本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)SortaseA活性的底物蛋白、表達(dá)載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌分選酶SortaseA兼具蛋白酶和轉(zhuǎn)肽酶的功能。細(xì)菌表面蛋白在成熟前首先在細(xì)菌胞質(zhì)中合成帶有N端信號(hào)肽及C端分選信號(hào)的蛋白前體，并通過(guò)分泌途徑分泌到胞外。在這一過(guò)程中信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除，蛋白前體通過(guò)C端疏水區(qū)定位在細(xì)胞膜上。隨后其特征基序被分選酶SortaseA識(shí)別，并斷開(kāi)LPXTG中的T-G鍵，催化Thr與細(xì)胞壁肽聚糖的共價(jià)結(jié)合，從而將表面蛋白錨定到細(xì)胞壁上。由于細(xì)菌表面蛋白在病原菌的吸附感染，生物被膜形成方面具有關(guān)鍵作用，因此分選酶SortaseA是革蘭氏陽(yáng)性菌致病性的重要藥物靶點(diǎn)，篩選抑制其活性的抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的實(shí)際意義。

目前，分選酶Sortase A抑制劑的篩選方法目前大致可分為四種：基于片段小分子化合物庫(kù)高通量篩選、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法、HPLC檢測(cè)法及纖連蛋白結(jié)合法。這幾種方法中，適宜高通量的篩選方法是引用FRET的底物蛋白篩選法，即人工合成序列為L(zhǎng)PXTG的小肽，兩端分別進(jìn)行化學(xué)修飾使其含有Dabcyl-Edans或abz-dnp熒光淬滅對(duì)修飾，當(dāng)分選酶SortaseA催化底物蛋白鏈斷裂，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)分離，熒光強(qiáng)度就會(huì)發(fā)生變化。因此可以用于篩選影響分選酶SortaseA活性的抑制劑。

雖然FRET的底物蛋白篩選法可以對(duì)分選酶SortaseA的活性進(jìn)行高通量檢測(cè)，但是由于其底物蛋白是化學(xué)合成制備，合成費(fèi)用高，周期長(zhǎng)，有時(shí)甚至合成失敗，需要反復(fù)優(yōu)化合成條件，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白、表達(dá)載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用，解決了現(xiàn)有的分選酶Sortase A活性檢測(cè)方法中底物蛋白需要化學(xué)合成，費(fèi)用高，合成周期長(zhǎng)，容易失敗的問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白表達(dá)載體，所述底物蛋白表達(dá)載體是在大腸桿菌表達(dá)載體pET28a的NcoI、XhoI酶切位點(diǎn)插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列構(gòu)建而成。

本發(fā)明還提供一種上述檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

步驟1，在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的5’端添加NcoI的酶切位點(diǎn)，3’端添加X(jué)hoI的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成如SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

步驟2，底物蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

以NcoI、XhoI雙酶切如SEQ ID NO.3所示的DNA片段，并回收1.6kb的目的DNA片段；以NcoI、XhoI雙酶切大腸桿菌表達(dá)載體pET28a，并回收5.2kb的載體DNA片段；將1.6kb的目的DNA片段連接到5.2kb的載體DNA片段上，構(gòu)建成底物蛋白表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了一種上述底物蛋白表達(dá)載體，在檢測(cè)金黃色葡萄球菌的分選酶Sortase A活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種利用上述底物蛋白表達(dá)載體檢測(cè)金黃色葡萄球菌的分選酶Sortase A活性的方法，包括以下步驟：

步驟(1)，制備底物蛋白表達(dá)載體；

步驟(2)，將底物蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21DE3菌感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)底物蛋白，得到底物蛋白表達(dá)產(chǎn)物，然后利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)底物蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到底物蛋白溶液；

步驟(3)，利用大腸桿菌表達(dá)載體pET28a構(gòu)建含有金黃色葡萄球菌基因組中分選酶Sortase A基因的表達(dá)載體pET28a-srtA，然后將表達(dá)載體pET28a-srtA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21DE3菌感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)分選酶Sortase A，得到分選酶SortaseA表達(dá)產(chǎn)物，然后利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)分選酶SortaseA表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到分選酶SortaseA溶液；

步驟(4)，以底物蛋白溶液為空白對(duì)照組，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)分選酶Sortase A溶液中分選酶SortaseA的活性。

優(yōu)選的，上述的檢測(cè)分選酶SortaseA活性的方法中，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)分選酶SortaseA溶液中分選酶Sortase A的活性，具體包括以下步驟：

將底物蛋白溶液和分選酶Sortase A溶液混合加入到酶標(biāo)板中，作為檢測(cè)組，同時(shí)以底物蛋白溶液為空白對(duì)照組；

將酶標(biāo)板置于37℃，避光孵育1h；

酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)定為350nm激發(fā)，495nm記錄，測(cè)定酶標(biāo)板內(nèi)溶液的熒光強(qiáng)度；

比較空白對(duì)照組和檢測(cè)組的熒光強(qiáng)度大小，判斷分選酶SortaseA是否具有活性。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白是用原核表達(dá)載體表達(dá)制備，不需要化學(xué)合成和修飾，制備的底物蛋白是受分選酶特異性激活的GFP蛋白，在沒(méi)有被分選酶Sortase A切割前，不產(chǎn)生成熟的GFP熒光蛋白，不會(huì)產(chǎn)生熒光，而被分選酶Sortase A切割后，可以產(chǎn)生成熟的GFP熒光蛋白，產(chǎn)生熒光，在靈敏度上完全可以替代現(xiàn)有的基于FRET原理的化學(xué)合成的底物蛋白。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白，一般實(shí)驗(yàn)條件下就可制備，成本低、周期短，且不受化學(xué)合成技術(shù)的限制，底物蛋白的制備成功率高，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為底物蛋白和金黃色葡萄球菌的分選酶SortaseA反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)分選酶Sortase A活性的底物蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述底物蛋白的核苷酸序列中含有分別編碼分選酶Sortase A特異識(shí)別的核苷酸序列、GFP熒光淬滅序列以及GFP蛋白的核苷酸序列。

基于同一種發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)分選酶SortaseA活性的底物蛋白表達(dá)載體，所述底物蛋白表達(dá)載體是在大腸桿菌表達(dá)載體pET28a中插入如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列構(gòu)建而成，具體按照以下步驟構(gòu)建：

步驟1，人工合成如SEQ ID NO.3所示的DNA片段。

根據(jù)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的基因序列，編碼金黃色葡萄球菌分選酶Sortase A能識(shí)別的表面蛋白C端分選信號(hào)所含的保守基序LPXTG的核苷酸序列，以及編碼熒光淬滅蛋白(quenching peptide，QP)的核苷酸序列，在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的5’端添加NcoI的酶切位點(diǎn)，3’端添加X(jué)hoI的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并人工合成如SEQ ID NO.3所示的DNA片段，SEQ ID NO.3所示的具體序列片段如下：

，其中5’端的劃線部分為Nco I的酶切位點(diǎn)，3’端的劃線部分為XhoI的酶切位點(diǎn)，大寫(xiě)字母所示的核苷酸序列中含有可編碼GFP的序列，小寫(xiě)加黑字母所示的核苷酸序列用于編碼可被分選酶SortaseA特異性識(shí)別并剪切的肽段的序列，小寫(xiě)斜體所示的核苷酸序列為編碼熒光淬滅蛋白的核苷酸序列。

需要說(shuō)明的是，SEQ ID NO.3所示的DNA片段既包括了如SEQ ID NO.1所示的DNA片段，也包括了Nco I、XhoI的酶切位點(diǎn)。

步驟2，底物蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

將如SEQ ID NO.3所示的DNA片段經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，并將雙酶切后的產(chǎn)物連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a相應(yīng)的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建成底物蛋白表達(dá)載體，具體包括：

步驟2.1，以NcoI、XhoI雙酶切如SEQ ID NO.3所示的DNA片段，并回收1.6kb的目的DNA片段；以NcoI、XhoI雙酶切大腸桿菌表達(dá)載體pET28a，并回收5.2kb的載體DNA片段；將1.6kb的目的DNA片段與5.2kb的載體DNA片段于16℃連接過(guò)夜(10-16h)，構(gòu)建成底物蛋白表達(dá)載體，將底物蛋白表達(dá)載體命名為，底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP，該底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

步驟2.2，將底物蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿DH5α菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選獲得陽(yáng)性菌株，測(cè)序鑒定底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP是否構(gòu)建成功。

基于同一種發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述底物蛋白表達(dá)載體(底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP)，在檢測(cè)金黃色葡萄球菌的分選酶Sortase A活性中的應(yīng)用，且上述底物蛋白表達(dá)載體檢測(cè)金黃色葡萄球菌的分選酶SortaseA活性的方法，具體包括以下步驟：

步驟(1)，按上述步驟1-2的方法制備底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP。

步驟(2)，獲取底物蛋白溶液

將底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21DE3(大腸桿菌BL21(DE3))中，誘導(dǎo)表達(dá)底物蛋白，然后利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)底物蛋白產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到底物蛋白溶液，具體包括：

步驟(2.1)，將底物蛋白表達(dá)載體pET28a-GFP-QALPETGEE-QP轉(zhuǎn)化入大腸桿BL21DE3菌感受態(tài)細(xì)胞中，次日挑取單菌落，并于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)過(guò)夜的時(shí)間為10-16h，得到培養(yǎng)液；

步驟(2.2)，取10mL培養(yǎng)液接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，且每毫升LB液體培養(yǎng)基中含有25μg卡那霉素，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6-0.8。

步驟(2.3)，將步驟(2.2)的溶液溫度降至16℃，加入IPTG，并使IPTG的終濃度為1mmol/L，之后于16℃誘導(dǎo)過(guò)夜，誘導(dǎo)過(guò)夜的時(shí)間為10-16h，得到誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

步驟(2.4)，將誘導(dǎo)培養(yǎng)液于4℃、14000rpm，離心30min，收集沉淀，并用50mL裂解緩沖液重懸沉淀，冰浴上超聲破碎30min，其中超聲破碎的頻率是400W，后于4℃、14000rpm、離心30min，收集上清，得到含有底物蛋白表達(dá)產(chǎn)物的上清液，最后通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)上清液中的底物蛋白。

步驟(2.5)，利用Ni-NTA親和層析柱(鎳柱)對(duì)底物蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到底物蛋白溶液。

用5mL濃度為10mmol/L的咪唑洗滌緩沖液平衡Ni-NTA親和層析柱后，將含有底物蛋白表達(dá)產(chǎn)物的上清液過(guò)柱，因?yàn)榈孜锏鞍椎腘端上有His標(biāo)簽，因此能夠結(jié)合到Ni-NTA親和層析柱上，再用5ml濃度為150mmol/L咪唑洗脫液洗脫，收集流出液，得到底物蛋白溶液，測(cè)定底物蛋白溶液中底物蛋白的濃度，并將底物蛋白命名為GFP-QALPETGEE-QP。

其中，10mmol/L的咪唑洗滌緩沖液由NaH₂PO₄、NaCl、Tween-20、咪唑和去離子水制備而成，且裂解緩沖液中NaH₂PO₄的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為300mmol/L、Tween-20的體積百分比濃度為0.05％、咪唑的濃度為10mmol/L，配制好后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)為pH為7.0。

150mmol/L咪唑洗脫液由NaH₂PO₄、NaCl、Tween-20、咪唑和去離子水制備而成，且裂解緩沖液中NaH₂PO₄的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為300mmol/L、Tween-20的體積百分比濃度為0.05％、咪唑的濃度為150mmol/L配制好后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)為pH為7.0。

步驟(3)，獲取分選酶SortaseA溶液

利用大腸桿菌表達(dá)載體pET28a構(gòu)建含有金黃色葡萄球菌基因組中分選酶Sortase A基因的表達(dá)載體pET28a-srtA，然后將表達(dá)載體pET28a-srtA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21DE3菌感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)分選酶Sortase A，得到分選酶Sortase A表達(dá)產(chǎn)物，然后利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)分選酶Sortase A表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到分選酶SortaseA溶液，具體包括：

步驟(3.1)，引物設(shè)計(jì)：根據(jù)金黃色葡萄球菌的分選酶SortaseA基因序列，用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)合成了一對(duì)寡核苷酸引物，包括上游引物：5′-CATGCCATGGGCCAAGCTAAACCT-3′(劃線部分為NcoI酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CCGCTCGAGGCTGCTGCCTTTGACTTCTGTAGCTACAAAGA-3′(劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。

步驟(3.2)，提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，并以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板DNA，進(jìn)行分選酶Sortase A基因的PCR擴(kuò)增，最后經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳回收PCR產(chǎn)物。

PCR總體積25μL，包括：模板DNA 1μL(模板DNA濃度為50ng/μL)、2.5μL 10×buffer、上游引物1μL(上游引物濃度為10μmol/L)、下游引物1μL(下游引物濃度為10μmol/L)、2.0μL的2.5mmol/L dNTP、0.2μL ExTaq聚合酶、17.3μL ddH₂O。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，60.2℃退火1min，72℃延伸1min，共28個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸7min，最后4℃終止反應(yīng)。

步驟(3.3)，步驟(3.2)的PCR產(chǎn)物和大腸桿菌表達(dá)載體pMD18T于4℃連接過(guò)夜，連接過(guò)夜時(shí)間為10-16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，得到含有分選酶SortaseA基因的pMD18T載體的陽(yáng)性細(xì)胞。

步驟(3.4)，提取步驟(3.3)的陽(yáng)性細(xì)胞中含有分選酶Sortase A基因的pMD18T載體，然后經(jīng)NcoI、XhoI雙酶切，回收0.46kb的目的DNA片段；同時(shí)以NcoI、XhoI雙酶切大腸桿菌表達(dá)載體pET28a，回收5.2kb的載體DNA片段；0.46kb的目的DNA片段與5.2kb的載體DNA片段于16℃連接過(guò)夜，該連接過(guò)夜時(shí)間為10-16h，構(gòu)建成分選酶SortaseA表達(dá)載體。

步驟(3.5)，將分選酶Sortase A表達(dá)載體經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿BL21DE3菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得攜帶有分選酶SortaseA表達(dá)載體的原核表達(dá)菌。

步驟(3.6)，挑取原核表達(dá)菌的單菌落，接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，且每毫升LB液體培養(yǎng)基中含有50ug卡那霉素，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，該培養(yǎng)過(guò)夜時(shí)間為10-16h，得到原核表達(dá)菌培養(yǎng)物。

步驟(3.7)，按原核表達(dá)菌培養(yǎng)物：含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基＝1：100的體積比例，將原核表達(dá)菌培養(yǎng)物接種至20mL的含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，且每毫升LB液體培養(yǎng)基中含有50ug卡那霉素，37℃220r/min，培養(yǎng)至OD600＝0.6。

步驟(3.8)，將步驟(3.7)的溶液溫度降至28℃，加入IPTG，并使IPTG的終濃度為1mmol/L，之后于28℃180r/min，誘導(dǎo)表達(dá)6h，得到原核表達(dá)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

步驟(3.9)，取原核表達(dá)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)液400μL，4℃、10000r/min，離心30s，收集沉淀物，并將沉淀物重懸于5mL裂解緩沖液中，加入50μL 100mg/mL溶菌酶，冰上放置30min，然后400W超聲波破碎5min，再依次加入0.5μL 5U/mL DnaseI、5μL 10μg/mL RnaseA、125μL 1mol/L MgCl₂、250μL 20％TrionX-100，4℃放置30min，14 000g離心10min，收集上清，得到含有分選酶Sortase A表達(dá)產(chǎn)物的上清液。

其中，步驟(2.4)和步驟(3.9)的裂解緩沖液由NaH₂PO₄、NaCl、Tween-20和去離子水制備而成，且裂解緩沖液中NaH₂PO₄的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為300mmol/L、Tween-20的體積百分比濃度為0.05％，配制好后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH＝8.0。

步驟(3.10)，利用Ni-NTA親和層析柱(鎳柱)對(duì)分選酶SortaseA表達(dá)產(chǎn)物的上清液進(jìn)行純化，得到分選酶SortaseA溶液，包括：

用5mL濃度為20mmol/L咪唑洗滌緩沖液洗平衡Ni-NTA親和層析柱后，將含有分選酶Sortase A表達(dá)產(chǎn)物的上清液過(guò)柱，再用5mL濃度為250mmol/L咪唑洗脫液洗脫，收集流出液，得到分選酶SortaseA溶液。

20mmol/L的咪唑洗滌緩沖液由NaH₂PO₄、NaCl、Tween-20、咪唑和去離子水制備而成，且裂解緩沖液中NaH₂PO₄的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為300mmol/L、Tween-20的體積百分比濃度為0.05％、咪唑的濃度為20mmol/L，配制好后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)為pH為7.0。

250mmol/L咪唑洗脫液由NaH₂PO₄、NaCl、Tween-20、咪唑和去離子水制備而成，且裂解緩沖液中NaH₂PO₄的濃度為50mmol/L、NaCl的濃度為300mmol/L、Tween-20的體積百分比濃度為0.05％、咪唑的濃度為250mmol/L配制好后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)為pH為7.0。

步驟(4)，以底物蛋白溶液為空白對(duì)照組，利用酶標(biāo)儀對(duì)分選酶Sortase A溶液中分選酶SortaseA的活性進(jìn)行檢測(cè)

步驟(4.1)，將底物蛋白溶液和分選酶SortaseA溶液混合加入到酶標(biāo)板中，作為檢測(cè)組，同時(shí)以底物蛋白溶液為空白對(duì)照組；

步驟(4.2)，將酶標(biāo)板置于37℃，避光孵育1h；

步驟(4.3)，酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)定為350nm激發(fā)，495nm記錄，測(cè)定每孔的熒光強(qiáng)度；

步驟(4.4)，比較空白對(duì)照組和檢測(cè)組的熒光強(qiáng)度大小，判斷分選酶Sortase A是否具有活性。

圖2為底物蛋白和金黃色葡萄球菌的分選酶Sortase A反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化圖，共計(jì)三組平行實(shí)驗(yàn)，如圖2所示，當(dāng)?shù)孜锏鞍缀头诌x酶Sortase A反應(yīng)后，可以在酶標(biāo)儀下檢測(cè)到熒光值升高的現(xiàn)象；而底物蛋白組熒光值很低，說(shuō)明本發(fā)明提供的底物蛋白可以有效的檢測(cè)分選酶Sortase A的活性。

需要說(shuō)明的是，上述大腸桿菌BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司，Ni-NTA親和層析柱由購(gòu)自德國(guó)默克生物科學(xué)公司的Ni-NTAHis·Bind樹(shù)脂(貨號(hào)70666)和空色譜柱(貨號(hào)69673)按常規(guī)方法制備而成。

需要說(shuō)明的是上述試驗(yàn)中，利用Ni-NTA親和層析柱(鎳柱)對(duì)底物蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，和利用Ni-NTA親和層析柱(鎳柱)對(duì)分選酶Sortase A表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，均是按照常規(guī)的Ni-NTA親和層析柱(鎳柱)使用方法進(jìn)行純化的。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。