本發(fā)明涉及從獲得自牛奶的乳清材料分離乳清蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的方法。具體地，本發(fā)明涉及從乳清材料分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，至少一種乳清蛋白已經(jīng)從所述乳清材料中去除，或基本去除。發(fā)明背景牛奶是非常復(fù)雜的材料，以及工業(yè)過(guò)程使用牛奶來(lái)產(chǎn)生酪蛋白、乳清、乳糖、煉乳、奶粉和許多其他食品添加劑和工業(yè)產(chǎn)品。牛奶包含諸如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪、糖、鹽和維生素的組分的混合物。特別地，牛奶中的主要作為酪蛋白或乳清蛋白被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)在這些年來(lái)已經(jīng)越來(lái)越多地獲得關(guān)注。該增加的關(guān)注的原因在于牛奶蛋白的多樣性，以及因?yàn)楦鞯鞍拙哂袪I(yíng)養(yǎng)的、生物的、功能的和食品成分應(yīng)用的獨(dú)特屬性。此外，這些蛋白質(zhì)與例如牛奶中的肽和酶一起構(gòu)成人和動(dòng)物中的主要和重要的健康和營(yíng)養(yǎng)作用。為獲得蛋白的最大可能潛能以及探索或開(kāi)發(fā)蛋白，以及乳清蛋白的潛在功能及生物活性特性，通過(guò)避免可能的變性條件(如高鹽條件、高或低pH條件、熱或蛋白酶處理/暴露)的程序來(lái)分離天然的乳清蛋白是重要的。除了酪蛋白產(chǎn)品(如奶酪)以外，最常生產(chǎn)的牛奶蛋白產(chǎn)品為濃縮乳清蛋白(WPC)和分離乳清蛋白(WPI)。這些WPC和WPI產(chǎn)品為通過(guò)各種分離技術(shù)，如沉淀技術(shù)、膜過(guò)濾技術(shù)以及離子交換吸附程序從乳清獲得的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。而且，通過(guò)使用色譜支持物使得WPC蛋白或WPI蛋白分級(jí)成單獨(dú)的蛋白級(jí)分，如β-乳球蛋白級(jí)分、α-乳白蛋白級(jí)分、免疫球蛋白級(jí)分、乳過(guò)氧化物酶級(jí)分和乳鐵蛋白級(jí)分是可能的。由于不同乳清蛋白具有相對(duì)類似的物理化學(xué)特性，單獨(dú)的乳清蛋白級(jí)分的分離已證明是困難的。技術(shù)人員了解基于乳清蛋白的分子大小(根據(jù)需要，當(dāng)使用膜過(guò)濾時(shí))提供優(yōu)良的分離是困難的，并且由于待分離的乳清材料和乳清蛋白的復(fù)雜性，以該方式提供的級(jí)分導(dǎo)致差的收率和/或差的純度。然而，基于乳清蛋白的等電點(diǎn)(pI)分離該乳清蛋白產(chǎn)生兩個(gè)不同的組：主要蛋白，如α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白G和血清白蛋白，其在甜乳清的pH帶負(fù)電荷(pH6.2-6.4)；以及次要的乳清蛋白，如乳鐵蛋白和乳過(guò)氧化物酶，其在甜乳清的pH保持凈正電荷。這些不同特性提供使用色譜支持物將一組和另一組選擇性分離的可能性。在提供單獨(dú)的級(jí)分，如包含β-乳球蛋白的蛋白級(jí)分以及包含α-乳白蛋白的級(jí)分中使用色譜支持物的此種選擇性分離可以在兩種條件下操作：(i)乳清蛋白從色譜支持物的選擇性洗脫，或(ii)一種或多種乳清蛋白至色譜支持物的選擇性吸附。在選擇性洗脫中，溶液中的所有蛋白同時(shí)捕獲在色譜支持物上。漂洗掉色譜支持物上的污染物和未捕獲的物質(zhì)。然后，由任何人使用專門(mén)設(shè)計(jì)的適合于待分離的特定蛋白質(zhì)的洗脫緩沖液依序洗脫捕獲的蛋白。因此，通過(guò)使用選擇性洗脫技術(shù)，從同一色譜支持物獲得數(shù)種純化的蛋白級(jí)分是可能的。以此方式，生產(chǎn)成本在不同產(chǎn)物之間分?jǐn)?。選擇性洗脫的一些挑戰(zhàn)為：當(dāng)將乳清裝載至柱時(shí)的裝載容量較低，以及當(dāng)洗脫各種蛋白級(jí)分時(shí)的緩沖液消耗較高。此外，由于不同蛋白級(jí)分之間的重疊洗脫條件和高鹽含量(電導(dǎo)率)，獲得的蛋白級(jí)分具有低收率、低回收率和/或低純度。在選擇性吸附中，優(yōu)化工藝條件以越過(guò)一種蛋白質(zhì)捕獲另一種蛋白質(zhì)。當(dāng)捕獲目標(biāo)蛋白時(shí)，漂洗掉色譜支持物的污染物，隨后洗脫特定蛋白。因?yàn)檫x擇性吸附技術(shù)僅提供單一蛋白的最佳結(jié)合，所以技術(shù)人員不認(rèn)為該技術(shù)具有發(fā)展成工業(yè)應(yīng)用的巨大潛能。然后，來(lái)自該單一蛋白的收入必須覆蓋所有生產(chǎn)成本以及與處理剩余的乳清蛋白有關(guān)的成本。因此，選擇性洗脫技術(shù)被認(rèn)為是最適用于工業(yè)應(yīng)用。此外，選擇性吸附在工業(yè)背景中是很難實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)樗枰?dú)特的和昂貴的吸附劑設(shè)置以及精確的吸附條件的調(diào)節(jié)。因此，選擇性洗脫技術(shù)被認(rèn)為是最適用于工業(yè)應(yīng)用。所以，提供乳清蛋白級(jí)分的改善方法是有利的，所述方法將解決上面的問(wèn)題，以及將適合于工業(yè)應(yīng)用。特別地，更有效的方法是可取的，所述方法導(dǎo)致α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的增加的收率、回收率和純度，具有低的緩沖液消耗和高的裝載容量。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的改善的方法。該方法為劃算的以及產(chǎn)生高品質(zhì)的蛋白級(jí)分，提供均具有高純度、高回收率和/或高收率的單獨(dú)的α-乳白蛋白級(jí)分和單獨(dú)的β-乳球蛋白級(jí)分。具體地，本發(fā)明的目標(biāo)是提供解決以上提及的現(xiàn)有技術(shù)中分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的問(wèn)題的方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及從獲得自牛奶的乳清材料提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：(i)提供乳清材料；(ii)使所述乳清材料與色譜支持物接觸，允許β-乳球蛋白被所述色譜支持物保留；(iii)從所述色譜支持物獲得包含所述α-乳白蛋白級(jí)分的透過(guò)物級(jí)分；(iv)任選地洗滌所述色譜支持物；(v)從所述色譜支持物獲得包含所述β-乳球蛋白級(jí)分的保留物級(jí)分；其中步驟(i)中提供的所述乳清材料中的至少一種乳清蛋白，如至少2種乳清蛋白，例如至少3種乳清蛋白已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的包含α-乳白蛋白的α-乳白蛋白級(jí)分和/或包含β-乳球蛋白的β-乳球蛋白級(jí)分。本發(fā)明的另一方面涉及在食物產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品、飲料產(chǎn)品、美容產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品或食品補(bǔ)充劑中使用根據(jù)本發(fā)明的α-乳白蛋白級(jí)分和/或根據(jù)本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分?，F(xiàn)在將在下述更詳細(xì)地描述本發(fā)明。發(fā)明詳述多年以來(lái)，使用乳清蛋白的應(yīng)用的數(shù)目已經(jīng)擴(kuò)大，以及對(duì)于分離的和純的級(jí)分的需求已經(jīng)獲得越來(lái)越多的關(guān)注。除了以上提及的現(xiàn)有技術(shù)的劣勢(shì)以外，當(dāng)前所述的方法面臨的挑戰(zhàn)之一為提供不同分離的級(jí)分的成本。所以，本發(fā)明的發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)用于提供具有高收率、高回收率和高純度的α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法，所述方法是容易的、快速的且具有成本效率。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)β-乳球蛋白級(jí)分的選擇性吸附從獲得自牛奶的乳清材料提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：(i)提供乳清材料；(ii)任選地調(diào)節(jié)乳清材料的pH；(iii)使乳清材料與色譜支持物接觸，允許β-乳球蛋白被色譜支持物保留；(iv)從色譜支持物獲得包含α-乳白蛋白級(jí)分的透過(guò)物級(jí)分；(v)任選地洗滌色譜支持物；(vi)使洗脫緩沖液與色譜材料接觸；以及(vii)從色譜支持物獲得包含β-乳球蛋白級(jí)分的保留物級(jí)分；其中色譜支持物包含一種或多種能夠結(jié)合β-乳球蛋白級(jí)分的帶負(fù)電荷的配體。本發(fā)明的另一方面涉及從獲得自牛奶的乳清材料提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：(i)提供乳清材料；(ii)使乳清材料與色譜支持物接觸，允許β-乳球蛋白被色譜支持物保留；(iii)從色譜支持物獲得包含α-乳白蛋白級(jí)分的透過(guò)物級(jí)分；(iv)任選地洗滌色譜支持物；(v)從色譜支持物獲得包含β-乳球蛋白級(jí)分的保留物級(jí)分；其中步驟(i)中提供的乳清材料中的至少一種乳清蛋白，如至少2種乳清蛋白，例如至少3種乳清蛋白已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“耗盡的”涉及乳清材料中存在不可檢測(cè)量的給定乳清蛋白。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本耗盡的”涉及這樣的乳清材料，其中相對(duì)于乳清中乳清蛋白的最初含量，給定乳清蛋白的含量已經(jīng)被降低至低于所述蛋白的最初含量的30％，如低于20％、例如低于15％、如低于10％、例如低于5％、如低于3％、例如低于1％、如低于0.5％、例如低于0.1％、如低于0.05％、例如低于0.01％的含量。從酪蛋白的去除直接獲得的乳清中的乳清蛋白的“最初含量”可以通過(guò)以下測(cè)定：(a)在沒(méi)有耗盡(或沒(méi)有基本耗盡)下所使用的乳清的分析，或(b)如文獻(xiàn)中所述的乳清中所述蛋白的常規(guī)的列出量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分與β-乳球蛋白級(jí)分的分級(jí)通過(guò)β-乳球蛋白級(jí)分至色譜支持物的選擇性吸附進(jìn)行。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“選擇性吸附”涉及色譜支持物被設(shè)計(jì)和/或過(guò)程條件被設(shè)計(jì)成有助于來(lái)自混合物的一種組分而不是另一組分的結(jié)合的過(guò)程。關(guān)于本發(fā)明，“一種組分”為β-乳球蛋白，以及“另一組分”為α-乳白蛋白，以及“混合物”為乳清材料。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，選擇性吸附導(dǎo)致α-乳白蛋白級(jí)分與β-乳球蛋白的分離。該分離可以通過(guò)提供色譜支持物和/或過(guò)程條件進(jìn)行，其有助于β-乳球蛋白的選擇性吸附，以及允許α-乳白蛋白通過(guò)色譜支持物而不會(huì)被吸附。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“保留”涉及將β-乳球蛋白保存或保持在特定位置，即在色譜支持物的行為。β-乳球蛋白可以被保留在色譜支持物中直至改變條件，以及β-乳球蛋白被從色譜支持物釋放和洗脫。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法可以為中型規(guī)模生產(chǎn)或大規(guī)模生產(chǎn)。乳清根據(jù)本發(fā)明所述的方法，最初步驟涉及提供乳清材料。本發(fā)明的乳清材料為包含α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分級(jí)乳清，其中至少一種乳清蛋白已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，乳清材料可以獲得自任何產(chǎn)乳動(dòng)物，并且優(yōu)選傳統(tǒng)上用于大規(guī)模牛奶生產(chǎn)的動(dòng)物。優(yōu)選地，牛奶獲得自反芻動(dòng)物，如牛、山羊、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、牦牛、鹿、駱駝、美洲駝或羚羊。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“乳清材料”涉及來(lái)自牛奶(無(wú)酪蛋白的牛奶部分)的血清材料。根據(jù)本發(fā)明的乳清材料可以為獲得自乳清、酸乳清、甜乳清、分離乳清蛋白(WPI)或濃縮乳清蛋白(WPC)的分級(jí)乳清。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，乳清材料包含小于5g酪蛋白/L乳清材料、如小于2g酪蛋白/L乳清材料、例如小于1g酪蛋白/L乳清、如小于0.5g酪蛋白/L乳清、如小于0.2g酪蛋白/L乳清材料、例如小于0.1g酪蛋白/L乳清、如小于0.05g酪蛋白/L乳清材料、例如小于0.01g酪蛋白/L乳清。根據(jù)本發(fā)明的如步驟(i)中提供的乳清材料中的至少一種乳清蛋白，如至少2種乳清蛋白，例如至少3種乳清蛋白已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，至少一種蛋白可以選自免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶和糖巨肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一種蛋白可以選自免疫球蛋白G、血清白蛋白和糖巨肽。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于乳清材料中的蛋白總量，乳清材料包含按干物質(zhì)計(jì)小于30％(w/w)的選自免疫球蛋白G、血清白蛋白和糖巨肽中的至少一種蛋白，更優(yōu)選地，小于20％，甚至更優(yōu)選地，小于15％，甚至更優(yōu)選地，小于10％，甚至更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。在優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(i)中提供的乳清材料可以耗盡或基本耗盡免疫球蛋白G。優(yōu)選地，相對(duì)于乳清材料中的蛋白總量，乳清材料可以包含按干物質(zhì)計(jì)小于8％(w/w)的免疫球蛋白G，更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(i)中提供的乳清材料可以耗盡或基本耗盡血清白蛋白。優(yōu)選地，相對(duì)于乳清材料中的蛋白總量，乳清材料可以包含按干物質(zhì)計(jì)小于5％(w/w)的血清白蛋白，更優(yōu)選地，小于4％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。如果通過(guò)沉淀或使用凝乳酶凝結(jié)去除酪蛋白，則可以產(chǎn)生糖巨肽(GMP)，其將保持在乳清中(作為“乳清蛋白”)，并且提供甜乳清。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)乳清材料由甜乳清提供時(shí)，糖巨肽(GMP)的耗盡或基本耗盡才會(huì)應(yīng)用。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(i)中提供的乳清材料中的糖巨肽已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。優(yōu)選地，相對(duì)于乳清材料中的蛋白總量，乳清材料可以包含按干物質(zhì)計(jì)小于20％(w/w)的糖巨肽，更優(yōu)選地,小于15％，甚至更優(yōu)選地，小于10％，甚至更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法可以為分批法或連續(xù)法。中型規(guī)模生產(chǎn)和/或工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)可以以分批法進(jìn)行。優(yōu)選地，此類分批法涉及處理至少50升乳清/周期，如至少100升乳清/周期，例如250升乳清/周期，如至少500升乳清/周期，例如750升乳清/周期，如至少1,000升乳清/周期，例如2,500升乳清/周期，如至少5,000升乳清/周期，例如7,500升乳清/周期，如至少10,000升乳清/周期，例如25,000升乳清/周期，如至少50,000升乳清/周期，例如75,000升乳清/周期，如至少100,000升乳清/周期，例如250,000升乳清/周期。可選地，大規(guī)模生產(chǎn)(工業(yè)規(guī)模生產(chǎn))可以以連續(xù)法進(jìn)行。在選擇性分離，如選擇性吸附中，該過(guò)程最后需要吸附的蛋白，例如β-乳球蛋白的洗脫。通過(guò)提供至少兩個(gè)色譜支持物并且將它們平行放置，在乳清材料的流動(dòng)可以從一個(gè)色譜支持物(當(dāng)該色譜材料被裝載并且準(zhǔn)備好洗脫時(shí))移動(dòng)至另一個(gè)色譜支持物的情況下，可以提供此類連續(xù)的選擇性吸附過(guò)程?？蛇x地，可以使用移動(dòng)床色譜、模擬移動(dòng)床色譜等。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，連續(xù)的選擇性吸附過(guò)程可以具有至少5,000升乳清材料/小時(shí)、如至少10,000升乳清材料/小時(shí)、例如至少12,000升乳清/小時(shí)，如至少15,000升乳清材料/小時(shí)、例如至少18,000升乳清/小時(shí)，如至少20,000升乳清材料/小時(shí)、例如至少25,000升乳清/小時(shí)，如至少50,000升乳清材料/小時(shí)、例如至少100,000升乳清/小時(shí)的容量。為了實(shí)現(xiàn)β-乳球蛋白的期望分離，可以提供有利的過(guò)程條件。因此，乳清材料可以在20℃具有至少3.0mS/cm、如至少3.5mS/cm、例如至少4.0mS/cm、如至少4.5mS/cm、例如至少5mS/cm、如至少5.5mS/cm、例如至少6、如至少7mS/cm、例如至少7.5mS/cm、如在4.5-15mS/cm范圍內(nèi)、如在5.0-14mS/cm范圍內(nèi)、例如在5.5-13mS/cm范圍內(nèi)、如在6.0-12.5mS/cm范圍內(nèi)、例如在6.5-12mS/cm范圍內(nèi)、如在7.0-11.5mS/cm范圍內(nèi)、例如在7.5-11mS/cm范圍內(nèi)、如在8.0-10.5mS/cm范圍內(nèi)、例如約9.0mS/cm的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，不調(diào)節(jié)乳清材料的電導(dǎo)率。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，乳清材料可以在20℃具有小于7mS/cm、如小于5、例如小于3的電導(dǎo)率，以及可以具有在4.6-6.5范圍內(nèi)的pH-值，如在4.7-6.4范圍內(nèi)的pH-值，例如在4.8-6.3范圍內(nèi)的pH-值，如在4.9-6.2范圍內(nèi)的pH-值，例如在4.9-6.1范圍內(nèi)的pH-值，如在5.0-6.0范圍內(nèi)的pH-值，例如在5.2-5.8范圍內(nèi)的pH-值。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，乳清材料可以包含礦物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，乳清材料未進(jìn)行礦物質(zhì)的去除。具體地，乳清材料未進(jìn)行鈣的去除。優(yōu)選地，礦物質(zhì)選自鈣、磷、碘、鎂、鋅和鉀。優(yōu)選地，乳清材料中存在的礦物質(zhì)為乳清材料中天然存在的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“天然存在的”涉及這樣的礦物質(zhì)，其存在于乳清材料中，并且不是單獨(dú)添加的化合物，但可見(jiàn)于步驟(i)中提供的乳清材料中。pH調(diào)節(jié)根據(jù)提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的乳清材料的類型，乳清材料可以進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以調(diào)節(jié)乳清材料的pH以便促進(jìn)β-乳球蛋白至色譜支持物的最佳吸附。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟(ii)中，將乳清材料的pH調(diào)節(jié)至pH大于4.5、如pH大于4.6、例如pH大于4.7、如pH大于4.8、例如pH大于4.9、如pH大于5.0、例如pH大于5.1、如pH大于5.2、例如pH大于5.3、如pH大于5.4、例如pH大于5.5、如在pH4.5-6.5范圍內(nèi)，如在pH4.5-6.0范圍內(nèi)、例如在pH4.6-5.5范圍內(nèi)，如在pH4.7-5.0范圍內(nèi)。如果乳清材料的pH變得太低，低于4.0，則蛋白或部分蛋白可能變性以及天然功能可能喪失的風(fēng)險(xiǎn)增加。調(diào)節(jié)pH優(yōu)選通過(guò)添加酸并降低pH進(jìn)行。優(yōu)選地，可以使用低成本的礦物酸，如鹽酸、磷酸、硫酸。然而，食品級(jí)有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸和乳酸也可以為特別優(yōu)選的?？蛇x地，可以經(jīng)由使乳清材料通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑(酸性形式)來(lái)調(diào)節(jié)乳清材料的pH值。陽(yáng)離子交換劑結(jié)合來(lái)自乳清材料的鹽并釋放H+-離子，從而將pH降低至預(yù)期值。適合于降低pH值的陽(yáng)離子交換劑和過(guò)程為技術(shù)人員眾所周知的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將乳清材料以1-50cm/min范圍內(nèi)；優(yōu)選5-30cm/min范圍內(nèi)；更優(yōu)選10-25cm/min范圍內(nèi)；甚至更優(yōu)選地，15-20cm/min范圍內(nèi)的流速裝載至色譜支持物。色譜支持物如以上所述，本發(fā)明教導(dǎo)色譜支持物的用途，其允許β-乳球蛋白被保留(步驟(v))。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“色譜支持物”涉及包含吸附劑的任何種類的容器，其可以被提供有用于乳清材料應(yīng)用的至少一個(gè)入口以及當(dāng)經(jīng)歷洗脫緩沖液時(shí)用于獲得α-乳白蛋白級(jí)分和/或β-乳球蛋白級(jí)分的至少一個(gè)出口。待使用的色譜支持物可以為膜色譜支持物，優(yōu)選帶電的膜色譜支持物或柱色譜支持物。優(yōu)選地，柱色譜支持物包括填充床色譜、攪拌罐吸附、移動(dòng)床色譜、模擬移動(dòng)床色譜、流化床色譜和/或膨脹床色譜。膨脹床色譜(EBA)技術(shù)通?？梢耘c非澄清的原材料一起有效地起作用的事實(shí)使其成為實(shí)施生物分子物質(zhì)，如來(lái)自乳清材料的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離和分級(jí)的吸引人的解決方案。與基于填充床色譜的過(guò)程相比，膨脹床色譜可以提供包含較少步驟，以及因此導(dǎo)致增加的收率和改善的過(guò)程經(jīng)濟(jì)性的穩(wěn)健過(guò)程。由于實(shí)行EBA過(guò)程期間吸附床的膨脹，EBA柱可以被進(jìn)一步按比例放大至工業(yè)規(guī)模，而沒(méi)有關(guān)于由于系統(tǒng)堵塞而引起的增加的背壓或過(guò)程故障(當(dāng)使用填充床柱時(shí)，其常常為一種問(wèn)題)的任何顯著的注意事項(xiàng)。所以，根據(jù)本發(fā)明，膨脹床色譜可以為優(yōu)選的柱色譜支持物。通常，膨脹床吸附為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以將本發(fā)明中所述的方法修改成WO92/00799、WO92/18237、WO97/17132、WO00/57982或WO98/33572中所述的方法。吸附劑在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，色譜支持物可以包含吸附劑。該吸附劑可以被用于選自以下的技術(shù)：離子交換吸附、疏水性相互作用吸附、親和吸附、混合模式配體吸附、金屬螯合吸附、反相吸附以及它們的任何組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，吸附劑可以被用于離子交換吸附，優(yōu)選地，用于陽(yáng)離子交換吸附中。在乳清材料可以與吸附劑接觸之前，本發(fā)明方法中的最初但任選步驟可以涉及吸附劑的平衡。可以通過(guò)使用平衡液來(lái)進(jìn)行此類平衡。在優(yōu)選實(shí)施方案中，平衡液可以被用于陽(yáng)離子交換吸附，并且可以為pH大于4.5、如pH大于4.6、例如pH大于4.7、如pH大于4.8、例如pH大于4.9、如pH大于5.0、例如pH大于5.1、如pH大于5.2、例如pH大于5.3、如pH大于5.4、例如pH大于5.5、如在pH4.5-6.5范圍內(nèi)、如在pH4.5-6.0范圍內(nèi)、例如在pH4.6-5.5范圍內(nèi)、如在pH4.7-5.0范圍內(nèi)的含水液體。吸附劑的平衡可以優(yōu)選地通過(guò)使用酸進(jìn)行。優(yōu)選地，陽(yáng)離子交換吸附中使用的平衡液可以包含低成本的礦物酸，如鹽酸、磷酸、硫酸。然而，食品級(jí)有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸和乳酸也可以是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，吸附劑可以被用于離子交換吸附，優(yōu)選地，用于離子交換吸附。在優(yōu)選實(shí)施方案中，平衡液可以被用于離子交換吸附，并且可以為pH大于6.5、如pH大于7.0、例如pH大于7.5、如pH大于8.0、例如pH大于8.5、如pH大于9.0、如在pH7.0-9.0范圍內(nèi)的含水液體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以用于離子交換吸附的平衡液可以包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨、磷酸鉀、磷酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉或它們的任何組合。優(yōu)選地，包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨或它們的任何組合的洗脫緩沖液為優(yōu)選的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“吸附劑”涉及色譜支持物中存在的整個(gè)床，并且負(fù)責(zé)保留β-乳球蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，吸附劑可以包含單獨(dú)的顆粒。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“吸附劑顆?！迸c術(shù)語(yǔ)“顆?！笨山粨Q地使用，并且涉及構(gòu)成吸附劑的單獨(dú)的單一顆粒。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，吸附劑可以包含裝載能夠結(jié)合β-乳球蛋白級(jí)分的帶負(fù)電荷的配體的膜。如果吸附劑被用于膨脹床吸附，則數(shù)種特征，如流速、顆粒大小和顆粒密度均對(duì)流化床的膨脹和蛋白的分離具有影響。以使吸附劑顆粒保持在柱內(nèi)，但同時(shí)優(yōu)化流速的方式控制膨脹度是重要的。膨脹度可以被確定為H/H0，其中“H0”為填充床模式中床的高度，以及“H”為膨脹模式中床的高度。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，膨脹度H/H0在1.0-10范圍內(nèi)，例如1.0-6、如1.2-5、例如1.3-5、如1.5-4、例如4-6、如3-5、例如3-4、如4-6。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，膨脹度H/H0為至少1.0、如至少1.5、例如至少2、如至少2.5、例如至少3、如至少3.5、例如至少4、如至少4.5、例如至少5、如至少5.5、例如至少6、如至少10。此外，關(guān)于典型的EBA柱內(nèi)部可能的吸附床的最大膨脹度(例如H/H0max3-5)，發(fā)現(xiàn)EBA吸附劑顆粒的密度對(duì)于可應(yīng)用的流速是高度重要的，并且必須為至少1.3g/ml、更優(yōu)選地至少1.5g/ml、更優(yōu)選地至少1.8g/ml、甚至更優(yōu)選地至少2.0g/ml、最優(yōu)選地至少2.3g/ml，以便使方法的高生產(chǎn)率成為可能。EBA吸附劑顆粒的密度意指吸附劑顆粒在其完全溶劑化(例如水合)狀態(tài)的密度，與干燥的吸附劑顆粒的密度相對(duì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，吸附劑顆粒具有至多250μm、如至多200μm、例如至多180μm、特別地如至多160μm、例如至多150μm、如至多140μm、例如至多130μm、如至多120μm、例如至多110μm、如至多100μm的平均顆粒大小。甚至更通常地，吸附劑顆粒具有在90-250μm范圍內(nèi)，例如100-200μm、如120-180μm、例如140-160μm的平均顆粒大小。應(yīng)理解，本發(fā)明也覆蓋小于100μm，如小于90μm、例如小于80μm、如小于70μm、例如小于60μm、如小于50μm、例如小于40μm、如小于30μm、例如小于20μm、如小于10μm的平均顆粒大小。然而，與使用平均顆粒大小為或大于100μm的吸附劑顆粒相比，使用平均顆粒大小小于100μm的吸附劑顆粒導(dǎo)致較低的生產(chǎn)率。在很大程度上，可以通過(guò)包含某一比例的致密無(wú)孔芯材(優(yōu)選具有至少4.0g/ml、如至少10g/ml、例如至少16g/ml、如至少25g/ml的密度)來(lái)實(shí)現(xiàn)吸附劑顆粒的高密度。通常，無(wú)孔芯材具有在約4.0-25g/ml范圍內(nèi)的密度，如約4.0-20g/ml、例如約4.0-16g/ml、如12-19g/ml、例如14-18g/ml、如約6.0-15.0g/ml、例如約6.0-16g/ml。根據(jù)本發(fā)明，使用的吸附劑顆粒對(duì)乳清材料中存在的蛋白可以是至少部分可透過(guò)的，以便確保重要的結(jié)合能力，這與僅可以在其表面結(jié)合靶分子，導(dǎo)致相對(duì)低的結(jié)合能力的不可滲透的顆粒相反。吸附劑顆粒可以為不同結(jié)構(gòu)、組成和形狀的陣列。吸附劑顆?？梢杂稍S多化學(xué)衍生的具有必需密度和結(jié)合能力的多孔材料構(gòu)成以在給定流速下自身操作。顆?？梢詾槿鏦O92/00799中所述的具有被多孔聚合物基體基質(zhì)包圍的至少兩個(gè)無(wú)孔芯的聚集物類型，或具有被多孔聚合物基體基質(zhì)包圍的單個(gè)無(wú)孔芯的薄膜類型。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“聚集物類型”涉及微粒材料的顆粒，其包含具有通過(guò)多孔聚合物基體基質(zhì)保持在一起的不同類型和大小的芯材的高密度無(wú)孔芯珠，例如由通過(guò)周?chē)沫傊?多孔聚合物基體基質(zhì))保持在一起的兩個(gè)或更多個(gè)高密度顆粒組成的芯顆粒。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“薄膜類型”涉及顆粒的復(fù)合物，其中各個(gè)顆粒僅由涂覆有一層多孔聚合物基體基質(zhì)的一個(gè)高密度芯材，例如涂覆有瓊脂糖的高密度不銹鋼珠組成。因此，術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)高密度無(wú)孔芯”涉及包含單個(gè)高密度無(wú)孔顆粒的薄膜芯，或者其涉及包含多于一個(gè)高密度無(wú)孔顆粒的聚集物芯。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“芯”涉及吸附劑內(nèi)部存在的芯顆粒。芯顆?？梢愿綆У胤植荚诙嗫拙酆衔锘w基質(zhì)內(nèi)且不限于位于吸附劑的中心。無(wú)孔芯通常構(gòu)成吸附劑的總體積的至多50％、如至多40％、例如至多30％、如至多25％、例如至多20％、如至多10％、例如至多5％。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解各種無(wú)孔芯材和各種多孔聚合物基體基質(zhì)。無(wú)孔芯材和多孔聚合物基體基質(zhì)的實(shí)例可以見(jiàn)于WO2010/037736。技術(shù)人員也了解根據(jù)本發(fā)明制備吸附劑的方法，此類制備吸附劑的方法可以描述在WO2010/03776、EP0538350或WO97/17132中。在操作期間，乳清材料可以與吸附劑接觸，以及β-乳球蛋白可以被吸附或固定至吸附劑，然而α-乳白蛋白級(jí)分不結(jié)合色譜支持物，并且流過(guò)吸附劑。該吸附可以在壓力下進(jìn)行。在任選洗滌期間，從柱中任選去除微粒材料和可溶性雜質(zhì)。當(dāng)使乳清材料與吸附劑接觸時(shí)，可以優(yōu)化吸附劑與乳清材料之間的比率以便提供吸附劑的高容量，以及獲得分離的α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的高純度、高收率和/或高回收率。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，β-乳球蛋白相對(duì)于吸附劑的裝載比為至少2mg裝載的β-乳球蛋白/ml吸附劑，如至少5mg、例如至少10mg、如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少40mg、例如至少50mg、如至少75mg、例如至少100mg、如至少125mg、例如至少150mg。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，乳清相對(duì)于吸附劑的裝載比為至少10mg裝載的蛋白/ml吸附劑，如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少50mg、例如至少75mg、如至少100mg、例如至少150mg、如至少175mg、例如至少200mg。配體為了使吸附劑在β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的選擇性吸附中起作用，吸附劑可以包含配體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，吸附劑可以包含對(duì)β-乳球蛋白具有親和力的一種或多種配體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“配體”涉及共價(jià)連接吸附劑且具有吸附β-乳球蛋白的功能的化合物。配體可以為低分子量化合物，以及在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體的分子量可以為至多500道爾頓、如至多250道爾頓、例如至多100道爾頓、例如至多50道爾頓。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，配體可以在pH6.5或以下、如pH6.0或以下、例如pH5.5或以下是帶負(fù)電荷的。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，帶負(fù)電荷的配體選自諸如丙烷磺酸或丁烷磺酸的磺酸配體和/或諸如氯乙酸的羧酸配體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體可以在pH大于6.5、如pH大于7.0、例如pH大于7.5、如pH大于8.0、例如pH大于8.5、如pH大于9.0、如pH7.0-9.0范圍內(nèi)是帶正電荷的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，帶正電荷的配體選自諸如季銨陰離子的Q-陰離子交換配體、或諸如二乙氨乙基的DEAE-陰離子交換配體。為了改善容量、純度和回收率，配體濃度也是重要的。所以，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，配體濃度在30-300微摩爾/ml沉降的吸附劑范圍內(nèi)，例如50-200微摩爾/ml沉降的吸附劑、如75-175微摩爾/ml沉降的吸附劑、例如100-160微摩爾/ml沉降的吸附劑、如120-145微摩爾/沉降的吸附劑。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“沉降的吸附劑”或“吸附劑顆?！币庵冈谄渫耆軇┗?例如水合)狀態(tài)的吸附劑，與干燥的吸附劑的密度相對(duì)。洗滌在乳清材料已經(jīng)與色譜支持物接觸，以及β-乳球蛋白級(jí)分已經(jīng)被允許結(jié)合吸附劑之后，根據(jù)本發(fā)明的方法還可以涉及使用洗滌緩沖液的任選洗滌步驟。所以，提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：(iv)任選地洗滌色譜支持物。洗滌色譜支持物的步驟可以通過(guò)使用洗滌緩沖液進(jìn)行，由此可以獲得洗滌級(jí)分。一旦乳清材料已經(jīng)與色譜支持物接觸，可以使用具有如先前針對(duì)β-乳球蛋白級(jí)分與陽(yáng)離子交換吸附或陰離子交換吸附的最佳吸附所概述的pH值的洗滌緩沖液洗滌色譜支持物。優(yōu)選地，洗滌緩沖液的pH值為6.5或以下、如pH6.0或以下、例如pH5.5或以下、如pH5.0或以下、例如pH4.7或以下、如pH4.6或以下。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可應(yīng)用于調(diào)節(jié)洗滌緩沖液的pH值的酸可以選自先前針對(duì)調(diào)節(jié)乳清材料的pH值所概述的酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于洗滌步驟的流速可以選自先前用于將乳清材料裝載至色譜支持物所概述的范圍。α-乳白蛋白級(jí)分本發(fā)明的發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)以下方法：其中乳清材料與色譜支持物接觸，允許β-乳球蛋白被色譜支持物保留，以及其中包含α-乳白蛋白的透過(guò)物級(jí)分獲得自色譜支持物。以這種方式，β-乳球蛋白級(jí)分和α-乳白蛋白級(jí)分可以通過(guò)簡(jiǎn)單、廉價(jià)和容易的方式以高收率、高回收率和/或高純度提供。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“透過(guò)物”涉及當(dāng)乳清材料與色譜支持物接觸，并且保留β-乳球蛋白時(shí)流過(guò)色譜支持物的級(jí)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，除α-乳白蛋白之外，獲得的包含α-乳白蛋白級(jí)分的流過(guò)級(jí)分還可以包含一種或多種選自以下的組分：碳水化合物、脂肪、鹽、肽和乳清材料中存在的痕量的其他蛋白。如果乳清材料為甜乳清材料，則α-乳白蛋白級(jí)分可以包含糖巨肽(GMP)，除非乳清材料(甜乳清)中的GMP已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。如果色譜支持物超載，則一些β-乳球蛋白級(jí)分也可以存在于流過(guò)級(jí)分中，并且“污染”α-乳白蛋白級(jí)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟(iv)中獲得的α-乳白蛋白級(jí)分在20℃具有至少3.0mS/cm、如至少3.5mS/cm、例如至少4.0mS/cm、如至少4.5mS/cm、例如至少5mS/cm、如至少5.5mS/cm、例如至少6、如至少7mS/cm、例如至少7.5mS/cm、如在4.5-15mS/cm范圍內(nèi)、如在5.0-14mS/cm范圍內(nèi)、例如在5.5-13mS/cm范圍內(nèi)、如在6.0-12.5mS/cm范圍內(nèi)、例如在6.5-12mS/cm范圍內(nèi)、如在7.0-11.5mS/cm范圍內(nèi)、例如在7.5-11mS/cm范圍內(nèi)、如在8.0-10.5mS/cm范圍內(nèi)、例如約9.0mS/cm的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，在獲得自步驟(iv)的α-乳白蛋白級(jí)分上直接測(cè)定電導(dǎo)率。期望獲得具有高純度的α-乳白蛋白的α-乳白蛋白級(jí)分。所以，相對(duì)于所述α-乳白蛋白級(jí)分中的蛋白總量，α-乳白蛋白級(jí)分中α-乳白蛋白的量可以為至少25％、如至少30％、例如40％、如至少50％、例如60％、如至少70％、例如至少80％。如先前所提及的，根據(jù)本發(fā)明，α-乳白蛋白級(jí)分不被色譜支持物保留，但流過(guò)色譜支持物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分和流過(guò)級(jí)分是相同的。如果洗滌緩沖液被用于去除未吸附的組分以獲得洗滌級(jí)分，則此類洗滌級(jí)分可以與α-乳白蛋白級(jí)分/流過(guò)級(jí)分混合以便改善來(lái)自乳清材料的α-乳白蛋白的回收率。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分具有基本上類似于裝載至色譜支持物的乳清材料的pH值的pH值。優(yōu)選地，α-乳白蛋白級(jí)分包含在4.5-6.5范圍內(nèi)，如4.6-6.0、例如4.7-5.5、如4.8-5.2、例如4.9-5.1的pH值。由于α-乳白蛋白級(jí)分可類似于如上文所提及的流過(guò)級(jí)分，α-乳白蛋白級(jí)分中其他組分的存在可能取決于與色譜材料接觸的乳清材料的類型。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分還包含乳糖、維生素和/或礦物質(zhì)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分還包含礦物質(zhì)。優(yōu)選地，礦物質(zhì)可以選自鈣、磷、碘、鎂、鋅和鉀。甚至更優(yōu)選地，礦物質(zhì)可以為鈣和選自磷、碘、鎂、鋅和鉀的第二礦物質(zhì)。α-乳白蛋白級(jí)分中的礦物質(zhì)可以為來(lái)自乳清材料的礦物質(zhì)。優(yōu)選地，α-乳白蛋白級(jí)分中100％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料，例如α-乳白蛋白級(jí)分中至少98％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料，如α-乳白蛋白級(jí)分中至少95％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料，例如α-乳白蛋白級(jí)分中至少92％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料，如α-乳白蛋白級(jí)分中至少90％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料，例如α-乳白蛋白級(jí)分中至少75％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料，如α-乳白蛋白級(jí)分中至少50％的礦物質(zhì)來(lái)自乳清材料。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于乳清材料中礦物質(zhì)的總量，乳清材料中存在的至少20％(w/w)的礦物質(zhì)，如至少30％、例如至少40％、如至少50％例如至少70％、如至少80％、例如至少90％、如至少95％、例如至少98％、如至少99％、例如至少99.5％、如至少99.9％(w/w)的礦物質(zhì)存在于α-乳白蛋白級(jí)分中。由于β-乳球蛋白的致敏效果，由于α-乳白蛋白的各種用途例如食物成分和嬰兒配方，在工業(yè)中對(duì)限制α-乳白蛋白級(jí)分中β-乳球蛋白的量存在興趣。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，相對(duì)于α-乳白蛋白級(jí)分中的蛋白總量，α-乳白蛋白級(jí)分包含小于20％的非-α-乳白蛋白的蛋白，更優(yōu)選地，小于10％，甚至更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，非-α-乳白蛋白的蛋白包含一種或多種選自以下的蛋白：β-乳球蛋白、免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶和GMP。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，相對(duì)于α-乳白蛋白級(jí)分中的蛋白總量，α-乳白蛋白級(jí)分包含小于20％的β-乳球蛋白，更優(yōu)選地，小于10％，甚至更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。乳清材料可以包含一種或多種其他蛋白，如免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶和/或糖巨肽(GMP)，以及與色譜支持物接觸的乳清材料的類型可以影響α-乳白蛋白級(jí)分的組成。優(yōu)選地，僅一小部分的免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶可以見(jiàn)于α-乳白蛋白級(jí)分中。優(yōu)選地，非顯著量的免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶可以見(jiàn)于α-乳白蛋白級(jí)分中。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于α-乳白蛋白級(jí)分中的蛋白總量，α-乳白蛋白級(jí)分包含小于5％的免疫球蛋白G，更優(yōu)選地，小于4％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于α-乳白蛋白級(jí)分中的蛋白總量，α-乳白蛋白級(jí)分包含小于15％的糖巨肽，如小于10％、例如小于5％、如小于2％、例如小于1％、如小于0.5％、例如小于0.1％、如小于0.05％。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以提供過(guò)程條件，其中與免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶相反，糖巨肽(GMP)可能不被色譜支持物保留，但可以跟隨流過(guò)級(jí)分進(jìn)入α-乳白蛋白級(jí)分。在此類實(shí)施方案中，相對(duì)于α-乳白蛋白級(jí)分中的蛋白總量，α-乳白蛋白級(jí)分可以包含至少5％的糖巨肽，如至少7％、例如至少10％、如至少15％、例如至少20％、如至少25％、例如至少30％、如至少40％。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，獲得的α-乳白蛋白級(jí)分可以經(jīng)歷第一濃縮步驟。此類第一濃縮步驟可以包括超濾、納濾、微濾、離心或它們的任何組合。第一濃縮步驟可以導(dǎo)致包含α-乳白蛋白級(jí)分的第一濃縮的保留物級(jí)分以及包含水、乳糖和礦物質(zhì)的第一濃縮的透過(guò)物級(jí)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第一濃縮的透過(guò)物級(jí)分可以經(jīng)歷納濾和/或微濾，提供水透過(guò)物以及包含乳糖和礦物質(zhì)的乳糖-保留物，所述水透過(guò)物可以優(yōu)選地在本發(fā)明的方法中重復(fù)使用。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分是液體、濃縮液或粉末。β-乳球蛋白的洗脫為了從色譜支持物獲得包含β-乳球蛋白級(jí)分的保留物級(jí)分，可以使色譜支持物經(jīng)歷洗脫緩沖液。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“洗脫緩沖液”涉及能夠改變?chǔ)?乳球蛋白的特異性吸附至β-乳球蛋白級(jí)分的釋放和洗脫的色譜支持物的條件的組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于提供β-乳球蛋白級(jí)分的洗脫緩沖液的量相當(dāng)于色譜支持物的體積的至多5倍、如色譜支持物的體積的至多4倍、例如色譜支持物的體積的至多3倍、如色譜支持物的體積的至多2倍、例如色譜支持物的體積的至多1倍。與工業(yè)和現(xiàn)有技術(shù)中的期望相反，本發(fā)明的發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)：通過(guò)提供如本發(fā)明中所述的選擇性吸附的方法，制備或分離特異性乳清蛋白級(jí)分的成本顯著低于使用傳統(tǒng)上使用的特異性洗脫分離的乳清蛋白級(jí)分，同時(shí)可以獲得較高收率和較高純度。如果假定3個(gè)柱體積對(duì)于提供來(lái)自色譜支持物的期望乳清蛋白級(jí)分(例如α-乳白蛋白級(jí)分或β-乳球蛋白級(jí)分)的足夠的洗脫是必需的。通過(guò)使用選擇性洗脫分級(jí)乳清材料，1個(gè)柱體積的吸附劑可以被用于捕獲1kgα-乳白蛋白和1kgβ-乳球蛋白。為了獲得蛋白級(jí)分，3個(gè)柱體積被用于洗脫α-乳白蛋白級(jí)分，以及3個(gè)柱體積被用于洗脫β-乳球蛋白級(jí)分，導(dǎo)致總共消耗6個(gè)柱體積的洗脫緩沖液。通過(guò)使用選擇性吸附以分離例如β-乳球蛋白級(jí)分和α-乳白蛋白級(jí)分，可以提供兩種色譜支持物，一種色譜支持物用于每種蛋白級(jí)分。所述兩種色譜支持物各自包含1/2個(gè)柱體積吸附劑，其可以分別被用于捕獲1kgα-乳白蛋白級(jí)分和1kgβ-乳球蛋白級(jí)分。為了獲得蛋白級(jí)分，1.5個(gè)柱體積(3×1/2個(gè)柱體積)被用于洗脫α-乳白蛋白級(jí)分，以及1.5個(gè)柱體積(3×1/2個(gè)柱體積)被用于洗脫β-乳球蛋白級(jí)分，導(dǎo)致總共消耗3個(gè)柱體積的洗脫緩沖液。所以，通過(guò)使用如本發(fā)明中所述的選擇性吸附，將洗脫緩沖液溶液減少50％是可能的。在本發(fā)明中，可以甚至進(jìn)一步減少洗脫緩沖液的消耗，因?yàn)棣?乳白蛋白級(jí)分可以見(jiàn)于從色譜支持物直接獲得的透過(guò)物級(jí)分，因此獲得α-乳白蛋白級(jí)分無(wú)需任何洗脫緩沖液。因此，獲得α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的洗脫緩沖液的消耗可以甚至進(jìn)一步減少，優(yōu)選減少約50％。因此，這可以導(dǎo)致洗脫緩沖液消耗總共減少約75％。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的洗脫緩沖液的量相當(dāng)于色譜支持物的體積的至多5倍、如色譜支持物的體積的至多4倍、例如色譜支持物的體積的至多3倍、如色譜支持物的體積的至多2倍、例如色譜支持物的體積的至多1倍。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“柱體積”和“色譜支持物的體積”可互換使用，并且涉及色譜支持物中存在的吸附劑的體積，所述色譜支持物例如吸附劑能夠分離β-乳球蛋白和α-α-乳白蛋白并且保留β-乳球蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，測(cè)定為干燥的β-乳球蛋白級(jí)分的洗脫緩沖液的消耗/kgβ-乳球蛋白級(jí)分優(yōu)選為小于250L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、如小于200L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、例如小于150L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、如小于100L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、例如小于90L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、如小于80L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、例如小于75L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、如小于70L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分、例如小于60L/kg干燥的β-乳球蛋白級(jí)分。根據(jù)本發(fā)明用于提供兩種級(jí)分，即α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的洗脫緩沖液的消耗的顯著降低是現(xiàn)有技術(shù)中所述的技術(shù)的顯著改善。為了控制洗脫，使用pH的改變、添加鹽或者它們的組合是可能的。在本發(fā)明中，可以通過(guò)改變pH提供β-乳球蛋白級(jí)分?？蛇x地，如果數(shù)種蛋白和β-乳球蛋白一起被吸附至色譜支持物，則可以將選擇性洗脫用于吸附至所述色譜支持物的β-乳球蛋白和剩余蛋白的順序洗脫。優(yōu)選地，可以通過(guò)改變pH洗脫β-乳球蛋白級(jí)分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH可以促進(jìn)吸附至色譜支持物的β-乳球蛋白的最佳解吸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH大于6.5，例如pH為至少7.0、如至少8.0、例如至少9.5、如至少10.5、例如至少11.5、如至少12.0。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH值在7.0-13.0范圍內(nèi)、如在8.0-12.5范圍內(nèi)、例如在9.0-12.0范圍內(nèi)、如在10.0-11.5范圍內(nèi)、例如在10.5-11.0范圍內(nèi)、優(yōu)選在11.5-12.5范圍內(nèi)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨、磷酸鉀、磷酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉或它們的任何組合。優(yōu)選地，包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨或它們的任何組合的洗脫緩沖液為優(yōu)選的。β-乳球蛋白級(jí)分獲得的保留物級(jí)分可以優(yōu)選地包含β-乳球蛋白級(jí)分，并且取決于與色譜材料接觸的乳清材料的類型和/或洗脫緩沖液的組成，β-乳球蛋白級(jí)分可以包含其他組分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟(v)中獲得的β-乳球蛋白級(jí)分在20℃具有低于50mS/cm、如低于40mS/cm、例如低于30mS/cm、如低于25mS/cm、例如低于20mS/cm、如低于15mS/cm、例如低于10mS/cm、如低于8mS/cm、例如低于5mS/cm、如低于3mS/cm、例如低于2mS/cm、如低于1mS/cm、例如低于0.5mS/cm的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，直接在獲得自步驟(v)的β-乳球蛋白級(jí)分上測(cè)定電導(dǎo)率。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，β-乳球蛋白級(jí)分的pH值大于4.5、例如至少5.5、如至少6.5、例如pH為至少7.0、如至少8.0、例如至少9.5、如至少10.5、例如至少11.5、如至少12.0。本發(fā)明的發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)之一為從乳清材料中回收的大量的β-乳球蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，乳清材料中存在的大于80％的β-乳球蛋白在β-乳球蛋白級(jí)分中，例如乳清材料中存在的大于90％的β-乳球蛋白、如至少91％、例如至少92％、如至少93％、例如至少94％、如至少95％、例如至少96％、如至少97％、例如至少98％、如至少99％、例如至少99.5％的β-乳球蛋白在β-乳球蛋白級(jí)分中。β-乳球蛋白級(jí)分的高回收率可以優(yōu)選地獲得自乳清材料與色譜支持物之間的單次接觸。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“單次接觸”涉及使乳清材料與色譜支持物僅接觸一次，并且沒(méi)有使透過(guò)物級(jí)分或保留物級(jí)分再循環(huán)至色譜支持物以改善分離。取決于使用的乳清材料的類型或使用的洗脫緩沖液，例如如果使用選擇性洗脫，則可以進(jìn)一步改善β-乳球蛋白級(jí)分的純度。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于所述β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，β-乳球蛋白級(jí)分中β-乳球蛋白的量為至少75％、如至少80％、例如90％、如至少91％、例如92％、如至少93％、例如至少94％、如至少95％、例如至少96％、如至少97％、例如至少98％、如至少99％、例如至少99.5％。相對(duì)于β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，β-乳球蛋白級(jí)分可以優(yōu)選地包含小于25％(w/w)的非-β-乳球蛋白的蛋白，優(yōu)選地，相對(duì)于β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，β-乳球蛋白級(jí)分可以包含小于15％(w/w)的非-β-乳球蛋白的蛋白，更優(yōu)選地，小于10％，甚至更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。優(yōu)選地，非-β-乳球蛋白的蛋白包含選自α-乳白蛋白、免疫球蛋白G、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶和糖巨肽中的一種或多種蛋白。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，相對(duì)于β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，β-乳球蛋白級(jí)分包含小于15％的α-乳白蛋白，優(yōu)選地，小于10％，更優(yōu)選地，小于8％，甚至更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于1％。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，β-乳球蛋白級(jí)分包含小于10％的免疫球蛋白G，更優(yōu)選地，小于5％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。如果乳清中耗盡或基本耗盡的乳清蛋白不是免疫球蛋白G，則β-乳球蛋白級(jí)分可以包含較高量的免疫球蛋白G，相對(duì)于β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，如小于60％的免疫球蛋白、如小于50％、例如小于40％、例如小于30％、如小于20％、例如小于10％、如小于5％。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，相對(duì)于β-乳球蛋白級(jí)分中的蛋白總量，β-乳球蛋白級(jí)分包含小于5％的糖巨肽，更優(yōu)選地，小于4％，甚至更優(yōu)選地，小于3％，甚至更優(yōu)選地，小于2％，甚至更優(yōu)選地，小于1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.5％，甚至更優(yōu)選地，小于0.1％，甚至更優(yōu)選地，小于0.05％。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，β-乳球蛋白級(jí)分可以包含礦物質(zhì)。優(yōu)選地，礦物質(zhì)可以選自鈣、磷、碘、鎂、鋅和鉀。甚至更優(yōu)選地，礦物質(zhì)可以為鈣以及選自磷、碘、鎂、鋅和鉀的第二礦物質(zhì)。即使β-乳球蛋白級(jí)分可以包含礦物質(zhì)，但礦物質(zhì)的主要部分可以在流過(guò)級(jí)分中，并且終止于α-乳白蛋白級(jí)分中。所以，相對(duì)于乳清材料中礦物質(zhì)的總量，β-乳球蛋白級(jí)分可以包含小于20％的礦物質(zhì)、如小于15％的礦物質(zhì)、例如小于10％的礦物質(zhì)、如小于5％的礦物質(zhì)、例如小于1％的礦物質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以使獲得的β-乳球蛋白級(jí)分經(jīng)歷第二濃縮步驟。此類第二濃縮步驟可以包括超濾、納濾、微濾、離心或它們的任何組合。第二濃縮步驟可以產(chǎn)生包含β-乳球蛋白級(jí)分的第二濃縮的保留物級(jí)分以及主要包含水的第二濃縮的透過(guò)物級(jí)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以將在第二濃縮的透過(guò)物級(jí)分中獲得的水優(yōu)選地再用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，β-乳球蛋白級(jí)分為液體、濃縮物或粉末。其它實(shí)施方案在大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)中，乳清蛋白的變性并不被認(rèn)為是問(wèn)題，并且實(shí)施可損害天然乳清蛋白的功能的過(guò)程條件。本發(fā)明可以從乳清蛋白的非常溫和的處理中受益，并且可優(yōu)選地期望可以保持α-乳白蛋白級(jí)分和/或β-乳球蛋白級(jí)分的天然功能，更優(yōu)選地，可以保持α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的天然功能。不同的條件可以引起乳清蛋白的變性，以及乳清材料中的一些蛋白可能比其他蛋白更敏感?？梢鹱冃缘臈l件的實(shí)例可以為暴露于小于3以及大于12的pH值；高鹽濃度；高溫；和化學(xué)品。因此，為了避免乳清蛋白的變性，優(yōu)選地使牛奶不經(jīng)歷巴氏滅菌。同樣地，優(yōu)選地使乳清材料不經(jīng)歷巴氏滅菌。雖然應(yīng)避免高溫以便不會(huì)使乳清蛋白處于變性的風(fēng)險(xiǎn)，但根據(jù)本發(fā)明的方法可以在高于環(huán)境溫度的溫度有利地進(jìn)行。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，步驟(ii)至(v)中的至少一個(gè)可以在高于25℃、如高于27℃、例如高于30℃、如高于35℃、例如高于40℃、如高于45℃、例如約50℃、如在25-80℃范圍內(nèi)、例如在30-70℃范圍內(nèi)、如在35-65℃范圍內(nèi)、例如在40-60℃范圍內(nèi)、如在45-55℃范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行。如本發(fā)明中所述的從乳清材料獲得的α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的純度、收率和回收率可以由乳清材料通過(guò)色譜支持物的單個(gè)循環(huán)提供。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“單個(gè)循環(huán)”涉及色譜支持物與乳清材料之間僅具有一次接觸。透過(guò)物級(jí)分或保留物級(jí)分并沒(méi)有再循環(huán)至色譜支持物以便提供α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的進(jìn)一步分離。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將根據(jù)本發(fā)明的α-乳白蛋白級(jí)分和/或根據(jù)本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分用作食物產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品、飲料產(chǎn)品、美容產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品或食品補(bǔ)充劑中的成分。可以將本發(fā)明的α-乳白蛋白級(jí)分優(yōu)選地用于嬰兒配方中。可以將本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分用于數(shù)個(gè)應(yīng)用中，特別是數(shù)個(gè)食品應(yīng)用中。優(yōu)選地，可以將本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分用作飲料中的穩(wěn)定劑，其中β-乳球蛋白可以使飲料中的其他蛋白穩(wěn)定，否則，其他蛋白可在酸性環(huán)境中沉淀，導(dǎo)致飲料變得不澄清和無(wú)吸引力的。在另一實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分用作維生素的載體，因?yàn)棣?乳球蛋白包含針對(duì)例如維生素的結(jié)合性能。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分已經(jīng)顯示具有強(qiáng)的發(fā)泡性能，并且可以優(yōu)選地用作例如取代蛋白的發(fā)泡劑。在實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的β-乳球蛋白級(jí)分用作運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)品，優(yōu)選地，呈酒膠糖、凝膠、飲料、粉末、丸劑或糖漿的形式的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)品以改善從劇烈運(yùn)動(dòng)中的恢復(fù)，如肌肉恢復(fù)。應(yīng)注意，在本發(fā)明的方面之一的上下文中所述的實(shí)施方案和特征也適用于本發(fā)明的其他方面。本申請(qǐng)中引用的所有專利和非專利參考據(jù)此通過(guò)引用整體并入。本發(fā)明方法的理論實(shí)例在下述中，描述根據(jù)本發(fā)明的方法的理論實(shí)例。在該理論實(shí)例中，提供用于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離的乳清材料中的多種乳清蛋白中的一種已經(jīng)被耗盡或基本耗盡。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案的下述理論實(shí)例中，從乳清材料中最初去除或基本去除免疫球蛋白G。獲得的所得透過(guò)物(第一透過(guò)物)代表經(jīng)歷α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離的耗盡的或基本耗盡的乳清材料。除非另有規(guī)定，否則在本專利申請(qǐng)中早前描述的定義和實(shí)施方案在此也適用于本發(fā)明的方法的理論實(shí)例中。因此，在本發(fā)明的根據(jù)理論實(shí)例的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由獲得自牛奶的乳清材料提供免疫球蛋白G級(jí)分、α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：(i)提供乳清材料；(ii)使所述乳清材料與第一色譜支持物接觸，允許免疫球蛋白G被所述第一色譜支持物保留；(iii)獲得包含α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的第一透過(guò)物級(jí)分；(iv)從所述第一色譜支持物獲得包含所述免疫球蛋白G級(jí)分的第一保留物級(jí)分；(v)使所述第一透過(guò)物級(jí)分與第二色譜支持物接觸，允許β-乳球蛋白被所述第二色譜支持物保留；(vi)從色譜支持物獲得包含所述α-乳白蛋白級(jí)分的第二透過(guò)物級(jí)分；以及(vii)從色譜材料獲得包含所述β-乳球蛋白級(jí)分的第二保留物級(jí)分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以通過(guò)免疫球蛋白G級(jí)分與第一色譜支持物的選擇性吸附進(jìn)行免疫球蛋白G級(jí)分與包含α-乳白蛋白級(jí)分和β-乳球蛋白級(jí)分的乳清材料的分級(jí)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以通過(guò)β-乳球蛋白級(jí)分與第二色譜支持物的選擇性吸附進(jìn)行來(lái)自第一透過(guò)物的α-乳白蛋白級(jí)分與β-乳球蛋白級(jí)分的分級(jí)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，選擇性吸附導(dǎo)致免疫球蛋白G級(jí)分與α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離。該分離可以通過(guò)提供第一色譜支持物和/或第一過(guò)程條件進(jìn)行，其有助于免疫球蛋白G的選擇性吸附，并且允許β-乳球蛋白和α-乳白蛋白隨著第一透過(guò)物級(jí)分一起通過(guò)第一色譜支持物，而不會(huì)被吸附。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，選擇性吸附導(dǎo)致α-乳白蛋白級(jí)分與β-乳球蛋白級(jí)分的分離。該分離可以通過(guò)提供第二色譜支持物和/或第二過(guò)程條件進(jìn)行，其有助于β-乳球蛋白的選擇性吸附，并且允許α-乳白蛋白隨著第二透過(guò)物級(jí)分一起通過(guò)第二色譜支持物，而不會(huì)被吸附。先前已經(jīng)提及一些過(guò)程條件。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“乳清材料”涉及來(lái)自牛奶、不含酪蛋白的牛奶部分的血清材料。根據(jù)本發(fā)明的乳清材料可以為乳清、酸性乳清、甜乳清、至少部分分級(jí)的乳清(只要免疫球蛋白G、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白存在于至少部分分級(jí)的乳清中)、分離乳清蛋白(WPI)或濃縮乳清蛋白(WPC)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“至少部分分級(jí)的乳清”涉及至少一種蛋白已經(jīng)被去除或基本去除的乳清。這種類型的乳清的唯一要求是存在免疫球蛋白G、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。如以上所述，本發(fā)明教導(dǎo)使用第一色譜支持物，允許免疫球蛋白G被保留(步驟(iv))，以及使用第二色譜支持物，允許β-乳球蛋白被保留(步驟(vii))。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“第一色譜支持物”涉及提供用于保留免疫球蛋白G的色譜支持物。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“第二色譜支持物”涉及提供用于保留β-乳球蛋白的色譜支持物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一色譜支持物可以包含第一吸附劑?？梢詫⒃摰谝晃絼┯糜谶x自以下的技術(shù)中：離子交換吸附、疏水性相互作用吸附、親和吸附、混合模式配體吸附、金屬螯合吸附、反相吸附以及它們的任何組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一吸附劑被用于混合模式配體吸附中。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第二色譜支持物包含第二吸附劑。可以將該第二吸附劑用于選自以下的技術(shù)中：離子交換吸附、疏水性相互作用吸附、親和吸附、混合模式配體吸附、金屬螯合吸附、反相吸附以及它們的任何組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將吸附劑用于離子交換吸附，優(yōu)選地，用于陽(yáng)離子交換吸附中。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以將第二吸附劑用于離子交換吸附，優(yōu)選地，用于陰離子交換吸附中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，陰離子交換吸附中使用的平衡液可以為pH大于6.5、如pH大于7.0、例如pH大于7.5、如pH大于8.0、例如pH大于8.5、如pH大于9.0、如在pH7.0-9.0范圍內(nèi)的液體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，陰離子交換吸附中使用的平衡液可以包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨、磷酸鉀、磷酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉或它們的任何組合。優(yōu)選地，包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨或它們的任何組合的洗脫緩沖液為優(yōu)選的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，與第二色譜支持物中使用的吸附劑相比，第一色譜支持物中使用的吸附劑具有不同的平均顆粒大小。優(yōu)選地，第一色譜支持物的平均顆粒大小在160-220μm范圍內(nèi)、如在170-200μm范圍內(nèi)、例如在175-190μm范圍內(nèi)、如約180μm。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，第二色譜支持物的平均顆粒大小在120-159μm范圍內(nèi)、如在130-150μm范圍內(nèi)、例如在135-145μm范圍內(nèi)、如約140μm。在操作期間，可以使乳清材料與第一吸附劑接觸，以及免疫球蛋白G可以被吸附或固定至第一吸附劑。該吸附可以在壓力下進(jìn)行。允許β-乳球蛋白和α-乳白蛋白通過(guò)第一色譜支持物，以及第一吸附劑不會(huì)與其結(jié)合，或基本上不會(huì)與其結(jié)合。在任選的洗滌期間，從第一吸附劑任選地去除微粒材料和可溶性雜質(zhì)。當(dāng)乳清材料與第一吸附劑接觸時(shí)，可以優(yōu)化第一吸附劑與乳清材料之間的比率以便提供高容量的第一吸附劑，以及獲得高純度和/或高回收率的免疫球蛋白G級(jí)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，免疫球蛋白G相對(duì)于第一吸附劑的裝載比為至少2mg裝載的免疫球蛋白G/ml第一吸附劑，如至少5mg、例如至少10mg、如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少40mg、例如至少50mg、如至少75mg、例如至少100mg、如至少125mg、例如至少150mg。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，乳清相對(duì)于第一吸附劑的裝載比為至少10mg裝載的蛋白/ml第一吸附劑，如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少50mg、例如至少75mg、如至少100mg、例如至少150mg、如至少175mg、例如至少200mg。當(dāng)將乳清材料裝載至第一色譜支持物時(shí)，提供包含未捕獲的且未結(jié)合的材料的第一透過(guò)物，如β-乳球蛋白和α-乳白蛋白?？梢允沟谝煌高^(guò)物與第二吸附劑接觸，以及β-乳球蛋白可以被吸附或固定至第二吸附劑。該吸附可以在壓力下進(jìn)行。允許α-乳白蛋白通過(guò)第二色譜支持物，以及第二吸附劑不會(huì)與其結(jié)合，或基本上不會(huì)與其結(jié)合。在任選的洗滌期間，從第二吸附劑任選地去除微粒材料和可溶性雜質(zhì)。當(dāng)?shù)谝煌高^(guò)物級(jí)分與第二吸附劑接觸時(shí)，可以優(yōu)化第二吸附劑與第一透過(guò)物級(jí)分之間的比率以便提供高容量的第二吸附劑，以及獲得高純度、高收率和/或高回收率的β-乳球蛋白級(jí)分和α-乳白蛋白級(jí)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，β-乳球蛋白相對(duì)于第二吸附劑的裝載比為至少2mg裝載的β-乳球蛋白/ml第二吸附劑，如至少5mg、例如至少10mg、如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少40mg、例如至少50mg、如至少75mg、例如至少100mg、如至少125mg、例如至少150mg。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，乳清相對(duì)于第二吸附劑的裝載比為至少10mg裝載的蛋白/ml第二吸附劑，如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少50mg、例如至少75mg、如至少100mg、例如至少150mg、如至少175mg、例如至少200mg。為了使吸附劑在免疫球蛋白G與β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的選擇性吸附中起作用，第一吸附劑可以包含第一配體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一吸附劑包含對(duì)免疫球蛋白G具有親和力的一種或多種第一配體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“第一配體”涉及共價(jià)連接第一吸附劑并且具有吸附免疫球蛋白G功能的化合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以將第一吸附劑用于混合模式配體吸附中。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，第一配體包含酸性單環(huán)或雙環(huán)的任選取代的芳族或雜芳族部分。優(yōu)選地，酸性單環(huán)或雙環(huán)的任選取代的芳族或雜芳族部分為苯甲酸或取代的苯甲酸。第一配體可以為低分子量化合物，并且在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體的分子量可以為至多500道爾頓、如至多250道爾頓、例如至多100道爾頓、例如至多50道爾頓。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，取代的苯甲酸選自2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2-巰基苯甲酸、2-巰基煙酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、2-氨基-5-氯苯甲酸、2-氨基-4-氯苯甲酸、4-氨基水楊酸、5-氨基水楊酸、3,4-二氨基苯甲酸、3,5-二氨基苯甲酸、5-氨基間苯二甲酸、4-氨基鄰苯二甲酸，優(yōu)選地，取代的苯甲酸為4-氨基苯甲酸。為了改善容量、純度和回收率，第一配體濃度可能也很重要。所以，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一配體濃度在以下范圍內(nèi)：30-300微摩爾/ml沉降的吸附劑、例如50-200微摩爾/ml沉降的第一吸附劑、如75-175微摩爾/ml沉降的第一吸附劑、例如100-160微摩爾/ml沉降的第一吸附劑、如120-145微摩爾/沉降的第一吸附劑。為了使第二吸附劑在β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的選擇性吸附中起作用，第二吸附劑可以包含第二配體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第二吸附劑包含對(duì)β-乳球蛋白具有親和力的一種或多種第二配體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“第二配體”涉及共價(jià)連接第二吸附劑，并且具有吸附β-乳球蛋白功能的化合物。第二配體可以為低分子量化合物，以及在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體的分子量可以為至多500道爾頓、如至多250道爾頓、例如至多100道爾頓、例如至多50道爾頓。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第二配體可以在pH6.5或以下、如pH6.0或以下、例如pH5.5或以下是帶負(fù)電荷的。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，第二配體可以選自諸如丙烷磺酸或丁烷磺酸的磺酸配體和/或諸如氯乙酸的羧酸配體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第二配體可以在pH大于6.5、如pH大于7.0、例如pH大于7.5、如pH大于8.0、例如pH大于8.5、如pH大于9.0、如pH7.0-9.0范圍內(nèi)是帶正電荷的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第二配體可以選自諸如季銨陰離子的Q-陰離子交換配體、或諸如二乙氨乙基的DEAE-陰離子交換配體。為了改善容量、純度和回收率，第二配體濃度可能也很重要。所以，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第二配體濃度可以在以下范圍內(nèi)：30-300微摩爾/ml沉降的吸附劑、例如50-200微摩爾/ml沉降的第二吸附劑、如75-175微摩爾/ml沉降的第二吸附劑、例如100-160微摩爾/ml沉降的第二吸附劑、如120-145微摩爾/沉降的第二吸附劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第一透過(guò)物級(jí)分可以包含礦物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一透過(guò)物級(jí)分未進(jìn)行礦物質(zhì)的去除。具體地，第一透過(guò)物級(jí)分未進(jìn)行鈣的去除。優(yōu)選地，礦物質(zhì)選自鈣、磷、碘、鎂、鋅和鉀。優(yōu)選地，第一透過(guò)物級(jí)分中存在的礦物質(zhì)天然存在于乳清材料中。優(yōu)選地，可以使第一色譜支持物經(jīng)歷第一洗脫緩沖液來(lái)洗脫免疫球蛋白G級(jí)分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一洗脫緩沖液的pH可以促進(jìn)吸附至第一色譜支持物的免疫球蛋白G的最佳解吸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一洗脫緩沖液的pH大于6.5，例如pH為至少7.0、如至少8.0、例如至少9.5、如至少10.5、例如至少11.5、如至少12.0。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第一洗脫緩沖液的pH值在7.0-13.0范圍內(nèi)、如在8.0-12.5范圍內(nèi)、例如在9.0-12.0范圍內(nèi)、如在10.0-11.5范圍內(nèi)、例如在10.5-11.0范圍內(nèi)、優(yōu)選地在11.5-12.5范圍內(nèi)。優(yōu)選地，用于提供免疫球蛋白G級(jí)分的第一洗脫緩沖液的量相當(dāng)于第一色譜支持物的體積的至多3倍、如第一色譜支持物的體積的至多2倍、例如第一色譜支持物的體積的至多1倍、如第一色譜支持物的體積的至多0.5倍、例如第一色譜支持物的體積的至多0.25倍。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于免疫球蛋白G級(jí)分中蛋白的總量，免疫球蛋白G級(jí)分中免疫球蛋白G的量可以為至少40％、如至少50％、例如60％、如至少70％、例如80％、如至少85％、例如至少87％、如至少89％、例如約90％。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，相對(duì)于免疫球蛋白G級(jí)分中蛋白的總量，免疫球蛋白G級(jí)分包含小于60％的非免疫球蛋白G蛋白，更優(yōu)選地，小于50％，甚至更優(yōu)選地，小于40％，甚至更優(yōu)選地，小于30％，甚至更優(yōu)選地，小于25％，甚至更優(yōu)選地，小于20％，甚至更優(yōu)選地，小于15％，甚至更優(yōu)選地，小于10％。優(yōu)選地，非免疫球蛋白G蛋白包含選自α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶和糖巨肽的一種或多種蛋白。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“第二透過(guò)物級(jí)分”涉及當(dāng)?shù)谝煌高^(guò)物級(jí)分與第二色譜支持物接觸并且保留β-乳球蛋白時(shí)，流過(guò)第二色譜支持物的級(jí)分。由于α-乳白蛋白級(jí)分可能類似于獲得自如以上所提及的第二色譜支持物的流過(guò)級(jí)分，α-乳白蛋白級(jí)分中其他組分的存在可能取決于與色譜材料接觸的乳清材料的類型。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，α-乳白蛋白級(jí)分還包含乳糖、維生素和/或礦物質(zhì)。早前已經(jīng)在本專利申請(qǐng)中描述α-乳球蛋白級(jí)分中乳清蛋白的含量，并且其也適用于本發(fā)明方法的該優(yōu)選實(shí)施方案。為了從第二色譜支持物獲得包含β-乳球蛋白級(jí)分的第二保留物級(jí)分，可以使第二色譜支持物經(jīng)歷第二洗脫緩沖液。術(shù)語(yǔ)“第二洗脫緩沖液”可以涉及這樣的組合物，其能夠?qū)⒌诙V支持物從特異性吸附β-乳球蛋白的狀態(tài)改變至釋放和洗脫β-乳球蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于提供β-乳球蛋白級(jí)分的第二洗脫緩沖液的量可以相當(dāng)于第二色譜支持物的體積的至多5倍、如第二色譜支持物的體積的至多4倍、例如第二色譜支持物的體積的至多3倍、如第二色譜支持物的體積的至多2倍、例如第二色譜支持物的體積的至多1倍。早前已經(jīng)在本專利申請(qǐng)中描述β-乳球蛋白級(jí)分中乳清蛋白的含量，并且其也適用于本發(fā)明方法的該優(yōu)選實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1在pH范圍為pH3.5-6.6的不同pH-值下，在中試規(guī)模中，使用88l乳清材料，使用膨脹床色譜，從酸乳清中分離乳清蛋白以示出不同乳清蛋白的結(jié)合如何隨著pH的變化而變化，以及顯示有利的pH-范圍，在該pH-范圍中使用選擇性吸附分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。β-乳球蛋白被吸附至色譜支持物，允許“純的”α-乳白蛋白流過(guò)色譜支持物而不會(huì)結(jié)合。原材料在本實(shí)施例中使用的乳清材料是從生鮮乳(?？苿?dòng)物)獲得的、未經(jīng)巴氏滅菌的，其是從當(dāng)?shù)剞r(nóng)民獲得的。通過(guò)離心從生鮮乳中去除奶油。用鹽酸將所得脫脂乳的pH調(diào)節(jié)至pH4.5。通過(guò)使乳清材料通過(guò)100μm濾網(wǎng)去除沉淀的酪蛋白級(jí)分，從而保留酪蛋白凝乳。收集上清液(酸乳清材料)，并將其用于實(shí)驗(yàn)中。在吸附之前，分別用1M鹽酸將酸乳清材料的pH調(diào)節(jié)至pH-值低于pH4.5，以及用1MNaOH將酸乳清材料的pH調(diào)節(jié)至pH-值高于pH4.5。下表顯示在各個(gè)pH-值下乳清材料的測(cè)試的不同pH-值和電導(dǎo)率。pH電導(dǎo)率,mS/cm3.510.003.89.784.09.184.29.044.28.404.58.144.67.914.88.585.09.315.29.995.410.756.011.186.611.40吸附劑使用FastLineSP，包含磺基的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑。吸附劑基于5％的瓊脂糖和摻入的10％的碳化鎢顆粒，密度為大約2.9g/ml，以及顆粒大小在40-250μm范圍內(nèi)。吸附劑與表氯醇交聯(lián)，并且與1,4-丁烷磺內(nèi)酯偶聯(lián)。配體濃度：174mmol磺基/L吸附劑。過(guò)程參數(shù)將8.8升吸附劑(FastLineSP)填充在直徑為15cm的色譜柱中。填充模式的床高為50cm。用多達(dá)50升10mM檸檬酸鈉平衡吸附劑以達(dá)到期望pH-參見(jiàn)上表。將88升pH-調(diào)節(jié)的酸乳清材料裝載至色譜柱。流速，重力：15cm/min，導(dǎo)致兩倍的床膨脹(至100cm膨脹床高度)。用50升水洗滌吸附劑。用40升20mMNaOH洗脫蛋白。用1M鹽酸中和洗出液。在室溫(20-25℃)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不同級(jí)分中蛋白的測(cè)定用SDS-PAGE技術(shù)估算洗出液中不同蛋白的收率。根據(jù)下述通用程序進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳：將25μL樣品與25μLtris-甘氨酸樣品緩沖液(LC2676,NovexbyLifeTechnologies,USA)混合。在非還原條件下，將所得溶液在水中煮沸5min。將20μL煮沸的樣品上樣至預(yù)制的SDS-PAGE凝膠夾盒(4-20％tris-甘氨酸梯度凝膠(1mm),(EC6025,NovexbyLifeTechnologies,USA)中。將凝膠在200V，400mA下運(yùn)行1小時(shí)。用考馬斯藍(lán)染色劑對(duì)凝膠進(jìn)行染色過(guò)夜(SimplyBlueTMSafeStain,LC6060)。結(jié)果下表顯示在將乳清材料添加至色譜柱之后從色譜柱獲得的洗出液中α-乳白蛋白的相對(duì)收率。收率顯示為原材料中存在的蛋白與裝載至針對(duì)β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)的柱的蛋白的百分比。用SDS-PAGE技術(shù)估算收率：結(jié)果顯示：在4.5-4.8的pH范圍內(nèi)，α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的分離是最佳的，其中較多部分的β-乳球蛋白結(jié)合陽(yáng)離子交換劑，隨后使用40升20mMNaOH洗脫(導(dǎo)致洗出液中有85->90％的β-乳球蛋白)，并且在流過(guò)物中回收較多部分的α-乳白蛋白(導(dǎo)致洗出液中僅存在<5-20％的α-乳白蛋白)。預(yù)期甚至用包含所有乳清蛋白的乳清材料(未進(jìn)行乳清蛋白的耗盡)進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)與當(dāng)使用耗盡一種或多種乳清蛋白的乳清材料進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似。實(shí)施例2使用選擇性吸附從耗盡免疫球蛋白(IgG)、乳鐵蛋白(LF)和乳過(guò)氧化物酶(LP)的酸乳清材料中分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。β-乳球蛋白被吸附至色譜支持物，允許“純的”α-乳白蛋白流過(guò)色譜支持物而不會(huì)結(jié)合。在pH4.5和pH4.7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原材料乳清材料為從生鮮乳(牛科動(dòng)物)獲得的、未經(jīng)巴氏滅菌的、由當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收集的酸乳清材料。通過(guò)離心從生鮮乳中去除奶油。用鹽酸將所得脫脂乳的pH調(diào)節(jié)至pH4.5。通過(guò)使乳清材料通過(guò)100μm濾網(wǎng)去除沉淀的酪蛋白級(jí)分，從而保留酪蛋白凝乳。通過(guò)色譜吸附基本耗盡上清液(酸乳清材料)中的乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、免疫球蛋白G和白蛋白，并將其用于實(shí)驗(yàn)中。在使酸乳清材料與吸附劑接觸之前，將酸乳清材料分成兩個(gè)級(jí)分，一個(gè)級(jí)分保持酸乳清材料的pH-值(pH4.5)，以及用1MNaOH調(diào)節(jié)另一級(jí)分的pH-值用于提供4.7的pH-值。吸附劑FastLineSP，包含磺基的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑。吸附劑基于5％的瓊脂糖和摻入的10％的碳化鎢顆粒，密度為大約2.9g/ml，顆粒大小在40-250μm范圍內(nèi)。吸附劑與表氯醇交聯(lián)，并且與1,4-丁烷磺內(nèi)酯偶聯(lián)。配體濃度：174mmol磺基/L吸附劑。過(guò)程參數(shù)將8.8升吸附劑(FastLineSP)填充在直徑為15cm的色譜柱中。填充模式的床高為50cm。相對(duì)于進(jìn)行的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，用多達(dá)50升10mM檸檬酸鈉平衡吸附劑以分別達(dá)到pH4.5和pH4.7。將220升pH-調(diào)節(jié)的酸乳清材料裝載至色譜柱。流速，重力：15cm/min，導(dǎo)致兩倍的床膨脹(至100cm膨脹床高度)。用50升水洗滌吸附劑。用40升20mMNaOH洗脫β-乳球蛋白。用1M鹽酸中和洗出液。在室溫(20-25℃)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。級(jí)分中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的測(cè)定進(jìn)行單向放射免疫擴(kuò)散(SRI)以便定量分別在上樣pH4.5和pH4.7下來(lái)自柱的流過(guò)級(jí)分中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的相對(duì)收率百分比，如Scand.J.Immunol.Vol.17,Suppl.10,41-56,1983中所述。利用以下進(jìn)行SRI：UpFrontChromatographyA/S生產(chǎn)的來(lái)自針對(duì)?？苿?dòng)物α-乳白蛋白升高的超免疫兔血清的純化的免疫球蛋白級(jí)分(6.5μl/cm2)，UpFrontChromatographyA/S生產(chǎn)的(15μl/cm2)來(lái)自針對(duì)牛科動(dòng)物β-乳球蛋白升高的超免疫兔血清的純化的免疫球蛋白級(jí)分，利用上樣至柱的濃度為100％、80％、60％、40％和20％的酸乳清溶液完成標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取各個(gè)級(jí)分。結(jié)果下表顯示上樣至柱的原材料的相對(duì)收率百分比：對(duì)于兩個(gè)上樣pH-值，來(lái)自柱的流過(guò)級(jí)分中α-乳白蛋白的量和β-乳球蛋白的量的測(cè)定。對(duì)于兩個(gè)上樣pH-值，獲得自柱的洗出液中α-乳白蛋白的量和β-乳球蛋白的量的測(cè)定。上樣pH％的α-乳白蛋白％的β-乳球蛋白4.513904.7689推斷在上樣pH4.5下，在1:25的裝載比(25L裝載的乳清/L吸附劑)中，從酸乳清材料中去除93％的β-乳球蛋白。在pH4.7下，去除89％的β-乳球蛋白。在兩個(gè)pH-值下，在獲得自吸附劑的流過(guò)級(jí)分中回收主要部分的α-乳白蛋白：在pH4.5和pH4.7下，分別為87％和91％。實(shí)施例3使用選擇性吸從酸乳清流中分離IgG、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。首先，IgG被吸附至第一色譜支持物，以及允許β-乳球蛋白和α-乳白蛋白流過(guò)第一色譜支持物。在第一色譜支持物之后，β-乳球蛋白被吸附至第二色譜支持物，允許“純的”α-乳白蛋白流過(guò)第二色譜支持物而不會(huì)結(jié)合。在pH4.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原材料乳清材料為從生鮮乳(牛科動(dòng)物)獲得的、未經(jīng)巴氏滅菌的、由當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收集的酸乳清材料。通過(guò)離心從生鮮乳中去除奶油。用鹽酸將所得脫脂乳的pH調(diào)節(jié)至pH4.6。通過(guò)使乳清材料通過(guò)100μm濾網(wǎng)去除沉淀的酪蛋白級(jí)分，從而保留酪蛋白凝乳。收集上清液(酸乳清材料)，并將其用于實(shí)驗(yàn)中。吸附劑第一色譜支持物的吸附劑為包含4-氨基苯甲酸的混合模式配體。第二色譜支持物的吸附劑為FastLineSP，包含磺基的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑。兩種吸附劑基于5％瓊脂糖和摻入的10％的碳化鎢顆粒，密度為大約2.9g/ml，顆粒大小在40-250μm范圍內(nèi)?；旌夏Ｊ轿絼┖虵astLineSP吸附劑與表氯醇交聯(lián)，并且分別與4-氨基苯甲酸和1,4-丁烷磺內(nèi)酯偶聯(lián)。配體濃度：分別為40mmol混合模式基團(tuán)/L吸附劑和174mmol磺基/L吸附劑。過(guò)程參數(shù)將13.2升吸附劑(混合模式吸附劑)填充在直徑為15cm的第一色譜柱中。填充模式的床高為75cm。用75升10mM檸檬酸鈉平衡吸附劑以達(dá)到pH4.6。將330升pH-調(diào)節(jié)的酸乳清材料裝載至第一色譜柱。流速，重力：15cm/min，導(dǎo)致兩倍的床膨脹(至150cm膨脹床高度)。用75升水洗滌吸附劑。用60升20mMNaOH洗脫IgG。用1M鹽酸中和洗出液。將13.2升吸附劑(FastLineSP)填充在直徑為15cm的第二色譜柱中。填充模式的床高為75cm。用75升10mM檸檬酸鈉平衡吸附劑以達(dá)到pH4.6。將從第一色譜柱獲得的330升流過(guò)級(jí)分直接裝載至第二色譜柱。流速，重力：15cm/min，導(dǎo)致兩倍的床膨脹(至100cm膨脹床高度)。用75升水洗滌吸附劑。用60升20mMNaOH洗脫β-乳球蛋白。用1M鹽酸中和洗出液。在室溫(20-25℃)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。級(jí)分中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的測(cè)定進(jìn)行單向放射免疫擴(kuò)散(SRI)以便定量獲得自第一色譜材料的洗脫級(jí)分和流過(guò)級(jí)分以及獲得自第二色譜材料的洗脫級(jí)分和流過(guò)級(jí)分中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的相對(duì)收率百分比，如Scand.J.Immunol.Vol.17,Suppl.10,41-56,1983中所述。利用以下進(jìn)行SRI：UpFrontChromatographyA/S生產(chǎn)的來(lái)自針對(duì)?？苿?dòng)物α-乳白蛋白升高的超免疫兔血清的純化的免疫球蛋白級(jí)分(6.5μl/cm2)，UpFrontChromatographyA/S生產(chǎn)的來(lái)自針對(duì)?？苿?dòng)物β-乳球蛋白升高的超免疫兔血清的純化的免疫球蛋白級(jí)分(15μl/cm2)，利用上樣至柱的濃度為100％、80％、60％、40％和20％的酸乳清溶液完成標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取各個(gè)級(jí)分。不同級(jí)分中IgG的測(cè)定用SDS-PAGE技術(shù)估算IgG的收率。根據(jù)下述通用程序進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳：將25μL樣品與25μLtris-甘氨酸樣品緩沖液(LC2676,NovexbyLifeTechnologies,USA)混合。在非還原條件下，將所得溶液在水中煮沸5min。將20μL煮沸的樣品上樣至預(yù)制的SDS-PAGE凝膠夾盒(4-20％tris-甘氨酸梯度凝膠(1mm),(EC6025,NovexbyLifeTechnologies,USA)中。將凝膠在200V，400mA下運(yùn)行1小時(shí)。用考馬斯藍(lán)染色劑對(duì)凝膠進(jìn)行染色過(guò)夜(SimplyBlueTMSafeStain,LC6060)。結(jié)果下表顯示上樣至各柱的原材料的相對(duì)收率百分比：在上樣pH4.6下，來(lái)自第一柱的流過(guò)級(jí)分中IgG、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的量的測(cè)定。上樣pH％的α-乳白蛋白％的β-乳球蛋白％的IgG4.6100995在上樣pH4.6下，來(lái)自第二柱的流過(guò)級(jí)分中IgG、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的量的測(cè)定。上樣pH％的α-乳白蛋白％的β-乳球蛋白％的IgG4.69155利用20mMNaOH洗脫，獲得自第一柱和第二柱的洗出液中IgG、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的量的測(cè)定。洗出液％的α-乳白蛋白％的β-乳球蛋白％的IgG第一柱0195第二柱6920推斷在上樣pH4.6下，在1:25的裝載比(25L裝載的乳清/L吸附劑)中，提供基本上純的IgG級(jí)分(基本上不含α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)、基本上純的α-乳白蛋白級(jí)分(基本上不含IgG和β-乳球蛋白)和基本上純的β-乳球蛋白級(jí)分(基本上不含IgG和α-乳白蛋白)是可能的。結(jié)果顯示所有的α-乳白蛋白和基本上所有的β-乳球蛋白存在于來(lái)自第一柱的流過(guò)級(jí)分中，然而來(lái)自乳清材料的95％的IgG被第一色譜支持物中存在的4-氨基苯甲酸偶聯(lián)的吸附劑保留。隨后，可以從第一色譜支持物將保留的IgG洗脫，產(chǎn)生不含α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的IgG級(jí)分。隨后，將獲得自第一色譜支持物的流過(guò)級(jí)分上樣至第二柱，相對(duì)于最初應(yīng)用至第一色譜支持物的乳清材料中存在的α-乳白蛋白的量，從第二色譜支持物產(chǎn)生包含多于90％的α-乳白蛋白的流過(guò)級(jí)分(α-乳白蛋白級(jí)分)。獲得的α-乳白蛋白級(jí)分基本上不含β-乳球蛋白和IgG，相對(duì)于應(yīng)用至第一色譜支持物的乳清材料中存在的這些化合物的總量，僅少量的這些組分(約5％的β-乳球蛋白和5％的IgG)存在于α-乳白蛋白級(jí)分中。流過(guò)級(jí)分(或乳清材料)中存在的β-乳球蛋白被第二色譜支持物中存在的SP吸附劑保留，并且從第二色譜支持物洗脫，產(chǎn)生β-乳球蛋白級(jí)分。相對(duì)于乳清材料中存在的量，β-乳球蛋白級(jí)分已經(jīng)顯示不包含IgG和基本上不含α-乳白蛋白(僅約6％)。因此，本發(fā)明的方法已經(jīng)顯示在獲得的各個(gè)級(jí)分中高效提供高收率、回收率和純度的IgG、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。參考WO92/00799WO92/18237WO97/17132WO00/57982WO98/33572WO2010/037736EP0538350當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3