專利名稱：Rhamm結(jié)合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新肽，以及它們?cè)谟糜阼b定表達(dá)RHAMM的細(xì)胞的組合物和方法中的用途，以及它們?cè)谥委烺HAMM/配體復(fù)合物形成所致的病癥或病況的組合物和方法中的用途。
背景技術(shù)：
在本申請(qǐng)的全文中，多種參考文獻(xiàn)在方括號(hào)中引用，以更充分地描述本發(fā)明所述領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)水平。乙酰透明質(zhì)酸(HA，葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺的重復(fù)單元的陰離子型聚合物)是基質(zhì)的一種胞外基質(zhì)(ECM)組分，其與癌癥的進(jìn)展相關(guān)在癌癥患者中腫瘤HA積累增加預(yù)不著后果不良[1，2, 3] ο HA在體外刺激癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性,表明其在體內(nèi)在癌細(xì)胞侵襲中的重要性。已牽涉癌癥進(jìn)展的2種HA細(xì)胞受體是⑶44和RHAMM (HA-介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性的受體)。目前公認(rèn)祖細(xì)胞或“腫瘤起始細(xì)胞”不成比例地促進(jìn)白血病的腫瘤形成潛力。新近已描述了在乳癌(BC)和其它實(shí)體瘤中的一種類似現(xiàn)象，并且這些腫瘤細(xì)胞亞類的表型已被部分地表征為⑶44+/⑶24-/ESA+。盡管這些細(xì)胞亞類與臨床后果間準(zhǔn)確的關(guān)系尚有爭(zhēng)論，但是經(jīng)FAGS從原代BC中分選出的⑶44+細(xì)胞表達(dá)預(yù)測(cè)不良臨床后果的基因標(biāo)簽。RHAMMmRNA和蛋白過量表達(dá)也發(fā)生在原代人乳瘤細(xì)胞亞類中并且這些RHAMM陽性亞類在BC中的存在預(yù)示著不良臨床后果和外周轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加。盡管CD44在許多正常組織中都表達(dá)，但在這些組織中未檢出RHAMM的表達(dá)，而是出現(xiàn)在創(chuàng)傷修復(fù)之后和病理過程例如癌癥進(jìn)展期間。因此⑶44-陽性和RHAMM-陽性腫瘤細(xì)胞亞類的成像在鑒定處于不良后果的風(fēng)險(xiǎn)之中的患者方面是相關(guān)的。然而，直到本文件寫成之日，還未對(duì)這些和/或其它腫瘤祖細(xì)胞直接成像。因此，可有利的是，找到能夠靶向RHAMM的分子成像探針，以提供對(duì)祖細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行非侵襲性成像的方法。這種靶向方法也可提供用治療藥劑選擇性靶向祖細(xì)胞的方法，或直接通過配體-受體相互作用，或間接通過將治療性有效載荷(payload)遞送給靶細(xì)胞。例如，可以將發(fā)射粒子的同位素遞送到祖細(xì)胞，或可將化療藥遞送到細(xì)胞(例如順鉬)。本發(fā)明提供用于靶向RHAMM的新肽配體，這是以前未報(bào)道過的。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及能結(jié)合RHAMM的新肽的發(fā)現(xiàn)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的肽，其包含選自至少以下氨基酸序列的至少一種氨基酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17。另一方面，本發(fā)明提供分離的DNA，所述DNA包含編碼SEQ ID No.1至SEQ ID NO:17的肽的核酸序列(nucleic sequence)。本發(fā)明還涉及以一定的特異性和親和力與RHAMM結(jié)合的肽的發(fā)現(xiàn)，其中所述肽源自微管蛋白。一方面，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽源自微管蛋白的羧基端尾。依照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供RHAMM-結(jié)合肽，其中所述RHAMM-結(jié)合肽包含選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的至少一種氨基酸序列。依照另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，Z選自酪氨酸或谷氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含有效量的一種或多種本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供探針，其包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)受試者組織或器官中的RHAMM表達(dá)進(jìn)行成像的方法，其特征在于所述方法包括(a)給予包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針；和(b)應(yīng)用成像技術(shù)以在受試者組織或器官中檢測(cè)所述標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，提供測(cè)定細(xì)胞中RHAMM的存在情況的方法，其特征在于所述方法包括使細(xì)胞與包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針接觸，和應(yīng)用成像技術(shù)以在細(xì)胞中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中細(xì)胞中所述標(biāo)記的檢出表示細(xì)胞中RHAMM的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)受試者的腫瘤祖細(xì)胞進(jìn)行成像的方法，其特征在于所述方法包括將包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針給予所述受試者并將成像技術(shù)用于在受試者中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中受試者中所述標(biāo)記的檢出表示受試者中腫瘤祖細(xì)胞的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是對(duì)動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官中的腫瘤祖細(xì)胞進(jìn)行成像的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞、組織或器官與包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針接觸，和應(yīng)用成像技術(shù)以在細(xì)胞、組織或器官中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中細(xì)胞、組織或器官中所述標(biāo)記的檢出表示細(xì)胞、組織或器官中腫瘤祖細(xì)胞的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定癌癥患者的預(yù)后的方法，其特征在于所述方法包括(a)從所述患者獲取腫瘤組織樣品；(b)使所述樣品與包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針接觸；(c)應(yīng)用成像技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)所述標(biāo)記；和(d)確定所述患者的預(yù)后，其中所述預(yù)后預(yù)測(cè)患者的癌癥侵占性(aggressiveness)或轉(zhuǎn)移的可能性,和其中所述樣品中RHAMM表達(dá)的檢出表示不良預(yù)后。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定用于癌癥患者的療程的方法，其特征在于所述方法包括(a)從所述患者獲取腫瘤組織樣品；(b)使所述樣品與包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針接觸；(C)應(yīng)用成像技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)所述標(biāo)記；和(d)確定所述患者的預(yù)后，其中所述預(yù)后預(yù)測(cè)患者的癌癥侵占性的可能性，和其中所述樣品中RHAMM表達(dá)的檢出表示不良預(yù)后；并根據(jù)所述預(yù)后而確定用于所述患者的療程。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于診斷與RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的患者的方法，其特征在于所述方法包括(a)從所述患者獲取組織樣品；(b)使所述樣品與包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的探針接觸；和(c)應(yīng)用成像技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)所述標(biāo)記；其中所述樣品RHAMM表達(dá)的檢出表不所述病癥或病況的陽性診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患有與RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的受試者的方法，其特征在于所述方法包括給予所述受試者有效量的組合物，所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，Z選自酪氨酸或谷氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患有與RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的受試者的方法，其特征在于所述方法包括給予所述受試者有效量的組合物，所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs.1-17。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞增殖的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，Z選自酪氨酸或谷氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞增殖的方法，其特征在于所述方法包括使細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs:1-17。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量(effective)的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，Z選自酪氨酸或谷
氨酸。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs:1-17。在本發(fā)明的多個(gè)方面，所述表達(dá)RHAMM的細(xì)胞是癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在癌癥患者中預(yù)防轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述方法包括給予所述患者有效量的包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子的組合物，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，Z選自酪氨酸或谷氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在癌癥患者中預(yù)防轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述方法包括給予所述患者有效量的包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子的組合物，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs:1-17。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供RHAMM-結(jié)合肽在治療、改善或預(yù)防RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況中的用途，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO:18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，Z選自酪氨酸或谷氨酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述RHAMM-結(jié)合肽的核酸在治療、改善或預(yù)防RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況中的用途，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽選自 SEQ ID NOs: 1-17。在本發(fā)明的多個(gè)方面，所述RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況是組織瘢痕形成。在本發(fā)明的多個(gè)方面，所述RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況是癌癥。在本發(fā)明的多個(gè)方面，本發(fā)明的肽可在肽的一端或兩端添加半胱氨酸，從而通過二硫鍵形成、磷基團(tuán)和乙?；姆绞蕉h(huán)化。在本發(fā)明范圍之內(nèi)的還有本發(fā)明的任何肽的功能類似物以及本發(fā)明肽的多聚體例如本發(fā)明肽的二聚體或三聚體。本發(fā)明的多聚體可以是由多個(gè)相同的肽組成的同型多聚體或由不同的肽組成的異型多聚體。本發(fā)明肽的特征性氨基酸序列可側(cè)接隨機(jī)氨基酸序列。優(yōu)選的是對(duì)肽具有穩(wěn)定作用、因而增加其生物利用度的側(cè)翼序列。側(cè)翼序列也可用于改進(jìn)藥物動(dòng)力學(xué)行為。在本發(fā)明范圍之內(nèi)的還有融合肽和peg化(pegylated)肽，其可改進(jìn)代謝穩(wěn)定性，增加生物利用度，降低對(duì)蛋白水解的敏感性。在本發(fā)明范圍之內(nèi)的還有這樣的肽其特征為至少一個(gè)氨基酸被具有類似化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸取代；至少一個(gè)氨基酸被非天然氨基酸取代，所述非天然氨基酸例如N-甲基化氨基酸、D-氨基酸或其它非天然氨基酸構(gòu)建體；在N-端或/和C-端存在至少一個(gè)額外氨基酸；至少一個(gè)氨基酸缺失；和至少一個(gè)氨基酸被化學(xué)修飾。附圖簡(jiǎn)述
根據(jù)本文給出的詳細(xì)描述和附圖，將會(huì)更充分理解本發(fā)明，所述描述和附圖都是以說明性方式給出而并非限制本發(fā)明預(yù)期 范圍。

圖1A顯示72 kDa RHAMM蛋白的圖，所述蛋白含有RHAMM/乙酰透明質(zhì)酸(HA)相互作用所必需的HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基718-750，SEQ ID NO: 19)。圖1B說明分子成像探針的設(shè)計(jì)和優(yōu)化的流程圖。圖2A顯示以下的通用結(jié)構(gòu)(a)未經(jīng)修飾的微管蛋白_衍生的肽，(b)與N-乙酰半胱氨酸綴合的微管蛋白-衍生的肽，和(C)與異硫氰酸熒光素綴合的微管蛋白-衍生的肽。圖2B是17種合成的微管蛋白-衍生的肽的表，包括用熒光素或N-乙酰半胱氨酸衍生的肽、微管蛋白片段種類、計(jì)算的和實(shí)測(cè)的質(zhì)譜m/z值(m表示分子量或原子量，z表示離子攜帶的元電荷數(shù)量)、％純度和結(jié)合常數(shù)Kd。圖2B按照出現(xiàn)的順序分別公開了 SEQ IDNOs: 1、24-25、2-3、26-27、4-9、28-29、10-11、30-31、12、32-33、13-14、34-35 和 15-17。圖3A是一個(gè)表，說明RHAMM-CT固定在表面等離振子共振(SPR)傳感器板的pH依賴性。根據(jù)6次測(cè)量的平均SPR反應(yīng)測(cè)定配體密度。對(duì)于RHAMM pi = 10. 1，用碳酸氫鈉緩沖液(pH 9. 7)作為對(duì)照運(yùn)行。用EDAC (100 mM)和磺基-NHS (25 mM)將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到傳感器板。圖3B說明針對(duì)RHAMM，對(duì)純化的微管蛋白-衍生的肽(SEQ ID NOs: 1-17)的基于表面等離振子共振(SPR)的篩選，以測(cè)定高親和力配體。篩選得到6種對(duì)RHAMM具有高親和力的配體(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12 和 14)。圖3C是證實(shí)經(jīng)SPR篩選后的6種肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)的親和力的ELISA結(jié)合測(cè)定，說明熒光素-標(biāo)記的本發(fā)明肽與RHAMM的結(jié)合。從每次測(cè)量中減去陰性對(duì)照(未固定的RHAMM)。
圖4A說明7組傳感圖，顯示每組特定肽-RHAMM相互作用的總體擬合，并有陰性對(duì)照和參比傳感圖。抗RHAMM mAb用作陽性對(duì)照。每組傳感圖都對(duì)應(yīng)3個(gè)RHAMM濃度(1000nM、750 nM和500 nM)與固定化肽的相互作用的反應(yīng)。圖4B是一個(gè)表，說明所選微管蛋白-衍生的肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)和RHAMM單克隆抗體(mAb)的動(dòng)力學(xué)概況。該表顯示計(jì)算的締合速率(KJ、解離速率(Ktw)和結(jié)合常數(shù)(KD)。誤差是平均Kd的標(biāo)準(zhǔn)差。圖5A是一幅圖，顯示6種所選熒光素-標(biāo)記的本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NOs:1、3、9、11、12 和 14 (分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33 和 35)被HA (0、1.25、2.5、5 和 10 μ g/mL)競(jìng)爭(zhēng)性置換(competitive displacement)到固定化 RHAMM-CT。數(shù)據(jù)顯不在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值。圖5B是一幅圖，顯示染料-標(biāo)記的HA被6種所選非標(biāo)記的本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)競(jìng)爭(zhēng)性置換到固定化RHAMM-CT。數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值。圖5C是一幅圖，顯示6種熒光素-綴合的本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NOs:1、3、9、11、12 和 14 (分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33 和 35)和純化的 CD44 或RHAMM-CT的ELISA結(jié)合測(cè)定。數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值。圖6A是顯微照片，說明在乳瘤細(xì)胞(MDA-MB-231)中使用熒光成像，對(duì)熒光素-綴合的 SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)攝取的顯現(xiàn)(visualization)。DAPI 通道表示核，而FITC通道說明熒光素-標(biāo)記的肽的定位。圖6B是一幅圖，說明在乳瘤細(xì)胞(MDA-MB-231)中熒光素-綴合的SEQ ID NOs:1、9和14 (SEQ ID NOs: 25、29、35)攝取的定量測(cè)定。每一柱形代表來自3個(gè)實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)的1048次測(cè)量 的平均值。與接受抗RHAMM治療的組相比，所有治療組顯著更高(p〈 O. 001)。用ANOVA分析數(shù)據(jù)，誤差是平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。圖7是顯微照片，說明在乳瘤細(xì)胞(MDA-MB-231)中使用熒光成像，F(xiàn)ITC-綴合的SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NOs: 25 和 29)攝取的顯現(xiàn)。DAPI 通道表示核，而FITC通道說明熒光素-標(biāo)記的肽的定位。圖8A是RHAMM的HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(aa 716-750 ；SEQ ID NO: 19)。HA結(jié)合所需的堿性氨基酸殘基用下劃線標(biāo)出。圖8B是4種RHAMM-結(jié)合肽(SEQ ID NOs: 1、3、9和11)的氨基酸序列比對(duì)。相同序列用灰色突出顯示，而半保守殘基用白色框標(biāo)出?？膳cRHAMM上的堿性氨基酸殘基通過離子鍵合相互作用的酸性氨基酸殘基用下劃線標(biāo)出。圖9說明SEQ ID NOs: 1、3、9、10、12和14的血清穩(wěn)定性研究。圖顯示％完整肽(經(jīng)RP-HPLC檢測(cè))，以30分鐘的增量，共11小時(shí)。數(shù)據(jù)擬合到一級(jí)衰減曲線。圖1OA是一幅圖，說明丙氨酸-取代的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO:1 (SEQ IDNO: 25)與RHAMM (分別為SEQ ID NOs:1和36-47，從左欄到右欄)的親和力。星號(hào)表示觀測(cè)到的熒光顯著降低(P〈0. 01)，因?yàn)閷?duì)RHAMM-結(jié)合而言重要的殘基的丙氨酸取代(從每次測(cè)量中減去未固定的RHAMM并且所有數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值)。圖1OB說明12種丙氨酸-取代的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:25)被HA競(jìng)爭(zhēng)性置換到固定化RHAMM (分別為SEQ ID NOs:1和36-47，從左到右)。陰性對(duì)照(從每次測(cè)量中減去未固定的RHAMM并且所有數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值)。圖11是一幅圖，說明在不同濃度(I μπι和10 μ m)的RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO:1存在下，人上皮卵巢癌(EOC)細(xì)胞的增殖測(cè)定。在該測(cè)定中，在第一天處理細(xì)胞，然后增殖6天。圖12是一幅圖，說明本發(fā)明的Rhamm-結(jié)合肽SEQ ID NO: 3降低了腹水-來源的人EOC細(xì)胞的活力(p〈005)。圖13是顯微照片，說明使用熒光顯微術(shù)，卵巢瘤細(xì)胞對(duì)熒光素-綴合的肽SEQ IDNO:1 (SEQ ID NO: 25)的攝取。DAPI通道表示核，而FITC通道說明熒光素-標(biāo)記的肽的定位。圖14 A顯示(a)使用熒光顯微術(shù)，PC3mLN4人前列腺癌細(xì)胞對(duì)本發(fā)明熒光素-綴合的SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 29)的攝取，(b)對(duì)熒光素-SEQ ID NO: 9的攝取未被特異性抗⑶44 mAb封閉， 然而，(c)對(duì)熒光素-綴合的SEQ ID NO: 9的攝取卻被特異性抗RKAMM mAb 封閉。圖14 B顯示PC3mLN4人前列腺癌細(xì)胞對(duì)本發(fā)明SEQ ID NO: 9攝取的定量測(cè)定。數(shù)據(jù)顯示接受無抗體治療的細(xì)胞(a)和用抗CD44封閉的細(xì)胞(b)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在用抗RHAMM抗體治療的細(xì)胞中對(duì)探針的攝取極大地下降(c)。圖15 A說明Ga-DOTA-綴合的SEQ ID NO:1肽的合成。圖15 B是純化的Ga-DOTA-綴合的SEQ ID NO:1肽在9. 73分鐘的RP-HPLC色譜圖。圖15C是純化的Ga-DOTA-綴合的SEQ ID NO:1肽的ESI質(zhì)譜。圖16A說明Re(CO)3+ -配位的SEQ ID NO:1肽的合成。圖16B是純化的Re (CO) 3+ _配位的SEQ ID NO:1肽在11. 06分鐘的RP-HPLC色譜圖。圖16C是純化的Re (CO) 3+ _配位的SEQ ID NO:1肽的ESI質(zhì)譜。圖17A說明丙氨酸-取代的熒光素-綴合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO ；35)肽與RHAMM (分別為SEQ ID NOs: 48-55，14和56-58，從左欄到右欄)的親和力。星號(hào)表示觀測(cè)到的熒光顯著降低(P〈0. 01)，這是由于對(duì)RHAMM-結(jié)合而言重要的殘基的丙氨酸取代(從每次測(cè)量中減去未固定的RHAMM并且所有數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值)所致。圖17B說明11種丙氨酸-取代的熒光素-綴合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO:35)肽被HA競(jìng)爭(zhēng)性置換到固定化RHAMM (分別為SEQ ID NOs: 48-55、14和56-58，從左到右)。陰性對(duì)照(從每次測(cè)量中減去未固定的RHAMM并且所有數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值)。發(fā)明詳述 定義
氨基酸殘基的以下標(biāo)準(zhǔn)單字母和三字母縮寫可用于本說明書全文A，Ala-丙氨酸；R, Arg-精氨酸；N, Asn—天冬酰胺；D, Asp—天冬氨酸；C，Cys—半胱氨酸；Q, Gin—谷氨酰胺；E, Glu—谷氨酸；G, Gly—甘氨酸；H, His—組氨酸；I, IIe—異売氨酸；L,Leu—亮氨酸；K, Lys—賴氨酸；Μ, Met—甲硫氨酸；F, Phe-苯丙氨酸；P, Pro—脯氨酸；S，Ser-絲氨酸；T，Thr-蘇氨酸;W，Trp色氨酸；Y，Tyr—酪氨酸；和V，Val-纈氨酸。類似物”包括具有與本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽序列基本相同的氨基酸殘基序列的任何肽，其中一個(gè)或多個(gè)殘基已被功能類似的殘基保守取代和其表現(xiàn)出模擬HA結(jié)合肽的能力。“衍生物”是指一個(gè)或多個(gè)殘基通過功能性側(cè)基反應(yīng)而化學(xué)衍生的肽。這樣的衍生分子可包括例如這樣的分子其中游離氨基被衍生而形成胺的鹽酸鹽、對(duì)甲苯磺?；⑵S氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙?；蚣柞；?。游離羧基可被衍生而形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼。游離羥基可被衍生而形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生而形成N-1m-芐基組氨酸。衍生物還包括含有20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如4-羥脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥賴氨酸可取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；同型絲氨酸可取代絲氨酸；和鳥氨酸可取代賴氨酸。術(shù)語“片段”是指所具有的氨基酸殘基序列比其氨基酸殘基序列已在本文顯示的肽更短的任何主題肽。術(shù)語“分離的肽”或“分離的DNA”視情況而定可定義為肽或DNA分子，其可與可天然伴隨肽和DNA分子的其它細(xì)胞組分基本分離。該術(shù)語包括但不限于重組或克隆的DNA分離物和經(jīng)化學(xué)合成的類似物或經(jīng)異源系統(tǒng)生物合成的類似物。本文所用的術(shù)語“肽”定義為通常具有確定序列的氨基酸殘基鏈。本文所用的術(shù)語“肽(P印tide)”與術(shù)語“肽(P印tides)”和“蛋白”互相包含。在本文件中“RHAMM”是指透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性的受體，也稱為⑶168。RHAMM為非整合細(xì)胞表面(⑶168)和胞內(nèi)乙酰透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，其在體外促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性并且其表達(dá)在侵占性腫瘤中被強(qiáng)烈上調(diào)(W0 2008/140587]。本文所用的術(shù)語“RHAMM-結(jié)合肽”是指能結(jié)合RHAMM的肽。“受試者”或“患者”是指需要治療病況、病癥或疾病的動(dòng)物，包括人。概述
本發(fā)明涉及可能夠結(jié)合RHAMM的肽和編碼所述肽的核酸序列。本發(fā)明還涉及在可能與RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的疾病、病況或病癥的治療中使用所述RHAMM-結(jié)合肽和編碼所述RHAMM-結(jié)合肽的核酸序列的方法。本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可用于探針，所述探針可能夠鑒定表達(dá)RHAMM的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用RHAMM-結(jié)合肽來鑒定可能包含表達(dá)RHAMM的細(xì)胞的樣品的方法。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)包括(a)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與RHAMM特異性結(jié)合的新的小肽；(b)按照本發(fā)明人的了解，腫瘤祖細(xì)胞尚不能直接成像。所述新肽可用作分子成像探針，用于對(duì)祖細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行無侵襲性成像；(c)可利用所述新肽特異性結(jié)合RHAMM的能力，從而用治療藥劑選擇性靶向祖細(xì)胞，或者直接通過配體-受體相互作用，或間接通過將治療性有效載荷遞送給靶細(xì)胞；(d)本發(fā)明肽與RHAMM的結(jié)合增加了表位暴露和抗RHAMM Mab的結(jié)合，其可允許增強(qiáng)成像以及治療性靶向RHAMM陽性細(xì)胞。根據(jù)以下詳述，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將會(huì)是顯而易見的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，表示本發(fā)明實(shí)施方案的詳述和具體實(shí)施例僅通過說明的方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)所述詳述，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都將是顯而易見的。
RHAMM-結(jié)合肽
本發(fā)明人已經(jīng)分離、測(cè)序和表征了大約6-14個(gè)氨基酸殘基的新肽。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼肽的分離的DNA，所述肽具有選自SEQ ID NO:1至17的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的分離的肽。本發(fā)明的新肽可能夠結(jié)合RHAMM。在本發(fā)明的多個(gè)方面，本發(fā)明的新RHAMM-結(jié)合肽可能夠特異性結(jié)合RHAMM。在本發(fā)明的多個(gè)方面，本發(fā)明的新的RHAMM-結(jié)合肽可能夠以顯著高親和力結(jié)合RHAMM。在本發(fā)明的多個(gè)方面，本發(fā)明的新的RHAMM-結(jié)合肽可能夠以顯著高親和力特異性結(jié)合RHAMM。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的新的RHAMM-結(jié)合肽可包含下式(I)的序列
(I) EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)
其中X選自A或G，Z選自Y或E。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的新的RHAMM-結(jié)合肽可包含選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17 的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供RHAMM-結(jié)合肽，其中所述肽選自SEQ ID NOs:1、3、9、10、11、12 和 14。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供RHAMM-結(jié)合肽，其中所述肽選自SEQ ID NOs:1、9 和 14。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可源自微管蛋白的羧基端尾(CTT)區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RHAMM-結(jié)合肽可源自與微管蛋白的CTT區(qū)緊鄰的序列。意想不到的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RHAMM與維持有絲分裂紡錘體所必需的蛋白質(zhì)共享結(jié)構(gòu)和功能相似性。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可顯示與許多驅(qū)動(dòng)蛋白和微管相關(guān)蛋白(MAP)的微管蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列同源性。微管蛋白的CTT區(qū)已經(jīng)證明與常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白和MAP相互作用。舉例而言，當(dāng)與染料-綴合的本發(fā)明肽一起孵育時(shí)，已知表達(dá)RHAMM的人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231顯示出胞內(nèi)熒光，如圖6A和圖7所示。用抗RHAMM封閉的細(xì)胞的胞內(nèi)熒光減少大約65%至大約85%，如圖6B所示。當(dāng)與本發(fā)明的RHAMM肽一起孵育時(shí)，其它表達(dá)RHAMM的癌細(xì)胞例如PC3mLN4和患者來源的卵巢瘤細(xì)胞也顯示胞內(nèi)熒光，如圖13和圖14所示。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽與RHAMM結(jié)合可增加表位暴露和抗RHAMM單克隆抗體(mAb)結(jié)合。本發(fā)明RHAMM結(jié)合肽的這種增加向抗RHAMM mab的表位暴露的能力，可在治療上使用并用于增強(qiáng)成像。因此，本發(fā)明的肽可用于例如“活化”現(xiàn)存的RHAMM，例如在腫瘤(但不限于該病)中。因此，可給予治療的或成像(例如Fab片段)的抗RHAMMmAb并可更有效地靶向表達(dá)RHAMM的(腫瘤)細(xì)胞?？偟膩碚f，本發(fā)明證明了一組RHAMM-結(jié)合肽，其在某些方面可衍生自微管蛋白序列的CTT，而在其它方面可基于人工肽序列。本發(fā)明的肽可如下被修飾在肽的一端或兩端添加半胱氨酸殘基，從而通過形成二硫鍵而使肽環(huán)化。本發(fā)明的肽可通過添加磷基和乙?；恍揎?。磷酸化是發(fā)生在動(dòng)物細(xì)胞中的最常見的蛋白修飾之一 [4]。它最常發(fā)生在蘇氨酸殘基、絲氨酸殘基和酪氨酸殘基上并且在許多細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，所述細(xì)胞過程包括細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和分化[4]。該過程是可能的，因?yàn)楸景l(fā)明的某些肽含有酪氨酸和因?yàn)榭蓪Ⅴ；拥絅-端氨基酸上[5]。本發(fā)明肽中的芳族氨基酸即苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被其它芳族氨基酸取代，以評(píng)價(jià)它們對(duì)肽活性的影響。同樣，本發(fā)明肽中的脂族氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸可被其它脂族氨基酸取代，以評(píng)價(jià)它們對(duì)肽活性的影響。本發(fā)明肽的長(zhǎng)度可以是大約6至大約14個(gè)氨基酸和可包含其中的任何長(zhǎng)度范圍(即 6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-11、10-12、10-13 和 10-14)，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣。長(zhǎng)度超過大約14個(gè)氨基酸的肽也可包括在本發(fā)明內(nèi)。肽的長(zhǎng)度僅受其結(jié)合RHAMM的能力的限制。本發(fā)明的肽也可包括肽的二聚體和三聚體以及額外的穩(wěn)定的側(cè)翼序列，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣并描述于例如美國(guó)專利號(hào)5，824, 315和美國(guó)專利號(hào)6，184，204 (其公開內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中)。本發(fā)明的多聚體可以是由多個(gè)相同的肽組成的同型多聚體或由不同的肽組成的異型多聚體。如所述的，本發(fā)明肽的氨基酸序列可側(cè)接隨機(jī)氨基酸序列?？蔀閮?yōu)選的是對(duì)肽具有穩(wěn)定作用，因而增加它們的生物利用度的側(cè)翼序列。另外，其它肽模擬物(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽也可包括可能已通過例如磷酸化、糖基化、peg化或脂質(zhì)化而修飾的肽。此外，本發(fā)明的肽也可包括本發(fā)明肽的功能上等價(jià)的變體或類似物。因此，這可包括但不限于具有部分序列同源性的肽、具有一個(gè)或多個(gè)特定保守和/或非保守氨基酸改變的肽以及不改變所述肽的生物或結(jié)構(gòu)性質(zhì)(即結(jié)合RHAMM的能力)的肽綴合物。就功能類似物而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解，生物功能肽類似物的定義中所固有的概念是對(duì)于在分子的限定部分內(nèi)可進(jìn)行改變的數(shù)量存在限制，并且仍然產(chǎn)生具有可接受水平的等價(jià)生物活性(在本文的情況下，將包括結(jié)合RHAMM的能力)的分子。可以容易地制備具有不同取代的多個(gè)獨(dú)特肽/蛋白并可用于本發(fā)明。也可理解，某些殘基對(duì)于蛋白或肽的生物或結(jié)構(gòu)性質(zhì)而言特別重要，所述殘基例如受體識(shí)別區(qū)內(nèi)的殘基，其中這樣的殘基通?？刹槐唤粨Q。 功能類似物可通過保守或非保守氨基酸取代而產(chǎn)生。氨基酸取代通常可根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。因此，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，保守氨基酸改變是指特定位置上的氨基酸改變，其可以是與原先存在的類型相同即疏水性氨基酸交換為疏水性氨基酸，堿性氨基酸交換為堿性氨基酸等。保守取代的實(shí)例可包括但不限于非極性(疏水性)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代為另一種氨基酸，一種極性(親水性)殘基取代為另一種(例如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間的取代)，或者一種堿性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代為另一種，一種酸性殘基例如天冬氨酸或谷氨酸取代為另一種，支鏈氨基酸例如異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸取代為另一種，一種芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代為另一種。這樣的氨基酸改變可產(chǎn)生功能類似物，其中它們可不顯著地改變肽的總電荷和/或構(gòu)型。這類保守改變的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并在本發(fā)明范圍之內(nèi)。保守取代也可包括使用經(jīng)化學(xué)衍生的殘基代替非衍生殘基，條件是所得肽是本發(fā)明肽的生物功能等價(jià)物。因此，本發(fā)明的肽可包括其氨基酸序列不同于SEQ ID NOs: 1-17的肽。本發(fā)明的肽也可包括其氨基酸序列因單個(gè)突變而不同于SEQ ID NOs: 1-17的肽，其中該單突變代表一個(gè)氨基酸缺失、插入或取代。圖1OA和圖10B，例如，說明了就RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO:1而言，位置1、3、5、6和11的丙氨酸取代看來不影響取代的RHAMM-結(jié)合肽與RHAMM的適當(dāng)結(jié)合。圖17A和圖17B，例如，說明了就RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO: 14而言，位置1、4、7、8、11和12的丙氨酸取代看來不影響取代的RHAMM-結(jié)合肽與RHAMM的適當(dāng)結(jié)合。 RHAMM-結(jié)合肽的制備
本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法來制備，最特別且優(yōu)選的方法是通過化學(xué)合成，使用蛋白質(zhì)化學(xué)眾所周知的技術(shù)，例如固相合成[6，7，8，其通過引用結(jié)合到本文中]或在均質(zhì)溶液中合成[9，其通過引用結(jié)合到本文中]，以產(chǎn)生合成肽?；蛘撸景l(fā)明的肽可通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)來制備。還考慮的是，本發(fā)明包括可包含編碼至少一種本發(fā)明肽的核酸的載體。RHAMM-結(jié)合肽的分離
可通過測(cè)定結(jié)合RHAMM的肽的樣品，分離RHAMM-結(jié)合肽。檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的任何測(cè)定系統(tǒng)或試驗(yàn)方法都可使用，包括但不限于免疫共沉淀、交聯(lián)以及通過梯度或色譜柱而共-純化?？蓽y(cè)試生物樣品和市售文庫中的RHAMM-結(jié)合肽。例如，帶標(biāo)記的RHAMM可用于探測(cè)噬菌體展示文庫，正如實(shí)施例1中更詳細(xì)描述的那樣。另外，針對(duì)本發(fā)明肽而制備的抗體可用于分離具有RHAMM-結(jié)合親和力的其它肽。例如，帶標(biāo)記的抗體可用于探測(cè)噬菌體展示文庫或生物樣品。另外，編碼RHAMM蛋白的DNA序列可用于探測(cè)生物樣品或文庫中的編碼HA-結(jié)合蛋白的核酸。組合物
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可包含一種或多種本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽的組合物，所述組合物用于以適于體內(nèi)給藥的生物相容形式給予受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的組合物，所述組合物用于在體外研究樣品?？墒褂玫臉悠钒ǖ幌抻诩?xì)胞、組織和器官。所謂“適于體內(nèi)給藥的生物相容形式”是指所給予物質(zhì)的形式，其中療效比任何毒性效應(yīng)更重要?？蓪⑽镔|(zhì)給予任何動(dòng)物，優(yōu)選人。治療活性量的本發(fā)明藥物組合物或“有效量”的給予，可定義為達(dá)到在人體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答所需結(jié)果所必需的劑量和時(shí)間而有效的量。合適的給藥途徑可以是肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射、口服和鼻內(nèi)給予?？山邮艿妮d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并包括例如無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和去離子水。此外本發(fā)明的組合物可包含一種或多種穩(wěn)定劑，例如碳水化合物(包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖)、蛋白質(zhì)(例如白蛋白或酪蛋白)和緩沖劑(例如堿性磷酸鹽)。此外，本發(fā)明的組合物可包含可增強(qiáng)本發(fā)明肽的抗細(xì)胞增殖性能的一種或多種輔助劑。注射用組合物可包含(但非排它性地)本發(fā)明的肽或核酸以及一種或多種藥學(xué)上可接受的溶媒或稀釋劑，并包含在合適PH和與生理流體等滲的緩沖液中。任何藥學(xué)上合適的稀釋劑都可用于注射用組合物蒸餾水、生理溶液或鹽溶液、和/或緩沖液。注射用組合物可按常規(guī)體積-重量方法來制備?？捎孟♂寗┗蛉軇⒁欢康碾南♂屩帘匾w積。然后溶液可通過無菌濾器過濾，裝瓶或裝入安瓿(ampouled)。所得溶液可以是穩(wěn)定的透明液體，并且可不含任何化學(xué)物或其它雜質(zhì)。檢測(cè)探針
可用合適探針，對(duì)樣品(包括但不限于細(xì)胞、組織或器官)中的RHAMM表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。探針可至少包含本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽和可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記可能夠通過檢測(cè)手段而被檢測(cè)。檢測(cè)手段可以是對(duì)可檢測(cè)標(biāo)記可能提供任何可測(cè)量反應(yīng)的任何檢測(cè)技術(shù)。在本發(fā)明的多個(gè)方面，可以圖像形式提供可測(cè)量反應(yīng)?？蓹z測(cè)標(biāo)記可允許使用合適檢測(cè)手段來檢測(cè)RHAMM陽性細(xì)胞的位置。本發(fā)明的探針可允許跟蹤RHAMM陽性細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和顯像(development) 0因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針可用于但不限于在診斷和預(yù)后方法中研究RHAMM陽性細(xì)胞。制備探針的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的[10，11，其通過引用結(jié)合到本文中]。標(biāo)記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。優(yōu)選的標(biāo)記可以是適用于體內(nèi)成像的那些。在檢測(cè)之前可對(duì)抗RHAMM探針進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記?；蛘撸墒褂每山Y(jié)合雜交產(chǎn)物的可檢測(cè)標(biāo)記。這類可檢測(cè)標(biāo)記可包括但不限于具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)性質(zhì)并且在免疫測(cè)定領(lǐng)域內(nèi)已被良好開發(fā)的任何材料。用于本發(fā)明的標(biāo)記可以是可通過檢測(cè)手段而檢測(cè)的任何組合物，所述手段包括但不限于光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記包括基于生物素的標(biāo)記、磁標(biāo)記(例如DYNABEADS )、放射性標(biāo)記(例如3H、nS、32P、51Cr或125I)、熒光標(biāo)記(例如熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等)、電子-致密試劑(例如金)、酶 (例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或ELISA中常用的其它酶)、地高辛配基(digoxigenin)或半抗原以及其抗血清或單克隆抗體可得到的蛋白質(zhì)(例如可通過將放射性標(biāo)記摻入本發(fā)明肽中而使得本發(fā)明肽可檢測(cè)，并用于檢測(cè)與肽特異性反應(yīng)的抗體)。本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可與載體一起提供，例如與牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet haemocyanin)偶聯(lián)?？蓪HAMM-結(jié)合肽與金或聚苯乙烯的微球體、玻片、芯片等固體載體，或與微量滴定板壁共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)?？捎脴?biāo)記直接或間接地標(biāo)記RHAMM-結(jié)合肽，所述標(biāo)記選自但不限于生物素、熒光素和酶例如辣根過氧化物酶。所用的具體標(biāo)記對(duì)本發(fā)明而言并非關(guān)鍵，只要它不干擾RHAMM/RHAMM-結(jié)合肽復(fù)合物的形成。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，成像組分可以是放射性核素(例如18F、nC、13N、64Cu、88Ga, 1231,111In,99mTC等)，因?yàn)镾PECT、CT和PET成像等技術(shù)容易使用，用于體內(nèi)檢測(cè)RHAMM/RHAMM-結(jié)合肽復(fù)合物和腫瘤祖細(xì)胞。用于SPECT或PET成像試劑的合適成像成分的判定也可通過放射性核素是否是由發(fā)生器或回旋加速器產(chǎn)生或者是螯合劑或有機(jī)/齒化物而確定。圖15和圖16說明Ga-DOTA綴合的肽SEQ ID NO:1和Re (CO) 3+_配位的肽SEQ IDNO:1的合成和質(zhì)譜表征。本文所用的直接標(biāo)記的探針可以是連接可檢測(cè)標(biāo)記的探針。因?yàn)橹苯訕?biāo)記已經(jīng)與探針連接，所以無需后續(xù)步驟將探針與可檢測(cè)標(biāo)記締合。相反，間接標(biāo)記的探針可以是攜帶了某一部分的探針，所述部分在隨后(通常在RHAMM-結(jié)合肽與靶RHAMM雜交之后)與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，也可制備和使用可識(shí)別任何本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽的單克隆抗體(mAb)，以檢測(cè)樣品中RHAMM-結(jié)合肽的存在情況。Mab可提供檢測(cè)本發(fā)明組合物品質(zhì)的快速而簡(jiǎn)單的方法。一般而言，制備抗體的方法是眾所周知的。例如，產(chǎn)生特異性識(shí)別本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽的mAb的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。一般而言，用弗氏佐劑中的肽注射小鼠。在3周時(shí)間內(nèi)注射9次之后，取出小鼠脾臟并重懸于磷酸緩沖鹽水(PBS)。脾細(xì)胞可作為淋巴細(xì)胞來源，其中的一些可產(chǎn)生具有合適特異性的抗體。然后可將這些細(xì)胞與永久生長(zhǎng)的骨髓瘤伙伴細(xì)胞融合，并且可在選擇試劑例如HAT存在下將融合產(chǎn)物鋪板到多個(gè)組織培養(yǎng)孔中。然后篩選各孔，以通過ELISA鑒定那些含有制造有用抗體的細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞用于新鮮鋪板。經(jīng)過生長(zhǎng)周期之后，這些孔可再次經(jīng)篩選而鑒定產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。可進(jìn)行若干克隆程序，直到超過90%的孔都含有抗體產(chǎn)生為陽性的單克隆。從該程序中，可建立穩(wěn)定克隆系，其廣生mAb。然后通過未和力色譜，使用蛋白A或蛋白G瓊脂糖而純化 mAb (另見美國(guó)專利號(hào) 4，609，893 ;4，713，325 ;4，714，681 ;4，716，111 ;4，716，117 ;和4，720，459)。 RHAMM-結(jié)合肽的應(yīng)用
本發(fā)明可包含檢測(cè)、成像、診斷和治療性策略，所述策略可包括但不限于用本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽靶向RHAMM，其可破壞RHAMM/配體復(fù)合物的形成，并可起到刺激配體-RHAMM介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性反應(yīng)的作用。這些方法可與治療病原性病況、炎癥和病原性感染相關(guān)的病癥的其它已知療法聯(lián)用。1. RHAMM陽性細(xì)胞的檢測(cè)
參考圖9，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽已經(jīng)證明在生物環(huán)境中具有適度穩(wěn)定性(大約110至大約250分鐘的半衰期)，這足夠長(zhǎng)，有利于體外或體內(nèi)成像。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，RHAMM-結(jié)合肽可用于鑒定RHAMM陽性細(xì)胞的方法。鑒定RHAMM陽性細(xì)胞的方法可包括使細(xì)胞接觸本發(fā)明探針并應(yīng)用合適的檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)細(xì)胞中的可檢測(cè)標(biāo)記。根據(jù)用檢測(cè)技術(shù)對(duì)可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，可確定對(duì)RHAMM陽性細(xì)胞的鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在受試者組織或器官中檢測(cè)RHAMM表達(dá)的方法。所述方法可包括(a)將本發(fā)明的探針給予受試者；(b)應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)受試者組織或器官中的標(biāo)記。因?yàn)橹铝鲎婕?xì)胞可通過RHAMM表達(dá)而得以表征，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可用于確定樣品例如腫瘤活檢中是否可能包含致瘤祖細(xì)胞的診斷方法，致瘤祖細(xì)胞可使癌癥患者處于發(fā)展轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)之中。一種這樣的診斷方法可包括使用一種或多種RHAMM-結(jié)合肽來檢測(cè)樣品中RHAMM的存在情況。RHAMM陽性樣品可表示該樣品中含有癌癥祖細(xì)胞。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，診斷癌癥患者的方法可包括(a)從所述患者獲取組織樣品；(b)使所述樣品與本發(fā)明的探針接觸；(c)應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)探針的可檢測(cè)標(biāo)記。樣品中RHAMM表達(dá)的檢出可表示癌癥診斷。依照本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，診斷癌癥患者的方法可包括(a)將本發(fā)明的探針給予受試者；和(b)應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)以在受試者的組織或器官中檢測(cè)探針的標(biāo)記。受試者中RHAMM的檢出可表示癌癥診斷。
依照本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，確定癌癥患者的預(yù)后的方法可包括(a)從患者獲取腫瘤組織樣品；(b)使所述樣品與本發(fā)明的探針接觸；(c)應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)探針的標(biāo)記；和(d)確定患者的預(yù)后。預(yù)后可預(yù)測(cè)患者的癌癥侵占性或轉(zhuǎn)移的可能性。樣品中RHAMM表達(dá)的檢出可表示不良預(yù)后。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定癌癥患者的療程的方法。所述方法可包括(a)從患者獲取腫瘤組織樣品；(b)使所述樣品與本發(fā)明的探針接觸；(c)應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)探針的標(biāo)記；和(d)確定患者的預(yù)后。預(yù)后可預(yù)測(cè)患者的癌癥侵占性或轉(zhuǎn)移的可能性。因此，樣品中可測(cè)量RHAMM表達(dá)的檢出可表示不良預(yù)后；并根據(jù)預(yù)后而確定用于患者的療程。在本發(fā)明診斷和預(yù)后方法的一方面，可將樣品中的RHAMM表達(dá)與已知陰性對(duì)照或已知標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。相對(duì)于陰性對(duì)照或已知標(biāo)準(zhǔn)而言，樣品中可測(cè)量RHAMM表達(dá)的檢出可表不:樣品中RHAMM的存在，癌癥的診斷，或不良預(yù)后，視情況而定。圖6和圖7說明使用熒光素-綴合的RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO: 14 (圖6A ；SEQID NO: 35)和 SEQ ID NOs:1 和 9 (圖 7 ；SEQ ID NOs: 25 和 29)，人乳癌細(xì)胞的顯現(xiàn)。圖13說明使用熒光素-綴合的RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO: 25)，人卵巢癌細(xì)胞的顯現(xiàn)，而圖14表明使用熒光素-綴合的RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO: 9 (SEQID NO: 29)，人前列腺癌細(xì)胞的顯現(xiàn)。如圖14所說明的，侵占性侵襲和轉(zhuǎn)移的PC3mLN4人前列腺癌系對(duì)于熒光染色是強(qiáng)陽性，表示HA肽模擬物SEQ ID NO: 9的快速攝取。本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽的細(xì)胞攝取可被特異性抗RHAMM mAb封閉，但不被特異性抗⑶44 mAb封閉，但后者可封閉HA與⑶44的結(jié)合(參見圖6，7，13和14)。這些結(jié)果可表明本發(fā)明的HA肽模擬物可通過RHAMM依賴性機(jī)制與前列腺癌細(xì)胞、乳癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞締合并被這些細(xì)胞所攝取。

2. 治療藥
參考圖9,本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽在生物環(huán)境中可具有顯著穩(wěn)定性(substantialstability)(大約110至大約250分鐘的半衰期)，這可為足夠長(zhǎng)，有利于將它們用于治療性方法。本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的病理性病況例如癌癥、炎性和自身免疫病癥和組織創(chuàng)傷及其恢復(fù)相關(guān)的纖維化病癥。本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可用于通過破壞所述RHAMM/配體復(fù)合物的形成而治療RHAMM/配體復(fù)合物的形成所致的病癥或病況的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供用于治療可能患有RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的受試者的方法。所述方法可包括至少給予所述受試者有效量的組合物，所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供預(yù)防或減少組織瘢痕形成的方法。所述方法可包括至少給予有需要的受試者有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子。RHAMM-結(jié)合肽抑制癌細(xì)胞增殖的能力可涉及它們?cè)陬A(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移中的有效性和它們作為癌癥化療藥劑的效用。因此，本發(fā)明提供預(yù)防或減少腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括將有效量的RHAMM-結(jié)合肽或編碼本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子給予有需要的受試者。因此，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可用于治療RHAMM表達(dá)相關(guān)的癌癥，包括但不限于肺癌、胃腸癌、乳癌、膀胱癌、皮膚癌(黑素瘤和非黑素瘤)、腦癌、宮頸癌和白血病。因此，本發(fā)明可提供在受試者中預(yù)防或治療癌癥的方法。該方法可包括至少給予有需要的受試者有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或者編碼所述一種或多種本發(fā)明RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可與現(xiàn)有療法聯(lián)用，以降低RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況例如癌癥的患者的發(fā)病率和死亡率。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供的是用于在患者中治療RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況的方法。所述方法可包括至少給予受試者本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽并聯(lián)合用于所述RHAMM相關(guān)病癥的至少一種其它療法。RHAMM-結(jié)合肽和至少一種其它療法的聯(lián)用可增加疾病治療的功效。例如，就癌癥治療而言，也可給予受試者可能夠顯著降低血管生成的療法，例如小分子藥物、siRNAs、反義療法(antisense therapy)或其任何組合，其可靶向一種或多種生長(zhǎng)因子(其可作為血管生成的開關(guān))，并為滋養(yǎng)層和內(nèi)皮細(xì)胞提供增殖信號(hào)。生長(zhǎng)因子對(duì)于多種癌癥的生長(zhǎng)和存活而言可能是需要的并且對(duì)癌癥進(jìn)展而言可能是必需的。因此，可將使用RHAMM-結(jié)合分子的本發(fā)明抗癌方法與祀向一種或多種生長(zhǎng)因子(包括VEGF、FGR和hCG)的療法聯(lián)合。也可將本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽與放療或化療聯(lián)合。這樣的聯(lián)合療法促進(jìn)治療癌癥的協(xié)同作用。本發(fā)明人已經(jīng)證明，例如，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可能夠抑制人上皮卵巢癌(EOC)細(xì)胞的增殖(參見圖11)。本發(fā)明人也已證明本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可能夠降低人EOC細(xì)胞的活力(參見圖12)。通過如上所提出的方法鑒定癌癥祖細(xì)胞，本發(fā)明的檢測(cè)方法可允許開發(fā)新的治療藥，以選擇性殺傷這些祖細(xì)胞或迫使其末端分化。例如，本發(fā)明的技術(shù)可用于可含有高度致瘤的祖細(xì)胞亞類的腫瘤的體內(nèi)成像，其可允許選擇性治療具有轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的患者，相對(duì)于沒有風(fēng)險(xiǎn)的患者而言。最重要的是，本發(fā)明的技術(shù)可用于將抗癌藥遞送給原發(fā)性癌癥例如乳癌中存在的高度致瘤的祖細(xì)胞亞類。例如，可將肽與細(xì)胞毒劑綴合，以使得能夠?qū)⒓?xì)胞毒劑靶向遞送至表達(dá)RHAMM的細(xì)胞。通過同樣的機(jī)制，其它治療實(shí)體的遞送也是可能的，包括但不限于烷化劑、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、激素治療藥、核苷類似物或其前體藥物。此夕卜，可預(yù)見放療藥，其中可將本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽與發(fā)射粒子的放射性核素連接，從而提供將細(xì)胞破壞性實(shí)體選擇性遞送給RHAMM陽性細(xì)胞的機(jī)制。治療性放射性核素可包括發(fā)射β的放射性核素，例如9°Υ或186Re;發(fā)射β/Y的放射性核素，例如47Sc、153Sm、177Lu或186Re ;發(fā)射α的放射性核素，例如213B1、223Ra或225Ac ;或發(fā)射Auger的放射性核素，例如67Ga或 mIn。3. 給藥和劑量
可采用本領(lǐng)域已知的任何途徑將本發(fā)明的探針和/或肽直接給予哺乳動(dòng)物受試者，所述途徑包括但不限于例如注射(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi))、吸入、透皮施用、直腸給藥、鼻內(nèi)或口服給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可經(jīng)皮下給予本發(fā)明的檢測(cè)探針和/或肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 可經(jīng)靜脈內(nèi)給予本發(fā)明的檢測(cè)探針和/或肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有效量的探針或RHAMM-結(jié)合肽可通過非系統(tǒng)性的局部給藥而給予，例如通過外周給藥，包括外周肌內(nèi)、腺體內(nèi)和皮下給藥途徑，并且允許探針和/或肽在體內(nèi)經(jīng)數(shù)小時(shí)而攜帶到具有表達(dá)RHAMM的細(xì)胞和致瘤性細(xì)胞群體的位點(diǎn)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案可以是通過可植入裝置來給予RHAMM-結(jié)合肽。在本發(fā)明的多個(gè)方面，可植入裝置可能夠控制RHAMM-結(jié)合肽的釋放?？砂瓷衔乃?，全身性提供本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，本發(fā)明的RHAMM-結(jié)合肽可用在常規(guī)脂質(zhì)體、特化脂質(zhì)體、脂質(zhì)制劑和免疫脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體可以是單層或多層并可由選自以下的組分形成磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿及其組合。多層脂質(zhì)體可包括組成與單層囊泡類似、但可經(jīng)制備從而產(chǎn)生多區(qū)室的多層囊泡，其中包埋銀組分/溶液或乳液。另外，其它輔助劑和改性劑也可包入脂質(zhì)體制劑中，例如聚乙二醇或其它材料。雖然脂質(zhì)體制劑可包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿膽固醇(1:1)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，任何數(shù)量的脂質(zhì)體雙層組合物都可用于本發(fā)明的組合物。脂質(zhì)體可通過各種已知方法來制備，例如公開于以下文獻(xiàn)中的那些方法美國(guó)專利號(hào)4，235，871和RRC，Liposomes:A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1990,第 33-101 頁，其通過引用結(jié)合到本文中。含有RHAMM-結(jié)合肽的脂質(zhì)體可具有修飾，例如具有與脂質(zhì)體外部結(jié)合的非聚合物分子，例如半抗原、酶、抗體或抗體片段、細(xì)胞因子和激素和其它小蛋白、多肽或非蛋白分子，所述分子賦予脂質(zhì)體所需的酶促或表面識(shí)別特征。優(yōu)先將脂質(zhì)體靶向特定器官或細(xì)胞類型的表面分子包括例如能將脂質(zhì)體靶向帶有特定抗原的細(xì)胞的抗體。將所述分子偶聯(lián)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的(參見例如美國(guó)專利號(hào)4，762，915，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。或者，或同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，攜帶正或負(fù)凈電荷的任何數(shù)量的脂質(zhì)都可用于改變脂質(zhì)體膜的表面電荷或表面電荷密度。脂質(zhì)體也可摻入熱敏性或pH敏感性脂質(zhì)作為脂質(zhì)雙層的組分，以提供脂質(zhì)囊泡膜的控制降解。在本發(fā)明上下文中，給予患者的劑量可以是對(duì)RHAMM/RHAMM-結(jié)合配體復(fù)合物和致瘤細(xì)胞群體的位置有效成像并具有足夠特異性的合適劑量，從而使外科醫(yī)生可進(jìn)行活檢或其它程序以除去通過對(duì)RHAMM/RHAMM-結(jié)合肽復(fù)合物成像而檢測(cè)的致瘤細(xì)胞群體。該劑量可根據(jù)所用的具體載體(例如肽或核酸)的功效和患者狀況、以及所治療患者的體重或表面積而確定。劑量大小也可根據(jù)在具體患者中伴隨給予探針的任何不良副作用的存在、性質(zhì)和程度來確定。對(duì)于給藥，本發(fā)明檢測(cè)探針可以由多肽或核酸的LD-50和不同濃度的多肽或核酸的副作用確定的比率給予，當(dāng)考慮到患者的整體(mass)和總體健康時(shí)?？赏ㄟ^單次或分次劑量來完成給藥，例如定期(例如每天)并持續(xù)一段時(shí)間(例如2、3、4、5、6天或1-3周或更長(zhǎng))給予的劑量。在又一些實(shí)施方案中，可用公認(rèn)的臨床標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)踐，將大約5至大約2000 LD 50單位的標(biāo)記的探針給予所述受試者。
以上公開內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明。參考以下具體實(shí)施例可獲得更完整的理解。這些實(shí)施例僅以說明的目的而描述，并非意欲限制本發(fā)明范圍。當(dāng)情況可暗示或使得有利時(shí)，考慮了形式上的改變和等價(jià)物取代。盡管本文使用了具體術(shù)語，但這樣的術(shù)語旨在描述性意義而非限制性目的。
實(shí)施例實(shí)施例是為了說明的目的而描述并且不得視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 - BLAST搜索和序列比對(duì)
在基本搜索比對(duì)搜索工具(BLAST)中使用對(duì)應(yīng)于RHAMM (SEQ ID NO: 19)的HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(aa 718-750)的查詢序列，以搜集顯示序列同源性的蛋白列表。圖1 B說明分子成像探針設(shè)計(jì)和優(yōu)化的流程圖。HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域用作BLAST中的查詢序列，以確定同源蛋白序列。然后，闡明同源序列的推定的結(jié)合配偶體(配體)。根據(jù)截短的配體序列合成肽文庫并用表面等離振子共振(SPR)結(jié)合測(cè)定進(jìn)行篩選，以確定高親和力配體。再用多種體外結(jié)合測(cè)定進(jìn)一步評(píng)價(jià)候選肽配體。RHAMM和MAP的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域和驅(qū)動(dòng)蛋白間的成對(duì)比較揭示出與RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的適度序列同源性(使用ClustalX2計(jì)算出大約17-24%[12]);然而，MAP和RHAMM在它們的微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列方面共享類似的理化性質(zhì)。換句話說，RHAMM和MAPS都具有推測(cè)與微管蛋白結(jié)合的堿性殘基段(stretch)。此外，MAP的微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)和RHAMM的乙酰透明質(zhì)酸結(jié)合位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有同樣的螺旋程度并且 都可以歸類為堿性-拉鏈結(jié)構(gòu)域[13]。據(jù)報(bào)道RHAMM使用通用結(jié)合位點(diǎn)與胞外表面的HA和胞質(zhì)溶膠中的微管締合[14]。因?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)動(dòng)力蛋白和MAP表現(xiàn)出與微管蛋白的CTT直接結(jié)合，所以本發(fā)明人假設(shè)RHAMM可顯示與代表不同微管蛋白亞類的CTT的合成肽的直接相互作用。因?yàn)镠A與RHAMM主要通過其帶負(fù)電荷基團(tuán)與RHAMM上的正電荷基團(tuán)之間的離子相互作用而相互作用，所以具有類似的負(fù)電荷分布的分子原則上可作為HA模擬物。例如，微管蛋白CTT上的Glu殘基和Asp殘基可模擬HA上的羧酸基。因此，合成CTT與RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可利用被認(rèn)為對(duì)于HA結(jié)合而言重要的相同帶電荷側(cè)鏈。實(shí)施例2 -針對(duì)RHAMM的微管蛋白-衍生的肽的篩選
材料所有溶劑無需進(jìn)一步純化就可使用，并且都購(gòu)自VWR、Fisher Scientific或Sigma Aldrich。對(duì)于妝合成，荷基甲氧基擬基(Fmoc) Rink amide MBHA (100-200目)樹月旨、Fmoc氨基酸、Fmoc-保護(hù)的氨基己酸(Fmoc-Ahx)和HBTU (六氟磷酸2_(1H_苯并三唑1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鐵)偶聯(lián)劑得自Peptides International。N_(3_ 二甲氨基丙基)-N’ -乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉鹽(磺基-NHS)、異硫氰酸熒光素(FITC)異構(gòu)體I和胎牛血清(FBS)都購(gòu)自Sigma Aldrich。NHS-生物素得自NovaBioChem。抗體例如抗RHAMM (Santa Cruz Biotechnology, USA)、抗CD44 (Pharmigen)和IgG ab (Santa Cruz Biotechnology USA)都市購(gòu)獲得。肽合成使用固相肽合成，按照Fmoc方案，合成17種肽，其具有對(duì)應(yīng)于不同微管蛋白亞類的CTT和H12區(qū)的12個(gè)氨基酸殘基。
在rink amide MBHA樹脂(0· I mmol)上進(jìn)行肽鏈延伸，使用自動(dòng)化(APEX 396自動(dòng)合成儀)和/或手動(dòng)方法，使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成，包括Fmoc脫保護(hù)和氨基酸偶聯(lián)循環(huán)，每次循環(huán)用Kaiser試驗(yàn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)[15，16]。在整個(gè)合成中重復(fù)進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)(15和20分鐘周期)，使用N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液。以30分鐘和90分鐘間隔使用O. 05 M或更高濃度的Fmoc-保護(hù)的氨基酸和HBTU，5當(dāng)量N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)/DMF，進(jìn)行所有氨基酸偶聯(lián)。每次脫保護(hù)和偶聯(lián)步驟之后，樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復(fù)洗滌。使用同樣參數(shù)偶聯(lián)Fmoc-Ahx。進(jìn)行氨基端?；?15和10分鐘)，使用10%乙酸酐/DMF，接著Fmoc脫保護(hù)。進(jìn)行熒光素偶聯(lián)，即通過使肽的氨基與FITC熒光染料(4當(dāng)量)/DMF和DIPEA (2當(dāng)量)反應(yīng)4小時(shí)。使用94% v/v三氟乙酸(TFA), 1% v/v三異丙基硅烷(TIPS)、2· 5% v/v H2O和 2· 5%ν/ν 1，2-乙烷二硫醇(EDT)的溶液，對(duì)含半胱氨酸的肽進(jìn)行完全脫保護(hù)，達(dá)1. 0-1. 5小時(shí)。使用88% V/v TFA,5% v/v水、5% m/v苯酚、2% v/v TIPS的溶液，對(duì)所有其它肽進(jìn)行完全脫保護(hù)，達(dá)2-4小時(shí)。收集濾液,用冷的叔丁基甲醚沉淀并通過在3000 rpm在-5°C離心10分鐘而沉淀。再將沉淀物溶于蒸餾的去離子水并凍干，得到固體粉末。蛋白純化通過反相HPLC將本項(xiàng)研究中所用的所有肽都純化至純度大于92%并通過ESI質(zhì)譜來表征。對(duì)肽進(jìn)行純化，使用由H2O + O. 1% TFA (溶劑A)和CH3CN + O. 1% TFA (溶劑B)組成的梯度溶劑系統(tǒng)，對(duì)分析 型和制備型HPLC分別以線性流速1. 5 mL/min和20 mL/min。使用 Grace Vydac 蛋白 /妝RP-C18 柱(4. 6 mm x 250 μ m, 5 μ m),進(jìn)行分析型HPLC,并使用 Grace Vydac 蛋白 / 肽 RP-C18 柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μ m)，進(jìn)行制備型 HPLC。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器，在220 nm和254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。純化期間，收集各流分，凍干并通過 ES1-MS (Waters Micromass Quattro Micro API)分析。從攜帶重組質(zhì)粒pPAL7-RHAMM的大腸桿菌BL21 (D3)菌株中分離重組蛋白R(shí)HAMM-CT (一種截短的RHAMM，僅對(duì)應(yīng)于含有HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基端，氨基酸706-766，序列RDSYAQLLGH QNLKQKIKHV VKLKDENSQL KSEVSKLRSQ LVKRKQNELR LQGELDKALG I, M. W.
7.1 kDa, pi = 10.1 ；SEQ ID NO: 20)。將細(xì)菌在含氨芐青霉素(100 μ g/ml)和 O. 5 % 葡萄糖的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)過夜，讓其生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期中期。用2 mM IPTG在37°C誘導(dǎo)重組RHAMM基因表達(dá)，持續(xù)4小時(shí)，然后通過在10,000 x g離心20 mm收獲細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)菌細(xì)胞重懸于裂解緩沖液(由O. 2 M磷酸鈉、O. 2 M乙酸鉀、1% triton X-100和O.1 %蛋白酶抑制劑，pH = 7. O組成)，超聲處理(60 S，10 s/脈沖)并離心(4°C，12000 X g, 20 mm)。將所得上清液移至干凈管中并過濾(使用O. 45 μ m濾器)。用Profinity eXact (Bio-Rad, USA)親和力樹脂,依照制造商方案,對(duì)eXact標(biāo)簽的-重組RHAMM進(jìn)行純化。對(duì)于本實(shí)驗(yàn),將裂解液上樣到填裝有Profinity eXact親和力樹脂(4 mL樹脂，柱15 X 1.5 cm)并用洗滌緩沖液(0. 2M磷酸鈉，pH 7.0)平衡的重力柱。該柱用洗滌緩沖液洗滌以除去雜質(zhì)，然后用洗脫緩沖液(由0. 2 M磷酸鈉、0.1 M氟化鈉，pH 7. O組成)洗脫重組RHAMM。然后使用Millipore濾器在由0. 2M磷酸鈉和0. 2 M乙酸鉀組成的緩沖液(pH = 7.0)中，對(duì)蛋白進(jìn)行透析和濃縮(Mi I lipore, USA,截止3 kDa)。所分離蛋白的純度在ID SDS-PAGE上得以證實(shí)。使用抗RHAMM抗體，通過蛋白質(zhì)印跡分析，對(duì)RHAMM進(jìn)行鑒定和證實(shí)。
SPR (表面等離振子共振)篩選測(cè)定ProteON XPR36系統(tǒng)用于針對(duì)RHAMM而對(duì)不同微管蛋白衍生的肽進(jìn)行選擇和分級(jí)。對(duì)于RHAMM的固定，通過胺偶聯(lián)，使用100 mM EDAC和24 mM磺基-NHS使ProteON GLC傳感器芯片表面活化。以30 μ 1/mm的流速注射RHAMM(30 μ g/mL的碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.7)。將緩沖液樣品注入不同傳感器板上，用作參考。然后注射乙醇胺HCl (1M, pH 8. 5)以使任何剩余表面基團(tuán)失活。在3分鐘內(nèi)，以50 μ L/min將肽(在PBS-T中的10 μ m, 2% DMS0)注射到RHAMM功能化表面，接著是10分鐘的解離(即注射PBS-T緩沖液)期。用兩次注射30 μ L IM NaCl使表面再生，然后再注射下一種肽。在所有實(shí)驗(yàn)中，使用得自參考板(無RHAMM)和RHAMM功能化板的數(shù)據(jù)，減去參考。使用熒光素-標(biāo)記的肽的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行ELISA，以測(cè)試FITC-標(biāo)記的微管蛋白-衍生的肽與HA競(jìng)爭(zhēng)RHAMM結(jié)合位點(diǎn)的能力。將重組RHAMM (O. 05Μ PBS中的100μ L、10 μ g/mL, pH = 9)固定在96-孔ELISA板(終濃度I μ g/孔)并在4°C孵育過夜，得到最終蛋白量I Ug/孔。各板用(0.05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μ L/孔)洗滌3次，用封閉緩沖液(5% 200 yL/孔，PBS-吐溫-20/孔)洗滌，然后在室溫下孵育I小時(shí)。如上所述洗滌3次之后，將FITC-標(biāo)記的微管蛋白衍生的肽(終濃度I μ g/mL)和HA (100yL/孔，Μ.Ι 220 kDa, PBS 中的 10 μ g/mL,進(jìn)行系列稀釋，得到 HA =1:1、1: 2、1: 4、1:8,1:16)加入各板并在4°C孵育過夜。如上所述洗滌各板，然后在485/535 nm處測(cè)量吸光度。使用熒光素-標(biāo)記的RHAMM的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行ELISA，以測(cè)試無標(biāo)記的微管蛋白-衍生的肽與染料(Alexa Fluor 647)-綴合的HA競(jìng)爭(zhēng)RHAMM的能力。將RHAMM(100 μ I, 10 μ g/mL 的 O. 05 M PBS, pH = 9)固定在 96-孔 ELISA 板(以達(dá)到最終量 Iμ g/孔)并在4°C孵育過夜。各板用(O. 05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μ L/孔)洗滌3次，再與封閉緩沖液(200 μ I/孔，5 %吐溫-20的PBS)在室溫下孵育I小時(shí)。用(O. 05%) PBS-吐溫-20緩沖液洗滌3次之后，將微管蛋白-衍生的肽(10 μ g/ml)和HA-綴合的Alexa Fluor 647(100 μ g/孔，Μ· W. 220 kDa, PBS 中的 10 μ g/ml)加入各板并在 4°C孵育過夜。陰性對(duì)照板接受無染料-綴合的HA并且所有實(shí)驗(yàn)都一式三份地進(jìn)行。如上所述地洗滌各板，然后在650 nm處測(cè)量熒光。SPR (表面等離振子共振)結(jié)合測(cè)定肽篩選之后，GWC SPRimager 系統(tǒng)用于測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)常數(shù)。將milliQ水中的I nM濃度含Thiol肽固定在馬來酰亞胺-功能化的鍍金芯片上達(dá)3小時(shí)。用milliQ水洗滌除去過量肽。對(duì)于結(jié)合研究，將一系列濃度(500 nM、750 nM和1000 nM)的RHAMM注射到固定化肽。15 min解離期之后，通過用2次10 min脈沖注射(以100 mL/min)再生緩沖液(2 M NaCl的HBS-EP，pH 7.4)的處理，使傳感器芯片表面再生，用于下一種肽樣品注射。再生步驟之后，基線回到起始值，證實(shí)所有結(jié)合的分析物都除去。分析數(shù)據(jù)并通過非線性回歸擬合到Langmuir結(jié)合模型獲取相應(yīng)的解離常數(shù)(kD)[17]。在所有實(shí)驗(yàn)中，使用得自參考板(無肽)和肽功能化板的數(shù)據(jù)，減去參考。血清穩(wěn)定性研究評(píng)價(jià)微管蛋白CTT在血清中的穩(wěn)定性達(dá)11小時(shí)。將每種肽與預(yù)熱(37°C，pH 7.3 ±0.1)胎牛血清(FBS)混合，(最終樣品體積3 mL，肽濃度15 μ m)。記錄開始時(shí)間，并在每個(gè)30分鐘時(shí)間點(diǎn)，從反應(yīng)混合物中取出40 μ L等分試樣并通過C18反相(C18 Sep-Pak )柱。用3 mL含O. 1% TEA的乙醇(70% v/v)將肽從柱上洗脫下來，凍干并用分析型RP-HPLC (Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱4. 6 x 250 mm, 5 μ m)進(jìn)行分析。該系統(tǒng)所用的流動(dòng)相是O. 1% TFA的水(洗脫液A)和O. 1% TFA的CH3CN (洗脫液B)。對(duì)于每種肽樣品，使用在20分鐘內(nèi)流速1. 5 ml/min的10-95%洗脫液B的線性梯度。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器，設(shè)置在220和254 nm處，檢測(cè)％完整肽并用ES1-MS鑒定。用GraphPad Prism 5. 01版測(cè)定肽的半衰期。細(xì)胞攝取研究將對(duì)RHAMM-CT顯示出高親和力的候選肽與熒光染料(FITC)綴合，并使用細(xì)胞熒光成像測(cè)定評(píng)價(jià)它們對(duì)表達(dá)RHAMM的癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的特異性。將MDA-MB-231細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基和10% FBS中培養(yǎng)至90%匯合。然后將細(xì)胞接種在2 X 24-孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片(12 X 12 mm,包被有50 μ g/ml纖連蛋白)上(20000/孔的匯合)，接種之后一天。用DMEM + 0.1% FCS在37°C過夜，進(jìn)行饑餓步驟。然后吸出培養(yǎng)基并用DMEM + O. 1% FCS在37°C漂清過夜。細(xì)胞用3% BSA的DMEM + O. 1% FCS在室溫下封閉I小時(shí)。對(duì)于封閉實(shí)驗(yàn)，加入抗體(稀釋度1:100，小鼠IgG ab，山羊，抗RHAMM mAb,或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + O. 1% FCS培養(yǎng)基)并在37°C孵育I小時(shí)。用抗小鼠IgG封閉的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，因?yàn)樵摽贵w顯示出對(duì)RHAMM無結(jié)合親和力。然后吸出所得培養(yǎng)基，細(xì)胞用DMEM + 0.1% FCS在RT洗滌。加入熒光素-綴合的肽(50 μ g/mL)并在37 °C孵育30分鐘。細(xì)胞用DMEM + O. 1% FCS洗滌，再用PBS (pH = 7. 6)洗漆。然后使用含 Fluoro-gel 11 的 DAPI (Electron microscopysciences, USA),通過制造商方案將細(xì)胞封固。用Olympus FluoView FV1000偶聯(lián)的1X81 Motorized Inverted System Microscope 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攝影。使用 ImageJ (vl. 42q)軟件分析Tiff圖像。將每幅圖像轉(zhuǎn)化為8-bit格式并經(jīng)受閾值20和255。選擇對(duì)應(yīng)于細(xì)胞體(n=15)的目標(biāo)區(qū)(ROI)。再用8 bit所獲數(shù)據(jù)計(jì)算每一 ROI的平均突光。用Prism(GraphPad Software, San Diego, USA)統(tǒng)計(jì)程序，用單向 AN0VA,分析數(shù)據(jù)。結(jié)果` 針對(duì)RHAMM，篩選微管蛋白-衍生的肽
圖2 A顯示未經(jīng)修飾的微管蛋白-衍生的肽(圖2 A a)、以及與N-乙酰半胱氨酸(圖2 A b)和異硫氰酸熒光素綴合的肽的通用結(jié)構(gòu)(圖2 A C)。圖2 B是描述為本研究而制備
的所有17種肽的表。17種合成肽的序列包括不同微管蛋白亞類的CTT以及直接側(cè)接aia·(SEQ ID NOs: 6、7 和 8)和_3*CTT的序列(SEQ ID NOs: 13 和 14)。 一個(gè) 6 碳接頭用于
增加肽和額外肽修飾之間的距離。圖2 B也包括衍生的肽。制備衍生的肽，其具有熒光素(圖 2B 的肽 lc、3c、9c、llc、12c、14c ;SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33 和 35)或 N-乙酰半胱氨酸修飾的 N-端(圖 2B 的肽 lb、3b、9b、llb、12b、14b ;SEQ ID NOs: 24、26、28、30、32 和
34)。所有肽都通過ESI+質(zhì)譜來表征并通過反相HPLC來分析其純度。圖2 B是說明使用ES1-MS和RP HPLC,分析17種合成的微管蛋白-衍生的肽的表。計(jì)算的和實(shí)測(cè)的m/z值基于經(jīng)ES I測(cè)定的所觀測(cè)到的明顯信號(hào)。％純度經(jīng)RP HPLC測(cè)定，在220 nm處檢測(cè)?；赟PR (表面等離振子共振)的篩選方法用于快速而準(zhǔn)確測(cè)定能識(shí)別RHAMM的HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的潛在候選肽。篩選17種微管蛋白-衍生的肽，所得傳感圖用于推測(cè)顯示出對(duì)RHAMM的親和力的肽。篩選之前，測(cè)定配體固定(在該情況下是RHAMM)到傳感器板的最佳條件。固定緩沖液的最佳PH平衡蛋白與傳感器板的靜電引力，同時(shí)使蛋白失活減至最小。在本研究中，用于固定的最佳pH經(jīng)測(cè)定是產(chǎn)生最高配體密度的pH。使用不同pH的碳酸氫鈉緩沖液，流速30 μ L/min和固定濃度的EDAC和磺基-NHS，將RHAMM偶聯(lián)到傳感器板。根據(jù)6次測(cè)量的平均SPR反應(yīng)測(cè)定各pH固定條件的RHAMM配體密度，并且最大配體固定發(fā)生在pH 9.7 (圖3 A)。配體固定稍低于pH 10. 1，部分地因?yàn)镽HAMM上的凈電荷在其等電點(diǎn)損失。RHAMM在SPR傳感器芯片上固定之后,將一系列微管蛋白衍生的妝進(jìn)彳丁注射。妝與RHAMM的締合進(jìn)行3分鐘并且在無分析物緩沖液中進(jìn)行解離10分鐘。圖3 B顯示在濃度為10 μ m時(shí)得到的實(shí)驗(yàn)傳感圖。對(duì)于每次肽注射，從試驗(yàn)傳感圖中減去對(duì)照傳感圖(未固定的RHAMM和緩沖液注射)，并在下一次肽注射之前使芯片表面再生，以除去任何殘余的結(jié)合肽。對(duì)17種肽進(jìn)行篩選得到對(duì)RHAMM顯示出親和力增加的6種肽，S卩1a (SEQ ID NO:l)、3a (SEQ ID NO: 3)、9a (SEQ ID NO: 9)、Ila (SEQ ID NO: 11)、12a (SEQ ID NO: 12)和 14a (SEQ ID NO: 14)。固定化微管蛋白衍生的肽對(duì)RHAMM的親和力對(duì)以上部分得到的這6種肽與RHAMM的結(jié)合進(jìn)行定量測(cè)定。截短研究表明CTT (即S-肽最后12個(gè)羧端殘基)足以誘導(dǎo)MAP-指導(dǎo)的微管裝配[18]，因此將通過接頭部分間隔的標(biāo)記放在CTT的氨基端，不會(huì)影響肽-蛋白相互作用。將肽固定在傳感器板并使不同濃度的RHAMM流過衍生的表面，恒定流速lOOyL/min。圖4 A描述所得傳感圖。同樣，每幅傳感圖都通過從參考傳感圖(數(shù)據(jù)得自無固定化肽的傳感圖)中減去各曲線而得以校正，以說明運(yùn)行緩沖液和樣品溶液之間的折射指數(shù)差異。用得自動(dòng)力學(xué)模型的曲線擬合實(shí)驗(yàn)傳感圖，用于1:1 Langmuir結(jié)合模型。圖4 B的表中給出了得自不同RHAMM濃度的6種肽的Kd平均值以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。作為陽性對(duì)照，也測(cè)量了抗RHAMM mAb的動(dòng)力學(xué)概況，結(jié)果顯示對(duì)RHAMM的5. 53 nM親和力。肽SEQID NO:1 (Kd= 24 nM), SEQ ID NO: 9 (Kd= 32 nM)和SEQ ID NO: 14 (Kd= 30 nM)顯示出在低納摩爾范圍內(nèi)的解離常數(shù)，表明對(duì)RHAMM的高親和力。還使用ELISA測(cè)量了 6種肽的每一種的相對(duì)結(jié)合親和力。在該測(cè)定中，肽用熒光素標(biāo)記，通過加入氨基己酸接頭而使染料遠(yuǎn)離肽。如圖3 C所示，ELISA結(jié)果也表明肽SEQID NOs: 1、9和14在所有濃度時(shí)都具有最高相對(duì)結(jié)合親和力。可能的是，肽的熒光團(tuán)修飾可對(duì)配體-RHAMM相互作用或?qū)Ψ翘禺愋越Y(jié)合有影響，因此SPR和ELISA結(jié)果可能并不準(zhǔn)確匹配。微管蛋白 -衍生的肽被HA競(jìng)爭(zhēng)性置換進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，以測(cè)定肽對(duì)RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇性。在該測(cè)定中，使用熒光素-標(biāo)記的肽并評(píng)價(jià)未標(biāo)記的HA封閉肽與RHAMM結(jié)合的有效性。將熒光素-標(biāo)記的肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14，對(duì)應(yīng)于圖2B 中的肽 lc、3c、9c、llc、12c 和 14c (SEQ ID NO 25、27、29、31、33 和 35)加入到含固定化RHAMM的ELISA板，然后加入不同濃度的HA，其是RHAMM的天然配體。可見所觀測(cè)的熒光減少，因?yàn)镠A置換了熒光素-標(biāo)記的肽，如果它們競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合位點(diǎn)的話。圖5 A顯示肽與RHAMM的結(jié)合被HA競(jìng)爭(zhēng)性置換，并在所有6種配體中都觀測(cè)到隨著HA競(jìng)爭(zhēng)者濃度增加，熒光的濃度依賴性減少，其中最有效的相對(duì)置換發(fā)生在熒光素-標(biāo)記的肽SEQ ID NOs: 1、12和 14 (SEQ ID NOs: 25、33 和 35)，盡管 SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 29)的肽也被置換。設(shè)計(jì)出備選的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)肽配體，因?yàn)闊晒馑貥?biāo)記的存在可能影響這些低分子量肽的物理性質(zhì)和所得結(jié)合潛力。使用ELISA，未標(biāo)記的肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (對(duì)應(yīng)于圖2B的肽la、3a、9a、lla、12a和14a)用于與染料-標(biāo)記的HA競(jìng)爭(zhēng)。本測(cè)定消除了如下所致的混雜結(jié)果染料標(biāo)記和蛋白之間的相互作用或者因大量染料加入到肽配體中所導(dǎo)致的親和力變化。如圖5B所示，因熒光信號(hào)減少而容易觀測(cè)到標(biāo)記的-HA被無熒光的微管蛋白衍生的肽置換。未標(biāo)記的RHAMM配體或熒光素-標(biāo)記的配體SEQ IDNO: 14和未標(biāo)記的RHAMM配體或熒光素-標(biāo)記的配體SEQ ID NO: 9尤其顯示出能夠一貫性地與HA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，因此支持了以下觀點(diǎn)在肽的氨基端上的進(jìn)一步修飾對(duì)與RHAMM的結(jié)合幾乎無影響。然而，與SEQ ID NO:1的未修飾肽相比，含有序列SEQ ID NO:1的熒光素-標(biāo)記的a Ia-CTT (肽Ic ；SEQ ID NO: 25)，似乎更好地與HA競(jìng)爭(zhēng)。 對(duì)RHAMM和⑶44的特異性先前的結(jié)果表明這些肽可能夠靶向RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。然而，為了顯示這些HA模擬物是特異性靶向RHAMM的，有必要測(cè)試所述肽對(duì)其它透明質(zhì)酸粘素(hyaladerin)例如⑶44的親和力。為此,用⑶44功能化表面進(jìn)行固相肽結(jié)合測(cè)定(ELISA)，其在圖5 C中說明。如上所述，SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (SEQID NOs: 25、27、29、31、33和35)的每種FITC-綴合的肽與每一種透明質(zhì)酸粘素(RHAMM或CD44)孵育，并在充分洗滌方案后記錄所得熒光測(cè)量。正如所料，產(chǎn)生自RHAMM和熒光素-肽的熒光測(cè)量顯示最高信號(hào)，并且在加入HA之后，觀測(cè)到熒光明顯減少。相反，如熒光所表明的CD44和熒光素-肽相互作用，顯著更低并且在加入HA之后未顯示出預(yù)期的熒光測(cè)量的下降。因此，肽的結(jié)合是由與RHAMM的特異性相互作用所致，而它們顯示出與CD44有限的相互作用。血清穩(wěn)定性為了測(cè)試它們作為靶向?qū)嶓w或治療藥的潛力，需要研究RHAMM-結(jié)合肽在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性，在11小時(shí)的時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)了肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14的每一種的體外血清穩(wěn)定性，并且用RP-HPLC對(duì)剩余完整肽進(jìn)行定量測(cè)定。在本測(cè)定中，在37°C讓肽經(jīng)受胎牛血清，以30分鐘間隔取出等分試樣。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過用三氟乙酸(TFA)沉淀血清蛋白而終止反應(yīng)，并用離心以獲取含肽的粗制溶液。將溶液通過C18反相柱(C18 S印-Pak )，以除去低分子量雜質(zhì)。從柱子上洗脫完整肽，凍干并分析。如圖9所示，未經(jīng)修飾的RHAMM-結(jié)合肽表現(xiàn)出血清穩(wěn)定性，且合理半衰期為大約2-4小時(shí)。細(xì)胞熒光測(cè)定(MDA-MB-231攝取研究):為了測(cè)定本發(fā)明微管蛋白衍生的肽對(duì)表達(dá)RHAMM的細(xì)胞的特異性以及它們作為靶向?qū)嶓w的潛力，使用經(jīng)抗RHAMM抗體處理的MDA-MB-231細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞熒光測(cè)定。MDA-MB-231乳瘤細(xì)胞系顯示出RHAMM受體的高表達(dá)，因此該細(xì)胞系是評(píng)價(jià)合成微管蛋白肽的靶向和特異性的理想選擇。將MDA-MB-231細(xì)胞與熒光素-綴合的肽SEQ ID NOs: 1、9和14 (SEQ ID NOs: 25、29和35) —起孵育，并且測(cè)量細(xì)胞對(duì)探針的攝取。如圖6A (對(duì)于SEQ ID NO: 35)和圖7 (對(duì)于SEQ ID NOs: 25和29)所說明的，對(duì)于所有測(cè)試的肽，在未接受封閉處理的細(xì)胞以及在與非特異性抗體(IgG抗體)一起孵育的細(xì)胞中觀測(cè)到熒光信號(hào)的積累，表明對(duì)熒光標(biāo)記的探針的高攝取。有趣的是，用抗CD44封閉的細(xì)胞顯示出無信號(hào)降低。然而，用抗RHAMM mAb封閉的細(xì)胞顯示出細(xì)胞熒光的顯著降低，證實(shí)肽SEQ ID NOs:1、9和14對(duì)RHAMM的特異性(P〈0.001)。如圖6 B所說明的，用抗RHAMM mAb封閉的細(xì)胞顯示出大約65%至大約85%的細(xì)胞熒光降低(熒光素-標(biāo)記的SEQ ID NOs: 1、9和14分別顯示出大約85%、大約76%和大約65%的熒光降低)。
討論
RHAMM是在各種癌癥中過量表達(dá)的癌基因。另外，在表達(dá)RHAMM的癌細(xì)胞中HA (RHAMM的胞外配體)的積累增加是不良臨床后果的預(yù)后因素。因此，靶向RHAMM并能與HA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的低分子量配體可用于診斷和治療目的。在本研究中，本發(fā)明人尋求鑒定能靶向RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體。本發(fā)明人理由充分地說明，因?yàn)楹蠬A結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RHAMM羧基端介導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)的微管網(wǎng)絡(luò)上的定位，所以進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫搜索和RHAMM與已知微管蛋白相關(guān)蛋白(例如MAP)的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的成對(duì)比較。此外，因?yàn)檫@些蛋白表現(xiàn)出與微管蛋白的CTT直接結(jié)合，所以本發(fā)明人假設(shè)RHAMM可顯示出與代表不同微管蛋白亞類的CTT的合成肽的直接相互作用。因?yàn)镸AP的微管蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和RHAMM的HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的適度特異性，所以進(jìn)行進(jìn)一步研究，以測(cè)定微管蛋白的哪些肽片段與RHAMM相互作用。在本研究中，推導(dǎo)出RHAMM和新配體之間的特異性相互作用。使用固相肽合成，合成衍生自不同微管蛋白亞類羧基端結(jié)構(gòu)域(即CTT區(qū))的肽片段、以及直接接近上述結(jié)構(gòu)域的序列。針對(duì)RHAMM，對(duì)所得肽進(jìn)行篩選，以測(cè)定高親和力配體。為此，使用SPR篩選方法，其中將RHAMM蛋白固定到SPR傳感器板，并讓肽流過，以發(fā)現(xiàn)具有高親和力和特異性的配體。使用該方法，因?yàn)樗试S使用單個(gè)RHAMM-帶電荷的傳感器板進(jìn)行高通量篩選，并且SPR-結(jié)合的RHAMM可反映其作為細(xì)胞受體的天然膜結(jié)合狀態(tài)。篩選得到6種高親和力配體，其能與HA競(jìng)爭(zhēng)經(jīng)ELISA測(cè)定的RHAMM的HA結(jié)合區(qū)。進(jìn)一步評(píng)價(jià)確定這些肽相較于CD44( —種已知也結(jié)合HA的透明質(zhì)酸粘素)顯示出對(duì)RHAMM的更高特異性。肽在生物環(huán)境(牛血清)中顯示出適度穩(wěn)定性(大約110-250分鐘的半衰期)，這可為足夠長(zhǎng),有利于體外、離體或體內(nèi)成像。通過在表達(dá)RHAMM的癌細(xì)胞中定量測(cè)定對(duì)配體的相對(duì)攝取，分析了對(duì)RHAMM具有更高親和力的3種HA肽模擬物(SEQ ID NOs:. 1、9和14)的特異性。為此，將SEQ ID NOs:. 1、9和14的肽與熒光素綴合(SEQ ID NOs: 25,29和35)并與MDA-MB-231細(xì)胞(過量表達(dá)RHAMM的細(xì)胞系)孵育。對(duì)于所有3種肽都觀測(cè)到細(xì)胞熒光，并且加入抗CD44或非特異性抗體(即IgG抗體)并未減少攝取。然而，當(dāng)加入抗RHAMM抗體時(shí)觀測(cè)到探針攝取大大減少，表明對(duì)探針攝取的特異性封閉。因此，探針的高特異性與適度穩(wěn)定性聯(lián)合可允許進(jìn)一步開發(fā)為診斷試劑，用于表達(dá)RHAMM的癌細(xì)胞。該報(bào)告中顯示的所述結(jié)果表明RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在微管蛋白可變羧基_端部分存在通用位點(diǎn)。在大多數(shù)候選肽中注意到重復(fù)的6肽基序，并且共享該酸性羧基-端區(qū)段的肽與RHAMM相互作用?；駿EXEEZ (其中X為A或G，Z為V或E ;SEQ ID NO: 18)
存在于合成的 Qla (SEQ ID NO; 1). alllc (SEQ ID NO 3), pla (SEQ ID NO:9)和 p丨V-CT了 (SEQ IDNO: 11)中，如圖8B所說明的。該結(jié)果與先前的報(bào)告是一致的，即短序列EEGEE (SEQ IDNO: 21) (Paschal等，1989)可參與微管蛋白和MAP結(jié)合，是與RHAMM共享序列同源性的
蛋白家族。盡管酸性官能團(tuán)在HA和RHAMM相互作用中的作用，結(jié)果也可表明在CTT區(qū)內(nèi)的這些酸性殘基的隨機(jī)發(fā)生或增加，看來并不直接影響RHAMM-微管蛋白相互作用。意想不到的是，含有 DEXEEZ (如在肽 SEQ ID NOs: 2 和 4 中所見)(SEQ ID NO: 22)和 EEXEDZ (如在SEQ ID NO: 10中所見)(SEQ ID NO: 23)基序的肽未通過最初的篩選，表明第一和第五序列內(nèi)的Asp殘基不可取代該基序中的類似酸性Glu殘基。這表明CTT與RHAMM的相互作用同時(shí)被靜電力和構(gòu)象效應(yīng)介導(dǎo)。顯著性
本研究公開了至少6種與RHAMM的HA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的新配體的發(fā)現(xiàn)。這6種肽對(duì)RHAMM具有強(qiáng)親和力并且能夠被內(nèi)源HA置換，因此顯示出特異性靶向HA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另外，在基于無細(xì)胞的(即ELISA)和基于細(xì)胞的(即細(xì)胞熒光)測(cè)定中，這些配體與RHAMM結(jié)合的傾向大于與另一種透明質(zhì)酸粘素CD44，可證明其作為靶向?qū)嶓w的潛力。RHAMM的過量表達(dá)及其所導(dǎo)致的與HA的相互作用亦牽涉癌癥病理學(xué)。因此，這些肽可作為可封閉RHAMM-HA相互作用的拮抗劑，因此限制了 RHAMM的轉(zhuǎn)化潛力。實(shí)施例3 -丙氨酸-取代的RHAMM-結(jié)合肽與RHAMM的親和力
材料溶劑無需進(jìn)一步純化就可使用，并且購(gòu)自VWR, Fisher Scientific或SigmaAldrich。對(duì)于妝合成，荷基甲氧基擬基(Fmoc)-Rink amide MBHA (100-200目)樹脂、Fmoc氨基酸、Fmoc-保護(hù)的氨基己酸(Fmoc-Ahx)和HBTU (六氟磷酸2-(IH-苯并三唑1-基)-1，1，3，3-四甲基服鐵)偶聯(lián)劑得自 Peptides International。肽合成使用自動(dòng)化(APEX 396自動(dòng)合成儀)和/或手動(dòng)方法，使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成，包括Fmoc脫保護(hù)和氨基酸偶聯(lián)循環(huán),在rink amide MBHA樹脂(O.1 mmol)上進(jìn)行肽鏈延伸。使用20%哌啶在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液，在整個(gè)合成中重復(fù)進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)(15和20分鐘周期)。以30和90分鐘間隔使用O. 05 M或更高濃度的Fmoc-保護(hù)的氨基酸和HSTU，5當(dāng)量N，N- 二異丙 基乙胺(DIPEA) /DMF,進(jìn)行所有氨基酸偶聯(lián)。每次脫保護(hù)和偶聯(lián)步驟之后，樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復(fù)洗滌。使用同樣參數(shù)偶聯(lián)Fmoc-Ahx。如下進(jìn)行熒光素偶聯(lián)使肽的氨基與FITC熒光染料(4當(dāng)量)在含有DIPEA (2當(dāng)量)的DMF中反應(yīng)4小時(shí)。所得樹脂用由88% TFA和12%清除劑(5%水、5%三異丙基硅烷和2%苯酚)組成的裂解混合物處理。將所得樹脂在700 rpm振搖3小時(shí)并通過RP-HPLC純化。ELISA結(jié)合測(cè)定進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，以測(cè)試熒光素-標(biāo)記的肽SEQID NO:1 (SEQ ID NO: 25)或熒光素-標(biāo)記的肽SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)中丙氨酸取代的影響，以確定對(duì)RHAMM結(jié)合而言重要的殘基。將重組RHAMM (O. 05M PBS 中的 100 μ LUO μ g/mL, pH 9)加入到 96 孔板(終
濃度I Pg/孔)并在4°c孵育過夜。各板用(O. 05%) PBS-吐溫-20緩沖液(200 μ L/孔)洗滌3次，然后在室溫下與BSA封閉液孵育I小時(shí)。加入熒光素-標(biāo)記的肽(SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 35)(終濃度 I μ g/mL)，用(O. 05%) PBS-吐溫-20 緩沖液(200 μ L/ 孔)洗滌，然后在 485/535 nm處測(cè)量吸光度。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA :使用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，測(cè)量丙氨酸取代的熒光素-標(biāo)記的SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO: 25)或熒光素-標(biāo)記的 SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)置換 HA 和競(jìng)爭(zhēng)RHAMM的能力。如上所述地進(jìn)行蛋白固定和3次洗滌之后，將熒光素-標(biāo)記的微管蛋白衍生的肽(終濃度 I μ g/mL)和 HA (100 μ L/ 孔，Μ· ff. 220 kDa, PBS 中的 10 μ g/mL, HA =I mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL)加入到各板并在4°C孵育過夜。洗漆方案之后,在485/535nm處測(cè)量吸光度。結(jié)果圖10 A說明12種丙氨酸-取代的(丙氨酸掃描)熒光素-綴合的肽SEQ ID NO:1(SEQ ID NO: 25)對(duì)RHAMM的親和力。數(shù)據(jù)表明SEQ ID NO:1的殘基2、4、7_10和12對(duì)與RHAMM的適當(dāng)結(jié)合可為重要的。圖10 B說明12種丙氨酸-取代的熒光素-標(biāo)記的SEQ IDNO:1肽(SEQ ID NO: 25)被HA競(jìng)爭(zhēng)性置換到固定化Rhamm-CT。數(shù)據(jù)顯示在SEQ ID NO:1的位置2、4、7-10和12的丙氨酸取代消除了所述肽與HA競(jìng)爭(zhēng)的能力。從每次測(cè)量中減去陰性對(duì)照(未固定的RHAMM)并且所有數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值。圖17 A說明11種丙氨酸-取代的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO:
35)對(duì)RHAMM的HA-結(jié)合區(qū)的親和力。數(shù)據(jù)表明SEQ ID NO: 14的殘基2、3、5、6、9和10對(duì)RHAMM的適當(dāng)結(jié)合可為重要的。圖17 B說明11種丙氨酸-取代的熒光素-標(biāo)記的SEQ IDNO: 14 (SEQ ID NO: 35)被HA競(jìng)爭(zhēng)性置換到固定化RHAMM-CT。數(shù)據(jù)顯示在SEQ ID NO:14的位置2、3、5、6、9和10的丙氨酸取代消除了所述肽與HA競(jìng)爭(zhēng)的能力。從每次測(cè)量中減去陰性對(duì)照(未固定的RHAMM)并且所有數(shù)據(jù)顯示在2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的3次測(cè)量的平均值。實(shí)施例4-人上皮卵巢癌細(xì)胞
材料緩沖液和培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen、Sigma和VWR。AlamarBlue測(cè)定試劑盒購(gòu)自Invitrogen0 二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自Aldrich。上皮卵巢癌(EOC)細(xì)胞經(jīng)患者同意后得自London Regional Cancer Center。增殖測(cè)定檢查了一種RHAMM-結(jié)合肽(SEQ ID NO:1)限制患者來源的上皮卵巢癌腫瘤的增殖的能力和另一種RHAMM-結(jié)合肽(SEQ ID NO: 3)降低腹水-來源的人EOC細(xì)胞的活力的能力。在這些測(cè)定中，將上皮卵巢癌細(xì)胞(源自患者腹水)鋪板在96孔板中，密度為5，000細(xì)胞/孔，并讓其在37°C和5% CO2中生長(zhǎng)24小時(shí)。在第一天將肽(I μ M和10 μ Μ)加入細(xì)胞，并測(cè)量增殖達(dá)6天。每天將1/10體積的Alamar Blue試劑直接加入培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞中，共6天。在570/590 nm處讀出熒光。數(shù)據(jù)得自兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)驗(yàn)中包括了僅用DMSO (二甲 亞砜)處理的細(xì)胞和“無細(xì)胞”對(duì)照樣品。EOC細(xì)胞攝取研究將EOC細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基+ 10% FBS中培養(yǎng)至90%匯合。然后將細(xì)胞接種在2 X 24-孔組織培養(yǎng)板(20，000細(xì)胞/孔的匯合)。然后細(xì)胞用3% BSA的DMEM + O. 1% FCS在室溫下封閉I小時(shí)。對(duì)于封閉實(shí)驗(yàn)，加入抗體(稀釋度1:100，抗IgG,山羊抗-Rhamm mAb或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + O. 1% FCS培養(yǎng)基)并在37°C孵育I小時(shí)。然后吸出所得培養(yǎng)基，并用DMEM + 0.1% FCS在室溫下洗滌細(xì)胞。加入熒光素綴合的肽(SEQ ID NO: 25 ；50 ug/mL)并在 37°C孵育 30 分鐘。細(xì)胞用 DMEM + O. 1% FCS 洗滌，然后用 PBS(pH 7. 6)洗漆，使用含F(xiàn)luoro-gel 11 的DAPI (Electron microscopy sciences,
USA),通過制造商方案將細(xì)胞封固。用Olympus FluoView FV1000偶聯(lián)的ixgi MotorizedInverted System Microscope 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攝影。使用 ImageJ (vl. 42q)軟件分析 Tiff 圖像。將每幅圖像轉(zhuǎn)化為8-bit格式并經(jīng)受閾值20和255。選擇目標(biāo)區(qū)(ROI)并求出平均細(xì)胞熒光。人上皮卵巢癌細(xì)胞的增殖
圖11說明肽SEQ ID NO:1在人上皮卵巢癌(EOC)細(xì)胞中的增殖測(cè)定。EOC細(xì)胞是來自上皮卵巢癌患者腹水的樣品。用alamarBlue測(cè)定來測(cè)量增殖水平。在第一天加入一次肽SEQ ID NO:1并測(cè)量隨時(shí)間而變的作用。數(shù)據(jù)顯示在4份患者OC細(xì)胞樣品中有3份表現(xiàn)出對(duì)增殖的抑制。
圖13說明使用熒光顯微術(shù)，卵巢瘤細(xì)胞對(duì)熒光素-綴合的肽SEQ ID NO:1 (SEQID NO: 25)的攝取的顯現(xiàn)。正如所料，當(dāng)EOC細(xì)胞與抗RHAMM—起孵育時(shí)，對(duì)熒光素-標(biāo)記的SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO: 25)的攝取減少，而對(duì)于經(jīng)抗IgG或抗⑶44處理的細(xì)胞，探針的攝取不受影響。圖12是一幅圖，說明RHAMM-結(jié)合肽降低了腹水-來源的人EOC細(xì)胞的活力(p〈0. 05)。將來自患者樣品EOC的原代細(xì)胞接種到24-孔培養(yǎng)皿中，并在24小時(shí)后用RHAMM-結(jié)合肽SEQ ID NO: 3 (7和O. 7 uM的濃度)或DMSO溶媒對(duì)照開始處理。每天進(jìn)行重復(fù)給藥，共6天，并且通過熒光測(cè)定術(shù)，使用alamarBlue 試劑評(píng)價(jià)細(xì)胞活力(以熒光單位FU測(cè)量)。實(shí)施例5 - PC3mLN4人前列腺癌系材料和方法
細(xì)胞攝取研究由侵襲性/轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤細(xì)胞表達(dá)的2種乙酰透明質(zhì)酸受體是CD44和RHAMM。因此，評(píng)價(jià)了本發(fā)明肽選擇性靶向前列腺癌細(xì)胞的能力。在該測(cè)定中，將PC3mLN4人前列腺癌細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基+ 10% FBS中培養(yǎng)至90%匯合。然后將細(xì)胞接種在2 X 24-孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片(12 X 12 mm,包被有50 μ g/ml纖連蛋白)上(20000/孔的匯合)。然后細(xì)胞用3% BSA的DMEM + 0.1% FCS在室溫下封閉I小時(shí)。對(duì)于封閉實(shí)驗(yàn)，加入抗體(稀釋度1:100，山羊抗Rhamm mAb或小鼠抗⑶44 mAb的DMEM +O. 1% FCS培養(yǎng)基)并在37°C孵育I小時(shí)。然后吸出所得培養(yǎng)基，并用DMEM + O. 1% FCS在室溫下洗滌細(xì)胞。加入熒光素-綴合的肽(SEQ ID NO: 29 ；50 ug/mL)并在37°C孵育30分鐘。細(xì)胞用DMEM + 0.1% FCS洗滌，然后用PBS (pH = 7.6)洗滌，使用含F(xiàn)luoro-gel 11的 DAPI (Electron microscopy sciences, USA),通過制造商方案將細(xì)胞封固。用 OlympusFluoView FV1000 IXS1 Motorized Inverted System Microscope 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攝影。使用
ImageJ (vl. 42q)軟件分析Tiff圖像。將每幅圖像轉(zhuǎn)化為8_bit格式并經(jīng)受閾值20和255。選擇目標(biāo)區(qū)(ROI)并求出平均細(xì)胞熒光。PC3mLN4人前列腺癌系中的肽攝取
圖14 A顯示侵占性侵襲和轉(zhuǎn)移的PC3mLN4人前列腺癌系對(duì)HA的熒光素-綴合的肽SEQ ID NO: 9模擬物(SEQ ID NO: 29)的攝取。使用共聚焦顯微鏡，在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)熒光素-綴合的肽(圖14A (a)，然而，當(dāng)RHAMM蛋白被抗RHAMM mAb封閉時(shí)，F(xiàn)ITC信號(hào)減少(圖14A (C))。這表明探針攝取被特定抗RHAMM單克隆抗體封閉。另外，當(dāng)用抗CD44單克隆抗體處理細(xì)胞時(shí)，對(duì)熒光素-綴合的HA模擬物的攝取不變(圖14A (b))。這些結(jié)果表明本發(fā)明的HA肽模擬物通過RHAMM依賴性機(jī)制與前列腺癌細(xì)胞締合并且被這些細(xì)胞所攝取。對(duì)攝取的定量測(cè)定(圖14 B)顯示接受無抗體治療的細(xì)胞(a)和用抗CD44封閉的細(xì)胞(b)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在用抗RHAMM抗體治療的細(xì)胞中對(duì)探針的攝取極大地下降(c)(ρ〈0· 001)。實(shí)施例6 - Ga-DOTA-綴合的肽的合成和表征
材料所用溶劑購(gòu)自 VWR, Fisher Scientific 或 Sigma Aldrich。Rink amide M8HA樹脂(100-200目，0. 56 mmol/g)、標(biāo)準(zhǔn)Fmoc氨基酸和HBTU偶聯(lián)試劑得自PeptidesInternational。1-溴己酸、甘氨酸。溴乙酸乙酯和硝酸鎵(III)購(gòu)自Sigma Aldrich。Cyclen (1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二燒)和 Re (CO)5Br 購(gòu)自 Strem Chemicals。
肽合成使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成，包括Fmoc脫保護(hù)和氨基酸偶聯(lián)循環(huán)，在rinkamide MBHA樹脂(0.1 mmol)上合成肽。使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液，在整個(gè)合成中重復(fù)進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)(15和20分鐘周期)。以30分鐘和90分鐘間隔使用O. 05 M或更高濃度的Fmoc-保護(hù)的氨基酸和HBTU，5當(dāng)量N，N- 二異丙基乙胺(DIPEA) /DMF，進(jìn)行所有氨基酸偶聯(lián)。每次脫保護(hù)和偶聯(lián)步驟之后，樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復(fù)洗滌。使用同樣參數(shù)偶聯(lián)6-溴己酸。讓DMF中的Cyclen (I, 4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷)(10當(dāng)量)與肽基鏈末端反應(yīng)3天。讓DMF中的溴乙酸乙酯(3當(dāng)量/胺)與cyclen的仲胺反應(yīng)24小時(shí)，產(chǎn)生鎵螯合物(DOTA)。用88% TFA處理之后，對(duì)肽進(jìn)行純化，使用由H2O + O. 1% TFA (溶劑A)和CH3CN + O. 1% TFA (溶劑B)組成的梯度溶劑系統(tǒng)，對(duì)分析型和制備型HPLC分別以線性流速1. 5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白 / 妝 RP-C18 柱(4. 6 _ X 250 μ m, 5 μ m)，進(jìn)行分析型 HPLC,并使用 Grace Vydac 蛋白 / 肽 RP-C18 柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μ m)，進(jìn)行制備型 HPLC。使用 Waters 2998 光電二極管陣列檢測(cè)器，在220 nm和254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。純化期間，收集各流分，凍干并通過 ES1-MS (Waters Micromass Quattro Micro API)分析。Ga-69/71標(biāo)記使用69mGa(NO3)3的乙酸緩沖液，pH 5. 5，對(duì)鎵進(jìn)行配位達(dá)15分鐘。產(chǎn)物使用C18反相(C18 Sep-Pak )柱分離。使用含1%三氟乙酸的30%乙腈的去離子水將產(chǎn)物從柱子上洗脫下來。所得產(chǎn)物用質(zhì)譜表征，并用RP-HPLC分析純度。 Ga-DOTA-綴合的肽的合成和表征
合成和表征69mGa-DOTA-綴合的肽SEQ ID NO:1作為68Ga-配位的放射性示蹤劑的可能的非放射性替代物，用于PET成像。圖15 A描述DOTA-綴合的肽的鎵標(biāo)記。圖15 B說明純化的鎵配位的肽在9. 73分鐘的RP-HPLC色譜圖。圖15 C說明圖15 A化合物的ESI質(zhì)譜(實(shí)測(cè)的:936. 7 [M+2H] 2+，計(jì)算的:934. 87 [M+2H]2+)。實(shí)施例7 - Re (CO) 3+-配位的肽的合成和表征
材料所用溶劑購(gòu)自 VWR. Fisher Scientific 或 Sigma Aldrich。Rink amide MBHA樹脂(100-200目，O. 56 mmol/g)、標(biāo)準(zhǔn)Fmoc氨基酸和HBTU偶聯(lián)試劑得自PeptidesInternational。甘氨酸、氰基硼氫化鈉和3-卩比唳甲醒購(gòu)自Sigma Aldrich。Re(CO)5Br購(gòu)自 Strem Chemicals。Re(CO)3+螯合劑合成([雙(吡啶-2-基甲基)氨基]乙酸):向甘氨酸(0.602 g,
8.02 mmol)的10%乙酸(20 mL)溶液中加入過量3-吡啶甲醛(4. 28 g 0. 02 mol)。在室溫下攪拌I小時(shí)后，加入氰基硼氫化鈉(1.01 g, 0.016 mol)并將所得反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)。所得混合物用氯仿(3 X 40 mL)萃取，經(jīng)MgSO4干燥，并蒸發(fā)揮發(fā)物，得到黃色油狀物。粗制產(chǎn)物用二氧化硅色譜純化(90%氯仿10%甲醇)(1.67 g, 81%收率)。肽合成使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成，包括Fmoc脫保護(hù)和氨基酸偶聯(lián)循環(huán)，在rinkamide MBHA樹脂(0.1 mmol)上合成肽。使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液，在整個(gè)合成中重復(fù)進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)(15和20分鐘周期)。以30分鐘和90分鐘間隔使用0.05 M或更高濃度的Fmoc-保護(hù)的氨基酸和HBTU，5當(dāng)量N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)/DMF，進(jìn)行所有氨基酸偶聯(lián)。每次脫保護(hù)和偶聯(lián)步驟之后，樹脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重復(fù)洗滌。用上述方法偶聯(lián)Fmoc-氨基己酸和([雙(吡啶_2_基甲基)氨基]乙酸。使用過量[Re(CO)3Br3] (NEt4)2進(jìn)行錸配位。用88%三氟乙酸進(jìn)行從固體支持物上的裂解。對(duì)肽進(jìn)行純化，使用由H2O + O. 1% TFA (溶劑A)和CH3CN + O. 1% TFA (溶劑B)組成的梯度溶劑系統(tǒng)，對(duì)分析型和制備型HPLC分別以線性流速1. 5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/妝RP-C18柱(4. 6 _ x 250 μ m，5 μ m)進(jìn)行分析型HPLC，并使用 Grace Vydac 蛋白 / 肽 RP-C18 柱(22. O mm x 250 mm, 10 μ m)進(jìn)行制備型 HPLC。使用Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器，在220 nm和254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。純化期間，收集各流分，凍干并通過 ES1-MS (Waters Micromass Quattro Micro API)分析。合成和表征Re(CO)3+ -配位的肽SEQ ID NO:1作為99Tc(CO) 3+配位的放射性示蹤劑的可能的非放射性替代物，用于SPECT成像。圖16 A描述Re(CO)3+ -配位的肽SEQ IDNO:1的合成，圖16 B說明純化的錸配位的肽在11.06分鐘的RP-HPLC色譜圖。圖16 C說明錸配位的肽的ESI質(zhì)譜(實(shí)測(cè)的939.1 [M+2H]2.，計(jì)算的940. 2 [M+2H] 2+)。非專利參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO:18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
2.RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含至少一種選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽選自SEQID NO:1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和 SEQ IDNO: 14。
4.權(quán)利要求2的RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽選自SEQID NO:1、SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 14。
5.微管蛋白-衍生的肽，其中所述分離的微管蛋白-衍生的肽能結(jié)合RHAMM。
6.權(quán)利要求5的微管蛋白-衍生的肽，其特征在于所述微管蛋白衍生的肽包含至少一種選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5的微管蛋白-衍生的肽，其特征在于所述微管蛋白-衍生的肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
8.權(quán)利要求1-6或7的肽的功能類似物。
9.編碼權(quán)利要求2的RHAMM-結(jié)合肽的核酸。
10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的RHAMM-結(jié)合肽或權(quán)利要求8的功能類似物，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽與可檢測(cè)標(biāo)記綴合。
11.權(quán)利要求10的RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述可檢測(cè)標(biāo)記選自基于生物素的標(biāo)記、磁標(biāo)記、放射性標(biāo)記、突光標(biāo)記、電子致密試劑、酶、地高辛配基或半抗原。
12.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的RHAMM-結(jié)合肽，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽與細(xì)胞毒性分子或放射性分子綴合。
13.藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含有效量的一種或多種權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的肽或者權(quán)利要求9的核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其特征在于所述組合物額外包含輔助劑。
15.權(quán)利要求13的藥物組合物，其特征在于所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或核酸在脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體或脂質(zhì)制劑內(nèi)提供。
16.一種探針，所述探針包含RHAMM-結(jié)合肽和能通過檢測(cè)技術(shù)而檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記。
17.權(quán)利要求16的探針，其特征在于所述可檢測(cè)標(biāo)記選自基于生物素的標(biāo)記、磁標(biāo)記、放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、電子致密試劑、酶、地高辛配基或半抗原。
18.權(quán)利要求16的探針，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽與所述可檢測(cè)標(biāo)記綴合。
19.權(quán)利要求16、17或18的探針，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
20.權(quán)利要求16、17或18的探針，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含至少一種選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的探針，其特征在于所述探針用于研究表達(dá)RHAMM的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求16的探針，其特征在于所述探針選自SEQID NOs: 25、27、29、31、33和35。
23.權(quán)利要求16的探針，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽與Ga-DOTA標(biāo)記或與Re(CO)3+標(biāo)記綴合。
24.對(duì)受試者組織或器官中的RHAMM表達(dá)進(jìn)行成像的方法，其特征在于所述方法包括(a)將權(quán)利要求16的探針給予所述受試者；和(b)應(yīng)用成像技術(shù)以在所述受試者組織或器官中檢測(cè)所述標(biāo)記。
25.權(quán)利要求24的方法，其特征在于所述可檢測(cè)標(biāo)記是放射性核素，所述技術(shù)選自SPECT、CT和 PET。
26.權(quán)利要求24的方法，其特征在于將所述探針通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、口服或鼻內(nèi)給予遞送給所述受試者。
27.權(quán)利要求24的方法，其特征在于將所述探針植入目標(biāo)組織或器官。
28.權(quán)利要求24的方法，其特征在于所述受試者是人受試者。
29.權(quán)利要求24、25、26、27或28的方法，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
30.權(quán)利要求24、25、26、27或28的方法，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含至少一種選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
31.測(cè)定細(xì)胞中RHAMM的存在情況的方法，其特征在于所述方法包括使細(xì)胞與權(quán)利要求16的探針接觸和應(yīng)用所述成像技術(shù)以在細(xì)胞中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中細(xì)胞中標(biāo)記的檢出表示所述細(xì)胞中RHAMM的存在。
32.對(duì)受試者中的腫瘤祖細(xì)胞進(jìn)行成像的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求16的探針給予所述受試者和應(yīng)用所述成像技術(shù)以在受試者中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中受試者中標(biāo)記的檢出表示所述受試者中腫瘤祖細(xì)胞的存在。
33.對(duì)動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官中的腫瘤祖細(xì)胞進(jìn)行成像的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞、組織或器官與權(quán)利要求16的探針接觸和應(yīng)用所述成像技術(shù)以在細(xì)胞、組織或器官中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中細(xì)胞、組織或器官中標(biāo)記的檢出表示所述細(xì)胞、組織或器官中腫瘤祖細(xì)胞的存在。
34.確定癌癥患者的預(yù)后的方法，其特征在于所述方法包括(a)從所述患者獲取腫瘤組織樣品；(b)使所述樣品與權(quán)利要求16的探針接觸；(c)應(yīng)用所述成像技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)所述標(biāo)記；和(d)確定所述患者的預(yù)后，其中所述預(yù)后預(yù)測(cè)患者的癌癥侵占性或轉(zhuǎn)移的可能性，和其中樣品中RHAMM表達(dá)的檢出表不不良預(yù)后。
35.確定用于癌癥患者的療程的方法，其特征在于所述方法包括(a)從所述患者獲取腫瘤組織樣品；(b)使所述樣品與權(quán)利要求16的探針接觸；(c)應(yīng)用所述成像技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)所述標(biāo)記；和(d)確定所述患者的預(yù)后，其中所述預(yù)后預(yù)測(cè)患者的癌癥侵占性的可能性，并且其中所述樣品中RHAMM表達(dá)的檢出表示不良預(yù)后；并根據(jù)所述預(yù)后而確定用于所述患者的療程。
36.用于診斷RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的患者的方法，其特征在于所述方法包括(a)從所述患者獲取組織樣品；(b)使所述樣品與權(quán)利要求16的探針接觸；和(C)應(yīng)用所述成像技術(shù)以在所述樣品中檢測(cè)所述標(biāo)記；其中所述樣品中RHAMM表達(dá)的檢出表示所述病癥或病況的陽性診斷。
37.權(quán)利要求35的方法，其特征在于所述病癥或病況是癌癥。
38.權(quán)利要求31、32、33、34、35或36的方法，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
39.權(quán)利要求31、32、33、34、35或36的方法，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含至少一種選自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
40.用于治療患有RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的受試者的方法，其特征在于所述方法包括給予所述受試者有效量的組合物，所述組合物包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述一種或多種RHAMM -結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
41.用于治療患有RHAMM在細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的受試者的方法，其特征在于所述方法包括給予所述受試者有效量的組合物，所述組合物包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs. 1_17。
42.權(quán)利要求40或41的方法，其特征在于所述組合物包含有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽，并且其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽與對(duì)表達(dá)RHAMM的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的分子綴合。
43.權(quán)利要求40或41的方法，其特征在于所述病癥或病況是癌癥。
44.權(quán)利要求43的方法，其特征在于所述方法還包括給予常規(guī)癌癥療法。
45.權(quán)利要求44的方法，其特征在于所述癌癥療法選自癌癥疫苗、化學(xué)療法、免疫療法、放射療法或其組合。
46.權(quán)利要求40或41的方法，其特征在于所述病癥或病況是預(yù)防或減少組織瘢痕形成。
47.抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞增殖的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
48.抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞增殖的方法，其特征在于所述方法包括使細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs. 1_17。
49.抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
50.抑制表達(dá)RHAMM的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的方法，其特征在于所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子接觸，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs. 1_17。
51.權(quán)利要求47、48、49或50的方法，其特征在于所述表達(dá)RHAMM的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
52.在患有癌癥的患者中預(yù)防轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述方法包括給予所述患者有效量的包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子的組合物，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
53.在患有癌癥的患者中預(yù)防轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述方法包括給予所述患者有效量的包含一種或多種RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽的核酸分子的組合物，其中所述一種或多種RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs. 1_17。
54.RHAMM-結(jié)合肽在RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況的治療、改善或預(yù)防中的用途，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X選自丙氨酸或甘氨酸，并且Z選自酪氨酸或谷氨酸。
55.RHAMM-結(jié)合肽或編碼所述RHAMM-結(jié)合肽的核酸在RHAMM表達(dá)相關(guān)病癥或病況的治療、改善或預(yù)防中的用途，其特征在于所述RHAMM-結(jié)合肽選自SEQ ID NOs: 1_17。
56.權(quán)利要求54或55的用途，其特征在于所述病癥或病況是組織瘢痕形成。
57.權(quán)利要求54或55的用途，其特征在于所述病癥或病況是癌癥。
58.分離的肽，其包含選自SEQID NO:1至SEQ ID NO: 17的序列。
59.分離的DNA分子，其編碼權(quán)利要求58的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供結(jié)合透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性受體(RHAMM)分子的肽。更具體地講，提供了能特異性結(jié)合RHAMM分子并能以顯著高親和力結(jié)合RHAMM的肽。這些新RHAMM-結(jié)合肽為以下提供了基礎(chǔ)可用于鑒定表達(dá)RHAMM的細(xì)胞的新的成像探針，以及RHAMM表達(dá)相關(guān)病況的成像、預(yù)后、診斷和治療的方法。
文檔編號(hào)C07K7/08GK103038248SQ201180037528
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者L.G.盧伊特, E.A.特利, K.V.埃斯蓋拉 申請(qǐng)人:倫敦健康科學(xué)研究中心有限公司