專利名稱：新型清蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變型血清清蛋白，與衍生突變體的天然清蛋白相比它們展示改變的金屬結(jié)合和/或其它特征，以及這些突變型清蛋白在醫(yī)學領(lǐng)域或培養(yǎng)中細胞生長的用途。
背景技術(shù)：
人清蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)。通常，它以大約750μM的濃度存在。它是585個氨基酸的單個多肽鏈，主要是螺旋狀三結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。由假定的“加帽”位點至添加poly(A)的第一個位點，人血清清蛋白基因包含16,961個核苷酸。
清蛋白是血液中的主要運輸?shù)鞍祝夷軌蚩赡娼Y(jié)合廣泛的小分子，諸如脂肪酸、激素、和藥物。清蛋白還參與許多金屬離子的運輸和儲存。目前，人清蛋白在臨床上用于治療嚴重燒傷、休克、或失血的患者。其它哺乳動物清蛋白與人清蛋白高度同源。
已知鋅和銅分別以3.4×107和1.5×1016M-1的結(jié)合常數(shù)結(jié)合清蛋白(Masuoka等人，1993，J.Biol.Chem.，268，21533-21537)。Cu2+最強烈的結(jié)合清蛋白的N末端氨基酸Asp1-Ala2-His3，它提供了4N配基的正方平面位點，盡管知道分子上存在其它結(jié)合位點。
血漿中大約75％的Zn2+(大約14μM)結(jié)合清蛋白。這占到血清中Zn2+可交換級分的高達98％(Giroux等人，1976，J.Bioinorg.Chem.，5，211-218；Foote和Delves，1984，Analyst，109，709-711)。先前已經(jīng)顯示了清蛋白調(diào)控內(nèi)皮細胞的鋅攝取，盡管已經(jīng)在體外用清蛋白—鋅復(fù)合物證明了由受體介導(dǎo)的囊泡共運輸穿過內(nèi)皮(Bobilya等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，202，159-166；Tibaduiza等人，1996，J.Cell.Physiol.，167，539-547)。先前尚未明確定位清蛋白上的Zn2+結(jié)合位點，盡管認為清蛋白是循環(huán)中的主要鋅運輸?shù)鞍住?br> 鋅是身體的必需元素，而且在超過300種酶中存在。它具有許多重要作用，包括維生素A的運輸、傷口的愈合、男性的生精，而且受到炭疽致死因素和細菌腸毒素的征募。因此，血液中鋅水平的調(diào)控在生理學上非常重要。已經(jīng)提出由血液補充Zn2+可用于提高某些結(jié)合金屬有機藥物對蛋白質(zhì)和酶的親和力，如絲氨酸蛋白酶諸如胰蛋白酶的苯并咪唑抑制劑(Katz和Luong，1999，J.Mol.Biol.，292，669-684；Jane等人，2000，Biochemistry，39，4792-4800；Katz等人，2001，Chem.& Biol.，8，1107-1121；Liang等人，2002，J.Am.Chem.Soc.，)。
Reed和Burrington(1989，J.Biol.Chem.，264，17，9867-9872頁)關(guān)注清蛋白與肝細胞的結(jié)合以及這是否牽涉清蛋白的細胞表面受體。作者提出，他們的工作提供了證據(jù)表明清蛋白對肝細胞表面的可逆吸附而且伴隨的構(gòu)象變化增強了清蛋白與肝細胞表面之間的相互作用。然而，尚未提出可能發(fā)生哪種構(gòu)象變化或者如何控制它。
Bos等人(1989，J.Biol.Chem.，264，2，953-959頁)關(guān)注經(jīng)由組氨酸殘基的Ca2+離子結(jié)合對人血清清蛋白中性—堿性轉(zhuǎn)變的分子機制。論文揭示了中性—堿性轉(zhuǎn)變可能在藥物的藥代動力學中發(fā)揮作用，但是并未提出生成突變型血清清蛋白或者提出這些突變體可能具有的任何作用。
發(fā)明概述本發(fā)明基于如下最初發(fā)現(xiàn)位于結(jié)構(gòu)域I與II之間界面的一簇四個氨基酸(His67、Asn99、His247、和Asp249)參與鋅、銅、和/或鎘的結(jié)合位點(見

圖1和2)。所有這四個殘基在至今所有哺乳動物清蛋白序列中是高度保守的(見表1)。本文提及的編號指前清蛋白原(preproalbumin)序列在翻譯后受到切割之后在人血清清蛋白氨基酸序列特定位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸(見表1)。這一位點的鑒定為治療性清蛋白的設(shè)計提供了基本原理，它們用于控制血液中的可利用鋅和/或其它金屬離子水平并將它們投遞至靶組織。本發(fā)明還基于如下觀察結(jié)果突變型清蛋白影響細胞粘附。
由此，在第一個方面中，提供了分離的突變型血清清蛋白，突變使得與衍生突變體的天然清蛋白相比，突變體展示改變的金屬結(jié)合親和力和/或其它生理學特征。
設(shè)想本發(fā)明涵蓋下文定義的導(dǎo)致金屬結(jié)合和/或其它生理學特征改變的對天然清蛋白序列的任何突變。對于熟練從業(yè)人員而言，相對簡單的任務(wù)是生成特定突變體并根據(jù)本文描述的實驗測試法來測試這種突變體是否展示改變的金屬結(jié)合和/或其它生理學特征。
可以突變的優(yōu)選殘基經(jīng)鑒定是表1中所標示的殘基X1-X11和/或可以根據(jù)對特定血清清蛋白測定的晶體結(jié)構(gòu)確定的可以與任何這些殘基形成氫鍵的殘基。
在第二個方面中，提供了本質(zhì)上包含如下氨基酸序列的分離的突變型人血清清蛋白DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQX5LQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLX1TLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERX2X8CFX6QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRX9PYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVX10TECCX3X7X4LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSX11CIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL其中X1不同于H；X2不同于N；X3不同于H；X4不同于D；X5不同于Y；X6不同于L；X7不同于G；X8不同于E；X9不同于H；X10不同于H；和/或X11不同于H，使得與天然人血清清蛋白相比，所述突變體展示改變的金屬結(jié)合親和力和/或其它生理學特征。
可以理解，全文使用常規(guī)的單字母氨基酸命名法?？梢詫ζ渌烊话被徇M行氨基酸替代，尤其是由DNA直接編碼的20種氨基酸，或者例如可以是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的合成的或非常見的氨基酸。上文所示序列基于在Genbank數(shù)據(jù)庫中找到的人血清清蛋白序列。人血清清蛋白包含上文所示序列，其中X1是H、X2是N、X3是H、X4是D、X5是Y、X6是L、X7是G、X8是E、X9是H、X10是H、且X11是H。由此，依照本發(fā)明的突變型血清清蛋白與特定種類“清蛋白”天然氨基酸的X1-X11位置相比通常在所述位置包含至少一處突變。然而，應(yīng)當意識到物種的個體之間可以存在天然變異，使得序列中可能存在微小變異。可以理解，序列中不同于在X1-X7位置中鑒定的變異的這些微小變異并不違背本發(fā)明。應(yīng)當意識到序列中的這些變異可以表示為替代、倒位、缺失或易位。然而，這些變體清蛋白序列應(yīng)當展示與圖1所示任何序列的高度相似性。通常，變體清蛋白序列應(yīng)當展示與經(jīng)鑒定序列的至少90％、優(yōu)選至少95％、或甚至99％同一性(X位置除外)。
可以使用商業(yè)性算法來測定氨基酸序列之間的同源性(即同一性)。程序BLAST、缺口BLAST、BLASTN、PSI-BLAST、和BLAST2序列(由國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)提供)在本領(lǐng)域廣泛用于這一目的，而且能夠比對兩種氨基酸序列的同源區(qū)域。這些程序可以采用默認參數(shù)來測定結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)與待模擬的其它靶蛋白之間的氨基酸序列同源性程度。
可以理解，突變型血清清蛋白在不含或者本質(zhì)上或部分不含在生物體蛋白質(zhì)組中可能與其有關(guān)的其它蛋白質(zhì)的意義上是分離的，因而不包括細胞或生物體蛋白質(zhì)組中的任何天然形式的清蛋白。
上述序列基于序列中的前導(dǎo)序列(即MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR)得到切除后的人型血清清蛋白。本發(fā)明還延伸至包含這些前導(dǎo)序列的突變型序列。
盡管上文涉及突變型人血清清蛋白，然而可以理解本發(fā)明不只限于突變型人血清清蛋白。所有物種之間的血清清蛋白展示高度的保守性，而且由其它物種的清蛋白鑒定上述序列中由X表示的位置處的氨基酸并改變所述氨基酸以改變金屬結(jié)合和/或其它生理學特征完全屬于熟練從業(yè)人員的專業(yè)技能之內(nèi)。表1實際上顯示了哺乳動物血清清蛋白多肽序列的比對，其中突出了可以依照本發(fā)明突變的殘基?？梢岳斫猓辽僖惶幩鰵埢鶓?yīng)當不同于鑒定的天然殘基以生成突變型血清清蛋白，它與天然物種血清清蛋白相比可能展示改變的金屬結(jié)合和/或其它生理學特征。
知道許多血清清蛋白序列，而且易于由Genbank數(shù)據(jù)庫獲得，例如國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformationwww.ncbi.nlm.nih.gov)。例如，可以在編號P02768下找到人的序列。在www.albumin.org還可以找到其它編號。
可以理解，本發(fā)明的突變體可以在一般總體折疊方面與特定物種的天然血清清蛋白本質(zhì)上相似。例如，可以進行圓二色性研究以了解突變型血清清蛋白的圓二色性條帶的信號和量度是否與天然血清清蛋白相似。如果它們相似，那么這指示突變型血清清蛋白展示與天然血清清蛋白相似的二級結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的突變體應(yīng)當展示與衍生突變體的天然清蛋白相比改變的金屬結(jié)合親和力或其它改變的特征，如培養(yǎng)中的細胞粘附和/或生長改變。改變的金屬結(jié)合親和力理解為指金屬結(jié)合親和力(如Kd)的降低或升高和/或金屬結(jié)合/解離速率的升高或降低。優(yōu)選的是，升高或降低2、4或6倍，諸如根據(jù)在生理條件(即大約pH7.3)以及適當濃度和大約20-37℃溫度下的測定，在關(guān)注Kd值時在tog Kd值方面升高或降低10或100倍。對于這些突變型清蛋白可能展示改變的結(jié)合親和力的金屬是鋅、銅、鎳、和鈷。優(yōu)選的是，突變型清蛋白對鋅展示改變的結(jié)合親和力。一般而言，改變的金屬結(jié)合親和力將是對于金屬離子而言，諸如Zn2+、Cu2+、等。假定將認為參與金屬結(jié)合的殘基變成不具有合適金屬結(jié)合側(cè)鏈的殘基的突變導(dǎo)致金屬結(jié)合親和力降低。預(yù)計將不參與金屬/金屬離子結(jié)合但鄰近被認為參與金屬結(jié)合的殘基的殘基變成幫助/促進結(jié)合的殘基的逆向突變提高金屬結(jié)合親和力。
例如，假設(shè)下列突變導(dǎo)致金屬結(jié)合親和力降低X1＝＞A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX2＝＞A、F、G、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、YX3＝＞A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX4＝＞A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y而且導(dǎo)入金屬結(jié)合配基有可能導(dǎo)致金屬結(jié)合親和力升高或調(diào)整的側(cè)鏈突變包括X5＝＞C、D、E、H(這在豬清蛋白中已是His)X6＝＞C、D、E、HX7＝＞C、D、E、HX2＝＞C、D、E、HX4＝＞C、E、HX1＝＞C、D、EX3＝＞C、D、E發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在建議位點處的金屬結(jié)合受到脂肪酸結(jié)合的影響(A.J.Stewart，C.A.Blindauer，S.Berezenko，D.Sleep，P.J.Sadler，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，3701-3706)。不含脂肪酸的清蛋白與結(jié)合了5個肉豆蔻酸分子的清蛋白(pdb lbj5)的X射線結(jié)構(gòu)的比較揭示了，為了在所謂的結(jié)合位點2容納脂肪酸陰離子，連接結(jié)構(gòu)域I和II的長螺旋發(fā)生彎曲，而且兩個未結(jié)合配基(unliganded)rHA的半位點移動超過10以形成連通空穴(Curry，S.、Mandelkow，H.、Brick，P.、和Franks，N.，1998，Nat.Struct.Biol.，5，827-835)。在建議的Zn位點，這一脂肪酸結(jié)合導(dǎo)致殘基H247和D249遠離其它兩個殘基H67和N99移動4-6(見圖3e的A和B)。D249還改變了它的側(cè)鏈構(gòu)象以維持與H67的N′的氫鍵并與N99形成額外氫鍵。在未結(jié)合配基的結(jié)構(gòu)中與N99形成氫鍵的H247在結(jié)合脂肪酸的結(jié)構(gòu)中與E100形成氫鍵。所建議的人清蛋白中由脂肪酸結(jié)合導(dǎo)致的鋅位點開關(guān)是有機養(yǎng)分與必需金屬離子之間的變構(gòu)相互作用的有趣實例。由于預(yù)計H247-E100氫鍵穩(wěn)定“開關(guān)”形式，因此預(yù)測E100的下列突變可能影響交互式金屬/脂肪酸結(jié)合X8＝＞A，C，F(xiàn)，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y另外，最近的研究已揭示了具有突變H67A、N99D、和N99H的清蛋白在用于細胞培養(yǎng)基時展示與野生型顯著不同的特性。細胞粘附在H67A和N99H這兩種突變體中都受到削弱。已知肝對例如來自清蛋白的脂肪酸的攝取涉及清蛋白與細胞表面的非特異結(jié)合，以及誘導(dǎo)的清蛋白分子構(gòu)象變化(R.G.Reed，、C.M.Burrington，，1989，J.Biol.Chem.，264，9867-9872)。突變殘基都參與通過氫鍵來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域I-結(jié)構(gòu)域II之間的接觸。關(guān)于結(jié)構(gòu)域I/II介面中的單一突變嚴重影響突變型清蛋白對細胞的作用的發(fā)現(xiàn)說明了，涉及參與結(jié)構(gòu)域間氫鍵的結(jié)構(gòu)域I/II組氨酸殘基的下列突變也對細胞粘附和/或生長具有相似影響X9＝＞A、D、E、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX10＝＞A、D、E、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX11＝＞A、D、E、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y應(yīng)當理解，貫穿本說明書使用標準的單字母氨基酸命名法。
通過113Cd-NMR研究顯示了清蛋白上的Zn2+結(jié)合位點的本質(zhì)。幾種哺乳動物清蛋白具有兩個Cd2+強烈結(jié)合位點，它們具有N/O配位的化學位移特性(Sadler和Viles，1996，Inorg.Chem.，35，4490-4496)。對于人的清蛋白，24和114ppm的113Cd位移(相對于Cd(ClO4))分別指示位點含有單個咪唑氮和2-3個咪唑氮。Zn2+、Cu2+、和Ni2+離子可以在人清蛋白中從這些位點的后面取代Cd2+。本發(fā)明人基于清蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PBD 1AO6)的分子模擬提出，多個金屬結(jié)合位點可能參與His67、Asn99、His247、和Asp249簇。本發(fā)明人通過His67變成丙氨酸的定點誘變及隨后使用111Cd NMR的同位素富集鎘的金屬競爭研究確定了這個位點的位置。這通?？梢员硎龀蒆67A，即第67位的組氨酸突變成丙氨酸。說明書的其它部分使用這種表述。
設(shè)想其它殘基的突變影響鋅結(jié)合，如第30位酪氨酸(X5)和第248位甘氨酸(X7)。第30位酪氨酸本身不結(jié)合金屬，但是它與結(jié)合金屬的第99位殘基形成氫鍵。由此，第30位殘基的突變可能影響金屬結(jié)合位點。Gly248的主鏈羰基與第99位殘基形成氫鍵，因此這個殘基的突變可能影響金屬結(jié)合位點。
本發(fā)明的突變型清蛋白可以是從頭合成的，但是優(yōu)選通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的重組手段來生成它們。例如，通過在相關(guān)基因序列上進行定點誘變及隨后的蛋白質(zhì)表達，可以由天然清蛋白衍生突變型清蛋白。這些技術(shù)是眾所周知的，而且描述于例如Sambrook等人，1989，《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約州。
因此，本發(fā)明還延伸至編碼依照本發(fā)明的突變型血清清蛋白的核酸序列。
為了在宿主生物體中重組生成突變型清蛋白，可以將編碼突變型清蛋白蛋白質(zhì)的核苷酸序列插入表達盒以形成設(shè)計用于選擇宿主的DNA構(gòu)建物，并導(dǎo)入將重組生成它的宿主。特定調(diào)控序列諸如適用于選擇宿主的啟動子、信號序列、5′和3′非翻譯序列、增強子、和終止子的選擇屬于本領(lǐng)域普通工作人員的技術(shù)水平之內(nèi)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將由此產(chǎn)生的包含在正確讀碼框中相連的各個元件的分子導(dǎo)入選擇的細胞，諸如磷酸鈣沉淀、電穿孔、biolistic導(dǎo)入、病毒導(dǎo)入、等。對于諸如大腸桿菌(參閱如Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.，189，113；Brosius，1989，DNA，8759)、酵母(參閱如Schneider和Guarente，1991，Meth.Enzymol.，194，373)、以及昆蟲細胞(參閱如Luckow和Summers，1988，Bio/Technol.，6，47)和哺乳動物細胞(組織培養(yǎng)或基因療法)等宿主生物體而言，通過轉(zhuǎn)染(Schenoborn，E.T.、Goiffon，V.，2000，Methods Mol.Biol.，130，135-145；Schenborn，E.T.、Oler，J.，2000，Methods Mol.Biol.，130，155-164)、電穿孔(Heiser，W.C.，2000，Methods Mol.Biol.，130，117-134)、或重組病毒(Walther，W.、Stein，U.，2000年8月，Drugs，60(2)，249-271)重組生成蛋白質(zhì)的合適表達盒和載體以及方法是眾所周知的。
用于在微生物特別是酵母中表達清蛋白并由培養(yǎng)液進行純化的技術(shù)公開于US5637504、US6034221、和WO00/44772，其全部結(jié)合于此作為參考。
因此，本發(fā)明還提供了包含與編碼本文定義的突變型清蛋白的本文定義的核苷酸序列可操作連接的啟動子的表達盒?？梢砸勒毡景l(fā)明突變的編碼血清清蛋白的核苷酸序列也易于由Genbank數(shù)據(jù)庫獲得。
另外，本發(fā)明提供了包含本文定義的突變型清蛋白和藥用載體的藥物組合物。
藥用載體對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的，包括但不限于0.1M、優(yōu)選0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水。另外，這些藥用載體可以是水性或非水性溶液、混懸液、和乳劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油、和可注射有機酯諸如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳劑或混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、Ringer’s右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸化Ringer’s或固定油。靜脈內(nèi)載體包括流體和養(yǎng)分補充物、電解質(zhì)補充物諸如基于Ringer’s右旋糖的補充物、諸如此類。還可以存在防腐劑和其它添加劑，諸如例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體、諸如此類。
可以以藥物制劑的形式來提供本發(fā)明的突變型清蛋白，其中將突變型清蛋白與藥用載體(如粘合劑、調(diào)節(jié)劑(corrective)、矯味劑(corrigent)、崩解劑、乳化劑、賦形劑)、稀釋劑、或增溶劑混合而通過常規(guī)方式生成藥物組合物，配制成例如片劑、膠囊、顆粒、粉劑、糖漿、混懸液、溶液、注射液、輸液、存儲劑、栓劑，并通過例如口服或腸胃外施用。
在將片劑用于口服施用時，常用載體包括蔗糖、乳糖、甘露糖醇、麥芽糖醇、葡聚糖、玉米淀粉、典型潤滑劑諸如硬脂酸鎂、防腐劑諸如對羥基苯甲酸酯、山梨糖、抗氧化劑諸如抗壞血酸、α-生育酚、半胱氨酸、崩解劑或粘合劑。在作為膠囊口服施用時，有效稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉?？诜褂玫囊后w包括糖漿、混懸液、溶液、和乳劑，它們可以含有本領(lǐng)域使用的典型惰性稀釋劑，諸如水。另外，可以含有甜味劑或香味劑。
在腸胃外施用諸如皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、或輸注的情況中，活性成分溶液的pH可以適當調(diào)整、緩沖、或滅菌。可用載體或溶劑的實例包括蒸餾水、Ringer氏水、和等滲鹽水。對于靜脈內(nèi)使用，調(diào)節(jié)溶質(zhì)的總濃度使得溶液等滲。
可以通過混合本發(fā)明的化合物與合適的非刺激性賦形劑來制備栓劑，諸如在常溫下是固態(tài)的但在腸內(nèi)溫度下變成液態(tài)且在直腸中融化而釋放活性成分的賦形劑，諸如可可油和聚乙二醇。
可以根據(jù)接受治療的患者的年齡、體重、施用時間、施用方法、藥物組合、病癥水平、和其它因素來確定劑量。雖然日劑量可以根據(jù)患者的病癥和體重、活性成分的種類、和施用路徑而變化，但是在口服使用的情況中，日劑量可以是大約0.1-100mg/人/日，優(yōu)選0.5-30mg/人/日。在腸胃外使用的情況中，對于皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、和直腸內(nèi)施用，日劑量可能希望是0.1-50mg/人/日，優(yōu)選0.1-30mg/人/日。
本發(fā)明的突變型清蛋白可以在例如人類或動物醫(yī)學中用于治療營養(yǎng)缺乏病和感染、金屬超負荷、和/或金屬濃度的控制可能與另一種金屬離子或有機分子諸如藥物或天然分子的生理學功能有關(guān)的病癥。
還有可能使用本發(fā)明的突變型清蛋白來調(diào)控血液中存在的金屬諸如鋅的數(shù)量以促進對展示鋅吸收問題的受試者的治療。此外，展示特別強烈的金屬結(jié)合親和力的突變型清蛋白可用于生物傳感器以檢測環(huán)境中的金屬。
另外，關(guān)于與清蛋白結(jié)合的鋅可以是可以結(jié)合氯離子的Zn2+的形式的觀察結(jié)果還導(dǎo)致結(jié)合了鋅的清蛋白可以用作氯傳感器而且可以通過血液氯濃度(這還可能控制催化活性)來調(diào)控Zn通路的可能性。
本發(fā)明人還觀察到依照本發(fā)明的突變型清蛋白對培養(yǎng)的細胞生長有影響。突變體可以影響與基質(zhì)結(jié)合的細胞與在培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的那些細胞的分布。還觀察到有些突變體如Asn99Asp可以導(dǎo)致細胞生長全面增加。因此，本發(fā)明還涉及依照本發(fā)明的突變型血清清蛋白用于改變培養(yǎng)的細胞生長特征的方法或用途。生長特征的改變可以包括粘附、百分比成活力、和/或細胞生長的變化，如滴度、吸附于基質(zhì)上的細胞與散布于培養(yǎng)液中的細胞之間的細胞分布、或吸附的或散布于培養(yǎng)液中的死亡或存活細胞之間的差異。
清蛋白常常包含在細胞培養(yǎng)基中，尤其是用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，特別是無血清培養(yǎng)基。添加了本發(fā)明的經(jīng)修飾清蛋白的培養(yǎng)基可以含有或不含銅、鋅、和/或鎘。合適的實例包括Eagle’s培養(yǎng)基、Dulbecco’s改性的Eagle’s培養(yǎng)基(Dulbecco’s基本培養(yǎng)基)、Ham’sF10和F12培養(yǎng)基、Iscove’s改性的Dulbecco’s培養(yǎng)基、和RPMI培養(yǎng)基。在這些培養(yǎng)基通常含有清蛋白的情況中，本發(fā)明的經(jīng)修飾清蛋白可以部分或完全替代(人或牛的)天然清蛋白，或者添加的數(shù)量可以超過清蛋白的正常量。在這些培養(yǎng)基通常不含清蛋白的情況中，可以添加本發(fā)明的經(jīng)修飾清蛋白。
使用上述培養(yǎng)基的細胞可以是任何動物細胞，特別是鳥(諸如雞)或哺乳動物細胞，諸如人、其它靈長類(諸如猴)、或嚙齒類(諸如倉鼠、大鼠、或小鼠)細胞。細胞類型可以衍生自任何組織，例如腎、卵巢、或肝，而且可以是內(nèi)皮、上皮、表皮、神經(jīng)、淋巴、干細胞、諸如此類。它還可以是人工細胞，諸如雜交瘤。合適細胞的實例包括致瘤性或非致瘤性人肝細胞、B淋巴細胞、雜交瘤、倉鼠幼鼠腎細胞(baby hamster kidney cell)、中國倉鼠卵巢細胞、和人胚胎腎細胞?？梢栽诒砻嫔吓囵B(yǎng)細胞，諸如容器壁、多孔基質(zhì)、或珠，或者可以自由的懸浮在培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)細胞可用于生成由特定細胞天然生成的任何物質(zhì)，或者它們可以通過改造而表達其它產(chǎn)物，諸如治療性蛋白質(zhì)。實例包括單克隆抗體及其類似物(諸如單鏈可變區(qū)片段和人源化IgGκ輕鏈)、血液凝結(jié)因子(諸如因子VII、VIII、XI、和XIII)、抗凝血酶III、細胞因子(諸如白介素例如白介素-2和干擾素例如干擾素-α或干擾素-γ)、生長因子(諸如胰島素樣生長因子)、凝血調(diào)節(jié)蛋白、谷氨酰胺合成酶、尿激酶原、和纖溶酶原。
本發(fā)明的經(jīng)修飾清蛋白可以包含在為了原核生物和酵母以及衍生自脊椎動物和非脊椎動物的培養(yǎng)細胞和組織而配制的組織培養(yǎng)基中，從而對細胞產(chǎn)生期望作用，諸如增加的粘附、生長、和/或表達和分泌。
本發(fā)明經(jīng)修飾清蛋白在所選擇培養(yǎng)基中的合適濃度的測定屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)之內(nèi)。在一個實施方案中，以大約50μM-大約30mM的濃度將經(jīng)修飾清蛋白導(dǎo)入細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在另一個實施方案中，以大約250μM-大約20mM的濃度將肽導(dǎo)入細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。此外，可以向培養(yǎng)基質(zhì)表面添加多種經(jīng)修飾清蛋白以產(chǎn)生協(xié)同效果(若它們對細胞具有相同效果)或產(chǎn)生多重效果(若每一種清蛋白對相同細胞具有不同效果)。
可以將增加細胞粘附的本發(fā)明經(jīng)修飾清蛋白溶解于載體諸如水而產(chǎn)生溶液，用于包被組織培養(yǎng)基質(zhì)或用于生長錨定型細胞的其它表面。例如，可以在反向氣流罩中將含有一種或多種本發(fā)明所述經(jīng)修飾清蛋白的溶液分配到表面上并干燥，使得所述經(jīng)修飾清蛋白以干膜的形式存在于表面上。
本發(fā)明所述經(jīng)修飾清蛋白附著于表面的模式包括非共價相互作用、非特異吸附、和共價連接。在本發(fā)明的一個實施方案中，清蛋白可以直接吸附在表面上。在另一個實施方案中，肽可以吸附在早就用但不限于至少一種下列物質(zhì)預(yù)先包被的表面上匙孔戚血藍蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、聚賴氨酸、具有細胞表面受體識別序列的肽、免疫球蛋白、多糖、或生長因子。在另一個實施方案中，將清蛋白和上文所述蛋白質(zhì)之一或是游離的或是作為綴合物同時應(yīng)用于表面。
增強生長的本發(fā)明經(jīng)修飾清蛋白適于促進多種錨定依賴性細胞在表面上粘附和/或生長，包括二維或三維表面。例如，表面可以是容許細胞附著于3D陣列的生物反應(yīng)器的表面。通過使細胞附著于經(jīng)本發(fā)明肽修飾的3D表面，可以設(shè)計比現(xiàn)有生物反應(yīng)器更加有效的生物反應(yīng)器。
通過具體參考可用于實踐本發(fā)明的表面類型，合適表面將包括但不限于陶瓷、金屬、或聚合物表面。最理想的是，將本發(fā)明用于處理聚合物表面和陶瓷如玻璃表面。適用于本發(fā)明的表面包括但不限于塑料盤、塑料瓶、塑料顯微滴定板、塑料管、縫合線、膜、薄膜、生物反應(yīng)器、和微粒。聚合物表面可以包括但不限于聚羥基乙基甲基丙烯酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯、氟化乙烯、聚二甲基硅氧烷、和其它硅橡膠。玻璃表面可以包括甘油丙基硅烷粘合玻璃。
還提供了包含依照本發(fā)明的突變型血清清蛋白的細胞培養(yǎng)基。
發(fā)明詳述現(xiàn)在將通過實施例并參照附圖進一步描述本發(fā)明。
圖1顯示了PDB 1AO6中報告的人血清清蛋白三維結(jié)構(gòu)的模型，其中標示了本文鑒定的金屬結(jié)合位點。
圖2更加詳細的顯示了位于提出的鋅結(jié)合位點之中和周圍的氨基酸側(cè)鏈。
圖3a顯示了野生型清蛋白中鋅位點的初始模型，與apo-rHA(1AO6)進行比較。
圖3b顯示了野生型人血清清蛋白中鋅位點的重算的、改進的模型，與apo-rHA(1AO6)進行比較。鋅位點的力場能量是59.1kcal/mol。
圖3c顯示了Asn99His突變體中金屬位點的模型，與野生型Zn-rHA(綠色)進行比較。鋅位點的力場能量是83.2kcal/mol。野生型蛋白的rmsd是0.54；野生型Zn-清蛋白的rmsd是0.56。
圖3d顯示了Asn99Asp突變體中金屬位點的模型。
圖3e顯示了不含鋅的野生型和突變型清蛋白模型中潛在鋅位點的結(jié)構(gòu)域間氫鍵。A野生型；B加載了脂肪酸的野生型；CAsn99His突變體模型；DAsn99Asp突變體模型。
圖4顯示了野生型(實線)和H67A(虛線)清蛋白的圓二色性譜。
圖5顯示了天然和H67A rHA添加2摩爾當量111CdCl2的111CdNMR。
圖6顯示了在存在(a)鋅和(b)銅時rHA添加2摩爾當量111CdCl2的111Cd NMR。
圖7顯示了(a)天然rHA和(b)H67A rHA以0.2摩爾當量梯級(step)(由下至上)添加0.2-2摩爾當量CuCl2的紫外線—可見光吸收譜。
圖8顯示了未結(jié)合鋅的Asn99Asp突變體中的潛在鋅結(jié)合位點。右側(cè)蓋層上以深紅色顯示的是野生型結(jié)構(gòu)。突變位點的力場能量(101.4kcal/mol)并未顯著高于野生型(55.6kcal/mol)和Asp99His位點(75.6kcal/mol)。
圖9顯示了重組清蛋白(野生型和Asn99His突變體)添加2摩爾當量111Cd2+的1D111Cd NMR譜(條件1mM蛋白質(zhì)、50mMTris-HCl、50mM NaCl，295K)。
圖10顯示了重組清蛋白(野生型和Asn99Asp突變體)添加2摩爾當量111Cd2+的1D111Cd NMR譜(條件1mM蛋白質(zhì)、50mMTris-HCl、50mM NaCl，295K，如果沒有另外說明的話)。
圖11顯示了1mM含銅(II)的rHA的滴定(pH7.4，0.2M磷酸鉀)。在每個情況中以0.2摩爾當量份額添加CuCl2。顯示了差異譜，對清蛋白的吸收進行了校正。
圖12顯示了多種數(shù)量的Cu2+對野生型和突變型清蛋白紫外線—可見光差異譜的影響的直接比較。
圖13顯示了野生型rHA的去褶FT-ICR-MS譜(20μM，溶于8mMNH4Ac、25％甲醇、1％醋酸)。注意細線形狀(半高寬度大約25Da)，它能夠檢測小分子加合物。
圖14a顯示了分辨率提高的重組清蛋白突變體的1D1H NMR譜的觀察。圖14b、c、d、和e分別顯示了野生型、His67Ala、Asn99His、和Asn99Asp rHA的部分2D TOCSY NMR譜，顯示了His Hδ2/Hε1交叉峰。所有樣品都是以1mM濃度溶于50mM Tris-HCl、50mM NaCl，而且所有實驗都是在310K進行的。pH值在7.28(N99H)和7.40(H67A)之間變化，這說明了個別質(zhì)子的化學位移之間的輕微差異。可觀察到的Hε1質(zhì)子標有數(shù)字，f指作為化學位移標準物添加的甲酸鹽。
圖15顯示了添加了1摩爾當量Zn2+(pH*＝7.37)的部分1D和2DTOCSY譜，顯示了組氨酸Hδ2/Hε1交叉峰。
圖16a顯示了分辨率提高的野生型rHA的部分1D NMR譜(以1mM濃度溶于50mM Tris-HCl、50mM NaCl，pH*＝7.26)，含有不同量的辛酸鹽；圖16b顯示了增加辛酸鹽數(shù)量對組氨酸Hε1質(zhì)子的化學位移的影響。
圖17a和b顯示了含辛酸鹽的Cd2-rHA的滴定。條件1mM rHA，2mM當量111CdCl2，50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10％D2O，pH7.1，298K，10mm BBO探針。獲取一份光譜通常需要4小時。17b中的圖顯示了4個當量的時間過程[由于獲取每份光譜需要4小時，因此采用每份光譜的中點(即開始實驗后兩小時)作為平均時間點]。
圖18a顯示了使用天然和突變型血清清蛋白時在層中的細胞計數(shù)；圖18b顯示了使用天然和突變型血清清蛋白時在層中死亡細胞的百分率；圖18c顯示了使用天然和突變型血清清蛋白時培養(yǎng)液中的細胞計數(shù)；和圖18d顯示了使用天然和突變型血清清蛋白時培養(yǎng)液中死亡細胞的百分率。
圖19顯示了經(jīng)鑒定參與經(jīng)由氫鍵的結(jié)構(gòu)域I-結(jié)構(gòu)域II接觸的突變。
材料和方法a)分子模擬貫穿全文使用已公開的未結(jié)合配基的(apo)清蛋白2.5晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號1AO6)作為模型的起點。在Sybyl(TRIPOS公司，6.8版)中構(gòu)建模型，并進行能量最小化以優(yōu)化幾何學。注意到在先前的運行中程序忽略了二硫鍵的存在，這導(dǎo)致氫原子的添加和二硫鍵的斷裂。這個問題輕微影響整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是并不影響鋅位點本身，現(xiàn)在它已經(jīng)在最后的模擬運行得到了糾正。在最小化中，在執(zhí)行鋅的特定力場參數(shù)后，使用TRIPOS力場。與組氨酸(2.00)、天冬氨酸或谷氨酸(2.00)、和水(2.06)結(jié)合的Zn2+的鍵長來自Harding，M.M.，2001，Acta Cyst.，D57，401-411，http//tanna.bch.ed.ac.uk。這些數(shù)值還與來自通過金屬蛋白數(shù)據(jù)庫pdb分析的結(jié)果一致(Castagnetto，J.M.、Hennessy，S.W.、Roberts，V.A.、Getzoff，E.D.、Tainer，J.A.、Pique，M.E.，2002，Nucleic Acids Res.，30，379-382)。力常數(shù)來自TRIPOS力場。鋅周圍的鍵角不受約束。在第一步中，Zn2+周圍的幾何學通過只考慮Zn2+離子、四個蛋白質(zhì)配基殘基、和水分子的100步(step)能量最小化得到優(yōu)化。然后對第65-69位、第97-101位、和第247-251位殘基、Zn2+離子、和水分子應(yīng)用另外50步能量最小化以消除在第一步中通過原子運動導(dǎo)入的不利幾何學和范德華接觸。最后，出于相同原因?qū)φ麄€蛋白質(zhì)再應(yīng)用30步。圖中的蓋層是在Sybyl中用“適合單體(Fit monomer)”程序生成的，它還提供rmsd值。對于不含鋅的突變型清蛋白的模擬，在電腦上將N99側(cè)鏈突變成期望側(cè)鏈(Asp或His)，并且通過對整個分子應(yīng)用30步能量最小化來解除可能的不利接觸。對于含鋅突變體模型，使用用于野生型模型的相同方法，采用幾種可能的具有不同金屬—配基連接的起始結(jié)構(gòu)。
電腦程序和數(shù)據(jù)庫使用ClustalW(European Bioinformatics Institute，www.ebi.ac.uk/clustalw/)與由En trez Protein(National Centre forBiotechnology Informatio n，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)獲得的序列進行序列比對。由Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org/pdb/)獲得人清蛋白的三維坐標(PDB 1AO6)。
定點誘變使用由寡核苷酸介導(dǎo)的誘變來制備編碼H67A突變型清蛋白的cDNA。誘變寡核苷酸5’-GCTGAAATTGTGACAAATCACTTGCTACCCTTTTTGGAGACAAATTATGC-3’和5’-GCATAATTTGTCTCCAAAAAGGGTAGCAAGTGATTTGTCACAATTTTCAGC-3’由Delta生物技術(shù)有限公司(諾丁漢)提供。使用QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene)進行誘變。通過雙脫氧鏈終止測序法，通過跨越突變位點的核苷酸序列分析來鑒定含有期望突變的克隆。將突變的cDNA插入PUC9酵母表達載體，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞中。
表達和純化將釀酒酵母細胞培養(yǎng)物于30℃培養(yǎng)4天后以3,000rpm離心30分鐘。然后取出上清液并過濾。使用陽離子交換層析由上清液濃縮重組蛋白。用4個柱床體積的30mM醋酸鈉緩沖液pH5.5平衡SP-sepharose Fast Flow陽離子交換柱(柱床體積225ml)。將過濾后的上清液分成兩份，每份大約3L。向每份中添加7.5ml 2M辛酸鈉，并用醋酸將pH調(diào)至4.5。在施加到柱子上之前用去離子水將電導(dǎo)率調(diào)至5.5mS cm-1。加樣后，用8個柱床體積的50mM醋酸鹽、8mM NaOHpH4.0和4個柱床體積的含2M NaCl的27mM醋酸鈉緩沖液pH4.0清洗柱子。用10個柱床體積的平衡緩沖液進行第三輪清洗。最后，用2個柱床體積的含5mM辛酸的85mM醋酸鈉pH5.5進行洗脫。
然后通過陰離子交換層析在DEAE Fast Flow柱(柱床體積167ml)上進一步純化SP-sepharose Fast Flow洗脫液。用15個柱床體積的30mM醋酸鹽、27mM NaOH pH5.5平衡柱子。在施加到柱子上之前用去離子水將SP-sepharose洗脫液的電導(dǎo)率調(diào)至3.0mS cm-1。加樣后，用5個柱床體積的15.7mM K2B4O7·4H2O pH9.2清洗柱子。用0.75個柱床體積的85mM醋酸鹽、110mM K2B4O7·4H2O pH9.4進行洗脫。
然后通過親和層析在Delta Blue Agarose(Prometic Biosciences)柱(柱床體積423ml)上進一步純化DEAE洗脫液。在施加DEAE洗脫液之前用2個柱床體積的250mM醋酸銨緩沖液pH8.9平衡柱子。加樣后，用5個柱床體積的平衡緩沖液清洗柱子。用2個柱床體積的含2M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液pH6.9進行洗脫。
然后使用與蠕動泵連接的10kD MWCO Pall Filtron LUCentramate濾器濃縮Delta Blue洗脫液。測定得知回收了4.25g H67A清蛋白。將來自純化產(chǎn)物的濃縮液樣品稀釋至5mg/ml，并取10μl施加到SDS-PAGE凝膠上。使用Laemmli，1970，Nature，227，680-685的標準方法制備凝膠并進行電泳。將凝膠進行考馬斯藍染色和銀染兩種染色，揭示了無其它蛋白質(zhì)以1％水平存在(因此蛋白質(zhì)是大約99％純度)。
圓二色性將天然重組人清蛋白(rHA)(Delta Biotechnology有限公司，諾丁漢)和H67A突變型清蛋白在200mM磷酸鉀pH7.4中稀釋至大約1.5mg/ml。記錄這兩種蛋白質(zhì)的光譜。所用儀器是JASCO J-600旋光分光計。使用SELCON流程計算二級結(jié)構(gòu)評估。
使用10mm BBO(直接觀察)探頭于295K常規(guī)獲得1D111Cd-{1H}NMR譜(106.04MHz，Bruker DMX500)，以0.1M Cd(ClO4)2(0ppm)作為外部標準。使用GARP通過復(fù)合脈沖去耦實現(xiàn)質(zhì)子去耦。通常將蛋白質(zhì)樣品溶于含2摩爾當量111CdCl2的50mM Tris pH7.1、100mM NaCl、10％氧化氘。111CdCl2是通過將111CdO(95.11％同位素純度，Oak Ridge National Laboratory，田納西州，美國)溶于適當量的1M HCl而生成的。
使用1.5mM rHA或相同濃度的His67Ala突變型蛋白質(zhì)進行111Cd-NMR研究。加入多種當量的ZnCl2或CuCl2進行金屬滴定實驗，每次添加后檢查pH并進行調(diào)整(如果需要的話)。在30kHz(280ppm)的掃描寬度上獲得4k復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)點的光譜，其中111Cd脈沖寬度17.5μs(90°)，36k瞬變(transients)，采集時間0.10s，且再循環(huán)延遲0.30s。傅里葉變換前，將數(shù)據(jù)補零成16k數(shù)據(jù)點并通過指數(shù)乘法進行變跡(apodize)(120Hz譜線增寬)。
使用1mM突變型清蛋白溶液進行對Asn99Asp和Asn99His突變型rHA的111Cd-NMR研究。大多數(shù)光譜是在32kHz(300ppm)的掃描寬度上獲得的8k復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)點，其中111Cd脈沖寬度17.5μs(90°)，36k瞬變，采集時間0.13s，且再循環(huán)延遲0.24s。傅里葉變換前，將數(shù)據(jù)補零成32k數(shù)據(jù)點并通過指數(shù)乘法進行變跡(150Hz譜線增寬)。
d)1H NMR光譜學為了消除NH共振，將凍干樣品以大約50mg/ml溶于D2O(99.9％同位素純度，Aldrich)，于295K靜置48小時，并再次凍干，然后溶于含50mM NaCl、50mM Tris的D2O而產(chǎn)生1mM溶液。以1mM的濃度添加甲酸鈉作為內(nèi)部校準標準(8.48ppm，相對于3-三甲代甲硅烷基丙酸鈉；TSP)。將pH*(pH計讀數(shù))調(diào)至7.3-7.4，對應(yīng)于pH6.9-7.0(Glasoe，P.K.和Long，F(xiàn).A.，1960，J.Phys.Chem.，64，188)。于310K在Bruker Avance 600分光儀上常規(guī)進行1D和2D1H NMR實驗，在599.82MHz運行，使用Z-梯度三聯(lián)共振(1H、13C、15N)探頭。通常，使用針對殘余水抑制的簡單預(yù)飽和脈沖序列獲得lD光譜的512瞬變(90°激發(fā)脈沖，9kHz掃描寬度，8k時域數(shù)據(jù)點)。
將數(shù)據(jù)補零成32k，用平方正弦鐘形曲線(sine bell)與高斯函數(shù)的優(yōu)化聯(lián)合進行變跡以提高分辨率，并進行傅里葉變換。對于2DTOCSY實驗(90°激發(fā)脈沖，8.4kHz掃描寬度，65ms混合時間，1.3s松弛延遲)，使用針對殘余水抑制的靈敏度增強的雙重脈沖場梯度自旋回聲序列，以4k復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)點獲得每個2×512t1增量的48或56瞬變(使用與時間成正比的相位增量(TPPI)獲得超復(fù)數(shù))。將數(shù)據(jù)使用平方正弦鐘形曲線函數(shù)進行變跡，并在2k×2k數(shù)據(jù)點上進行實(real)傅里葉變換。
還在0.1M磷酸鉀(KHP)緩沖液中記錄了野生型的一些光譜。注意到組氨酸Hε1質(zhì)子的化學位移還取決于緩沖液的同一性。通常，與在相同pH*(在D2O中采集的pD)Tris緩沖液中采集的光譜相比，在KHP緩沖液中采集的信號向高磁場移位。光譜的質(zhì)量是相似的，而且發(fā)現(xiàn)1mM是所進行的大多數(shù)實驗的最佳蛋白質(zhì)濃度。在這個濃度以上，溶液變得太粘，似乎不利于信號的調(diào)整(shimming)和譜線寬度，而且使得溶液難以操作(如pH的調(diào)整、與反應(yīng)物的混合)。
e)UV-Vis光譜學銅滴定清蛋白樣品是溶于200mM磷酸鉀pH7.4的1mM和2mM溶液。由700mM CuCl2儲液，連續(xù)添加0.2μl等分量(相對于0.2摩爾當量)。將樣品徹底混勻，并在5分鐘后使用Shimadzu UV250IPC分光光度計記錄400-800nm之間的UV-Vis光譜。溶液首先變成粉紅色，隨著加液又變得渾濁，這說明了在光譜中觀察到的吸收的全面增加。渾濁(形成(Cu3(PO4)2)的開始在各種清蛋白突變體中明顯不同。
f)用于評估細胞毒性的細胞培養(yǎng)實驗在發(fā)明人的研究過程中，開發(fā)了用于調(diào)查鋅和清蛋白細胞毒性的兩種方法。最初實驗中所使用的方法依賴用錐蟲藍測定細胞成活力，而第二種方法在用碘化丙錠將死亡細胞染色后采用FACS(熒光激活細胞分揀，流式細胞術(shù)應(yīng)用)。第二種方法具有幾項優(yōu)點，即在時間和材料消耗方面更加有效。
i)標準培養(yǎng)條件在補充10％FCS(新生牛血清)、青霉素、和鏈霉素以及1x濃度NEAA(非必需氨基酸)的DMEM(Dulbecco’s改性的Eagles培養(yǎng)基)中培養(yǎng)WRL-68細胞。在80cm2組織培養(yǎng)級燒瓶中在37℃、5％CO2溫箱中培養(yǎng)細胞。每2-3天或者根據(jù)需要(通過監(jiān)測培養(yǎng)基中的重碳酸鹽顏色指示劑，黃色指示必需進行補充)給細胞補充新鮮培養(yǎng)基。一旦在燒瓶中培養(yǎng)的細胞匯合，就使用胰蛋白酶加EDTA和PBS進行收獲。將細胞混懸液在MSE Mistral 1000離心機中以1000rpm離心10分鐘直至形成沉淀。除去上清液并將細胞沉淀重懸于培養(yǎng)基，根據(jù)需要使用。
ii)使用錐蟲藍的細胞成活力計數(shù)使用錐蟲藍來評估群體中存活細胞的比例。細胞株的反應(yīng)性基于發(fā)色團帶負電荷而且不與細胞反應(yīng)除非膜受損的事實。存活細胞不攝取染料，然而死亡(非存活)細胞卻攝取染料。
通常取0.5ml細胞(15.2×105細胞/ml，需要用Kerry Bunyan檢查這一數(shù)值)接種小型細胞培養(yǎng)瓶。然后將它們靜置過夜以平衡。除去培養(yǎng)基并用PBS清洗細胞。
然后單獨用重組人清蛋白(rHA)(40mg/ml)、用H67A人清蛋白(H67A)(40mg/ml)、rHA和h67A及0.1、0.5、和1.0摩爾當量Zn、單獨用Zn以相同濃度處理細胞。所有處理在得到補充的DMEM中進行。還通過只添加培養(yǎng)基來建立對照。在處理后將燒瓶靜置兩個晚上。與清蛋白和鋅一起保溫后，取出培養(yǎng)基并保存用于分析。然后將細胞層用PBS清洗兩次，并將清洗液添加到收集的培養(yǎng)基中。然后使用胰蛋白酶加EDTA由燒瓶中取出細胞層。用PBS再次清洗燒瓶，并將清洗液添加到細胞混懸液中。然后將培養(yǎng)基和細胞混懸液的所有樣品離心。
一旦離心，吸出上清液并將沉淀重懸于PBS。為了對收集的培養(yǎng)基和細胞層評估存活細胞濃度和總細胞數(shù)目，將200μl混勻樣品、300μl PBS、和500μl 0.4％錐蟲藍(Sigma)溶液混合并于室溫靜置2-3分鐘。將混懸液轉(zhuǎn)移到血細胞計數(shù)器上，使用Olympus反相對比光學顯微鏡進行觀察，并對4×4方形格柵中的死亡(藍色)和存活(無色)細胞進行計數(shù)。合計對10個方形格柵進行計數(shù)。依照下列方程，使用這些細胞計數(shù)來評估細胞總數(shù)和存活細胞數(shù)目(成活力)細胞/ml＝平均細胞計數(shù)×5(稀釋倍數(shù))×1×104(血細胞計數(shù)器隔室因數(shù))存活細胞/ml＝存活細胞數(shù)目×5(稀釋倍數(shù))×1×104(血細胞計數(shù)器隔室因數(shù))細胞成活力(％)＝(存活細胞總數(shù)/存活和死亡細胞總數(shù))×100然后以圖解形式展示這些數(shù)值以顯示在培養(yǎng)液和細胞層中發(fā)現(xiàn)的細胞總數(shù)以及這些細胞的成活力。
iii)經(jīng)由流式細胞術(shù)和熒光激活細胞分揀(FACS)的分析將細胞涂布到12孔板上，0.0995×106細胞/ml，0.5ml/孔。然后將板靜置過夜以平衡。然后吸出培養(yǎng)基并用PBS清洗細胞層。隨后，在缺乏或存在野生型清蛋白或者His67Ala、Asn99Asp、或Asn99His突變型清蛋白時，用添加0、60、300、或600μMZnCl2的培養(yǎng)基處理細胞。將只有培養(yǎng)基的細胞用作對照。保溫48小時后，使用流式細胞術(shù)分析板。為此，除去培養(yǎng)基并將細胞層用PBS清洗兩次。將這些清洗液添加到先前除去的培養(yǎng)基中。然后用胰蛋白酶加EDTA取出細胞層并用PBS清洗兩次，將這些清洗液添加到細胞混懸液中。所有樣品在進行細胞分揀前添加10％FCS。向樣品中添加碘化丙錠(1μg/ml)并立即進行計數(shù)以檢測細胞死亡。然后使用BeckmanCoulter EPICS細胞計數(shù)儀運行樣品。記錄60秒后的事件總數(shù)以測定細胞數(shù)目，用于在各組之間進行比較。
實施例通過分子模擬對鋅結(jié)合位點的鑒定NMR研究揭示了，與清蛋白結(jié)合后的113Cd化學位移說明金屬在蛋白質(zhì)上的配位有兩個位點(Sadler和Viles，1996，Inorg.Chem.，35，4490-4496)。在Zn2+取代Cd2+的位點，化學位移處于涉及2-3個咪唑氮的金屬在蛋白質(zhì)上的配位范圍內(nèi)(z等人，1998，Biochem.Cell Biol.，76，223-234)。
由Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB 1AO6)獲得人清蛋白的晶體結(jié)構(gòu)坐標，并使用WebLab Viewer Pro v4.0(Accelrys)進行檢驗。標示了組氨酸殘基(因為它們是蛋白質(zhì)中用于金屬配位的主要氮貢獻殘基)，并測量了各個殘基之間的距離。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)僅在分子的一個位點存在彼此相距5以內(nèi)的2個組氨酸側(cè)鏈。這使得我們相信His67和His247參與鋅結(jié)合位點。該位點周圍其它殘基的鑒定揭示了Asn99和Asp249也足夠接近以提供金屬結(jié)合的氧配基。Asn99還能夠由其側(cè)鏈的酰胺基團潛在提供氮配基。
蛋白質(zhì)中與金屬配位的氨基酸側(cè)鏈的數(shù)據(jù)庫(Harding，200l，Acta Cyst.，D57，401-411；http∥tanna.bch.ed.ac.uk)揭示了其它三種蛋白質(zhì)含有與2個His、1個Asp、和1個Asn殘基結(jié)合的鋅(人鈣神經(jīng)素、大腸桿菌5’-內(nèi)切核酸酶、和菜豆紫色磷酸酶)，進一步說明這是鋅結(jié)合的合適位點。參閱圖1和2，它們根據(jù)本發(fā)明人的測定而顯示了金屬結(jié)合的預(yù)測區(qū)域。
鋅進入提出的結(jié)合位點的模擬使用Weblabviewer(Accelrys)根據(jù)發(fā)表的晶體結(jié)構(gòu)(pdb編號1AO6)構(gòu)建了含鋅清蛋白的初步模型。以含Cl-的5坐標模擬鋅位點作為第五個配基，因為在我們的1D111Cd NMR研究中我們注意到共振的位移取決于Cl-濃度，這使得生理條件下的氯結(jié)合高度可能。另一種可能性是以水作為第五個配基。
將模型輸入Sybyl v6.8(TRIPOS公司)，在設(shè)定鋅的一些特定參數(shù)后，使用TRIPOS力場進行能量最小化以優(yōu)化幾何學。與組氨酸(2.00)和天冬氨酸(2.00)(以及水，2.06)結(jié)合的Zn2+的鍵長取自Harding，2001，Acta Cyst.，D57，401-411，而且根據(jù)由Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得鈣神經(jīng)素、5′-內(nèi)切核酸酶、和菜豆紫色酸性磷酸酶的晶體結(jié)構(gòu)(pdb編號4KPB、1AUI、和1TCO)來估計Asn-Zn2+相互作用的鍵長(2.15)。由劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Allen和Kennard，1993，Chem.Design Autom.News，8，31-37)提取Zn-Cl鍵長的數(shù)值。力常數(shù)取自TRIPOS力場。鋅周圍的鍵角根本不受束縛，因為對于具有坐標數(shù)5的Zn2+而言，預(yù)計沒有規(guī)則或一致的角度。
在第一步中，只通過鋅原子、四個蛋白質(zhì)配基殘基、和氯離子的200步能量最小化來優(yōu)化鋅周圍的幾何學。然后又對整個蛋白質(zhì)采用10步能量最小化以消除通過第一步中的原子運動而導(dǎo)入的不良幾何學和范德華接觸。原始蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與修正模型之間的均方根偏差(rmsd)數(shù)值(這是結(jié)構(gòu)差異的指示)對于所有原子是0.13，而僅對于配基殘基原子是1.21。
圖3顯示了不含氫的原始結(jié)構(gòu)(黑色)與本發(fā)明人模型(灰色)之間的蓋層(overlay)，展示了只需要相對較小的運動就能提供鋅結(jié)合位點。該位點展示了軸向位置具有兩個組氨酸的變形三角雙錐幾何學。氯配基指向蛋白質(zhì)的外面。具有不同起始結(jié)構(gòu)的其它模擬嘗試提供了具有相似幾何學的位點，但是氯離子位于Zn的對面。
盡管運用了角束縛，然而模擬只含有蛋白質(zhì)配基的四面體位點的嘗試產(chǎn)生了與在5-坐標模型中發(fā)現(xiàn)的變形三角雙錐類似的幾何學，它在Cl-曾經(jīng)所在位置具有空的赤道結(jié)合位點。
支持模擬理論的實驗證據(jù)本發(fā)明人在釀酒酵母細胞中表達了突變型H67A，并且通過離子交換層析和親和層析將其純化至高于95％。圓二色性揭示了H67A突變體與野生型蛋白質(zhì)之間沒有較大的二級結(jié)構(gòu)變化(圖4)。對溶于含2摩爾當量111CdCl2的50mM Tris pH7.1的1.5mM重組人清蛋白(rHA)的111Cd-NMR研究確認了2個位點(A和B)處的結(jié)合，峰分別在27和131ppm(相對于Cd(ClO4)而言)。在相同條件下，H67A突變體產(chǎn)生29ppm的單峰(圖5)。在存在2摩爾當量111Cd2+時向rHA中添加0.5和1摩爾當量ZnCl2導(dǎo)致131ppm峰的強度降低(圖6a)。在存在2摩爾當量111CdCl2時向rHA中添加2和3摩爾當量CuCl2還似乎影響位點B處的Cd2+結(jié)合并導(dǎo)致37ppm處新111Cd峰的形成(圖6b)。添加1摩爾當量CuCl2不影響Cd2+結(jié)合。這最可能是因為Cu2+對N末端的高親和力，Cd2+取代只在該位點的結(jié)合飽和后發(fā)生。這些結(jié)果顯示了位點B具有針對Zn2+比Cd2+的更大親和力，而且Cu2+也競爭性結(jié)合該位點，還說明His67參與金屬配位。
還要注意圖4顯示了天然清蛋白和H67A突變體的圓二色性條帶的相似信號和量度。這指示H67ArHA具有與天然清蛋白相似的二級結(jié)構(gòu)。
已知肽和蛋白質(zhì)中與Cu2+配位的氮配基的數(shù)目影響這些復(fù)合物的d-d吸收譜帶的波長。向rHA和H67A突變體溶于200mM磷酸鉀pH7.4的2mM溶液中添加等分量CuCl2。第一次添加CuCl2后出現(xiàn)525nm處的吸收譜帶，指示蛋白質(zhì)N末端加載Cu2+，這是Cu2+的4N配位的特征。然而，向每種蛋白質(zhì)中進一步添加1摩爾當量CuCl2后觀察到吸收的顯著差異。天然蛋白質(zhì)在625nm處形成第二條吸收譜帶，而突變體在750nm處形成寬得多的條帶(圖7)。這些條帶分別說明了Cu2+對2N和1N的配位(Pettit等人，1990，J.Chem.Soc.Dalton.Trans.，3565-3570)。這說明His67殘基對于Cu2+結(jié)合以及Zn2+是重要的，盡管并未提供關(guān)于Cu2+離子仍然結(jié)合該位點(不涉及His67)或蛋白質(zhì)上其它位置的信息。
突變型清蛋白中金屬位點的進一步分子模擬通過優(yōu)化能量最小化方案和通過采用不同的起始結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人已經(jīng)能夠改進模擬方法學；因此，發(fā)明人再次模擬了野生型清蛋白上提出的Zn(II)位點，從而能夠進行多種模型之間富有意義的比較。下文概括了結(jié)果。
a)野生型清蛋白新模型的全面幾何學并非與先前的模型顯著不同(圖3a)，只是除了我們現(xiàn)在使用水作為第五種配基的事實以外(所有原子的rmsd0.05；Zn位點的rmsd0.25)。僅對于鋅位點的原子而言，初始結(jié)構(gòu)(pdb登錄1A06；圖3)與模型之間的rmsd是0.67，本質(zhì)上說明清蛋白中的鋅位點是預(yù)先組織的。
b)還對Asn99His突變體和Asn99Asp突變體進行模擬研究圖3c、3d、和3e顯示了突變體模型。顯示不含金屬形式的提出位點的圖19證明了突變對結(jié)構(gòu)域間氫鍵的作用，這可能在構(gòu)象動力學和變構(gòu)相互作用中發(fā)揮作用。
總之，模擬研究支持可以生成與野生型清蛋白相比能夠以不同親和力結(jié)合金屬如鋅和/或展示其它生理學特征的突變型血清清蛋白的想法。
探測突變的金屬位點評估蛋白質(zhì)中的鋅結(jié)合可能是困難的，因為Zn(II)離子對于大多數(shù)光譜學技術(shù)而言是“不可見的”。用于回避這一內(nèi)在問題的最常用方法使用與Zn(II)較為相似的其它金屬離子諸如Co(II)(用于UV/Vis光譜學)或Cd(II)(用于NMR光譜學)。另一種方法使用著色Zn(II)指示劑。下面，發(fā)明人描述了通過111Cd NMR光譜學和Cu(II)滴定獲得的關(guān)于新突變型清蛋白的結(jié)果。
a)突變型清蛋白的111Cd NMR倘若能夠用同位素富集Cd(II)制備加載了金屬的蛋白質(zhì)，那么111Cd(或113Cd；兩種核都可以用)NMR實驗是探測蛋白質(zhì)中金屬結(jié)合的較為直接的方法。本研究的結(jié)果揭示了這兩種突變體的金屬結(jié)合特性的有趣改變。
i)Asn99His突變體圖9和10比較了野生型和Asn99Asp突變型清蛋白在同樣條件下的1D111Cd光譜。
正如在野生型rHA的情況中，這些圖清楚顯示了在Asn99His突變體的1D111Cd光譜中能夠觀察到兩個峰，說明快速結(jié)合了兩個當量的111Cd2+。注意野生型和突變型rHA光譜的峰的譜線寬度是可比較的。峰的化學位移在存在80mM氯化物時是122(峰A)和28ppm(峰B)。與野生型rHA(131ppm和27ppm)相比，這意味著金屬結(jié)合位點B不受突變的影響，而突變體位點A的Cd(II)離子與野生型中的相比略微受到更多屏蔽。
可以預(yù)測用氮供體替代氧將導(dǎo)致去屏蔽，但是如果我們假設(shè)突變體中的N-Cd鍵比野生型中的O-Cd鍵短得多的話，那么可以定性理解所觀察到的峰A向較低ppm數(shù)值的移動。這是合理的假設(shè)，因為Asn是非常弱的配基，而且發(fā)明人先前估計O-Zn鍵的長度是大約2.15，比較而言，Zn-N(His)鍵是1.95-2.00。預(yù)計Cd也有相似趨勢。
本發(fā)明人還通過向Cd2-rHA樣品中添加Zn2+而探查了Cd2+與Zn2+之間的競爭。添加Zn2+明顯影響峰A，但是甚至在添加3個當量后，光譜中仍然存在111Cd峰A。相反，1摩爾當量的Zn2+足以競爭性消除野生型rHA光譜中的峰A，說明Cd2+已經(jīng)完全受到取代。通過考慮硬和軟酸和堿原理能夠在一定程度上解釋這些發(fā)現(xiàn)。Cd2+是比Zn2+“更軟”的金屬離子，而氮是比氧“更軟”的配基。使結(jié)合位點“更軟”將使得Cd2+結(jié)合比在野生型rHA中更加有利。本質(zhì)上，這些實驗顯示了，Asn99貢獻了野生型rHA中的鋅位點，而且突變位點確實能夠結(jié)合Cd2+和Zn2+。
ii)Asn99Asp突變體圖10概述了對Asn99Asp突變型rHA與野生型rHA相比的111Cd2+結(jié)合研究的結(jié)果。
Cd2+位點B的占據(jù)同樣顯得不受突變的影響(28ppm，與野生型光譜的27ppm相比)?？梢缘贸鲞@樣的結(jié)論，突變不影響蛋白質(zhì)這一特定部分的折疊，但是位點B至今尚未得到鑒定。
令人驚訝的是，在發(fā)明人常用于111Cd光譜的條件下(見圖10，圖例)，未檢測到峰A。延長化學位移的尺度也未揭示任何更多的峰。為了確保能夠獲得足夠的111Cd，多添加2個當量的111Cd。在對這個樣品記錄的光譜中，存在提示表明多了兩個峰，但是只是在溫度升高時(310K)確實檢測到兩個新的非常寬的共振(譜線寬度幾乎是2000Hz，與峰B的大約150-200Hz相比)。這說明化學交換現(xiàn)象影響光譜。盡管存在過量的Cd(II)，然而在NMR管中沒有觀察到沉淀，假設(shè)這是由于Tris結(jié)合Cd2+從而使之增溶的事實。Cd/Tris復(fù)合物的化學位移是106ppm(于295K)，而且這也是在圖10中對峰C觀察到的數(shù)值。310K光譜中的峰A具有67ppm位移，完全處于具有1個氮和3-5個氧供體的111Cd位點的范圍內(nèi)(Coleman，J.A.，1993，MethodsEnzymol.，227，16-43；z，G.L.、Pountney，D.L.、和Armitage，I.M.，1998，Biochem.Cell Biol.Biochim.Biol.Cell.，76，223-234)。發(fā)明人假設(shè)可利用的111Cd是突變型結(jié)合位點A與Tris(或者蛋白質(zhì)上的非特異位點)之間的中間(295K)或緩慢(310K)交換。
b)通過UV-Vis光譜學監(jiān)測的銅(II)結(jié)合先前(還可見圖6b)已經(jīng)顯示了向野生型rHA中添加Cu2+導(dǎo)致111Cd峰A的消除，指示體外Cu2+也能夠結(jié)合這個鋅位點。
發(fā)明人通過UV-Vis光譜學進行了apo形式的野生型和突變型清蛋白的Cu2+滴定，因為這些實驗提供關(guān)于金屬結(jié)合的快速定性信息，盡管定量評估是非直截了當?shù)?。圖11所示實驗揭示了Cu2+對Asn99突變體的結(jié)合與對野生型的結(jié)合不同。同樣清楚的是它們在第二個位點結(jié)合Cu2+，這可以由與His67Ala突變型rHA的比較看出。兩種突變體的吸收圖譜還彼此不同，暗示涉及突變型配基。
因此，突變確實影響第二個Cu2+位點，也就是已知的主要Zn2+位點。
5.突變型清蛋白的1H NMR發(fā)明人已經(jīng)獲得了1D和2D1H NMR譜，而且圖14比較了所研究的所有突變體的1D1H譜的芳香區(qū)。圖15包括含有和不含鋅的野生型的2D TOCSY譜的相關(guān)部分。已經(jīng)獲得了所測試的所有突變體的相似光譜(未顯示資料)。所有光譜與野生型光譜總體上較為相似。這指示所有突變對蛋白質(zhì)折疊都沒有顯著影響，至少apo形式?jīng)]有。然而存在可以解釋的細微變化。
具體而言，野生型NMR譜中的峰1和3受到所考慮任何突變的影響(His67Ala、Asn99Asp、和Asn99His)。因此假設(shè)它們可以歸因于殘基His67和His247。
結(jié)論對野生型和His67Ala、Asn99Asp、和Asn99His突變型rHA的1D和2D1H NMR譜的分析與由殘基His67、Asn99、His247、和Asp249形成的提出的結(jié)合位點一致。His67Ala突變影響野生型光譜中的兩個交叉峰，與突變殘基接近另一個His(His247)的想法一致。Asn99突變也影響相同的兩個野生型交叉峰，同樣說明所述三個殘基確實彼此緊密接觸。交叉峰1和A歸因于His247，而交叉峰3和B歸因于His67。
6.1H NMR組氨酸Hε1共振作為結(jié)合事件的診斷探針指派了與His67和His247對應(yīng)的兩個峰后，重要的是探究這些殘基是否影響鋅結(jié)合。
a)鋅結(jié)合根據(jù)1D和2D光譜的判斷，向野生型清蛋白中添加1摩爾當量的Zn2+對His殘基的動力學具有顯著后果。
幾個峰受到沉重影響，而峰4、6、7、8、和11保持不變。不再觀察到峰1和3，峰5也消失了，而且峰2和9/10強度降低。
峰消失而非位移的事實可以歸因于Zn2+結(jié)合的兩種作用?；蚴菤埢诮Y(jié)合鋅后變得更加鋼硬，這將導(dǎo)致譜線變寬，或是鋅在游離與結(jié)合狀態(tài)之間(由此其配基)交換，這種化學交換現(xiàn)象也可以導(dǎo)致譜線變寬。在任何情況中，我們都能夠確定，可以通過1H NMR來檢測鋅結(jié)合，而且它影響殘基His67和His247，同樣直接或間接影響其它尚未鑒定的組氨酸殘基。
鋅與Asn99Asp和Asn99His的結(jié)合兩種含1摩爾當量Zn(II)的1mM NMR樣品都在310K保溫約30分鐘后(這是獲取1D光譜需要的時間)產(chǎn)生沉淀。將樣品導(dǎo)入磁體前沒有觀察到沉淀，而且將樣品于279K保溫過夜后沉淀再次溶解。對Asn99Asp突變體觀察到的作用比Asn99His突變體更加顯著?，F(xiàn)在，發(fā)明人只能推測鋅對構(gòu)象動力學具有顯著作用，可能與結(jié)構(gòu)域間相互作用有關(guān)。這種想法還與對野生型的觀察結(jié)果一致。對111Cd樣品沒有觀察到沉淀，盡管Asn99Asp突變體樣品也在310K保溫幾個小時。
b)脂肪酸結(jié)合對野生型rHA的影響清蛋白在血漿中其它不溶性長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在正常條件下，1-2個脂肪酸分子結(jié)合清蛋白，但是在實踐過程中，這個數(shù)字可以升高至4(Peters，T.，Jr.，All About AlbuminBiochemistry，Genetics，and Medical Applications，Academic出版社，紐約，1995)。在體內(nèi)觀察到的最大數(shù)目是6，盡管清蛋白的X射線結(jié)構(gòu)顯示在5(Curry，S.、Mandelkow，H.、Brick，P.、和Franks，N.，1998，Nat.Struct.Biol.，5，827-835)和10(Bhattacharya，A.A.、Grüne，T.、和Curry，S.，2000，J.Mol.Biol.，303，721-732)個脂肪酸結(jié)合位點。在過去已經(jīng)使用包括13C(Hamilton，J.A.、Era，S.、Bhamidipati，S.P.、和Reed，R.G.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88，2051-2054)和1H NMR(Oida，T.，1986，J.Biochem.(日本)，100，1533-1542)在內(nèi)的多種技術(shù)廣泛研究了脂肪酸與清蛋白的結(jié)合。
由圖17可以直接看出眾多His Hε1峰受到脂肪酸結(jié)合的實質(zhì)性影響。這提供了監(jiān)測交互式鋅與脂肪酸結(jié)合的作用的操作。
7.111Cd NMR作為交互式金屬/脂肪酸結(jié)合的探針使用辛酸鹽飽和rHA樣品的初步111Cd NMR光譜學實驗揭示了這些樣品的光譜中缺失峰A。
由含2摩爾當量111Cd2+的徹底透析樣品(發(fā)明人還確定了這些經(jīng)透析樣品或Chen脫脂沉淀之間的1D111Cd NMR譜不存在可辨別差異)開始，我們添加等量的辛酸鉀。圖X顯示了滴定研究的結(jié)果。
最驚人的發(fā)現(xiàn)是，峰A首先縮小，但是在幾個小時后再次擴大。似乎存在緩慢平衡，導(dǎo)致脂肪酸和金屬離子的重新分布。脂肪酸與位點F2的初步結(jié)合顯得較快，正如能夠在混合樣品后直接觀察到峰強度的降低(至少添加2或3個當量；動力學在后續(xù)添加中顯得減慢)。由于峰A再次出現(xiàn)，因此可以推測脂肪酸分子隨后重新定位于熱力學更加有利的結(jié)合位點。預(yù)計脂肪酸由位點F2的解離能夠重新形成金屬結(jié)合位點，而且可利用的Cd2+能夠再次結(jié)合。這一流程可以重復(fù)達4個當量，然后比位點F2具有更高熱力學穩(wěn)定性的所有脂肪酸結(jié)合位點顯得飽和。在含5個當量辛酸鹽的樣品的最后光譜中，不再存在峰A。
這項研究的重要結(jié)果是以下結(jié)論脂肪酸的結(jié)合不僅防止金屬結(jié)合，而且金屬和脂肪酸的結(jié)合是交互式過程，且脂肪酸陰離子的結(jié)合似乎最終導(dǎo)致已結(jié)合金屬離子的解離。
8.細胞實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)清蛋白保護肝組織免于由肝損傷誘導(dǎo)的缺血和缺氧，而且這種效果歸因于清蛋白的金屬結(jié)合能力(Strubelt，O.、Younes，M.、Li.Y.，1994，Pharmacology and Toxicology，75，280-284)。發(fā)明人開發(fā)了體外實驗用于探索鋅、重組人血清清蛋白、和突變型清蛋白對肝細胞細胞培養(yǎng)物的作用。
所用人肝細胞細胞系是WRL-68。在Dulbecco’s基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。為了調(diào)查rHA和His67Ala突變型清蛋白的作用，向培養(yǎng)基中添加600μM rHA或His67Ala突變體。通過向培養(yǎng)基中添加60、300、和600μM ZnCl2來探究Zn(II)的作用。
通過對細胞計數(shù)并使用錐蟲藍評估細胞成活力來評估這些初步實驗。它們說明鋅水平升高對細胞成活力和粘附具有獨特的消極作用，它可以通過添加野生型清蛋白而降低，而且His67Ala突變體具有細胞毒性并抑制細胞粘附。
隨后，為了在清蛋白處理前生成細胞層，將人WRL-68肝細胞培養(yǎng)18小時。然后在存在或缺乏野生型或突變型清蛋白(600μM)的條件下在補充不同劑量(60、300、和600μM)Zn的Dulbecco’s基本Eagle氏培養(yǎng)基中保溫48小時。另外，培養(yǎng)條件(37℃、5％CO2)與先前的實驗相同。發(fā)明人還將研究延伸至兩種新的突變體，即Asn99Asp和Asn99His。
圖18中的圖概述了鋅與不同突變型清蛋白的聯(lián)合處理對人肝細胞的作用。將肝細胞在12孔板中培養(yǎng)成層，并且對細胞層和培養(yǎng)液二者都測定細胞計數(shù)和成活力。所有實驗平行進行三份，誤差條對應(yīng)于各個運行之間的標準偏差。
可以由圖18a-d中展示的結(jié)果得出下列結(jié)論a)確認了Zn2+水平的升高導(dǎo)致細胞死亡和粘附喪失；b)細胞非常耐受野生型rHA；對照與含野生型rHA的細胞計數(shù)之間的生長或粘附?jīng)]有顯著差異；c)Zn2+的不利作用通過600μM野生型rHA得到逆轉(zhuǎn)；d)His67Ala突變體在不添加Zn2+時對細胞粘附具有顯著影響，導(dǎo)致大多數(shù)細胞漂浮在培養(yǎng)基中，盡管細胞層或培養(yǎng)液中的細胞成活力似乎未被削弱；e)令人驚訝的是添加Zn2+似乎逆轉(zhuǎn)His67Ala對細胞粘附的消極影響，而不發(fā)揮與單獨使用時相同的損傷效果；f)Asn99Asp突變型清蛋白的處理導(dǎo)致細胞生長增加(大約+20％)，不考慮Zn2+的添加量；g)Asn99His突變型rHA的處理導(dǎo)致最顯著的粘附喪失。與His67Ala突變型rHA相反，添加Zn2+沒有有益作用。細胞成活力似乎不受影響。
總之，本發(fā)明人顯示了鋅位點配基的突變具有深遠的后果，不僅是蛋白質(zhì)的物理化學特性，還有它對存活細胞的作用。盡管觀察到的多種作用的原因仍然有待確定，然而不希望束縛于理論，發(fā)明人推測構(gòu)象動力學、結(jié)構(gòu)域/結(jié)構(gòu)域相互作用、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用、和可能的蛋白質(zhì)/膜相互作用對本發(fā)明的大多數(shù)觀察結(jié)果負有責任。
這些研究的結(jié)果是，有可能通過突變金屬位點所在周圍的殘基而制備對金屬離子諸如Zn2+的親和力降低或升高的新型突變型清蛋白。這包括將能夠結(jié)合金屬的側(cè)鏈突變成不能(或只是微弱)結(jié)合金屬的側(cè)鏈，這有可能降低金屬親和力。
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權(quán)利要求
1.一種分離的突變型血清清蛋白，其被突變使得與衍生突變體的天然清蛋白相比，突變體展示改變的金屬結(jié)合親和力和/或其它生理學特征。
2.權(quán)利要求1的突變體，其中所述其它生理學特征是細胞對基質(zhì)的粘附、細胞的百分比成活力和/或培養(yǎng)細胞的細胞生長中的變化。
3.一種分離的突變型人血清清蛋白，其本質(zhì)上包含如下氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQX5LQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLX1TLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERX2X8CFX6QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRX9PYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVX10TECCX3X7X4LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSX11CIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL其中X1不同于H；X2不同于N；X3不同于H；X4不同于D；X5不同于Y；X6不同于L；X7不同于G；X8不同于E；X9不同于H；X10不同于H；和X11不同于H，使得與天然人血清清蛋白相比，所述突變體展示改變的金屬結(jié)合親和力。
4.一種本質(zhì)上包含表1所示序列之一的分離的突變型哺乳動物血清清蛋白，其中至少一個由灰色陰影標示的殘基是突變的，使得與衍生突變體的天然序列相比，所述突變型血清清蛋白展示改變的金屬結(jié)合親和力或其它生理學特征。
5.依照權(quán)利要求3或4的分離的突變型血清清蛋白，它與衍生突變體的天然序列至少90％相同。
6.依照任何上述權(quán)利要求的突變型血清清蛋白，在一般總體折疊方面它與衍生它的天然血清清蛋白本質(zhì)上相似。
7.依照前述權(quán)利要求任一項的突變型血清清蛋白，其中改變的金屬結(jié)合親和力是在金屬結(jié)合親和力方面降低或升高。
8.依照任何上述權(quán)利要求的突變體，其中所述金屬是鋅。
9.依照權(quán)利要求3-8任一項的突變體，其包含至少一種下列突變X1＝>A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C、D、EX2＝>A、F、G、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C、D、E、HX3＝>A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C、D、EX4＝>A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C、E、HX5＝>C、D、E、HX6＝>C、D、E、HX7＝>C、D、E、HX8＝>A、C、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX9＝>A、D、E、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX10＝>A、D、E、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、YX11＝>A、D、E、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y
10.依照權(quán)利要求3-8任一項的突變體，其在X1，X2，X3或X4處包含至少一個突變。
11.一種突變型人血清清蛋白，其包含突變Asn99His，Asn99Asp或His67Ala。
12.一種核酸序列，其能夠編碼依照前述任何一項權(quán)利要求的突變型血清清蛋白。
13.一種表達盒，其包含與依照權(quán)利要求12的核酸序列可操作連接的啟動子。
14.一種藥物組合物，其包含依照前述任何一項權(quán)利要求的突變型血清清蛋白、核酸序列，或表達盒及其藥用載體。
15.一種細胞培養(yǎng)基，其包含依照權(quán)利要求1-13任一項的突變型血清清蛋白、核酸序列或表達盒。
16.依照權(quán)利要求1-13任一項的突變型血清清蛋白、核酸或表達盒在細胞培養(yǎng)中用于影響細胞粘附和/或細胞生長特征的用途。
17.一種改變細胞培養(yǎng)中的細胞生長特征的方法，其包括在存在依照權(quán)利要求1-13任一項的突變型血清清蛋白的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)細胞的步驟。
18.一種獲得突變型血清清蛋白的方法，所述突變型血清清蛋白與衍生突變體的天然清蛋白相比展示改變的金屬結(jié)合親和力和/或其它生理學特征的，所述方法包括步驟1.提供編碼核的清蛋白多肽的核酸序列；2.對所述核酸進行誘變反應(yīng)以改變所述核酸，使得所述改變的核酸序列編碼與所述天然清蛋白相比包含至少一個突變的突變型清蛋白多肽；3.表達所述突變型清蛋白多肽并檢測所述突變型清蛋白是否展示改變的金屬結(jié)合和/或其它生理學特征。
19.依照權(quán)利要求18的方法，其中所述突變型清蛋白包含表1所示在殘基X1-X11處的至少一個突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變型血清清蛋白，與衍生突變體的天然清蛋白相比它們展示改變的金屬結(jié)合和/或其它特征，以及這些突變型清蛋白在醫(yī)學領(lǐng)域或培養(yǎng)中細胞生長的用途。
文檔編號C07K14/435GK1684980SQ03822986
公開日2005年10月19日 申請日期2003年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者斯蒂芬·貝雷澤恩科, 彼得·約翰·薩德勒, 艾淪·詹姆斯·斯圖爾特, 克勞迪婭·布林德奧爾, 凱麗·?，敗げ寄岚?申請人:愛丁堡大學董事會, 戴塔生物技術(shù)有限公司