本發(fā)明涉及直接從含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶中分離可溶性蛋白的方法。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)使含有聚集的酪蛋白的材料經(jīng)歷能夠特異性結(jié)合可溶性蛋白的色譜支持物分離一種或多種可溶性蛋白。
發(fā)明背景
牛奶是非常復(fù)雜的材料，以及工業(yè)過(guò)程使用牛奶來(lái)產(chǎn)生酪蛋白、乳清、乳糖、煉乳、奶粉和許多其他食品添加劑和工業(yè)產(chǎn)品。牛奶包含諸如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪、糖、鹽和維生素的組分的混合物。特別地，牛奶中的主要作為酪蛋白或乳清蛋白被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)在這些年來(lái)已經(jīng)獲得越來(lái)越多的關(guān)注。該增加的關(guān)注的原因在于牛奶蛋白的多樣性，以及因?yàn)楦鞯鞍拙哂袪I(yíng)養(yǎng)的、生物的、功能的和食品成分的應(yīng)用的獨(dú)特屬性。此外，這些蛋白質(zhì)與例如牛奶中的肽和酶一起構(gòu)成人和動(dòng)物中的主要和重要的健康和營(yíng)養(yǎng)作用。
為獲得蛋白的最大可能潛能以及探索或開發(fā)蛋白，例如牛奶中的蛋白的潛在功能及生物活性特性，通過(guò)避免可能的變性條件(如高鹽條件、高或低pH條件、熱或蛋白酶處理/暴露)的程序來(lái)分離天然蛋白質(zhì)是重要的。
牛奶中的主要蛋白組分是酪蛋白。牛奶中的酪蛋白主要通過(guò)大分子酪蛋白聚集體形成的膠束酪蛋白被發(fā)現(xiàn)。膠束酪蛋白為多孔疏水性結(jié)構(gòu)，它們具有聚集和沉淀的天然趨勢(shì)，然而，在牛奶中，通過(guò)(a)酪蛋白聚集的結(jié)構(gòu)中糖巨肽的存在，以及(b)膠束結(jié)構(gòu)的負(fù)電荷阻止該趨勢(shì)。
可以通過(guò)使用凝乳酶對(duì)膠束結(jié)構(gòu)進(jìn)行酶修飾或通過(guò)酸沉淀來(lái)促進(jìn)酪蛋白聚集和沉淀。酶修飾導(dǎo)致酪蛋白膠束的特異性水解，由此丟失糖巨肽。當(dāng)膠束酪蛋白被切割成膠束實(shí)體聚集體，以及當(dāng)足量的膠束酪蛋白被切割時(shí)，聚集的酪蛋白沉淀，并且與作為固體級(jí)分的乳清蛋白分離。
傳統(tǒng)上，牛奶的處理通常由以下組成：酪蛋白的最初提取，如通過(guò)聚集的膠束酪蛋白的沉淀，例如通過(guò)使用凝乳酶進(jìn)行的酶修飾或通過(guò)酸處理，提供聚集的酪蛋白的沉淀物、凝乳和液體的乳清蛋白溶液。
然而，這種處理面臨一些劣勢(shì)，因?yàn)槊感揎椈蛩崽幚砜梢鹁奂睦业鞍缀?或部分可溶性蛋白被部分地分解，以及蛋白質(zhì)可能喪失一些生物學(xué)活性。此外，沉淀的酪蛋白可能在聚集體中包埋一些可溶性蛋白，從而降低可溶性蛋白的收率或增加聚集的酪蛋白沉淀物中的雜質(zhì)。
因此，解決以上提及的問(wèn)題以及適合于工業(yè)應(yīng)用的用于分級(jí)牛奶和提供可溶性蛋白級(jí)分的改善的方法將是有利的。具體地，直接由含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶提供高收率和/或純度的可溶性蛋白級(jí)分的更有效的、特異性的和/或可靠的方法將是有利的。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供將含有聚集的酪蛋白的材料分級(jí)成各種組分，如蛋白級(jí)分(各種可溶性蛋白級(jí)分和/或不溶性蛋白級(jí)分)、碳水化合物級(jí)分、礦物質(zhì)級(jí)分、脂質(zhì)級(jí)分和/或水級(jí)分的改善的方法。所述方法可以是快速的、劃算的，并產(chǎn)生具有高純度、高回收率和/或高收率的高品質(zhì)級(jí)分。
具體地，本發(fā)明的目標(biāo)是提供解決現(xiàn)有技術(shù)的以上提及的問(wèn)題的分級(jí)含有聚集的酪蛋白的材料的方法。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)涉及從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物接觸，允許在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一種或多種可溶性蛋白被所述色譜支持物保留；
(iii)從所述色譜支持物獲得包含聚集的酪蛋白的透過(guò)物級(jí)分；
(iv)任選地洗滌所述色譜支持物；
(v)使所述色譜支持物經(jīng)歷至少一種洗脫緩沖液，從所述色譜支持物獲得至少一種可溶性蛋白級(jí)分；以及
其中所述色譜支持物包含能夠結(jié)合來(lái)自所述含有聚集的酪蛋白的材料的所述可溶性蛋白的一種或多種混合模式配體。
本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的可溶性蛋白級(jí)分。
本發(fā)明的另一方面提供包含兩種或更多種可溶性蛋白的可溶性蛋白級(jí)分，其中所述兩種或更多種可溶性蛋白的蛋白概況基本上類似于含有聚集的酪蛋白的材料中所述可溶性蛋白的蛋白概況。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“蛋白概況”涉及在含有聚集的酪蛋白的材料或至少一種可溶性蛋白級(jí)分中兩種或更多種可溶性蛋白之間的相對(duì)濃度比率(以重量/重量計(jì))。
本發(fā)明的另一方面涉及包含具有共價(jià)連接的一種或多種混合模式配體的多孔有機(jī)聚合物基體基質(zhì)的色譜支持物在從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分中的用途，所述一種或多種混合模式配體包含疏水性部分和非芳族氮部分。
本發(fā)明的另外方面涉及本發(fā)明的可溶性蛋白級(jí)分作為成分，優(yōu)選地，作為食物產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品、飲食產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)食品產(chǎn)品、治療產(chǎn)品、飲料產(chǎn)品、護(hù)膚品、化妝品、針對(duì)營(yíng)養(yǎng)免疫療法的產(chǎn)品或針對(duì)被動(dòng)免疫的產(chǎn)品中的成分的用途。
本發(fā)明的另一方面是提供這樣的可溶性蛋白級(jí)分，關(guān)于至少免疫球蛋白和α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白，所述可溶性蛋白級(jí)分包含的蛋白概況基本上類似于含有聚集的酪蛋白的材料中的蛋白概況。
本發(fā)明的另一方面涉及包含一種或多種混合模式配體的色譜支持物在至少結(jié)合來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料中的可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一種中的用途。
本發(fā)明的另外方面涉及本發(fā)明的可溶性蛋白級(jí)分作為成分，優(yōu)選地，作為食物產(chǎn)品、飲料產(chǎn)品或化妝品中的成分的用途。
現(xiàn)在將在下述更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示使用混合模式配體直接從含有聚集的酪蛋白的材料，如脫脂乳中分離單個(gè)可溶性蛋白的本發(fā)明方法的效率。色譜支持物可以基本上保留來(lái)自脫脂乳的全部可溶性蛋白，以及隨后可以從色譜支持物洗脫單獨(dú)的可溶性蛋白，提供高純度、高回收率和高收率的單獨(dú)可溶性蛋白級(jí)分。圖1示出通過(guò)本發(fā)明獲得的高純度的β-乳球蛋白級(jí)分。虛線示出從色譜支持物直接獲得的β-乳球蛋白級(jí)分，然而實(shí)線顯示在另外的微濾步驟之后獲得的β-乳球蛋白級(jí)分。
現(xiàn)在將在下述更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
發(fā)明詳述
多年以來(lái)，分級(jí)含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶并提供所述蛋白級(jí)分的應(yīng)用的興趣已經(jīng)增大。傳統(tǒng)上，現(xiàn)有技術(shù)描述例如牛奶的分級(jí)，其從酪蛋白的提取開始的，具體地通過(guò)沉淀聚集的酪蛋白，以便獲得可溶部分與不溶部分的清晰的分離。本發(fā)明的發(fā)明人驚人地發(fā)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模上分級(jí)含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶的方法而無(wú)需聚集的酪蛋白的最初沉淀，該方法是直接從所述含有聚集的酪蛋白的材料提供高收率和/或純度的可溶性蛋白級(jí)分的有效的、特異性的和/或可靠的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物接觸，允許在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一種或多種可溶性蛋白被所述色譜支持物保留；
(iii)從所述色譜支持物獲得包含聚集的酪蛋白的透過(guò)物級(jí)分；
(iv)任選地洗滌所述色譜支持物；
(v)使所述色譜支持物經(jīng)歷至少一種洗脫緩沖液，從所述色譜支持物獲得至少一種可溶性蛋白級(jí)分；以及
其中所述色譜支持物包含能夠結(jié)合來(lái)自所述含有聚集的酪蛋白的材料的所述可溶性蛋白的一種或多種混合模式配體。
本發(fā)明的另外方面涉及從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物接觸，至少允許在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白種的至少一種被所述色譜支持物保留；
(iii)從所述色譜支持物獲得包含聚集的酪蛋白的透過(guò)物級(jí)分；
(iv)任選地洗滌所述色譜支持物；
(v)使所述色譜支持物經(jīng)歷至少一種洗脫緩沖液，從所述色譜支持物獲得至少一種可溶性蛋白級(jí)分；以及
其中所述色譜支持物包含能夠結(jié)合來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料的可溶性蛋白的一種或多種混合模式配體。
本發(fā)明的另外方面涉及從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分的方法，所述方法包括以下步驟：
(i)提供所述含有聚集的酪蛋白的材料；
(ii)使所述含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物接觸，允許在所述含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一種或多種可溶性蛋白被所述色譜支持物保留；
(iii)從所述色譜支持物獲得包含聚集的酪蛋白的透過(guò)物級(jí)分；
(iv)任選地洗滌所述色譜支持物；
(v)使所述色譜支持物經(jīng)歷至少一種洗脫緩沖液，從所述色譜支持物獲得至少一種可溶性蛋白級(jí)分；以及
其中所述色譜支持物包含具有共價(jià)連接的一種或多種混合模式配體的多孔有機(jī)聚合物基體基質(zhì)，所述一種或多種混合模式配體包含疏水性部分和非芳族氮部分。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“至少一種可溶性蛋白級(jí)分”涉及通過(guò)本發(fā)明獲得的并且包含單獨(dú)的可溶性蛋白或在相同的可溶性蛋白級(jí)分中兩種或更多種可溶性蛋白的各種組合的可溶性蛋白級(jí)分。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“單獨(dú)的可溶性蛋白”涉及這樣的蛋白概況，其已經(jīng)從與含有聚集的酪蛋白的材料的蛋白概況非常類似的蛋白概況轉(zhuǎn)移到至少一種可溶性蛋白是有利的蛋白概況。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“可溶性蛋白”涉及在含有聚集的酪蛋白的材料中溶解的自由流動(dòng)的非聚集成分。與可溶性蛋白相反，術(shù)語(yǔ)“聚集的”涉及當(dāng)分散在溶劑，如水中時(shí)形成一些非常大的分子如酪蛋白的結(jié)構(gòu)。此類大分子被認(rèn)為是太大而不能真正地溶于水中。然而，這些大分子形成允許其在水中保持懸浮如同其是可溶的結(jié)構(gòu)。這些大的結(jié)構(gòu)在水中的分散液被稱為膠體懸浮液。允許大分子保持膠狀地懸浮于水中的結(jié)構(gòu)被稱為膠粒。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一種或多種可溶性蛋白的分子大小可以小于1000千道爾頓(kDa)、如小于750kDa、如小于500kDa、例如小于400kDa、如小于300kDa、例如小于250kDa。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“分離”涉及將物質(zhì)的混合物，如含有聚集的酪蛋白的材料轉(zhuǎn)化成兩種或更多種不同級(jí)分的過(guò)程，不同級(jí)分中的至少一種富含來(lái)自混合物的一種或多種物質(zhì)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，分離涉及提供包含獲得自含有聚集的酪蛋白的材料的可溶性蛋白的混合物的至少一種可溶性蛋白級(jí)分的過(guò)程。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可溶性蛋白的混合物可以為至少2種或更多種可溶性蛋白、如至少3種或更多種可溶性蛋白、例如至少4種或更多種可溶性蛋白、如至少5種或更多種可溶性蛋白、例如至少6種或更多種可溶性蛋白的混合物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，分離涉及提供包含單獨(dú)的可溶性蛋白的兩種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分、如3種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分、例如4種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分、如5種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分、例如6種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分。
牛奶中的蛋白質(zhì)可以具有不同的物理化學(xué)特性，其可影響分級(jí)并且可以被有利地使用以提供一種可溶性蛋白級(jí)分與另一可溶性蛋白級(jí)分或含有聚集的酪蛋白的材料中的聚集的酪蛋白的選擇性分離。
此類使用色譜支持物的一種或多種可溶性蛋白的選擇性分離可以在兩種條件下操作：
(a)一種或多種可溶性蛋白從色譜支持物的選擇性洗脫，或
(b)一種或多種可溶性蛋白與色譜支持物的選擇性吸附
在選擇性洗脫中，含有聚集的酪蛋白的材料中的所有可溶性蛋白或一組可溶性蛋白被色譜支持物同時(shí)捕獲。漂洗色譜支持物上的污染物和未捕獲的物質(zhì)。然后，由人們使用專門設(shè)計(jì)的適合于待分離的特定蛋白質(zhì)的洗脫緩沖液依序洗脫捕獲的可溶性蛋白。因此，通過(guò)使用選擇性洗脫技術(shù)，從同一色譜支持物獲得數(shù)種純化的蛋白級(jí)分是可能的。
在選擇性吸附中，優(yōu)化工藝條件以越過(guò)一種蛋白質(zhì)捕獲另一種可溶性蛋白。當(dāng)捕獲感興趣的可溶性蛋白時(shí)，漂洗色譜支持物的污染物，隨后洗脫特異性可溶性蛋白。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，方法為選擇性洗脫過(guò)程。用這種方法，提供兩種或更多種、如3種或更多種、例如4種或更多種、如5種或更多種、例如6種或更多種包含單獨(dú)的可溶性蛋白的不同的可溶性蛋白級(jí)分是可能的。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“選擇性吸附”涉及這樣的過(guò)程，其中色譜支持物被設(shè)計(jì)和/或過(guò)程條件被設(shè)計(jì)成有利于來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料的一種組分而非來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料的另一種組分的結(jié)合。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“選擇性洗脫”涉及這樣的過(guò)程，其中洗脫緩沖液被設(shè)計(jì)和/或過(guò)程條件被設(shè)計(jì)成有利于一種保留的可溶性蛋白在另一種保留的可溶性蛋白之后從色譜支持物洗脫。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“保留”涉及將一種或多種可溶性蛋白保存或保持在特定位置，即在色譜支持物的行為?？扇苄缘鞍卓梢员槐Ａ粼谏V支持物中直至改變條件，以及保留蛋白被從色譜支持物同時(shí)或依序釋放和洗脫。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分的方法可以為中等大小規(guī)模的生產(chǎn)或大規(guī)模生產(chǎn)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，從含有聚集的酪蛋白的材料中分離至少一種可溶性蛋白級(jí)分的方法可以為分批過(guò)程或連續(xù)過(guò)程。
含有聚集的酪蛋白的材料
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述方法的最初步驟涉及提供含有聚集的酪蛋白的材料(步驟(i))。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料可以獲得自任何產(chǎn)乳動(dòng)物，并且優(yōu)選傳統(tǒng)上用于大規(guī)模牛奶生產(chǎn)的動(dòng)物。優(yōu)選地，含有聚集的酪蛋白的材料獲得自反芻動(dòng)物，如牛、山羊、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、牦牛、鹿、駱駝、美洲駝或羚羊。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“含有聚集的酪蛋白的材料”涉及未通過(guò)添加凝乳酶、酸、加熱或它們的任何組合經(jīng)受酪蛋白沉淀的材料。優(yōu)選地，含有聚集的酪蛋白的材料選自牛奶、全脂奶、脫脂乳、牛奶濃縮液、復(fù)原乳奶粉、未巴氏滅菌的牛奶、微濾的牛奶、pH-調(diào)節(jié)的牛奶。[改寫]
本發(fā)明的方面是在可溶性蛋白的分離之前，含有聚集的酪蛋白的材料未經(jīng)受酪蛋白沉淀或酪蛋白膠粒和/或酪蛋白聚集體的去除。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，直接從含有聚集的酪蛋白的材料中分離可溶性蛋白。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“酪蛋白聚集體”涉及不同大小的膠束結(jié)構(gòu)的酪蛋白和聚集的酪蛋白。當(dāng)形成酪蛋白分子時(shí)，隨著它們開始折疊成球形膠束結(jié)構(gòu)使得酪蛋白可以在乳水中保持無(wú)限懸浮，提供膠束酪蛋白。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料包含至少5g酪蛋白/l含有聚集的酪蛋白的材料、如至少10g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少15g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少20g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少22g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少24g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少30g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少40g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少50g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少60g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少70g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少80g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、例如至少90g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料、如至少100g酪蛋白/L含有聚集的酪蛋白的材料。
可以以分批過(guò)程進(jìn)行中等大小規(guī)模的生產(chǎn)和/或工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。優(yōu)選地，此類分批過(guò)程涉及處理至少50升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少100升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如250升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少500升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如750升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少1,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如2,500升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少5,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如7,500升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少10,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如25,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少50,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如75,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、如至少100,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)、例如250,000升含有聚集的酪蛋白的材料/循環(huán)。
可選地，可以以連續(xù)過(guò)程進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)(工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn))。當(dāng)可溶性蛋白被色譜支持物保留時(shí)，在分離過(guò)程期間的某個(gè)點(diǎn)的洗脫步驟可能是必要的。通過(guò)提供至少兩個(gè)色譜支持物并將其平行放置，可以提供此類連續(xù)分離，其中含有聚集的酪蛋白的材料的流動(dòng)可以從一個(gè)色譜支持物(當(dāng)該色譜材料為負(fù)載的并且準(zhǔn)備好洗脫時(shí))轉(zhuǎn)移至其他色譜支持物?？蛇x地，可以使用移動(dòng)床色譜、模擬的移動(dòng)床色譜等。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，連續(xù)分離的容量可以為至少5,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小時(shí)、如至少10,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小時(shí)、例如至少12,000升含有聚集的酪蛋白/小時(shí)、如至少15,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小時(shí)、例如至少18,000升含有聚集的酪蛋白/小時(shí)、如至少20,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小時(shí)、例如至少25,000升含有聚集的酪蛋白/小時(shí)、如至少50,000升含有聚集的酪蛋白的材料/小時(shí)、例如至少100,000升含有聚集的酪蛋白/小時(shí)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在將含有聚集的酪蛋白的材料添加至色譜支持物之前，不需要調(diào)節(jié)含有聚集的酪蛋白的材料的電導(dǎo)率和/或pH。因此，含有聚集的酪蛋白的材料的pH和/或電導(dǎo)率可與最初提供的含有聚集的酪蛋白的材料的pH和/或電導(dǎo)率相同。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料可以包含礦物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料未經(jīng)歷礦物質(zhì)的去除和/或添加。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料包含天然存在的礦物質(zhì)。
優(yōu)選地，礦物質(zhì)選自鈣、磷、碘、鎂、鋅和鉀。優(yōu)選地，乳清材料中存在的礦物質(zhì)為乳清材料中天然存在的。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“天然存在的”涉及這樣的礦物質(zhì)，其存在于含有聚集的酪蛋白的材料中，并且不是單獨(dú)添加的化合物，但可見于步驟(i)中提供的含有聚集的酪蛋白的材料中。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，未使含有聚集的酪蛋白的材料經(jīng)歷巴氏滅菌。
色譜支持物
如以上所述，本發(fā)明教導(dǎo)色譜支持物的用途，其允許來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料的一種或多種可溶性蛋白被保留(步驟(ii))。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“色譜支持物”涉及包含吸附劑的任何種類的容器，其可以被提供有用于含有聚集的酪蛋白的材料的應(yīng)用的至少一個(gè)入口以及當(dāng)經(jīng)歷洗脫緩沖液時(shí)用于獲得至少一種可溶性蛋白級(jí)分的至少一個(gè)出口。
待使用的色譜支持物可以為膜色譜支持物，優(yōu)選混合模式膜色譜支持物或柱色譜支持物。優(yōu)選地，柱色譜支持物包括填充床色譜、攪拌罐吸附、移動(dòng)床色譜、模擬移動(dòng)床色譜、流化床色譜和/或膨脹床色譜。
膨脹床色譜(EBA)技術(shù)通?？梢耘c非澄清的原材料，如含有聚集的酪蛋白的材料一起有效地起作用的事實(shí)使其成為實(shí)施生物分子物質(zhì)分離和分開的吸引人的解決方案。與基于填充床色譜的過(guò)程相比，膨脹床色譜可以提供包含較少步驟，以及因此導(dǎo)致增加的產(chǎn)率和改善的過(guò)程經(jīng)濟(jì)性的穩(wěn)健過(guò)程。由于實(shí)行EBA過(guò)程期間吸附床的膨脹，EBA柱可以被進(jìn)一步按比例放大至工業(yè)規(guī)模，而沒(méi)有關(guān)于由于系統(tǒng)堵塞而引起的增加的背壓或過(guò)程故障(當(dāng)使用填充床柱時(shí)，其常常為一種問(wèn)題)的任何顯著的注意事項(xiàng)。所以，根據(jù)本發(fā)明，膨脹床色譜可以為優(yōu)選的柱色譜支持物。
通常，膨脹床吸附為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以將本發(fā)明中所述的方法修改成WO 92/00799、WO 92/18237、WO 97/17132、WO 00/57982或WO 98/33572中所述的方法。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以以1-50cm/min范圍內(nèi)；優(yōu)選地在5-30cm/min范圍內(nèi)；更優(yōu)選地在10-25cm/min范圍內(nèi)；甚至更優(yōu)選地，在15-20cm/min范圍內(nèi)的流速將含有聚集的酪蛋白的材料裝載至色譜支持物。
吸附劑
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，色譜支持物可以包含吸附劑。
在含有聚集的酪蛋白的材料可以與吸附劑接觸之前，本發(fā)明方法中的最初但任選步驟可以涉及吸附劑的平衡?？梢酝ㄟ^(guò)使用平衡液來(lái)進(jìn)行此類平衡。平衡液的PH可以依賴于含有聚集的酪蛋白的材料的類型和/或使用的配體而改變。
吸附劑的平衡可以優(yōu)選地通過(guò)使用酸或水，如自來(lái)水、純凈水、去離子水、軟化水或蒸餾水進(jìn)行。如果平衡液為酸，則平衡液可以包含低成本的礦物酸，如鹽酸、磷酸、硫酸。然而，食品級(jí)有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸和乳酸也可以是特別優(yōu)選的。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“吸附劑”涉及色譜支持物中存在的整個(gè)床，并且負(fù)責(zé)保留一種或多種可溶性蛋白。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，吸附劑可以包含單獨(dú)的顆粒。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“吸附劑顆?！迸c術(shù)語(yǔ)“顆?！笨山粨Q地使用，并且涉及構(gòu)成吸附劑的單獨(dú)的單一顆粒。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，吸附劑可以包含與能夠結(jié)合一種或多種可溶性蛋白的混合模式配體偶聯(lián)的膜。
如果顆粒形式的吸附劑被用于膨脹床吸附，則數(shù)種特征，如流速、顆粒大小和顆粒密度可以對(duì)流化床的膨脹和蛋白的分離具有影響。以使吸附劑顆粒保持在柱內(nèi)，但同時(shí)優(yōu)化流速的方式控制膨脹度是重要的。
膨脹度可以被確定為H/H0，其中“H0”為填充床模式中床的高度，以及“H”為膨脹模式中床的高度。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，膨脹度H/H0在1.1-10范圍內(nèi)，例如1.0-6、如1.2-5、例如1.3-5、如1.5-4、例如4-6、如3-5、例如3-4、如4-6。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，膨脹度H/H0為至少1.1、如至少1.5、例如至少2、如至少2.5、例如至少3、如至少3.5、例如至少4、如至少4.5、例如至少5、如至少5.5、例如至少6、如至少10。
此外，關(guān)于典型的EBA柱內(nèi)部可能的吸附床的最大膨脹度(例如H/H0max 3-5)，EBA吸附劑顆粒的密度可以對(duì)于可應(yīng)用的流速是高度重要的，并且必須為至少1.3g/ml、更優(yōu)選地至少1.5g/ml、更優(yōu)選地至少1.8g/ml、甚至更優(yōu)選地至少2.0g/ml、最優(yōu)選地至少2.3g/ml，以便使方法的高生產(chǎn)率成為可能。
EBA吸附劑顆粒的密度意指吸附劑顆粒在其完全溶劑化(例如水合)狀態(tài)的密度，與干燥的吸附劑顆粒的密度相對(duì)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，吸附劑顆粒具有至多250μm、如至多200μm、例如至多180μm、特別地如至多160μm、例如至多150μm、如至多140μm、例如至多130μm、如至多120μm、例如至多110μm、如至多100μm的平均顆粒大小。甚至更通常地，吸附劑顆粒具有在90-250μm范圍內(nèi)，例如100-200μm、如120-180μm、例如140-160μm的平均顆粒大小。
應(yīng)理解，本發(fā)明也覆蓋小于100μm，如小于90μm、例如小于80μm、如小于70μm、例如小于60μm、如小于50μm、例如小于40μm、如小于30μm、例如小于20μm、如小于10μm的平均顆粒大小。然而，與使用平均顆粒大小為或大于100μm的吸附劑顆粒相比，使用平均顆粒大小小于100μm的吸附劑顆?？蓪?dǎo)致較低的生產(chǎn)率。
在很大程度上，可以通過(guò)包含某一比例的致密無(wú)孔芯材(優(yōu)選具有至少4.0g/ml、如至少10g/ml、例如至少16g/ml、如至少25g/ml的密度)來(lái)實(shí)現(xiàn)吸附劑顆粒的高密度。通常，無(wú)孔芯材具有在約4.0-25g/ml范圍內(nèi)的密度，如約4.0-20g/ml、例如約4.0-16g/ml、如12-19g/ml、例如14-18g/ml、如約6.0-15.0g/ml、例如約6.0-16g/ml。
根據(jù)本發(fā)明，使用的吸附劑顆粒對(duì)含有聚集的酪蛋白的材料中存在的蛋白可以是至少部分可透過(guò)的，以便確保重要的結(jié)合能力，這與僅可以在其表面結(jié)合靶分子，導(dǎo)致相對(duì)低的結(jié)合能力的不可滲透的顆粒相反。吸附劑顆粒可以為不同結(jié)構(gòu)、組成和形狀的陣列。
吸附劑顆粒可以由許多化學(xué)衍生的具有必需密度和結(jié)合能力的多孔材料構(gòu)成以在給定流速下自身操作。顆?？梢詾槿鏦O 92/00799中所述的具有被多孔聚合物基體基質(zhì)包圍的至少兩個(gè)無(wú)孔芯的聚集物類型，或具有被多孔聚合物基體基質(zhì)包圍的單個(gè)無(wú)孔芯的薄膜類型。
吸附劑可以包含具有共價(jià)連接的一種或多種混合模式配體的多孔聚合物基體基質(zhì)。優(yōu)選地，多孔聚合物基體基質(zhì)可以為多孔有機(jī)聚合物基體基質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，吸附劑可以包含被多孔聚合物基體基質(zhì)包圍的密致無(wú)孔芯材料。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“聚集物類型”涉及微粒材料的顆粒，其包含具有通過(guò)多孔聚合物基體基質(zhì)保持在一起的不同類型和大小的芯材的高密度無(wú)孔芯珠，例如由通過(guò)周圍的瓊脂糖(多孔聚合物基體基質(zhì))保持在一起的兩個(gè)或更多個(gè)高密度顆粒組成的芯顆粒。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“薄膜類型”涉及顆粒的復(fù)合物，其中各個(gè)顆粒僅由涂覆有一層多孔聚合物基體基質(zhì)的一個(gè)高密度芯材，例如涂覆有瓊脂糖的高密度不銹鋼珠組成。
因此，術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)高密度無(wú)孔芯”涉及包含單個(gè)高密度無(wú)孔顆粒的薄膜芯，或者其涉及包含多于一個(gè)高密度無(wú)孔顆粒的聚集物芯。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“芯”涉及吸附劑內(nèi)部存在的芯顆粒。芯顆粒可以附帶地分布在多孔聚合物基體基質(zhì)內(nèi)且不限于位于吸附劑的中心。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，無(wú)孔芯通常構(gòu)成吸附劑的總體積的至多50％、如至多40％、例如至多30％、如至多25％、例如至多20％、如至多10％、例如至多5％。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，分子量大于1000道爾頓的蛋白可進(jìn)入的孔體積構(gòu)成至少50％的吸附劑、如至少60％的吸附劑、例如至少70％的吸附劑、如至少75％的吸附劑、例如至少80％的吸附劑、如至少90％的吸附劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解各種無(wú)孔芯材和各種多孔聚合物基體基質(zhì)。無(wú)孔芯材和多孔聚合物基體基質(zhì)的實(shí)例可以見于WO 2010/037736。技術(shù)人員也了解根據(jù)本發(fā)明制備吸附劑的方法，此類制備吸附劑的方法可以描述在WO 2010/03776、EP 0 538 350或WO 97/17132中。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，聚合物基體基質(zhì)不包含苯乙烯乙烯基三乙氧基硅烷共聚物。
在本發(fā)明的另外實(shí)施方案中，吸附劑不包含二氧化硅顆?；蜓趸X顆粒。優(yōu)選地，吸附劑不包含包被有苯乙烯乙烯基三乙氧基硅烷共聚物的二氧化硅顆粒、氧化鋁顆?；蛱沾深w粒。
在操作期間，含有聚集的酪蛋白的材料可以與吸附劑接觸，以及一種或多種可溶性蛋白可以被吸附或固定至吸附劑，然而其他組分，如聚集的酪蛋白、礦物質(zhì)、碳水化合物或它們的組合不結(jié)合色譜支持物，并且流過(guò)吸附劑。該吸附可以在壓力下進(jìn)行。在任選洗滌期間，從柱中任選去除微粒和/或未結(jié)合的材料以及可溶性雜質(zhì)。
當(dāng)使含有聚集的酪蛋白的材料與吸附劑接觸時(shí)，可以優(yōu)化吸附劑與含有聚集的酪蛋白的材料之間的比率以便提供吸附劑的高容量，以及獲得分離的至少一種可溶性蛋白級(jí)分的高純度、高產(chǎn)率和/或高回收率。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，色譜支持物可以具有以下的可溶性蛋白相對(duì)于吸附劑的裝載比：至少10mg裝載的可溶性蛋白/ml吸附劑、如至少12mg、例如至少15mg、如至少20mg、例如至少25mg、如至少30mg、例如至少35mg、如至少50mg、例如至少75mg、如至少100mg、例如至少150mg、如至少175mg、例如至少200mg。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料相對(duì)于吸附劑的裝載比為至少50mg裝載的聚集的酪蛋白/ml吸附劑，如至少75mg、例如至少100mg、如至少200mg、例如至少300mg、如至少400mg、例如至少500mg、如至少600mg、例如至少700mg、如至少800mg、例如至少900mg、如至少1000mg、例如至少1500mg。
在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)測(cè)定可溶性蛋白和/或含有聚集的酪蛋白的材料的裝載比時(shí)，吸附劑處于其完全溶劑化(例如水合)狀態(tài)。
配體
為了使色譜支持物和/或吸附劑保留來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料的一種或多種可溶性蛋白，吸附劑可以包含配體。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，吸附劑可以包含對(duì)在含有聚集的酪蛋白的材料中存在的一種或多種可溶性蛋白具有親和力的一種或多種配體。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“配體”涉及共價(jià)連接吸附劑且具有吸附一種或多種可溶性蛋白的功能的化合物。
配體可以為低分子量化合物，以及在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體的分子量可以為至多1000道爾頓，如至多750道爾頓，例如至多500道爾頓、如至多250道爾頓、例如至多100道爾頓、例如至多50道爾頓。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，當(dāng)存在于堿性介質(zhì)時(shí)，配體為化學(xué)穩(wěn)定的配體和/或吸附劑在堿性介質(zhì)中是化學(xué)穩(wěn)定的吸附劑。具有化學(xué)穩(wěn)定的配體和/或化學(xué)穩(wěn)定的吸附劑的優(yōu)勢(shì)為：可以減少配體部分至一種或多種級(jí)分的滲漏；可以避免或減少可能的毒性問(wèn)題和/或可以保持色譜支持物的高性能。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在暗處，于37℃下，在1M NaOH中孵育3天，色譜支持物保持至少75％的配體濃度、如至少80％、例如至少85％、如至少90％、例如至少95％。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體與色譜支持物通過(guò)共價(jià)結(jié)合，優(yōu)選地，強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合偶聯(lián)，提供化學(xué)穩(wěn)定的配體和/或化學(xué)穩(wěn)定的吸附劑。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合可以通過(guò)包含吸附劑與配體之間的一種或多種活化劑提供。此類合適的活化劑的實(shí)例包括表氯醇、表溴醇、烯丙基-縮水甘油醚；雙環(huán)氧化物；鹵素取代的脂肪族化合物；醛類；醌類；氯-三嗪類；噁唑酮；和馬來(lái)酰亞胺。優(yōu)選的活化劑為環(huán)氧化合物，如表氯醇、烯丙基-縮水甘油醚和丁烷二醇二縮水甘油醚。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“混合模式配體”涉及具有多種行為的配體，例如當(dāng)操作混合模式配體時(shí)，色譜行為基于例如蛋白和配體的靜電性質(zhì)和疏水性質(zhì)的組合。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“多種行為”涉及配體與可溶性蛋白通過(guò)多種類型的分子相互作用，如疏水相互作用、離子相互作用、π-π相互作用、范德華相互作用等相互作用的能力。
根據(jù)本發(fā)明，混合模式配體可以包含至少一個(gè)疏水性部分和至少一個(gè)芳族氮部分。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，色譜支持物包含具有共價(jià)連接的一種或多種混合模式配體的多孔有機(jī)聚合物基體基質(zhì)，所述一種或多種混合模式配體包含疏水性部分和非芳族氮部分。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體還包含至少一個(gè)可帶電部分。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，混合模式配體包含至少一個(gè)疏水性部分、至少一個(gè)可帶電部分和至少一個(gè)非芳族氮部分。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，至少一個(gè)可帶電部分為pKa值是至多11.0、如至多10.0、例如至多9.0、如至多8.0、例如至多7.0、如至多6.0、例如至多5.0的堿性部分。
在含有聚集的酪蛋白的材料，如牛奶的pH，優(yōu)選地在pH 6-8范圍中的pH值下，至少一個(gè)可帶電部分可以為完全或部分帶正電荷的部分(在pH等于pKa值下，該可帶電部分為50％帶電的)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可帶電部分可以為羧酸或胺，所述胺選自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，疏水性部分可以為烴基部分或任選取代的芳族或雜芳族部分或者烴基-芳族或雜芳族部分的組合。
如果疏水性部分為烴基部分，則烴基部分可以為無(wú)支鏈的烴基部分。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，烴基部分可以包含至少3個(gè)碳原子、如至少4個(gè)碳原子、例如至少5個(gè)碳原子。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，非芳族氮部分中的氮與烴基部分中的碳之間的比率為至少1:3、如至少1:4、例如至少1:5、如至少1:6、例如至少1:7、如至少1:8、例如至少1:9、如至少1:10。
在本發(fā)明的上下文中，氮與碳之間的比率可以通過(guò)原子數(shù)目來(lái)限定，例如非芳族氮與碳之間至少1:3的比率意指1個(gè)非芳族氮原子相對(duì)于至少3個(gè)碳原子。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可帶電部分形成非芳族氮部分的一部分。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，非芳族氮部分可以為至少一個(gè)氮原子、至少一個(gè)伯氨基、至少一個(gè)仲氨基、至少一個(gè)叔氨基或至少一個(gè)季氨基。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，配體包含可帶電部分或形成非芳族氮基團(tuán)的一部分的可帶電部分?？蓭щ姴糠挚梢栽谌魏蝡H值下是帶電的，或者可帶電部分可以在任何pH值下是可帶電的。在本發(fā)明中，在任何pH值下是帶電的可帶電部分可以為季氨基。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在任何pH值下是可帶電的可帶電部分可以為伯氨基、仲氨基或叔氨基。
為了改善容量、純度和回收率，配體濃度也是重要的。所以，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，配體濃度可以在20-300微摩爾/ml沉降的吸附劑范圍內(nèi)，例如25-100微摩爾/ml沉降的吸附劑、如30-80微摩爾/ml沉降的吸附劑、例如40-70微摩爾/ml沉降的吸附劑、例如50-200微摩爾/ml沉降的吸附劑、如75-175微摩爾/ml沉降的吸附劑、例如100-160微摩爾/ml沉降的吸附劑、如120-145微摩爾/沉降的吸附劑。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“沉降的吸附劑”或“吸附劑顆粒”意指在其完全溶劑化(例如水合)狀態(tài)的吸附劑，與干燥的吸附劑的配體濃度相對(duì)。
透過(guò)物級(jí)分
當(dāng)使含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物接觸時(shí)，一種或多種可溶性蛋白可以被色譜支持物保留，然而聚集的酪蛋白保持未結(jié)合的，流過(guò)色譜支持物并且可以見于透過(guò)物級(jí)分中。
透過(guò)物級(jí)分還可以包含至少一種選自以下的化合物：乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、聚集的酪蛋白、礦物質(zhì)、維生素、碳水化合物和脂肪。
礦物質(zhì)可以選自鈣、磷、碘、鎂、鋅和鉀。甚至更優(yōu)選地，礦物質(zhì)可以為鈣和選自磷、碘、鎂、鋅和鉀的第二礦物質(zhì)。
透過(guò)物級(jí)分中存在的礦物質(zhì)可以優(yōu)選地為來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料的礦物質(zhì)。優(yōu)選地，透過(guò)物級(jí)分中50％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料，例如如透過(guò)物級(jí)分中至少75％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料，如透過(guò)物級(jí)分中至少90％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料，例如透過(guò)物級(jí)分中至少92％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料，如透過(guò)物級(jí)分中至少95％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料，例如透過(guò)物級(jí)分中至少98％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料，如透過(guò)物級(jí)分中100％的礦物質(zhì)來(lái)自含有聚集的酪蛋白的材料。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于含有聚集的酪蛋白的材料中礦物質(zhì)的總量，含有聚集的酪蛋白的材料中存在的至少20％(w/w)的礦物質(zhì)，如至少30％、例如至少40％、如至少50％、例如至少70％、如至少80％例如至少90％、如至少95％、例如至少98％、如至少99％例如至少99.5％、如至少99.9％的礦物質(zhì)存在于透過(guò)物級(jí)分中。
可以使透過(guò)物級(jí)分經(jīng)歷另外的分級(jí)步驟。優(yōu)選地，從透過(guò)物級(jí)分分離乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶。例如從透過(guò)物級(jí)分分離乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，從另外的分級(jí)步驟獲得的乳鐵蛋白的收率為含有聚集的酪蛋白的材料和/或透過(guò)物級(jí)分中存在的乳鐵蛋白的量的至少50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用根據(jù)本發(fā)明分離的乳鐵蛋白級(jí)分，或可以將其用于技術(shù)人員已知的應(yīng)用的組成中。具體地，可以單獨(dú)使用乳鐵蛋白級(jí)分，或者可以將其用于嬰兒配方、乳制品、運(yùn)動(dòng)和健身營(yíng)養(yǎng)品、藥物產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)食品產(chǎn)品、治療產(chǎn)品、體重管理、即食熱餐、加工肉類、化妝品、口腔衛(wèi)生用品或動(dòng)物飼料產(chǎn)品的組成中。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，從另外的分級(jí)步驟獲得的乳過(guò)氧化物酶的收率為含有聚集的酪蛋白的材料和/或透過(guò)物級(jí)分中存在的乳過(guò)氧化物酶的量的至少50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用根據(jù)本發(fā)明分離的乳過(guò)氧化物酶級(jí)分，或者將其用于技術(shù)人員已知的應(yīng)用的組成中。具體地，可以單獨(dú)使用乳過(guò)氧化物酶級(jí)分，或者將其用于乳制品、肥皂產(chǎn)品如洗發(fā)露、化妝品、口腔衛(wèi)生用品如牙膏、針對(duì)痤瘡的產(chǎn)品、植物保護(hù)產(chǎn)品、殺菌劑或殺真菌劑的組成中。
去除乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶的另外的分級(jí)步驟可以在含有聚集的酪蛋白的材料上進(jìn)行，產(chǎn)生乳鐵蛋白/乳過(guò)氧化物酶耗盡的含有聚集的酪蛋白的材料。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“乳鐵蛋白/乳過(guò)氧化物酶耗盡的含有聚集的酪蛋白的材料”涉及以透過(guò)物級(jí)分的干物質(zhì)基礎(chǔ)計(jì)，存在至多0.05mg/ml、如至多0.02ml/mg、例如至多0.01ml/mg、如至多0.005mg/ml乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶。
如果本發(fā)明的步驟(i)中提供的含有聚集的酪蛋白的材料為乳鐵蛋白/乳過(guò)氧化物酶耗盡的含有聚集的酪蛋白的材料，則透過(guò)物級(jí)分包含酪蛋白聚集體、礦物質(zhì)、維生素、碳水化合物和脂肪。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以將透過(guò)物級(jí)分、第二透過(guò)物級(jí)分和/或乳鐵蛋白/乳過(guò)氧化物酶耗盡的含有聚集的酪蛋白的材料用于制備范圍廣泛的乳制品，如奶酪、酸奶、飲用乳制品、發(fā)酵乳制品、烘焙食品、甜品和奶精。具體地，從β-乳球蛋白的完全耗盡或部分耗盡獲益的產(chǎn)品是優(yōu)選的，如嬰兒配方、低變應(yīng)原性產(chǎn)品和技術(shù)人員已知的某些類型的奶酪。
另外的分級(jí)步驟導(dǎo)致至少一種保留的乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶級(jí)分、包含單獨(dú)成分的兩種級(jí)分或包含兩者組合的級(jí)分以及包含酪蛋白聚集體的第二透過(guò)物級(jí)分。隨后，可以使透過(guò)物級(jí)分和/或第二透過(guò)物級(jí)分經(jīng)歷凝乳的形成，并且例如被用于奶酪的生產(chǎn)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，凝乳的形成可以通過(guò)以下提供：將凝乳酶添加至透過(guò)物級(jí)分和/或第二透過(guò)物級(jí)分，導(dǎo)致凝乳級(jí)分和糖巨肽級(jí)分(GMP-級(jí)分)的形成。在將凝乳酶添加至透過(guò)物級(jí)分和/或第二透過(guò)物級(jí)分之后，酪蛋白聚集體開始沉淀，形成固體凝乳級(jí)分和進(jìn)入液相的糖巨肽級(jí)分?？梢酝ㄟ^(guò)過(guò)濾、離心和/或潷析分離凝乳級(jí)分和GMP-級(jí)分。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，凝乳的形成可以通過(guò)以下提供：向透過(guò)物級(jí)分和/或第二透過(guò)物級(jí)分添加酸或添加酸與加熱的組合，導(dǎo)致固體凝乳級(jí)分的形成。
奶酪生產(chǎn)過(guò)程可以遵循技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)的奶酪生產(chǎn)過(guò)程。在傳統(tǒng)的奶酪生產(chǎn)期間，在切割沉淀的酪蛋白之前，測(cè)定沉淀的酪蛋白的適當(dāng)堅(jiān)度是重要的，以便排干乳清。傳統(tǒng)上，奶酪制造者進(jìn)行一系列測(cè)試以鑒定用于切割的最佳堅(jiān)度。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，切割沉淀的酪蛋白以便排干乳清的步驟可以省略或顯著減少。
在奶酪制造中使用獲得自本發(fā)明的沉淀的酪蛋白的優(yōu)勢(shì)為透過(guò)物級(jí)分和/或第二透過(guò)物級(jí)分耗盡或基本上耗盡纖溶酶原。該耗盡或基本耗盡導(dǎo)致更穩(wěn)定的酪蛋白結(jié)構(gòu)以及更可靠且可重現(xiàn)的奶酪生產(chǎn)過(guò)程。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，還可以例如通過(guò)膜過(guò)濾、吸附色譜法或它們的組合分離包含糖巨肽(GMP)的級(jí)分。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，相對(duì)于蛋白總量，糖巨肽(GMP)的收率為至少50％的GMP、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的上下文中，第二透過(guò)物級(jí)分不同于透過(guò)物級(jí)分。優(yōu)選地，第二透過(guò)物級(jí)分與透過(guò)物級(jí)分的不同之處在于至少一種可溶性蛋白，例如可溶性蛋白乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶已經(jīng)被去除，并且基本上不存在于第二透過(guò)物級(jí)分中。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本上不存在”涉及可溶性蛋白，如可溶性蛋白乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶中的至少一種，最初存在于透過(guò)物級(jí)分中，但已經(jīng)通過(guò)另外的分級(jí)步驟將所述可溶性蛋白從透過(guò)物級(jí)分中分離。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本上不存在”涉及相對(duì)于透過(guò)物級(jí)分中可溶性蛋白，例如乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶的總量，存在至多10％、例如至多5％、如至多3％、例如至多1％、如至多0.1％的可溶性蛋白，例如乳鐵蛋白和/或乳過(guò)氧化物酶。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第二透過(guò)物級(jí)分包含至多0.015g乳鐵蛋白/L第二透過(guò)物級(jí)分、如至多0.01g乳鐵蛋白/L第二透過(guò)物級(jí)分、例如至多0.005g乳鐵蛋白/L第二透過(guò)物級(jí)分、如至多0.001g乳鐵蛋白/L第二透過(guò)物級(jí)分、例如至多0.0005g乳鐵蛋白/L第二透過(guò)物級(jí)分。
在本發(fā)明的另外實(shí)施方案中，第二透過(guò)物級(jí)分包含至多0.003g乳過(guò)氧化物酶/L第二透過(guò)物級(jí)分、如至多0.001g乳過(guò)氧化物酶/L第二透過(guò)物級(jí)分、例如至多0.0005g乳過(guò)氧化物酶/L第二透過(guò)物級(jí)分、如至多0.00001g乳過(guò)氧化物酶/L第二透過(guò)物級(jí)分。
洗滌
在含有聚集的酪蛋白的材料已經(jīng)與色譜支持物接觸，并且已經(jīng)允許一種或多種可溶性蛋白與吸附劑結(jié)合之后，根據(jù)本發(fā)明的方法還可以涉及使用洗滌緩沖液進(jìn)行任選的洗滌步驟。因此，提供至少一種分離的可溶性蛋白級(jí)分的方法還可以包括以下步驟：
(iv)任選地洗滌色譜支持物。
可以通過(guò)使用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌色譜支持物的步驟，由此可以獲得洗滌級(jí)分。
一旦含有聚集的酪蛋白的材料已經(jīng)與色譜支持物接觸，可以使用洗滌緩沖液洗滌色譜支持物。洗滌緩沖液的pH可以依賴于過(guò)程、待分離的可溶性蛋白和使用的配體。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，洗滌緩沖液可以為酸或水，如自來(lái)水、純凈水、去離子水、軟化水或蒸餾水?？蛇m用于調(diào)節(jié)洗滌緩沖液的pH值的酸可以選自低成本的礦物酸，如鹽酸、磷酸和硫酸，但也可以來(lái)自食品級(jí)有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸和乳酸。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于洗滌步驟的流速可以選自先前將含有聚集的酪蛋白的材料裝載至色譜支持物所概述的范圍。
洗脫
為了獲得被色譜支持物保留的一種或多種可溶性蛋白，可以使色譜支持物經(jīng)歷洗脫緩沖液。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“洗脫緩沖液”涉及這樣的組合物，其能夠?qū)⑸V支持物從吸附本發(fā)明的可溶性蛋白的狀態(tài)改變至釋放和洗脫本發(fā)明的至少一種可溶性蛋白級(jí)分。
為了控制洗脫，使用pH的改變、疏水性的改變、電導(dǎo)率的改變(例如添加鹽)或它們的組合是可能的。
可以提供不同的洗脫策略。使用選擇性洗脫程序，或許全部保留的蛋白可以被同時(shí)洗脫，或者可選地保留的蛋白可以被依序洗脫。在本發(fā)明中，通過(guò)改變pH，改變電導(dǎo)率，保留的可溶性蛋白可以被同時(shí)或依序洗脫。改變可以為瞬時(shí)改變或逐漸改變。
優(yōu)選地，可以通過(guò)改變pH洗脫至少一種可溶性蛋白級(jí)分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH可以促進(jìn)吸附至色譜支持物的可溶性蛋白的最佳解吸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，待分離的可溶性蛋白為β-酪蛋白，以及洗脫緩沖液的pH低于6.0。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，待分離的可溶性蛋白為使用pH 6.0或以上的洗脫緩沖液的β-乳球蛋白、α-白蛋白和/或免疫球蛋白G。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，待分離的可溶性蛋白為使用pH低于6.0的洗脫緩沖液的β-酪蛋白，以及待分離的可溶性蛋白為使用pH 6.0或以上的洗脫緩沖液的β-乳球蛋白、α-白蛋白和/或免疫球蛋白G。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨、甲酸銨、磷酸鉀、磷酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉或它們的任何組合。優(yōu)選地，洗脫緩沖液優(yōu)選包含氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨或它們的任何組合。
可溶性蛋白級(jí)分
取決于提供的洗脫策略，至少一種可溶性蛋白級(jí)分可以為包含全部保留的可溶性蛋白的單一可溶性蛋白級(jí)分，或者可以將保留的可溶性蛋白洗脫成兩種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分，其包含單獨(dú)的可溶性蛋白或特定組群的可溶性蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，至少一種可溶性蛋白級(jí)分可以包含一種或多種可溶性蛋白。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，一種或多種可溶性蛋白可以選自免疫球蛋白G、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白胨如PP3、堿性磷酸酶、脂肪酶和可溶性酪蛋白如β-酪蛋白。
如果兩種或更多種保留的可溶性蛋白發(fā)現(xiàn)于相同的可溶性蛋白級(jí)分中，則可優(yōu)選色譜支持物保留的可溶性蛋白之間的相對(duì)比率基本上與含有聚集的酪蛋白的材料中的同一可溶性蛋白的相對(duì)比率相同。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，至少一種可溶性蛋白級(jí)分包含與含有聚集的酪蛋白的材料的蛋白概況基本上類似的蛋白概況。所述蛋白概況可以包含被色譜支持物保留的兩種或更多種可溶性蛋白、如3種或更多種可溶性蛋白、例如4種或更多種可溶性蛋白、如5種或更多種可溶性蛋白、例如6種或更多種可溶性蛋白，所述可溶性蛋白選自免疫球蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白胨如PP3、堿性磷酸酶、脂肪酶和可溶性酪蛋白。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本上相同”和“基本上類似”涉及至少一種可溶性蛋白級(jí)分中存在的可溶性蛋白的量與含有聚集的酪蛋白的材料中相同的可溶性蛋白的量之間具有至多10％、如至多5％、例如至多3％、如至多1％的差異。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可溶性級(jí)分中一種或多種可溶性蛋白的收率可以為含有聚集的酪蛋白的材料中存在的可溶性蛋白的量的至少50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，含有聚集的酪蛋白的材料中存在的至少可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一種可以被色譜支持物保留。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)色譜支持物的分離提供透過(guò)物級(jí)分和至少可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一種的保留物。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，分離涉及提供至少一種可溶性蛋白級(jí)分的過(guò)程，所述可溶性蛋白級(jí)分包含可溶性蛋白的混合物，如至少免疫球蛋白G或β-酪蛋白以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的至少一種可溶性蛋白級(jí)分可以包含可溶性蛋白免疫球蛋白G或β-酪蛋白中的至少一種以及α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白中的至少一種。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，分離涉及提供包含單獨(dú)的可溶性蛋白級(jí)分的兩種或更多種不同的可溶性蛋白級(jí)分。
如果提供兩種可溶性蛋白級(jí)分，則它們可以包含：
-一種可溶性蛋白級(jí)分包含β-乳球蛋白級(jí)分，以及另一種可溶性蛋白級(jí)分可以包含免疫球蛋白G級(jí)分或組合的免疫球蛋白G/α-乳白蛋白級(jí)分；
-一種β-乳球蛋白級(jí)分，以及另一種可溶性蛋白級(jí)分可以包含β-酪蛋白級(jí)分；
-一種組合的β-乳球蛋白/β-酪蛋白級(jí)分，以及另一種可溶性蛋白級(jí)分可以包含免疫球蛋白G級(jí)分；α-乳白蛋白級(jí)分或組合的免疫球蛋白G/α-乳白蛋白級(jí)分；
-一種可溶性蛋白級(jí)分包含免疫球蛋白G級(jí)分，以及另一種可溶性蛋白級(jí)分包含α-乳白蛋白級(jí)分或β-乳球蛋白級(jí)分或組合的α-乳白蛋白/β-乳球蛋白級(jí)分；或
-一種可溶性蛋白級(jí)分包含α-乳白蛋白級(jí)分，以及另一種可溶性蛋白級(jí)分包含免疫球蛋白G級(jí)分或組合的免疫球蛋白G/β-乳球蛋白級(jí)分。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，還可以將組合的級(jí)分，如組合的免疫球蛋白G/α-乳白蛋白級(jí)分；組合的β-乳球蛋白/β-酪蛋白級(jí)分；組合的α-乳白蛋白/β-乳球蛋白級(jí)分和/或組合的免疫球蛋白G/β-乳球蛋白級(jí)分分級(jí)成兩種單獨(dú)的蛋白級(jí)分。
如果提供3種可溶性蛋白級(jí)分，則一種級(jí)分可以包含免疫球蛋白G級(jí)分；一種級(jí)分包含β-乳球蛋白級(jí)分；以及一種級(jí)分包含α-乳白蛋白級(jí)分。
如果提供4種可溶性蛋白級(jí)分，則一種級(jí)分可以包含免疫球蛋白G級(jí)分；一種級(jí)分包含β-乳球蛋白級(jí)分；一種級(jí)分可以包含β-酪蛋白級(jí)分，以及一種級(jí)分包含α-乳白蛋白級(jí)分。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以獲得兩種可溶性蛋白級(jí)分，第一可溶性蛋白級(jí)分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，以及第二可溶性蛋白級(jí)分包含一種或多種選自以下的可溶性蛋白∶免疫球蛋白G、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白胨如PP3、堿性磷酸酶和脂肪酶。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用根據(jù)本發(fā)明分離的可溶性酪蛋白級(jí)分，如β-酪蛋白級(jí)分，或者可以將其用于技術(shù)人員已知的應(yīng)用的組成中。具體地，可以單獨(dú)使用可溶性酪蛋白級(jí)分，并且特別是β-酪蛋白級(jí)分，或者可以將其用于以下組成中：嬰兒配方；乳化劑組合物；發(fā)泡劑；口腔衛(wèi)生，如牙膏；酶活化，特別是核酸酶活化；乳制品；賴氨酸和/或色氨酸的來(lái)源，例如動(dòng)物飼料，如豬或家禽的動(dòng)物飼料；化妝品；功能食品、飲食產(chǎn)品；頭發(fā)修復(fù)；流變學(xué)和/或粘性降低；或增加腸中礦物質(zhì)攝取、低血壓、阿片樣物質(zhì)活性、ACE-抑制活性、對(duì)抗RSV、對(duì)抗流感的藥物或營(yíng)養(yǎng)食品組合物。
根據(jù)上文的實(shí)施方案，優(yōu)選第一可溶性蛋白級(jí)分中獲得的可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白的收率為含有酪蛋白的材料中存在的可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白的量的至少10％、20％、30％40％、50％，如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，獲得三種可溶性蛋白級(jí)分，第一可溶性蛋白級(jí)分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，第二可溶性蛋白級(jí)分包含β-乳球蛋白，以及第三可溶性蛋白級(jí)分包含一種或多種選自以下的可溶性蛋白∶免疫球蛋白G、α-乳白蛋白、血清白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白胨如PP3、堿性磷酸酶和脂肪酶。
根據(jù)上文的實(shí)施方案，優(yōu)選第二可溶性蛋白級(jí)分中獲得的β-乳球蛋白的收率為含有酪蛋白的材料中存在的β-乳球蛋白的量的至少10％、20％、30％、40％、50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用根據(jù)本發(fā)明分離的β-乳球蛋白級(jí)分，或者可以將其用于技術(shù)人員已知的應(yīng)用的組成中。具體地，可以單獨(dú)使用β-乳球蛋白級(jí)分，或者將其用于以下組成中：乳制品、飲料、即食熱餐、加工肉類、烘焙食品、穩(wěn)定化產(chǎn)品、或者維生素或礦物質(zhì)載體。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，獲得四種可溶性蛋白級(jí)分，第一可溶性蛋白級(jí)分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，第二可溶性蛋白級(jí)分包含β-乳球蛋白，第三可溶性蛋白級(jí)分包含免疫球蛋白G，以及第四可溶性蛋白級(jí)分包含一種或多種選自以下的可溶性蛋白：α-乳白蛋白、血清白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白胨如PP3、堿性磷酸酶和脂肪酶。
根據(jù)上文的實(shí)施方案，第三可溶性蛋白級(jí)分中獲得的免疫球蛋白G的收率為含有酪蛋白的材料中存在的免疫球蛋白G的量的至少10％、20％、30％、40％、50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用根據(jù)本發(fā)明分離的免疫球蛋白G級(jí)分，或者可以將其用于技術(shù)人員已知的應(yīng)用的組成中。具體地，可以單獨(dú)使用免疫球蛋白G級(jí)分，或者可以將其用于以下組成中：嬰兒配方、乳制品、運(yùn)動(dòng)和健身營(yíng)養(yǎng)品、藥物或營(yíng)養(yǎng)食品產(chǎn)品、體重管理、化妝品、營(yíng)養(yǎng)免疫療法或被動(dòng)免疫。
在本發(fā)明的另外實(shí)施方案中，獲得五種可溶性蛋白級(jí)分，第一可溶性蛋白級(jí)分包含可溶性酪蛋白，如β-酪蛋白，第二可溶性蛋白級(jí)分包含β-乳球蛋白，第三可溶性蛋白級(jí)分包含免疫球蛋白G，第四可溶性蛋白級(jí)分包含α-乳白蛋白，以及第五可溶性蛋白級(jí)分包含一種或多種選自以下的可溶性蛋白∶血清白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白胨如PP3、堿性磷酸酶和脂肪酶。
根據(jù)上文的實(shí)施方案，第四可溶性蛋白級(jí)分中獲得的α-乳白蛋白的收率為含有酪蛋白的材料中存在的α-乳白蛋白的量的至少10％、20％、30％、40％、50％、如至少75％、例如至少80％、如至少85％、例如至少90％、如至少95％、例如至少97％、如至少99％。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用根據(jù)本發(fā)明分離的α-乳白蛋白級(jí)，或者可以將其用于技術(shù)人員已知的應(yīng)用的組成中。具體地，可以單獨(dú)使用α-乳白蛋白級(jí)分，或者可以將其用于以下組成中：嬰兒配方；人乳化嬰兒食品；營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品；運(yùn)動(dòng)和健身營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品；乳制品；飲料；例如針對(duì)減少壓力、阿片樣物質(zhì)活性、細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)、抗?jié)兓钚?、免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗腹瀉、睡眠障礙、情緒障礙和壓力/抑郁問(wèn)題的藥物和/或營(yíng)養(yǎng)食品組合物。
可以優(yōu)選地從含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物之間的單次接觸獲得可溶性蛋白的這些高回收率。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“單次接觸”涉及使含有聚集的酪蛋白的材料與色譜支持物僅接觸一次，并且沒(méi)有使透過(guò)物級(jí)分或至少一種可溶性蛋白級(jí)分再循環(huán)至色譜支持物以改善分離。
根據(jù)洗脫緩沖液的組成和洗脫程序，可以在至少一種可溶性蛋白級(jí)分中獲得其他可溶性蛋白和可溶性蛋白的不同洗脫順序。
為了改善含有聚集的酪蛋白的材料中蛋白的穩(wěn)定性，被色譜支持物保留的一種或多種可溶性蛋白可以為纖溶酶原。
可以將從去除纖溶酶原獲得的透過(guò)物級(jí)分優(yōu)選地用于奶酪生產(chǎn)、長(zhǎng)效乳、UHT-乳或UHT-奶油。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以使獲得的至少一種可溶性蛋白級(jí)分經(jīng)歷第二濃縮步驟。此類第二濃縮步驟可以包括超濾、納濾、微濾、吸附色譜法、離心或它們的任何組合。第二濃縮步驟可以導(dǎo)致包含至少一種可溶性蛋白級(jí)分中存在的一種或多種可溶性蛋白的第二濃縮的保留物級(jí)分，以及主要包含水的第三濃縮的透過(guò)物級(jí)分。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，可以將在第三濃縮的透過(guò)物級(jí)分中獲得的水優(yōu)選地再用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，至少一種可溶性蛋白級(jí)分可以為液體、濃縮液或粉末。
另外的實(shí)施方案
在大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)中，蛋白的變性并不被認(rèn)為是一個(gè)問(wèn)題，并且實(shí)施可能危及天然蛋白質(zhì)的功能的過(guò)程條件。
本發(fā)明可以從可溶性蛋白的非常溫和的處理中受益，并且可優(yōu)選地期望保持或基本上保持分離的可溶性蛋白的天然功能。
不同的條件可引起可溶性蛋白的變性，以及含有聚集的酪蛋白的材料中的一些蛋白可能比其他蛋白更敏感?？梢鹱冃缘臈l件的實(shí)例可以暴露于小于3以及大于11的pH值；高鹽濃度；加熱；和化學(xué)品。
因此，為了避免可溶性蛋白的變性，優(yōu)選地使含有聚集的酪蛋白的材料不經(jīng)歷巴氏滅菌。
雖然應(yīng)避免高溫以便不會(huì)使可溶性蛋白處于變性的風(fēng)險(xiǎn)，但根據(jù)本發(fā)明的方法可以在高于環(huán)境溫度的溫度有利地進(jìn)行。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，步驟(ii)至(v)中的至少一個(gè)可以在高于25℃、如高于27℃、例如高于30℃、如高于35℃、例如高于40℃、如高于45℃、例如約50℃、如在25-80℃范圍內(nèi)、例如在30-70℃范圍內(nèi)、如在35-65℃范圍內(nèi)、例如在40-60℃范圍內(nèi)、如在45-55℃范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行。
可溶性β-酪蛋白可以結(jié)合膠束酪蛋白。然而，在低溫下，β-酪蛋白分子可以從膠束酪蛋白離解或部分離解。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟(i)和/或(ii)中的含有聚集的酪蛋白的材料的溫度可以在1-10℃范圍內(nèi)，如在2-7℃范圍內(nèi)，例如在3-5℃范圍內(nèi)?？蛇x地，含有聚集的酪蛋白的材料的溫度可以在與色譜材料接觸之前保持較低，即上文提及的1-10℃范圍內(nèi)的溫度下，但在與色譜支持物接觸之前立即升高至高溫，如上文提及的25-80℃范圍內(nèi)。
如本發(fā)明中所述的從含有聚集的酪蛋白的材料獲得的可溶性蛋白的純度、收率和回收率可以由乳清材料通過(guò)色譜支持物的單個(gè)循環(huán)提供。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“單個(gè)循環(huán)”涉及色譜支持物與含有聚集的酪蛋白的材料之間僅具有一次接觸。透過(guò)物級(jí)分、第二透過(guò)物級(jí)分或至少一種可溶性蛋白級(jí)分并沒(méi)有再循環(huán)至色譜支持物以便提供級(jí)分中存在的成分的進(jìn)一步分離。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以通過(guò)使兩個(gè)色譜支持物串聯(lián)連接提供至少一種可溶性蛋白級(jí)分。因此，可以提供一系列的至少2個(gè)色譜支持物，并且其中第一色譜支持物裝載有含有聚集的酪蛋白的材料，以及第二色譜支持物裝載有從第一色譜支持物獲得的流過(guò)級(jí)分，透過(guò)物級(jí)分。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，相對(duì)于混合模式配體能夠結(jié)合的可溶性蛋白，第一色譜支持物可以超負(fù)載有被色譜支持物保留的可溶性蛋白。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，此類超負(fù)載可以優(yōu)選地導(dǎo)致在第二色譜支持物上保留可溶性蛋白免疫球蛋白G和/或任選地α-乳白蛋白，以及在第一色譜支持物上保留可溶性蛋白β-乳球蛋白和任選地β-酪蛋白。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將根據(jù)本發(fā)明的至少一種可溶性蛋白級(jí)分和/或根據(jù)本發(fā)明的乳鐵蛋白/乳過(guò)氧化物酶級(jí)分、糖巨肽級(jí)分和/或凝乳級(jí)分用作食物產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品、飲食產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)食品產(chǎn)品、治療產(chǎn)品、飲料產(chǎn)品、護(hù)膚品、化妝品、針對(duì)營(yíng)養(yǎng)免疫療法的產(chǎn)品或針對(duì)被動(dòng)免疫的產(chǎn)品中的成分。
應(yīng)注意，在本發(fā)明的方面之一的上下文中或在本發(fā)明的實(shí)施方案之一中所述的實(shí)施方案和特征也適用于本發(fā)明的其他方面或其他實(shí)施方案。
本申請(qǐng)中引用的所有專利和非專利參考據(jù)此通過(guò)引用整體并入。
實(shí)施例
實(shí)施例1
從脫脂乳中直接分離β-乳球蛋白。脫脂乳是未經(jīng)歷酪蛋白去除的未巴氏滅菌的脫脂乳。
脫脂乳中基本上所有的可溶性蛋白被色譜支持物保留，以及聚集的酪蛋白、礦物質(zhì)、維生素、碳水化合物和脂肪流過(guò)色譜支持物。隨后從色譜支持物洗脫β-乳球蛋白級(jí)分，并對(duì)其進(jìn)行分析。
原材料
使用的原材料是從生鮮乳(?？苿?dòng)物)獲得的、未經(jīng)巴氏滅菌的以及由當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收集的脫脂乳。通過(guò)離心從生鮮乳中去除奶油。脫脂乳的pH為pH 6.58，并且無(wú)需任何pH調(diào)節(jié)(牛奶的天然pH)。
吸附劑
使用的吸附劑為基于芐胺的混合模式配體。
吸附劑基于5％的瓊脂糖和摻入的10％的碳化鎢顆粒，密度為大約2.9g/ml，以及顆粒大小在40-250μm范圍內(nèi)?；旌夏Ｊ轿絼┡c表氯醇交聯(lián)，并且與芐胺偶聯(lián)。配體濃度：大約42mmol混合模式組/L吸附劑。
過(guò)程參數(shù)
將13.2升吸附劑(混合模式吸附劑)填充在直徑為15cm的色譜柱中。填充模式的床高為75cm。
用75升水平衡吸附劑。
將132升原材料(脫脂乳)裝載在色譜柱上，導(dǎo)致裝載率為1∶10(吸附劑(升)：原材料(升))。流速，重力：20cm/min，導(dǎo)致兩倍的床膨脹(至150cm膨脹的床高度)。
用75升水洗滌吸附劑。
用25升20mM NaOH洗脫β-乳球蛋白。用1M鹽酸中和洗出液。通過(guò)改變洗脫緩沖液可以依序洗脫來(lái)自脫脂乳并且結(jié)合色譜材料的其他可溶性蛋白。
在50℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果
結(jié)果顯示：獲得20.08mgβ-乳球蛋白/ml洗出液，以及獲得總計(jì)562gβ-乳球蛋白。色譜材料(和混合模式配體)顯示每ml吸附劑的容量是42.6mgβ-乳球蛋白。
凝膠過(guò)濾分析顯示高純度的β-乳球蛋白級(jí)分，參見圖1，其顯示從本實(shí)施例獲得的β-乳球蛋白級(jí)分的純度。虛線示出從色譜支持物直接獲得的β-乳球蛋白級(jí)分的純度，以及實(shí)線示出從色譜支持物獲得，隨后進(jìn)行隨后的微濾步驟獲得的β-乳球蛋白級(jí)分的純度。
用SDS-PAGE技術(shù)估算不同級(jí)分中不同蛋白(例如在洗出液中(β-乳球蛋白級(jí)分))的收率。根據(jù)下述通用程序進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳：
將25μL樣品與25μL tris-甘氨酸樣品緩沖液(LC2676,Novex by Life Technologies,USA)混合。在非還原條件下，將所得溶液在水中煮沸5min。將20μL煮沸的樣品上樣至預(yù)制的SDS-PAGE凝膠夾盒(4-20％tris-甘氨酸梯度凝膠(1mm),(EC6025,Novex by Life Technologies,USA)中。將凝膠在200V，400mA下運(yùn)行1小時(shí)。用考馬斯藍(lán)染色劑對(duì)凝膠進(jìn)行染色過(guò)夜(SimplyBlueTMSafeStain,LC6060)。
基于SDS-PAGE的分析顯示β-乳球蛋白級(jí)分包含小于5％(以重量/重量計(jì))的α-乳白蛋白以及僅痕量的免疫球蛋白。
因此，提供具有高純度、高收率和高回收率的β-乳球蛋白級(jí)分。
參考
WO 92/00799
WO 92/18237
WO 97/17132
WO 00/57982
WO 98/33572