本發(fā)明涉及能夠識(shí)別源自RHAMM(Receptor for Hyaluronan-Mediated Moti l ity,RHAMM)抗原短肽的TCR，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)上述TCR來(lái)獲得的RHAMM特異性的T細(xì)胞，及他們?cè)陬A(yù)防和治療RHAMM相關(guān)疾病中的用途。

背景技術(shù)：

RHAMM又名CD168，是作為細(xì)胞外基質(zhì)成分之一的透明質(zhì)酸的受體。RHAMM是一種內(nèi)源性抗原，在細(xì)胞內(nèi)生成后被降解成小分子多肽，并與MHC(主組織相容性復(fù)合體)分子結(jié)合形成復(fù)合物，被呈遞到細(xì)胞表面。ILSLELMKL(165-173)是衍生自RHAMM的短肽(Greiner J,et al.,Blood 2005,106(3):938-945)。研究顯示，RHAMM在多種腫瘤組織中均有表達(dá)，以白血病(Greiner J,et al.,Experimental hematology 2002,30(9):1029-1035)、結(jié)腸癌(Yamada Y,et al.,Japanese journal of cancer research:Gann 1999,90(9):987-992)、乳腺癌(Wang C,et al.,Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research 1998,4(3):567-576)較為突出，在其他的癌癥，如胃癌(Li H,et al.,International journal of oncology 2000,17(5):927-932)、腎癌(Greiner J,et al.,Experimental hematology 2002,30(9):1029-1035)、口腔鱗狀細(xì)胞癌(Yamano Y,et al.,International journal of oncology 2008,32(5):1001-1009)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Schmitt A,et al.,International journal of oncology 2009,34(3):629-639)等腫瘤細(xì)胞中也均有表達(dá)。對(duì)于上述疾病的治療，可以采用化療和放射性治療等方法，但都會(huì)對(duì)自身的正常細(xì)胞造成損害。

T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療是將對(duì)靶細(xì)胞抗原具有特異性的反應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)入病人體內(nèi)，使其針對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮作用。T細(xì)胞受體(TCR)是T細(xì)胞表面的一種膜蛋白，其能夠識(shí)別相應(yīng)的靶細(xì)胞表面的抗原短肽。在免疫系統(tǒng)中，通過(guò)抗原短肽特異性的TCR與短肽-主組織相容性復(fù)合體(pMHC復(fù)合物)的結(jié)合引發(fā)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(APC)直接的物理接觸，然后T細(xì)胞及APC兩者的其他細(xì)胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，引起一系列后續(xù)的細(xì)胞信號(hào)傳遞和其他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T細(xì)胞對(duì)其靶細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于分離出對(duì)RHAMM抗原短肽具有特異性的TCR，以及將該TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞來(lái)獲得對(duì)RHAMM抗原短肽具有特異性的T細(xì)胞，從而使他們?cè)诩?xì)胞免疫治療中發(fā)揮作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種識(shí)別RHAMM抗原短肽的T細(xì)胞受體。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種T細(xì)胞受體(TCR)，所述TCR能夠與ILSLELMKL-HLA復(fù)合物結(jié)合。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID NO:1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID NO：5具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，其特征在于，所述TCRα鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為AATNSGYALN(SEQ ID NO: 12)；和/或所述TCRβ鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為AWSVDGAEQY(SEQ ID NO:15)。

在另一優(yōu)選例中，所述TCRα鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)為：

α CDR1-DRVSQS (SEQ ID NO:10)

α CDR2-IYSNGD (SEQ ID NO:11)

α CDR3-AATNSGYALN (SEQ ID NO:12)，和/或

所述TCRβ鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)為：

β CDR1-GTSNPN (SEQ ID NO:13)

β CDR2-SVGIG (SEQ ID NO:14)

β CDR3-AWSVDGAEQY (SEQ ID NO:15)。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR為αβ異質(zhì)二聚體，其包含TCRα鏈恒定區(qū)TRAC*01和TCRβ鏈恒定區(qū)TRBC1*01或TRBC2*01。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO：3和/或所述TCR的β鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:7。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR是可溶的。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR為單鏈。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域通過(guò)肽連接序列連接而成。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR在α鏈可變區(qū)氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或α鏈J基因短肽氨基酸倒數(shù)第3位、倒數(shù)第5位或倒數(shù)第7位中具有一個(gè)或多個(gè)突變；和/或所述TCR在β鏈可變區(qū)氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或β鏈J基因短肽氨基酸倒數(shù)第2位、倒數(shù)第4位或倒數(shù)第6位中具有一個(gè)或多個(gè)突變，其中氨基酸位置編號(hào)按IMGT(國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng))中列出的位置編號(hào)。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID NO:32和/或所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID NO:34。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的氨基酸序列為SEQ ID NO:30。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR包括(a)除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈；以及(b)除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈；

并且(a)和(b)各自包含功能性可變結(jié)構(gòu)域,或包含功能性可變結(jié)構(gòu)域和所述TCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分。

在另一優(yōu)選例中，半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域之間形成人工二硫鍵。

在另一優(yōu)選例中，在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列的一組或多組位點(diǎn)：

TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57；

TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；

TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；

TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；

TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；

TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；

TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；和

TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:26和/或所述 TCR的β鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:28。

在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結(jié)合有偶聯(lián)物。

在另一優(yōu)選例中，與所述T細(xì)胞受體結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測(cè)標(biāo)記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質(zhì)的組合。優(yōu)選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種多價(jià)TCR復(fù)合物，其包含至少兩個(gè)TCR分子，并且其中的至少一個(gè)TCR分子為本發(fā)明第一方面所述的TCR。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互補(bǔ)序列。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含編碼TCRα鏈可變域的核苷酸序列SEQID NO：2或SEQ ID NO:33。

在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子包含編碼TCRβ鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO:35。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含編碼TCRα鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：4和/或包含編碼TCRβ鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：8。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第三方面所述的核酸分子；優(yōu)選地，所述的載體為病毒載體；更優(yōu)選地，所述的載體為慢病毒載體。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明第四方面所述的載體或基因組中整合有外源的本發(fā)明第三方面所述的核酸分子。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明第三方面所述的核酸分子或本發(fā)明第四方面所述的載體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞或干細(xì)胞。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明第一方面所述的TCR、本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞。

本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的T細(xì)胞受體、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞的用途，用于制備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。

本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對(duì)象施用適量的本發(fā)明第一方面所述的T細(xì)胞受體、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞、或本發(fā)明第七方面所述的藥物組合物；

優(yōu)選地，所述的疾病為急性髓細(xì)胞系白血病、慢性髓細(xì)胞系白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、胃癌、膀胱移行細(xì)胞癌、前列腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為T(mén)CRα鏈可變域氨基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈氨基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCRα鏈氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCRα鏈核苷酸序列。

圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為T(mén)CRβ鏈可變域氨基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈氨基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCRβ鏈氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCRβ鏈核苷酸序列。

圖3為單克隆細(xì)胞的CD8⁺及四聚體-PE雙陽(yáng)性染色結(jié)果。

圖4a和圖4b分別為可溶性TCRα鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖5a和圖5b分別為可溶性TCRβ鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖6為純化后得到的可溶性TCR的膠圖。

圖7a和圖7b分別為單鏈TCR的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖8a和圖8b分別為單鏈TCRα鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖9a和圖9b分別為單鏈TCRβ鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖10a和圖10b分別為單鏈TCR連接序列(l inker)的氨基酸序列和核苷酸序列。

圖11為純化后得到的可溶性單鏈TCR的膠圖。

圖12為本發(fā)明可溶性TCR與ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物結(jié)合的BIAcore動(dòng)力學(xué)圖譜。

圖13為本發(fā)明可溶性單鏈TCR與ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物結(jié)合的BIAcore動(dòng)力學(xué)圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，找到了與RHAMM抗原短肽ILSLELMKL(165-173)(SEQ ID NO:9)能夠特異性結(jié)合的TCR，所述抗原短肽ILSLELMKL可與HLA A0201形成復(fù)合物并一起被呈遞到細(xì)胞表面。本發(fā)明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明TCR的細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)

MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，可以是Ⅰ類或Ⅱ類MHC分子。因此，其對(duì)于抗原的呈遞具有特異性，不同的個(gè)體有不同的MHC，能呈遞一種蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC細(xì)胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復(fù)合體。

T細(xì)胞受體(TCR)，是呈遞在主組織相容性復(fù)合體(MHC)上的特異性抗原肽的唯一受體。在免疫系統(tǒng)中，通過(guò)抗原特異性的TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合引發(fā)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(APC)直接的物理接觸，然后T細(xì)胞及APC兩者的其他細(xì)胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，這就引起了一系列后續(xù)的細(xì)胞信號(hào)傳遞和其他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T細(xì)胞對(duì)其靶細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。

TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質(zhì)二聚體形式存在的細(xì)胞膜表面的糖蛋白。在95％的T細(xì)胞中TCR異質(zhì)二聚體由α和β鏈組成，而5％的T細(xì)胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質(zhì)二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構(gòu)成αβ異源二聚TCR的亞單位。廣義上講，α和β各鏈包含可變區(qū)、連接 區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。各可變區(qū)包含嵌合在框架結(jié)構(gòu)(framework regions)中的3個(gè)CDR(互補(bǔ)決定區(qū))，CDR1、CDR2和CDR3。CDR區(qū)決定了TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合，其中CDR3由可變區(qū)和連接區(qū)重組而成，被稱為超變區(qū)。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個(gè)“結(jié)構(gòu)域”即可變域和恒定域，可變域由連接的可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成。TCR恒定域的序列可以在國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)(IMGT)的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，如TCR分子α鏈的恒定域序列為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β鏈還包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞質(zhì)區(qū)很短。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明的TCR”、“本發(fā)明的T細(xì)胞受體”可互換使用。

發(fā)明詳述

TCR分子

在抗原加工過(guò)程中，抗原在細(xì)胞內(nèi)被降解，然后通過(guò)MHC分子攜帶至細(xì)胞表面。T細(xì)胞受體能夠識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面的肽-MHC復(fù)合物。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種能夠特異性結(jié)合ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物的TCR分子。優(yōu)選地，所述TCR分子是分離的或純化的。該TCR的α和β鏈各具有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述TCR的α鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

α CDR1-DRVSQS (SEQ ID NO:10)

α CDR2-IYSNGD (SEQ ID NO:11)

α CDR3-AATNSGYALN (SEQ ID NO:12)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述TCR的β鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

β CDR1-GTSNPN (SEQ ID NO:13)

β CDR2-SVGIG (SEQ ID NO:14)

β CDR3-AWSVDGAEQY (SEQ ID NO:15)。

可以將上述本發(fā)明的CDR區(qū)氨基酸序列嵌入到任何適合的框架結(jié)構(gòu)中來(lái)制備嵌合TCR。只要框架結(jié)構(gòu)與本發(fā)明的TCR的CDR區(qū)兼容，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的CDR區(qū)就能夠設(shè)計(jì)或合成出具有相應(yīng)功能的TCR分子。因此，本發(fā)明TCR分子是指包含上述α和/或β鏈CDR區(qū)序列及任何適合的框架結(jié)構(gòu)的TCR分子。本發(fā)明TCRα鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID NO:1具有至少90％，優(yōu)選地95％，更優(yōu)選地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本發(fā)明TCRβ鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID NO：5具有至少90％，優(yōu)選地95％，更優(yōu)選地98％序列相同性的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子是由α與β鏈構(gòu)成的異質(zhì)二聚體。具體地，一方面所述異質(zhì)二聚TCR分子的α鏈包含可變域和恒定域，所述α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。優(yōu)選地，所述TCR分子包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更優(yōu)選地，所述TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:1。另一方面，所述異質(zhì)二聚TCR分子的β鏈包含可變域和恒定域，所述β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。優(yōu)選地，所述TCR分子包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更優(yōu)選地，所述TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:5。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子是由α鏈的部分或全部和/或β鏈的部分或全部組成的單鏈TCR分子。有關(guān)單鏈TCR分子的描述可以參考文獻(xiàn)Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根據(jù)文獻(xiàn)中所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地構(gòu)建包含本發(fā)明CDRs區(qū)的單鏈TCR分子。具體地，所述單鏈TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，優(yōu)選地按照從N端到C端的順序連接。

所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子包含α鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:1。所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO：15)。優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:5。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉或可以通過(guò)查閱相關(guān)書(shū)籍或IMGT(國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng))的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)獲得人的恒定域氨基酸序列。例如，本發(fā)明TCR分子α鏈的恒定域序列可以為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列可以為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中給出的氨基酸序列的第53位為Arg，在此表示為：TRAC*01外顯子1的Arg53，其他以此類推。優(yōu)選地，本發(fā)明TCR分子α鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，和/或β鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO:7。

天然存在的TCR是一種膜蛋白，通過(guò)其跨膜區(qū)得以穩(wěn)定。如同免疫球蛋白(抗體)作為抗原識(shí)別分子一樣，TCR也可以被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于診斷和治療，這時(shí)需要獲得可溶性的TCR分子?？扇苄缘腡CR分子不包括其跨膜區(qū)?？扇苄訲CR有很廣泛的用途，它不僅可用于研究TCR與pMHC的相互作用，也可用作檢測(cè)感染的診斷工具或作為自身免疫病的標(biāo)志物。類似地，可溶性TCR可以被用來(lái)將治療劑(如細(xì)胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)輸送到呈遞特異性抗原的細(xì)胞，另外，可溶性TCR還可與其他分子(如，抗-CD3抗體)結(jié)合來(lái)重新定向T細(xì)胞，從而使其靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞。本發(fā)明也獲得了對(duì)RHAMM抗原短肽具有特異性的可溶性TCR。

為獲得可溶性TCR，一方面，本發(fā)明TCR可以是在其α和β鏈恒定域的殘基之間引入人工二硫鍵的TCR。半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域間形成人工鏈間二硫鍵。半胱氨酸殘基可以取代在天然TCR中合適位點(diǎn)的其他氨基酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵。例如，取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基來(lái)形成二硫鍵。引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵的其他位點(diǎn)還可以是：TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；或TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱氨酸殘基取代了上述α與β鏈恒定域中任一組位點(diǎn)。可在本發(fā)明TCR恒定域的一個(gè)或多個(gè)C末端截短最多50個(gè)、或最多30個(gè)、或最多15個(gè)、或最多10個(gè)、或最多8個(gè)或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸殘基來(lái)達(dá)到缺失天然二硫鍵的目的，也可通過(guò)將形成天然二硫鍵的半胱氨酸殘基 突變?yōu)榱硪话被醽?lái)達(dá)到上述目的。

如上所述，本發(fā)明的TCR可以包含在其α和β鏈恒定域的殘基間引入的人工二硫鍵。應(yīng)注意，恒定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發(fā)明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通過(guò)存在于TCR中的天然二硫鍵連接。

為獲得可溶性TCR，另一方面，本發(fā)明TCR還包括在其疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR，這些疏水芯區(qū)域的突變優(yōu)選為能夠使本發(fā)明可溶性TCR的穩(wěn)定性提高的突變，如在公開(kāi)號(hào)為WO2014/206304的專利文獻(xiàn)中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水芯位置發(fā)生突變：(α和/或β鏈)可變區(qū)氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α鏈J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第3,5,7位,和/或β鏈J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第2,4,6位，其中氨基酸序列的位置編號(hào)按國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)(IMGT)中列出的位置編號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉上述國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)，并可根據(jù)該數(shù)據(jù)庫(kù)得到不同TCR的氨基酸殘基在IMGT中的位置編號(hào)。

本發(fā)明中疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的α與β鏈的可變域而構(gòu)成的穩(wěn)定性可溶單鏈TCR。應(yīng)注意，本發(fā)明中柔性肽鏈可以是任何適合連接TCRα與β鏈可變域的肽鏈。如在本發(fā)明實(shí)施例4中構(gòu)建的單鏈可溶性TCR，其α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:32，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO:33；β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO:34，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO:35。

本發(fā)明的TCR也可以多價(jià)復(fù)合體的形式提供。本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體包含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明TCR相結(jié)合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生四聚體，或多個(gè)本發(fā)明TCR與另一分子結(jié)合而形成的復(fù)合物。本發(fā)明的TCR復(fù)合物可用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞，也可用于產(chǎn)生具有此類應(yīng)用的其他多價(jià)TCR復(fù)合物的中間體。

本發(fā)明的TCR可以單獨(dú)使用，也可與偶聯(lián)物以共價(jià)或其他方式結(jié)合，優(yōu)選以共價(jià)方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測(cè)標(biāo)記物(為診斷目的，其中所述TCR用于檢測(cè)呈遞ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物的細(xì)胞的存在)、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。

用于診斷目的的可檢測(cè)標(biāo)記物包括但不限于：熒光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描技術(shù))造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物的酶。

可與本發(fā)明TCR結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌轉(zhuǎn)移評(píng)論(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌癥免疫學(xué)和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；3.細(xì)胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌癥免疫學(xué)和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌癥研究(Cancer Research)63，3202)；4.抗體Fc片段(Mosquera等，2005，免疫學(xué)雜志(The Journal Of Immunology)174，4381)；5.抗體scFv片段(Zhu等，1995，癌癥國(guó)際期刊(International Journal of Cancer)62,319)；6.金納米顆粒/納米棒(Lapotko等，2005，癌癥通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒顆粒(Peng等，2004，基因治療(Gene therapy)11，1234)；8.脂質(zhì)體(Mamot等，2005，癌癥研究(Cancer research)65，11631)；9.納米磁粒；10.前藥激活酶(例如，DT-心肌黃酶(DTD)或聯(lián)苯基水 解酶-樣蛋白質(zhì)(BPHL))；11.化療劑(例如，順鉑)或任何形式的納米顆粒等。

另外，本發(fā)明的TCR還可以是包含衍生自超過(guò)一種物種序列的雜合TCR。例如，有研究顯示鼠科TCR在人T細(xì)胞中比人TCR能夠更有效地表達(dá)。因此，本發(fā)明TCR可包含人可變域和鼠的恒定域。這一方法的缺陷是可能引發(fā)免疫應(yīng)答。因此，在其用于過(guò)繼性T細(xì)胞治療時(shí)應(yīng)當(dāng)有調(diào)節(jié)方案來(lái)進(jìn)行免疫抑制，以允許表達(dá)鼠科的T細(xì)胞的植入。

應(yīng)理解，本文中氨基酸名稱采用國(guó)際通用的單英文字母或三英文字母表示，氨基酸名稱的單英文字母與三英文字母的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

核酸分子

本發(fā)明的第二方面提供了編碼本發(fā)明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一個(gè)或多個(gè)CDR，α和/或β鏈的可變域，以及α鏈和/或β鏈。

編碼本發(fā)明第一方面TCR分子α鏈CDR區(qū)的核苷酸序列如下：

α CDR1-gaccgagtttcccagtcc (SEQ ID NO:16)

α CDR2-atatactccaatggtgac (SEQ ID NO:17)

α CDR3-gccgctacaaattccgggtatgcactcaac (SEQ ID NO:18)

編碼本發(fā)明第一方面TCR分子β鏈CDR區(qū)的核苷酸序列如下：

β CDR1-ggaacatcaaaccccaac (SEQ ID NO:19)

β CDR2-tccgttggtattggc (SEQ ID NO:20)

β CDR3-ctgaaagtggccgggtttaatctgctcatg (SEQ ID NO:21)

因此，編碼本發(fā)明TCRα鏈的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，和/或編碼本發(fā)明TCRβ鏈的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。

本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的，該核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含內(nèi)含子。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列不包含內(nèi)含子但能夠編碼本發(fā)明多肽，例如編碼本發(fā)明TCRα鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2和/或編碼本發(fā)明TCRβ鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6?；蛘?，編碼本發(fā)明TCRα鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:33和/或編碼本發(fā)明TCRβ鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:35。更優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:8。或者，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列為SEQ ID NO:31。

應(yīng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此，編碼本發(fā)明TCR的核酸序列可以與本發(fā)明附圖中所示的核酸序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。以本發(fā)明中的其中一個(gè)例子來(lái)說(shuō)明，“簡(jiǎn)并的變異體”是指編碼具有SEQ ID NO:1的蛋白序列，但與SEQ ID NO:2的序列有差別的核酸序列。

核苷酸序列可以是經(jīng)密碼子優(yōu)化的。不同的細(xì)胞在具體密碼子的利用上是不同的，可以根據(jù)細(xì)胞的類型，改變序列中的密碼子來(lái)增加表達(dá)量。哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及多種其他生物的密碼子選擇表是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

本發(fā)明的核酸分子全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用但不限于PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng) 域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。

載體

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體，包括表達(dá)載體，即能夠在體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。常用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。

病毒遞送系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。

優(yōu)選地，載體可以將本發(fā)明的核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，例如T細(xì)胞中，使得該細(xì)胞表達(dá)RHAMM抗原特異性的TCR。理想的情況下，該載體應(yīng)當(dāng)能夠在T細(xì)胞中持續(xù)高水平地表達(dá)。

細(xì)胞

本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明的載體或染色體中整合有本發(fā)明的核酸分子。宿主細(xì)胞選自：原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，例如大腸桿菌、酵母細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。

另外，本發(fā)明還包括表達(dá)本發(fā)明的TCR的分離的細(xì)胞，特別是T細(xì)胞。該T細(xì)胞可衍生自從受試者分離的T細(xì)胞，或者可以是從受試者中分離的混合細(xì)胞群，諸如外周血淋巴細(xì)胞(PBL)群的一部分。如，該細(xì)胞可以分離自外周血單核細(xì)胞(PBMC)，可以是CD4⁺輔助T細(xì)胞或CD8⁺細(xì)胞毒性T細(xì)胞。該細(xì)胞可在CD4⁺輔助T細(xì)胞/CD8⁺細(xì)胞毒性T細(xì)胞的混合群中。一般地，該細(xì)胞可以用抗體(如，抗-CD3或抗-CD28的抗體)活化，以便使它們能夠更容易接受轉(zhuǎn)染，例如用包含編碼本發(fā)明TCR分子的核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

備選地，本發(fā)明的細(xì)胞還可以是或衍生自干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞(HSC)。將基因轉(zhuǎn)移至HSC不會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞表面表達(dá)TCR，因?yàn)楦杉?xì)胞表面不表達(dá)CD3分子。然而，當(dāng)干細(xì)胞分化為遷移至胸腺的淋巴前體(lymphoid precursor)時(shí)，CD3分子的表達(dá)將啟動(dòng)在胸腺細(xì)胞的表面表達(dá)該引入的TCR分子。

有許多方法適合于用編碼本發(fā)明TCR的DNA或RNA進(jìn)行T細(xì)胞轉(zhuǎn)染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表達(dá)本發(fā)明TCR的T細(xì)胞可以用于過(guò)繼免疫治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉進(jìn)行過(guò)繼性治療的許多合適方法(如，Rosenberg等.，(2008)Nat Rev Cancer8(4)：299-308)。

RHAMM抗原相關(guān)疾病

本發(fā)明還涉及在受試者中治療和/或預(yù)防與RHAMM相關(guān)疾病的方法，其包括過(guò)繼性轉(zhuǎn)移RHAMM特異性T細(xì)胞至該受試者的步驟。該RHAMM特異性T細(xì)胞可識(shí)別ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物。

本發(fā)明的RHAMM特異性的T細(xì)胞可用于治療任何呈遞RHAMM抗原短肽ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物的RHAMM相關(guān)疾病。包括但不限于急性髓細(xì)胞系白血病、慢性髓細(xì)胞系白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、胃癌、膀胱移行細(xì)胞癌、前列腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。

治療方法

可以通過(guò)分離患有與RHAMM抗原相關(guān)疾病的病人或志愿者的T細(xì)胞，并將本發(fā)明的TCR導(dǎo)入上述T細(xì)胞中，隨后將這些基因工程修飾的細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)來(lái)進(jìn)行治療。因此，本發(fā)明提供了一種治療RHAMM相關(guān)疾病的方法，包括將分離的表達(dá)本發(fā)明TCR的T細(xì)胞，優(yōu)選地，該T細(xì)胞來(lái)源于病人本身，輸入到病人體內(nèi)。一般地，包括(1)分離病人的T細(xì)胞，(2)用本發(fā)明核酸分子或能夠編碼本發(fā)明TCR分子的核酸分子體外轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，(3)將基因工程修 飾的T細(xì)胞輸入到病人體內(nèi)。分離、轉(zhuǎn)染及回輸?shù)募?xì)胞的數(shù)量可以由醫(yī)師決定。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明的TCR能夠與RHAMM抗原短肽復(fù)合物ILSLELMKL-HLA A0201特異性結(jié)合，同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)了本發(fā)明TCR的細(xì)胞能夠被特異性激活并且對(duì)靶細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用。

下面的具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。

實(shí)施例1克隆RHAMM抗原短肽特異性T細(xì)胞

利用合成短肽ILSLELMKL(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)刺激來(lái)自于基因型為HLA-A0201的健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。將ILSLELMKL短肽與帶有生物素標(biāo)記的HLA-A*0201復(fù)性,制備pHLA單倍體。這些單倍體與用PE標(biāo)記的鏈霉親和素(BD公司)組合成PE標(biāo)記的四聚體，分選該四聚體及抗-CD8-APC雙陽(yáng)性細(xì)胞。擴(kuò)增分選的細(xì)胞，并按上述方法進(jìn)行二次分選，隨后用有限稀釋法進(jìn)行單克隆。單克隆細(xì)胞用四聚體染色，篩選到的雙陽(yáng)性克隆如圖3所示。

實(shí)施例2獲取RHAMM抗原短肽特異性T細(xì)胞克隆的TCR基因與載體的構(gòu)建

用Quick-RNA^TMMiniPrep(ZYMO research)抽提實(shí)施例1中篩選到的抗原短肽ILSLELMKL特異性、HLA-A0201限制性的T細(xì)胞克隆的總RNA。cDNA的合成采用clontech的SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，采用的引物是設(shè)計(jì)在人類TCR基因的C端保守區(qū)。將序列克隆至T載體(TAKARA)上進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)注意，該序列為互補(bǔ)序列，不包含內(nèi)含子。經(jīng)測(cè)序，該雙陽(yáng)性克隆表達(dá)的TCR的α鏈和β鏈序列結(jié)構(gòu)分別如圖1和圖2所示，圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為T(mén)CRα鏈可變域氨基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈氨基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCRα鏈氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCRα鏈核苷酸序列；圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為T(mén)CRβ鏈可變域氨基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈氨基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCRβ鏈氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCRβ鏈核苷酸序列。

經(jīng)鑒定，α鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

α CDR1-DRVSQS (SEQ ID NO:10)

α CDR2-IYSNGD (SEQ ID NO:11)

α CDR3-AATNSGYALN (SEQ ID NO:12)

β鏈包含具有以下氨基酸序列的CDR：

β CDR1-GTSNPN (SEQ ID NO:13)

β CDR2-SVGIG (SEQ ID NO:14)

β CDR3-AWSVDGAEQY (SEQ ID NO:15)

通過(guò)重疊(overlap)PCR分別將TCRα鏈和β鏈的全長(zhǎng)基因克隆至慢病毒表達(dá)載體pLenti(addgene)。具體為：用overlap PCR將TCRα鏈和TCRβ鏈的 全長(zhǎng)基因進(jìn)行連接得到TCRα-2A-TCRβ片段。將慢病毒表達(dá)載體及TCRα-2A-TCRβ酶切連接得到pLenti-RHAMMTRA-2A-TRB-IRES-NGFR質(zhì)粒。作為對(duì)照用,同時(shí)也構(gòu)建表達(dá)eGFP的慢病毒載體pLenti-eGFP。之后再用293T/17包裝假病毒。

實(shí)施例3 RHAMM抗原短肽特異性可溶TCR的表達(dá)、重折疊和純化

為獲得可溶的TCR分子，本發(fā)明的TCR分子的α和β鏈可以分別只包含其可變域及部分恒定域，并且α和β鏈的恒定域中分別引入了一個(gè)半胱氨酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵，引入半胱氨酸殘基的位置分別為T(mén)RAC*01外顯子1的Thr48和TRBC2*01外顯子1的Ser57；其α鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖4a和圖4b所示，其β鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖5a和圖5b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗字母表示。通過(guò)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將上述TCRα和β鏈的目的基因序列經(jīng)合成后分別插入到表達(dá)載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點(diǎn)分別是NcoI和NotI。插入片段經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤。

將TCRα和β鏈的表達(dá)載體分別通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3),細(xì)菌用LB培養(yǎng)液生長(zhǎng)，于OD₆₀₀＝0.6時(shí)用終濃度0.5mM IPTG誘導(dǎo)，TCR的α和β鏈表達(dá)后形成的包涵體通過(guò)BugBuster Mix(Novagene)進(jìn)行提取，并且經(jīng)BugBuster溶液反復(fù)多次洗滌，包涵體最后溶解于6M鹽酸胍,10mM二硫蘇糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸(EDTA),20mM Tris(pH 8.1)中。

溶解后的TCRα和β鏈以1：1的質(zhì)量比快速混合于5M尿素,0.4M精氨酸,20mM Tris(pH 8.1),3.7mM cystamine,6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中，終濃度為60mg/mL?；旌虾髮⑷芤褐糜?0倍體積的去離子水中透析(4℃)，12小時(shí)后將去離子水換成緩沖液(20mM Tris,pH 8.0)繼續(xù)于4℃透析12小時(shí)。透析完成后的溶液經(jīng)0.45μM的濾膜過(guò)濾后，通過(guò)陰離子交換柱(HiTrap Q HP,5ml,GE Healthcare)純化。洗脫峰含有復(fù)性成功的α和β二聚體的TCR通過(guò)SDS-PAGE膠確認(rèn)。TCR隨后通過(guò)凝膠過(guò)濾層析(HiPrep 16/60，Sephacryl S-100HR，GE Healthcare)進(jìn)一步純化。純化后的TCR純度經(jīng)過(guò)SDS-PAGE測(cè)定大于90％，濃度由BCA法確定。本發(fā)明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE膠圖如圖6所示。

實(shí)施例4 RHAMM抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的產(chǎn)生

根據(jù)專利文獻(xiàn)WO2014/206304中所述，利用定點(diǎn)突變的方法將實(shí)施例2中TCRα與β鏈的可變域構(gòu)建成了一個(gè)以柔性短肽(linker)連接的穩(wěn)定的可溶性單鏈TCR分子。該單鏈TCR分子的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖7a和圖7b所示。其α鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖8a和圖8b所示；其β鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖9a和圖9b所示；其linker序列的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖10a和圖10b所示。

將目的基因經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)過(guò)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切的pET28a載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR篩選，對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3),用于表達(dá)。

實(shí)施例5 RHAMM抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的表達(dá)、復(fù)性和純化

將實(shí)施例4中制備的含有重組質(zhì)粒pET28a-模板鏈的BL21(DE 3)菌落全部接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。5000rpm離心15min收獲細(xì)胞沉淀 物，用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解細(xì)胞沉淀物，6000rpm離心15min回收包涵體，再用Bugbuster(Merck)進(jìn)行洗滌以除去細(xì)胞碎片和膜組分，6000rpm離心15min,收集包涵體。將包涵體溶解在緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素)中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量后進(jìn)行分裝，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向5mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2.5mL緩沖液(6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA)，再加入DTT至終濃度為10mM,37℃處理30min。用注射器向125mL復(fù)性緩沖液(100mM Tris-HCl pH 8.1,0.4M L-精氨酸,5M尿素,2mM EDTA,6.5mMβ-mercapthoethylamine,1.87mM Cystamine)中滴加上述處理后的單鏈TCR，4℃攪拌10min，然后將復(fù)性液裝入截留量為4kDa的纖維素膜透析袋,透析袋置于1L預(yù)冷的水中，4℃緩慢攪拌過(guò)夜。17小時(shí)后，將透析液換成1L預(yù)冷的緩沖液(20mM Tris-HCl pH 8.0)，4℃繼續(xù)透析8h，然后將透析液換成相同的新鮮緩沖液繼續(xù)透析過(guò)夜。17小時(shí)后，樣品經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，真空脫氣后通過(guò)陰離子交換柱(HiTrap Q HP,GE Healthcare)，用20mM Tris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl線性梯度洗脫液純化蛋白，收集的洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮后進(jìn)一步用凝膠過(guò)濾柱(Superdex 7510/300,GE Healthcare)進(jìn)行純化，目標(biāo)組分也進(jìn)行SDS-PAGE分析。

用于BIAcore分析的洗脫組分進(jìn)一步采用凝膠過(guò)濾法測(cè)試其純度。條件為：色譜柱Agi lent Bio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流動(dòng)相為150mM磷酸鹽緩沖液，流速0.5mL/min，柱溫25℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。

本發(fā)明獲得的可溶性單鏈TCR的SDS-PAGE膠圖如圖11所示。

實(shí)施例6結(jié)合表征

BIAcore分析

本實(shí)施例證明了可溶性的本發(fā)明TCR分子能夠與ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物特異性結(jié)合。

使用BIAcore T200實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)檢測(cè)實(shí)施例3和實(shí)施例5中得到的TCR分子與ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物的結(jié)合活性。將抗鏈霉親和素的抗體(GenScript)加入偶聯(lián)緩沖液(10mM醋酸鈉緩沖液，pH 4.77)，然后將抗體流過(guò)預(yù)先用EDC和NHS活化過(guò)的CM5芯片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應(yīng)的活化表面，完成偶聯(lián)過(guò)程，偶聯(lián)水平約為15，000RU。

使低濃度的鏈霉親和素流過(guò)已包被抗體的芯片表面，然后將ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物流過(guò)檢測(cè)通道，另一通道作為參比通道，再將0.05mM的生物素以10μL/min的流速流過(guò)芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點(diǎn)。

上述ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物的制備過(guò)程如下：

a.純化

收集100ml誘導(dǎo)表達(dá)重鏈或輕鏈的E.coli菌液，于4℃8000g離心10min后用10ml PBS洗滌菌體一次，之后用5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)劇烈震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4℃，6000g離心15min，棄去上清，收集包涵體。

將上述包涵體重懸于5ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min；加30ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃6000g離心15min；棄去上清，加30ml稀釋10倍的BugBuster重懸包涵體，混勻，4℃6000g離心15min，重復(fù)兩次，加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重懸包涵體，混勻，4℃6000g 離心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測(cè)包涵體純度，BCA試劑盒測(cè)濃度。

b.復(fù)性

將合成的短肽ILSLELMKL(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mM DTT來(lái)溶解，復(fù)性前加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA進(jìn)一步變性。將ILSLELMKL肽以25mg/L(終濃度)加入復(fù)性緩沖液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM還原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF，冷卻至4℃)，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8h/次)，復(fù)性在4℃進(jìn)行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測(cè)能否復(fù)性成功。

c.復(fù)性后純化

用10體積的20mM Tris pH 8.0作透析來(lái)更換復(fù)性緩沖液，至少更換緩沖液兩次來(lái)充分降低溶液的離子強(qiáng)度。透析后用0.45μm醋酸纖維素濾膜過(guò)濾蛋白質(zhì)溶液，然后加載到HiTrap Q HP(GE通用電氣公司)陰離子交換柱上(5ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測(cè)純度。

d.生物素化

用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時(shí)將緩沖液置換為20mM Tris pH 8.0，然后加入生物素化試劑0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室溫孵育混合物過(guò)夜，SDS-PAGE檢測(cè)生物素化是否完全。

e.純化生物素化后的復(fù)合物

用Millipore超濾管將生物素化標(biāo)記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過(guò)濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過(guò)濾過(guò)的PBS預(yù)平衡HiPrep^TM 16/60S200HR柱(GE通用電氣公司)，加載1ml濃縮過(guò)的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時(shí)作為單峰洗脫出現(xiàn)。合并含有蛋白質(zhì)的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法(Thermo)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。

利用BIAcore Evaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到本發(fā)明可溶性的TCR分子以及本發(fā)明構(gòu)建的可溶性單鏈TCR分子與ILSLELMKL-HLA A0201復(fù)合物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)圖譜分別如圖12和圖13所示。同時(shí)，還利用上述方法檢測(cè)了本發(fā)明可溶性的TCR分子與其他抗原短肽包括GILGFVFTL-HLA A0201復(fù)合物以及SLLMWITQC-HLA A0201復(fù)合物的結(jié)合活性，結(jié)果顯示本發(fā)明TCR分子與其他無(wú)關(guān)抗原均無(wú)結(jié)合。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。