本發(fā)明屬于納米材料制備和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種四氧化三錳-乳白蛋白納米球及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

錳基核磁共振成像造影劑是一類具有t1，t2-加權(quán)mri成像造影劑，是醫(yī)療過程中常用的一類造影劑，它具有毒性小、生物相親性好、體內(nèi)穩(wěn)定等特點。而小尺寸的四氧化三錳納米顆粒還具有血管穿透性好、能夠完全被降解、弛豫效能高等優(yōu)點。因此，發(fā)展基于mn3o4納米顆粒的核磁診斷劑對推動其臨床應(yīng)用具有重要研究意義。但是，目前小尺寸的mn3o4納米顆粒多是采用溶劑熱方式合成，表面為油酸或油胺修飾，具疏水性，不利于其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。

α-乳白蛋白（簡稱α-la）是由123個氨基酸組成的一種結(jié)構(gòu)緊實的球蛋白，在其二級結(jié)構(gòu)中大約有26%為α-螺旋，14%為β-折疊，其它60%為無序結(jié)構(gòu)。酶解后的乳白蛋白會存在顯著的兩親性肽鏈，這些兩親性肽鏈可以作為兩親性單體聚集形成膠束。因此，la膠束可作為藥物載體負(fù)載疏水藥物分子。另一方面，α-乳白蛋白鏈有四個二硫鍵，通過還原試劑切割二硫鍵能夠得到游離的巰基，而在形成la膠束后能交聯(lián)形成新的二硫鍵，可以提高膠束作為藥物載體的穩(wěn)定性。

本發(fā)明利用la肽鏈的兩親性和能形成膠束的特性，對疏水性的mn3o4納米顆粒進(jìn)行組裝轉(zhuǎn)相，發(fā)展出一種兼具核磁成像功能及藥物載體功能的mn3o4-la自組裝納米球。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種四氧化三錳-乳白蛋白納米球及其制備方法與應(yīng)用。該納米球兼具核磁成像功能及藥物載體功能，并對低ph及高gsh有雙重刺激響應(yīng)釋放特性，可用于制備集核磁成像診斷及藥物傳輸為一體的診斷治療劑。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種四氧化三錳-乳白蛋白納米球，其是將α-la經(jīng)酶水解及dtt處理后，再與疏水性mn3o4納米顆粒通過疏水作用力自組裝而成；其平均尺寸為120~140nm，表面帶負(fù)電，在水相中分散性良好。

所述納米球的制備方法包括如下步驟：

1）將α-la溶解于tris-hcl中，經(jīng)蛋白水解酶水解獲得兩親性的多肽鏈溶液，再加入二硫蘇糖醇（dtt）進(jìn)行處理，使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，從而獲得處理液；

2）將疏水性mn3o4納米顆粒分散于四氫呋喃（thf）溶液中，然后將該分散液加入到步驟1）所得處理液中反應(yīng)12h，產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌，獲得mn3o4-la復(fù)合顆粒；

3）將所得mn3o4-la復(fù)合顆粒通氧氣處理30min使二硫鍵重新交聯(lián)，經(jīng)離心得到自組裝的mn3o4-la納米球。

其中，所用α-la與疏水性mn3o4納米顆粒的質(zhì)量比為1:1~5:1；所述疏水性mn3o4納米顆粒的表面以油酸進(jìn)行修飾，其顆粒尺寸﹤10nm。

步驟2）中處理液與分散液的體積比為5:1~10:1。

所述納米球在低ph（ph≤5.0）及高濃度gsh（gsh≥10mm）的雙重刺激下可發(fā)生解離并釋放出mn²⁺（核磁成像劑）及藥物分子，適用于制備集核磁成像診斷及藥物傳輸為一體的診斷治療劑。

所述藥物分子為疏水性藥物，包括光敏劑二氫卟吩e6（ce6）、吲哚菁綠（icg）、喜樹堿、順鉑、姜黃素等；和/或為親水性藥物，如阿霉素（dox）。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

（1）本發(fā)明合成的mn3o4-la納米球顆粒尺寸較為均一，其制備方法簡單，條件溫和可控；且其在低ph及高濃度gsh的雙重刺激下可發(fā)生解離，不僅可作為核磁成像劑，還能同時負(fù)載疏水性藥物和/或親水性藥物，是一種多功能診斷治療劑；

（2）本發(fā)明所得mn3o4-la納米球?qū)κ杷运幬锖陀H水性藥物的負(fù)載率都較高，如對光敏劑ce6的負(fù)載率可達(dá)到75%，對親水性藥物dox的負(fù)載率可達(dá)到42.1%，因此可有效降低治療過程中藥物載體的使用量，達(dá)到減少副作用的目的；

（3）本發(fā)明所得mn3o4-la納米球生物相容性好，且mn3o4納米顆粒及l(fā)a都易于在細(xì)胞內(nèi)降解，是可降解型藥物載體。

附圖說明

圖1為不同濃度mn3o4-la納米球的生物相容性試驗結(jié)果。

圖2為mn3o4-la納米球在不同條件下的體外核磁共振成像對比圖。

圖3為mn3o4-ce6-la納米球的透射電鏡圖。

圖4為不同時間下mn3o4-ce6-la納米球在pbs和培養(yǎng)液中的粒徑變化圖。

圖5為不同納米球的體外單線態(tài)氧產(chǎn)生率變化圖。

圖6為mn3o4-ce6-la納米球在不同條件下ce6的釋放率曲線。

圖7為mn3o4-ce6-la-dox納米球在不同條件下dox的釋放率曲線。

圖8為不同條件下納米球在光照前和光照后的細(xì)胞毒性試驗結(jié)果，其中，laser（+）代表光照組，laser（-）代表非光照組。

具體實施方式

一種四氧化三錳-乳白蛋白納米球的制備：

1）疏水性mn3o4納米顆粒的合成：

取0.75mg油酸鉀溶解于2.5ml乙醇、5ml甲苯和0.5ml油酸的混合溶液中，超聲15min；取0.1004gmn(no)3·4h2o溶于5ml水中；將兩者混合置于反應(yīng)釜中，并在150℃下反應(yīng)18h，然后靜置，取油相用乙醇作為沉淀劑進(jìn)行沉淀，離心，獲得疏水性mn3o4納米顆粒；

2）α-乳白蛋白的酶水解：

取6mgα-乳白蛋白溶解于200μl、ph=7.5的75mmtris-hcl中，再加入12μl、0.3u/ml蛋白水解酶，用1ml注射器吸取溶液，于0.22μm聚醚砜針頭式過濾器中過濾一次，然后在50℃水浴中加熱20min，離心后取上清液冷凍干燥，所得產(chǎn)物重新分散在ph=7.5的75mmtris-hcl中，從而得到α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液；

3）dtt處理：

取52μl、1mg/ml二硫蘇糖醇（dtt），將其加入步驟2）所得α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液中，1000rpm攪拌10min，使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，從而獲得處理液；

4）mn3o4-la復(fù)合顆粒的制備：

將步驟1）所得疏水性mn3o4納米顆粒分散于5mlthf溶液中，然后按體積比1:5將該分散液加入到步驟3）所得處理液中反應(yīng)12h，產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌，獲得mn3o4-la復(fù)合顆粒；

5）mn3o4-la納米球的制備：

將所得mn3o4-la復(fù)合顆粒通氧氣處理30min使二硫鍵重新交聯(lián)，得到mn3o4-la納米球。

mn3o4-la納米球的生物相親性：

取已消化的hela細(xì)胞懸濁液用培養(yǎng)液稀釋，以100μl/孔的密度接種到96孔板，每孔的細(xì)胞個數(shù)控制約為10⁵個。將96孔板置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去培養(yǎng)液，加入含有不同濃度的mn3o4-la納米球的溶液，每組設(shè)置4個重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，移去溶液，用pbs緩沖液（ph=7.4）清洗兩次，加入100μl培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h后，每孔分別加入10μl濃度為5mg/ml的mtt，繼續(xù)孵育4h，小心移去培養(yǎng)液，加入150μldmso，37℃培養(yǎng)15min，震蕩均勻后，在酶標(biāo)儀上測490nm處的吸收值，計算細(xì)胞存活率，以評價mn3o4-la納米球生物相親性，結(jié)果如圖7所示。

由圖1可見，在mn3o4-la納米球濃度為5~100μg/ml的區(qū)間，細(xì)胞存活率均在80%以上，說明mn3o4-la納米球具有優(yōu)異的生物相親性。

mn3o4-la納米球的體外核磁共振成像：

1）先取1ml、0.287mg/mlmn3o4納米顆粒溶液加入透析袋中，加入49ml、2wt%的硝酸溶液中消解24h，使其完全解離，再取一定量按需要稀釋，進(jìn)行icp-ms測定。根據(jù)icp-ms測試結(jié)果計算出1mlmn3o4納米顆粒溶液中含有mn²⁺為68.94μg；

2）取0.228ml、0.25mg/mlmn3o4-la溶液，分別加入到1mlph=7.4、ph=5.0、ph=7.4+10mmgsh、ph=5.0+10mmgsh的pbs溶液中（相當(dāng)于所含mn²⁺濃度為0.25mm），浸泡24h，離心后取一定量上清液分別配成5個不同mn²⁺濃度（0.01、0.05、0.1、0.2、0.25mm）的溶液，然后各取0.5ml進(jìn)行mri檢測。

圖2為mn3o4-la納米球在不同條件下的體外核磁共振成像對比圖。其中，從圖2（a）可以看出：在ph=5.0和ph=5.0+10mmgsh的條件下，隨著解離出來錳離子的濃度增加，成像的亮度也逐漸變亮；而在ph=7.4的條件下，成像的亮度基本沒有變化，說明在ph=7.4的緩沖液中mn3o4-la納米球錳離子解離的量較少；而在ph=7.4+10mmgsh的條件下，成像的亮度也逐漸變亮，說明gsh具有還原作用，能夠?qū)⒏嗟膍n²⁺還原出來，因而成像亮度逐漸變亮。進(jìn)一步的，由圖2（b）可知：在ph=5.0，ph=5.0+10mmgsh和ph=7.4+10mmgsh條件下的r1分別為8.02mm^-1·s^-1、12.9mm^-1·s^-1和7.67mm^-1·s^-1，均大于ph=7.4條件下的r1=2.98mm^-1·s^-1，這說明在酸性以及gsh存在條件下，mn3o4-la納米球發(fā)生解構(gòu)，釋放出較多的mn²⁺而使mri成像效果增強(qiáng)。由此證明，mn3o4-la納米球可實現(xiàn)針對ph及gsh雙重刺激響應(yīng)觸發(fā)的t1加權(quán)mri成像。

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

1）疏水性mn3o4納米顆粒的合成：

取0.75mg油酸鉀溶解于2.5ml乙醇、5ml甲苯和0.5ml油酸的混合溶液中，超聲15min；取0.1004gmn(no)3·4h2o溶于5ml水中；將兩者混合置于反應(yīng)釜中，并在150℃下反應(yīng)18h，然后靜置，取油相用乙醇作為沉淀劑進(jìn)行沉淀，離心，獲得疏水性mn3o4納米顆粒；

2）α-乳白蛋白的酶水解：

取6mgα-乳白蛋白溶解于200μl、ph=7.5的75mmtris-hcl中，再加入12μl、0.3u/ml蛋白水解酶，用1ml注射器吸取溶液，于0.22μm聚醚砜針頭式過濾器中過濾一次，然后在50℃水浴中加熱20min，離心后取上清液冷凍干燥，所得產(chǎn)物分散在ph=7.5的75mmtris-hcl中，從而得到α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液；

3）dtt處理：

取52μl、1mg/mldtt，將其加入步驟2）所得0.5mg/mlα-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液中，1000rpm攪拌10min，使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，從而獲得處理液；

4）mn3o4-ce6-la納米球的自組裝：

將步驟1）制得的疏水性mn3o4分散于4mlthf中；將3mg二氫卟吩e6（ce6）溶解于1mlthf中；然后將兩種混合液加入到步驟3）制得的處理液中，反應(yīng)12h，產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌，將所得復(fù)合顆粒通氧氣處理30min，經(jīng)離心得到mn3o4-ce6-la納米球；通過熒光數(shù)據(jù)測得ce6的負(fù)載率為75%；

5）mn3o4-ce6-la-dox納米球的合成：

將步驟4）制得的mn3o4-ce6-la納米球重新分散于水中，按質(zhì)量比10:1加入阿霉素（dox），室溫攪拌12h，離心，水清洗處理得mn3o4-ce6-la-dox納米球；通過熒光數(shù)據(jù)測得dox的吸附率為42.1%。

6）mn3o4-ce6-la-dox-rgd納米球的合成：

將步驟5）制備的mn3o4-ce6-la-dox納米球50μg重新分散于水中，加入5.5μgedc與6.35μgnhs反應(yīng)1h，然后按mn3o4-ce6-la-dox納米球和rgd的質(zhì)量比為2:1加入rgd，反應(yīng)12h，離心后得到mn3o4-ce6-la-dox-rgd納米球。

性能檢測：

1、將步驟4）制得的mn3o4-ce6-la納米球分散于水中，然后滴在銅網(wǎng)上，晾干后進(jìn)行tem掃描，結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，所得mn3o4-ce6-la顆粒為球形，是由平均尺寸為7nm的mn3o4納米顆粒自組裝形成，其尺寸較為均一，分散性較好，平均粒徑約為180±10nm；

2、分別取步驟4）制得的mn3o4-ce6-la納米球加入至pbs（ph=7.4）緩沖溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液中，配制成濃度為1mg/ml的溶液，混勻，分別于不同時間取樣測定粒徑大小的變化，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，mn3o4-ce6-la納米球不管在pbs緩沖液還是細(xì)胞培養(yǎng)液中顆粒的粒徑幾乎不會變化，由此可知mn3o4-ce6-la納米球在一定時間內(nèi)相對穩(wěn)定。

3、將步驟4）制得的mn3o4-ce6-la納米球分散于水中，配成濃度為0.08mg/ml（所含ce6的濃度為10μm）的溶液，然后將其與50μmdpbf均勻混合，加水至總體積為1ml，用波長為631nm、功率為100mw/cm²的紅外燈照射，在不同的時間點測單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處的紫外吸收值；另取含10μmce6的不同顆粒（自由的ce6分子、未交聯(lián)的mn3o4-ce6-la納米球、交聯(lián)的mn3o4-ce6-la-dox納米球）加入dpbf后，用同樣的光照射，測試結(jié)果如圖5所示（其中，用i/i0來評估，i為初始單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值，i0為不同時間點單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值）。

由圖5可知，交聯(lián)的mn3o4-ce6-la比自由的ce6分子單線態(tài)氧產(chǎn)生率稍低，這是因為交聯(lián)后顆粒更穩(wěn)定，ce6釋放緩慢，因此在相同照射時間中單線態(tài)氧產(chǎn)生率稍低。

4、將步驟4）制得的mn3o4-ce6-la納米球分散到不同溶液中（ph=7.4，ph=7.4+10mmgsh，ph=5.0，ph=5.0+10mmgsh），置于37℃下避光保存，于不同的時間點取樣離心。利用熒光計于404nm激發(fā)，測定630nm處的發(fā)射峰值，并根據(jù)ce6的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算分析不同條件下的釋放情況，其測試結(jié)果如圖6所示。

由圖6可見，在ph=7.4的緩沖液中，ce6的釋放率僅為17.2%，說明經(jīng)過通氧交聯(lián)后的mn3o4-ce6-la納米球很穩(wěn)定；而在ph=7.4+10mmgsh的條件下，ce6的釋放率達(dá)到70.2%，說明高gsh可以有效解離mn3o4-ce6-la納米球結(jié)構(gòu)，從而釋放出ce6。另一方面，在ph=5.0的緩沖液中，ce6的釋放率為62.1%，說明酸性也可以誘導(dǎo)mn3o4-ce6-la納米球結(jié)構(gòu)發(fā)生解離；而在ph=5.0+10mmgsh的條件下，ce6的釋放率增加到83.9%，說明經(jīng)低ph及高gsh的雙重刺激，mn3o4-ce6-la納米球結(jié)構(gòu)迅速發(fā)生解離，從而釋放出更多的ce6。

5、將步驟5）制得的mn3o4-ce6-la-dox納米球分散到不同溶液中（ph=7.4，ph=7.4+10mmgsh，ph=5.0，ph=5.0+10mmgsh），置于37℃下避光保存，于不同的時間點取樣離心。利用熒光計于488nm激發(fā)，測定596nm處的發(fā)射峰值，并根據(jù)dox的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算分析不同條件下的釋放情況，其測試結(jié)果如圖7所示。

由圖7可見，在ph=7.4的緩沖液中，dox的釋放率僅為19.8%，說明大部分dox分布在mn3o4-ce6-la-dox的納米球孔隙內(nèi)；而在ph=7.4+10mmgsh的條件下，dox的釋放率達(dá)到63.4%，說明高gsh可以有效解離mn3o4-ce6-la-dox納米球結(jié)構(gòu)，從而釋放出dox。另一方面，在ph=5.0的緩沖液中，dox的釋放率為58.2%，說明酸性也可以誘導(dǎo)mn3o4-ce6-la-dox納米球結(jié)構(gòu)發(fā)生解離；而在ph=5.0+10mmgsh的條件下，dox的釋放率增加到85.3%，說明經(jīng)低ph及高gsh的雙重刺激，mn3o4-ce6-la-dox納米球結(jié)構(gòu)迅速發(fā)生解離，從而釋放出更多的dox。

6、取已消化的hela細(xì)胞懸濁液用培養(yǎng)液稀釋，以100μl/孔的密度接種到96孔板，每孔的細(xì)胞個數(shù)控制約為10⁵個，每組設(shè)置4個復(fù)孔作為重復(fù)組。將96孔板置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去孔中培養(yǎng)液，分別加入含有1：control，2：freece6，3：mn3o4-ce6-la，4：mn3o4-ce6-la-dox，5：mn3o4-ce6-la-dox-rgd的溶液（以上各組中mn3o4-la的濃度均為67μg/ml，ce6的濃度均為5μg/ml，dox的濃度均為3.0μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，移去溶液，用pbs緩沖液清洗兩次，加入100μl培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h后，每孔分別加入10μl濃度為5mg/ml的mtt，繼續(xù)孵育4h，小心移去培養(yǎng)液，加入150μldmso，37℃培養(yǎng)15min，振蕩均勻后，在酶標(biāo)儀上測490nm處的吸收值，另設(shè)對應(yīng)光照組（波長為631nm，100mw/cm²照射10min），計算細(xì)胞存活率，評價各組治療效果，結(jié)果如圖8所示。

從圖8可以看出，光照組都比相對應(yīng)的沒有光照組的細(xì)胞死亡率要高，說明光照產(chǎn)生的單線態(tài)氧對細(xì)胞死亡率有一定影響。其中，光照組mn3o4-ce6-la-dox-rgd對癌細(xì)胞在24h內(nèi)抑制率達(dá)到90%，說明該載藥體系能有效地用于腫瘤的治療。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。