FCS培養(yǎng)基)并在37℃孵育1小時。然后吸出所得培養(yǎng)基,并用DMEM + 0.1% FCS在室溫下洗滌細胞。加入熒光素綴合的肽(SEQ ID NO: 25;50 ug/mL)并在37℃孵育30分鐘。細胞用DMEM + 0.1% FCS洗滌,然后用PBS(pH 7.6)洗滌,使用含Fluoro-gel 11的DAPI (Electron microscopy sciences, USA),通過制造商方案將細胞封固。用Olympus FluoView FV1000偶聯的Motorized Inverted System Microscope對細胞進行攝影。使用ImageJ (v1.42q)軟件分析Tiff圖像。將每幅圖像轉化為8-bit格式并經受閾值20和255。選擇目標區(qū)(ROI)并求出平均細胞熒光。

人上皮卵巢癌細胞的增殖

圖11說明肽SEQ ID NO: 1在人上皮卵巢癌(EOC)細胞中的增殖測定。EOC細胞是來自上皮卵巢癌患者腹水的樣品。用alamarBlue測定來測量增殖水平。在第一天加入一次肽SEQ ID NO: 1并測量隨時間而變的作用。數據顯示在4份患者OC細胞樣品中有3份表現出對增殖的抑制。

圖13說明使用熒光顯微術,卵巢瘤細胞對熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)的攝取的顯現。正如所料,當EOC細胞與抗RHAMM一起孵育時,對熒光素-標記的SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)的攝取減少,而對于經抗IgG或抗CD44處理的細胞,探針的攝取不受影響。

圖12是一幅圖,說明RHAMM-結合肽降低了腹水-來源的人EOC細胞的活力(p<0.05)。將來自患者樣品EOC的原代細胞接種到24-孔培養(yǎng)皿中,并在24小時后用RHAMM-結合肽SEQ ID NO: 3 (7和0.7 uM的濃度)或DMSO溶媒對照開始處理。每天進行重復給藥,共6天,并且通過熒光測定術,使用alamarBlue TM試劑評價細胞活力(以熒光單位FU測量)。

實施例5 - PC3mLN4人前列腺癌系

材料和方法

細胞攝取研究: 由侵襲性/轉移性前列腺腫瘤細胞表達的2種乙酰透明質酸受體是CD44和RHAMM。因此,評價了本發(fā)明肽選擇性靶向前列腺癌細胞的能力。在該測定中,將PC3mLN4人前列腺癌細胞在DMEM培養(yǎng)基 + 10% FBS中培養(yǎng)至90%匯合。然后將細胞接種在2 x 24-孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片(12 x 12 mm, 包被有50 μg/ml纖連蛋白)上(20000/孔的匯合)。然后細胞用3% BSA的DMEM + 0.1% FCS在室溫下封閉1小時。對于封閉實驗,加入抗體(稀釋度1:100, 山羊抗Rhamm mAb或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + 0.1% FCS培養(yǎng)基)并在37℃孵育1小時。然后吸出所得培養(yǎng)基,并用DMEM + 0.1% FCS 在室溫下洗滌細胞。加入熒光素-綴合的肽(SEQ ID NO: 29;50 ug/mL)并在37℃孵育30分鐘。細胞用DMEM + 0.1% FCS洗滌,然后用PBS (pH = 7.6)洗滌,使用含Fluoro-gel 11的DAPI(Electron microscopy sciences, USA),通過制造商方案將細胞封固。用Olympus FluoView FV1000Motorized Inverted System Microscope對細胞進行攝影。使用ImageJ (v1.42q)軟件分析Tiff圖像。將每幅圖像轉化為8-bit格式并經受閾值20和255。選擇目標區(qū)(ROI)并求出平均細胞熒光。

人前列腺癌系中的肽攝取

圖14 A顯示侵占性侵襲和轉移的PC3mLN4人前列腺癌系對HA的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 9模擬物(SEQ ID NO: 29)的攝取。使用共聚焦顯微鏡,在腫瘤細胞中檢測熒光素-綴合的肽(圖14A (a),然而,當RHAMM蛋白被抗RHAMM mAb封閉時,FITC信號減少(圖14A (C))。這表明探針攝取被特定抗RHAMM單克隆抗體封閉。另外,當用抗CD44單克隆抗體處理細胞時,對熒光素-綴合的HA模擬物的攝取不變(圖14A (b))。這些結果表明本發(fā)明的HA肽模擬物通過RHAMM依賴性機制與前列腺癌細胞締合并且被這些細胞所攝取。對攝取的定量測定(圖14 B)顯示接受無抗體治療的細胞(a)和用抗CD44封閉的細胞(b)間無統(tǒng)計學差異。在用抗RHAMM抗體治療的細胞中對探針的攝取極大地下降(c) (p<0.001)。

實施例6 - Ga-DOTA-綴合的肽的合成和表征

材料:所用溶劑購自VWR, Fisher Scientific或Sigma Aldrich。Rink amide M8HA樹脂(100-200目, 0.56 mmol/g)、標準Fmoc氨基酸和HBTU偶聯試劑得自Peptides International。1-溴己酸、甘氨酸。溴乙酸乙酯和硝酸鎵(III)購自Sigma Aldrich。Cyclen (1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷)和Re(CO)5Br購自Strem Chemicals。

肽合成:使用標準固相肽合成,包括Fmoc脫保護和氨基酸偶聯循環(huán),在rink amide MBHA樹脂(0.1 mmol)上合成肽。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液,在整個合成中重復進行Fmoc脫保護(15和20分鐘周期)。以30分鐘和90分鐘間隔使用0.05 M或更高濃度的Fmoc-保護的氨基酸和HBTU, 5當量N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)/DMF,進行所有氨基酸偶聯。每次脫保護和偶聯步驟之后,樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復洗滌。使用同樣參數偶聯6-溴己酸。讓DMF中的Cyclen (1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷) (10當量)與肽基鏈末端反應3天。讓DMF中的溴乙酸乙酯(3當量/胺)與cyclen的仲胺反應24小時,產生鎵螯合物(DOTA)。用88% TFA處理之后,對肽進行純化,使用由H2O + 0.1% TFA (溶劑A)和CH3CN + 0.1% TFA (溶劑B)組成的梯度溶劑系統(tǒng),對分析型和制備型HPLC分別以線性流速1.5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(4.6 mm x 250 μm, 5 μm),進行分析型HPLC,并使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μm),進行制備型HPLC。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測器,在220 nm和254 nm波長處檢測吸光度。純化期間,收集各流分,凍干并通過ESI-MS (Waters Micromass Quattro MicroTM API)分析。

Ga-69/71標記:使用69/71Ga(NO3)3的乙酸緩沖液,pH 5.5,對鎵進行配位達15分鐘。產物使用C18反相(C18 Sep-Pak?)柱分離。使用含1%三氟乙酸的30%乙腈的去離子水將產物從柱子上洗脫下來。所得產物用質譜表征,并用RP-HPLC分析純度。

綴合的肽的合成和表征

合成和表征69/71Ga-DOTA-綴合的肽SEQ ID NO: 1作為68Ga-配位的放射性示蹤劑的可能的非放射性替代物,用于PET成像。圖15 A描述DOTA-綴合的肽的鎵標記。圖15 B說明純化的鎵配位的肽在9.73分鐘的RP-HPLC色譜圖。圖15 C說明圖15 A化合物的ESI質譜(實測的:936.7 [M+2H] 2+, 計算的:934.87 [M+2H]2+)。

實施例7 - Re(CO)3+-配位的肽的合成和表征

材料:所用溶劑購自VWR. Fisher Scientific或Sigma Aldrich。Rink amide MBHA樹脂(100-200目, 0.56 mmol/g)、標準Fmoc氨基酸和HBTU偶聯試劑得自Peptides International。甘氨酸、氰基硼氫化鈉和3-吡啶甲醛購自Sigma Aldrich。Re(CO)5Br購自Strem Chemicals。

Re(CO)3+螯合劑合成([雙(吡啶-2-基甲基)氨基]乙酸):向甘氨酸(0.602 g, 8.02 mmol)的10%乙酸(20 mL)溶液中加入過量3-吡啶甲醛(4.28 g 0.02 mol)。在室溫下攪拌1小時后,加入氰基硼氫化鈉(1.01 g, 0.016 mol)并將所得反應混合物攪拌24小時。所得混合物用氯仿(3 x 40 mL)萃取,經MgSO4干燥,并蒸發(fā)揮發(fā)物,得到黃色油狀物。粗制產物用二氧化硅色譜純化(90% 氯仿: 10% 甲醇) (1.67 g, 81%收率)。

肽合成:使用標準固相肽合成,包括Fmoc脫保護和氨基酸偶聯循環(huán),在rink amide MBHA樹脂(0.1 mmol)上合成肽。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液,在整個合成中重復進行Fmoc脫保護(15和20分鐘周期)。以30分鐘和90分鐘間隔使用0.05 M或更高濃度的Fmoc-保護的氨基酸和HBTU, 5當量N,N-二異丙基乙胺 (DIPEA)/DMF,進行所有氨基酸偶聯。每次脫保護和偶聯步驟之后,樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復洗滌。用上述方法偶聯Fmoc-氨基己酸和([雙(吡啶-2-基甲基)氨基]乙酸。使用過量[Re(CO)3Br3](NEt4)2進行錸配位。用88%三氟乙酸進行從固體支持物上的裂解。

對肽進行純化,使用由H2O + 0.1% TFA (溶劑A)和CH3CN + 0.1% TFA (溶劑B)組成的梯度溶劑系統(tǒng),對分析型和制備型HPLC分別以線性流速1.5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)進行分析型HPLC,并使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)進行制備型HPLC。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測器,在220 nm和254 nm波長處檢測吸光度。純化期間,收集各流分,凍干并通過ESI-MS (Waters Micromass Quattro MicroTM API)分析。

合成和表征Re(CO)3+ -配位的肽SEQ ID NO: 1作為99Tc(CO) 3+配位的放射性示蹤劑的可能的非放射性替代物,用于SPECT成像。圖16 A描述Re(CO)3+ -配位的肽SEQ ID NO: 1的合成,圖16 B說明純化的錸配位的肽在11.06分鐘的RP-HPLC色譜圖。圖16 C說明錸配位的肽的ESI質譜(實測的:939.1 [M+2H]2+, 計算的:940.2 [M+2H] 2+)。

非專利參考文獻

1. Edward, M., 等, Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion(成纖維細胞乙酰透明質酸表達的腫瘤調節(jié):促進腫瘤生長和侵襲的機制). Carcinogenesis, 2005. 26(7): 第1215- 23頁.

2. Tammi, Mi., AJ. Day,和E.A. Turley, Hyalurorian and homeostasis: a balancing act (Hyalurorian和穩(wěn)態(tài):一種平衡作用). J Biol Chem, 2002, 277(7): 第4581-4頁.

3. Gotte, M.和G.W. Yip, Heparanase, hyaluronan, and CD44 in cancers: a breast carcinoma perspective (癌癥中的類肝素酶、乙酰透明質酸和CD44:乳癌的展望). Cancer Res, 2006. 66(21): 第10233-7頁.

4. Guo, Yan-Ting等. International Journal of Peptide Research and Therapeutics 11:159 (2005).

5. Aniel A.等. Rapid Comm Mass Spectr . 21:2237 (2007).

6. J. Am. Chem. Assoc. 65:2149 (1964).

7. J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963).

8. Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214 (1990).

9. Methods of Organic Chemistry, E. Wansch (主編) 第15卷, 第I和II部分, Thieme, Stuttgart (1987).

10. Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版), 第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

11. Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel 等主編,Greene Publishing和Wiley -lnterscience, New York (1987).

trough MEKI/ERK1, 2 activity (RHAMM通過MEK1/ERK1、2活性而促進間期微管不穩(wěn)定和有絲分裂紡錘體整合). J Biol. Chem., 285, 26461-26474.

14.Maxwell, C. A.;Keats, J. J.: Crainie, M.;Sun, X., Yen, T. Shibuya, E.;Hendzel, M. Chan, G.;和Pilarski, L. M. (2003) RHAMM is a centrosomal protein that interacts with dynein and maintains spindle pole stability (RHAMM是與動力蛋白相互作用并維持紡錘體極穩(wěn)定性的中心體蛋白). Mol. Blot. Cell., 14, 2262-2276.

15.Chan, W. C.;White, P. D. (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis (Fmoc固相肽合成);Chan, W. C., White, P. D主編;Oxford university Press: New York, 第41-76頁.

16.Kaiser, E.;Colescott, R. L.;Bossinger, C. D.;Cook, P. I. (1970) Color test for detection of free terminal amino groups in the solid phase synthesis of peptides (在肽的固相合成中用于檢測游離端氨基的顏色試驗). Biochem. 34, 595-598.

17. Zhang, L;Furst, EM;Kiick, KL. (2006) Manipulation of hydrogel assembly and growth factor delivery via the use of peptide-polysaccharide interactions (通過使用肽-多糖相互作用對水凝膠裝配和生長因子遞送的操作). J Control Release, 114, 130-42.

18. Cross, D.;Dominguez, J.: Maccioni, R. B. (1991) MAP-1 AND MAP-2 binding sites at the C-terminus of beta-tubulin. Studies with synthetic tubulin peptides (在β-微管蛋白C端的MAP-1和MAP-2結合位點。用合成微管蛋白肽的研究). Biochemistry. 30(17), 4362-4366.

當前第1頁1 2 3 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1