本發(fā)明屬于動物傳染病防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛支原體mbovp730蛋白及其應(yīng)用。經(jīng)過純化后的蛋白可以作為抗原蛋白在制備鑒別診斷野毒株mycoplasmabovishb0801感染和疫苗株mbovhb0801-150.2免疫試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牛支原體(mycoplasmabovis,m.bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物，是導(dǎo)致我國肉牛呼吸綜合征、運輸應(yīng)激綜合征和奶牛乳腺炎的主要病原體，臨床癥狀主要表現(xiàn)為肺炎，乳腺炎、關(guān)節(jié)炎，還可表現(xiàn)為中耳炎、結(jié)膜炎和生殖道炎癥等多種癥狀。牛支原體于1961年首次在美國發(fā)現(xiàn)，從患乳房炎奶牛的牛奶中分離得到。1976年證實其是導(dǎo)致肺炎的重要病原體。此后發(fā)現(xiàn)，牛支原體肺炎和乳腺炎在全世界廣泛流行(caswell等，2010；white等，2010)。據(jù)估計，歐洲每年約有25％～33％的犢牛肺炎是由牛支原體引起的，相當(dāng)于每年損失1.44～1.92億歐元,其中英國每年就有190萬頭牛患牛支原體肺炎，死亡達15.7萬頭。美國牛場牛支原體感染率可達70％，每年因牛支原體肺炎和乳腺疾病所造成損失也達1.40億美元。

隨著我國養(yǎng)牛業(yè)向規(guī)?；图s化發(fā)展，牛養(yǎng)殖量大大增加，專門化程度大幅度提高，肉?！爱惖赜省币殉蔀橹匾娜馀ｐB(yǎng)殖模式。長距離運輸是“異地運輸”的重要環(huán)節(jié)，運輸應(yīng)激可誘發(fā)多種重要疫病，牛支原體肺炎就是其中一種。該病2008年在湖北省首次報道(石磊等，2008)，從外地引進肉牛，在引進后2周左右發(fā)病，表現(xiàn)為發(fā)熱，咳嗽，流鼻涕，犢牛和體質(zhì)弱的牛發(fā)病嚴重。發(fā)病率為50％～100％。臨床治療周期長，效果差，病死率平均10％，可高達60％，主要病理變化為肺實變、化膿或干酪樣壞死，給我國養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大損失。繼2008年首次報道后，不同研究者均證實該病在全國廣泛流行(辛九慶等，2008；胡長敏等，2009)。

牛支原體無細胞壁，對常用β內(nèi)酰胺類抗生素不敏感，對其它藥物如四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)脂類和氟喹酪酮類等敏感藥物也很容易產(chǎn)生耐藥性(mustafa等,2013)。由于抗生素的不敏感，疫苗被認為是預(yù)防牛支原體病的有效措施。申請者先前將牛支原體野毒株(mycoplasmabovis hb0801)在體外連續(xù)傳代150代獲得疫苗株mbovhb0801-150.2，經(jīng)過牛體驗證該疫苗株免疫后對牛支原體野毒株攻擊具有良好的抵抗力(zhang等，2014)。

對m.bovishb0801(genbank登錄號：cp002058)和mbovhb0801-150.2的全基因組序列解析(qi等,2012)發(fā)現(xiàn)，mbovhb0801-150.2較m.bovishb0801缺失了長為14kb的dna片段，這為mbovhb0801-150.2免疫和m.bovishb0801感染的區(qū)分提供了良好的分子標(biāo)識。對缺失dna片段中的基因進行克隆表達，利用感染血清和疫苗免疫血清進行平行檢測，篩選發(fā)現(xiàn)一個能區(qū)分牛支原體野毒株感染和疫苗免疫的鑒別診斷標(biāo)識分子mbovp730。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其第一個目的是提供一個可以鑒別診斷牛支原體野毒株(m.bovishb0801)感染和牛支原體疫苗株(mbovhb0801-150.2)免疫的分子標(biāo)識牛支原體mbovp730蛋白。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種牛支原體mbovp730蛋白的抗體檢測方法，組裝用于區(qū)分牛支原體野毒株感染和牛支原體疫苗株elisa試劑盒中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

申請人于2008年6月從湖北省應(yīng)城市某養(yǎng)牛場發(fā)病的黃牛的肺組織中分離得到一株牛支原體mycoplasmabovishb0801，申請人將其命名為牛支原體hb0801，mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為cctccno：c2010040；同時將該分離株的基因組的核苷酸序列在genbank上登錄，登錄號為：cp002058。

以該株牛支原本基因組登錄號為cp002058)中的mbov_730基因序列為參照設(shè)計引物，從該菌基因組dna中克隆該基因，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏愛性，對mbov_730基因進行了修飾，將牛支原體色氨酸密碼子uga突變成大腸桿菌中的色氨酸密碼子ugg，進而在大腸桿菌中表達，得到了重組的牛支原體mbovp730蛋白(rmbovp730)。

進一步，本發(fā)明還公開了牛支原體mbovp730蛋白的純化方法。

生物驗證表明，本發(fā)明的rmbovp730蛋白可以作為鑒別診斷牛支原體野毒株感染和疫苗株免疫試劑盒中的應(yīng)用。

具體地，本發(fā)明的牛支原體mbovp730蛋白在區(qū)分牛支原體野毒株感染和疫苗株免疫中的應(yīng)用步驟包括：

利用間接elisa方法鑒別牛支原體野毒株感染，以rmbovp730蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板于4℃過夜，經(jīng)pbst洗滌后加入5％脫脂乳后在37℃封閉1h，再用pbst洗滌后加入檢測樣本于37℃孵育1h，樣本稀釋比例為1：1600。pbst洗滌后加入羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)二抗(1：5000，v/v)37℃孵育45min。最后用pbst洗滌后加入tmb底物顯色液顯色。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

疫苗株mbovhb0801-150.2免疫后，機體也會產(chǎn)生高水平血清抗體，但是現(xiàn)在國內(nèi)還沒有鑒別牛支原體野毒株感染和疫苗株免疫的診斷試劑盒。mbovp730蛋白是疫苗株mbovhb0801-150.2的缺失蛋白，又發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性，因此，使用rmbovp730蛋白構(gòu)建的間接elisa可以準(zhǔn)確區(qū)分牛支原體野毒株感染和疫苗株免疫，roc曲線分析表明以該蛋白建立的檢測方法特異性和敏感性都可以達到90％。

更詳細的發(fā)明方案見《具體實施方式》所述。

附圖說明

序列表seqidno:1是擴增mbov_730基因片段的引物730a1序列。

序列表seqidno:2是擴增mbov_730基因片段的引物/730a2序列。

序列表seqidno:3是擴增mbov_730基因片段的引物730b1序列。

序列表seqidno:4是擴增mbov_730基因片段的引物730b2序列。

序列表seqidno:5是擴增mbov_730基因片段的引物730c1序列。

序列表seqidno:6是擴增mbov_730基因片段的引物730c2序列。

序列表seqidno:7是擴增mbov_730基因片段的引物730d1序列。

序列表seqidno:8是擴增mbov_730基因片段的引物730d2序列。

序列表seqidno:9是擴增mbov_730基因片段的引物730e1序列。

序列表seqidno:10是擴增mbov_730基因片段的引物730e2序列。

序列表seqidno:11是擴增mbov_730基因片段的引物730f1序列。

序列表seqidno:12是擴增mbov_730基因片段的引物730f2序列。

序列表seqidno:13是保藏號為cctccno：m2010040的牛支原體mbovp730蛋白的核苷酸序列，序列長度為867bp。在該序列的471位，531位，615位，663位和738位發(fā)生等位基因突變。

序列表seqidno:14是保藏號為cctccno：m2010040的牛支原體mbovp730蛋白的蛋白質(zhì)序列，編碼288個氨基酸。

圖1：是本發(fā)明的起始質(zhì)粒(空載體)pet-30a的圖譜。pet-30a為一種商業(yè)質(zhì)粒(購自novagen公司)。

圖2：是本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730的圖譜。附圖標(biāo)記說明：重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730是由pet-30a質(zhì)粒和突變后的mbov_730基因全長經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后連接后重組而成。

圖3：是本發(fā)明實施例的牛支原體mbovp730蛋白純化的sds-page膠圖。附圖標(biāo)記說明：泳道：m蛋白marker；1為誘導(dǎo)前的含重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730的bl21表達菌；2為誘導(dǎo)后的含重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730的bl21表達菌；3為含有重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730的bl21表達菌破碎后上清上ni柱后的穿流液；4為純化后的牛支原體mbovp730重組蛋白。

圖4：是westernblot檢測牛支原體mbovp730蛋白特異性圖。附圖標(biāo)記說明：泳道：m蛋白marker；1為牛支原體hb0801株全菌蛋白；2為牛支原體mbovis-150株全菌蛋白；3為無乳支原體pg2株全菌蛋白；4為巴氏桿菌全菌蛋白；5為溶血曼氏桿菌全菌蛋白；6為牛結(jié)核分枝桿菌全菌蛋白；7為牛傳染性鼻氣管炎病毒總蛋白。

圖5：包被牛支原體hb0801株全菌蛋白篩選牛支原體自然感染血清結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：f1為牛支原體hb0801株自然感染血清；f150為mbovhb0801-150.2疫苗株免疫后血清；陰性：牛支原體陰性血清

圖6：包被rmbovp730通過間接elisa鑒別牛支原體自然感染與疫苗免疫。附圖標(biāo)記說明：牛支原體自然感染和疫苗株免疫檢測及閾值的確定，閾值為0.673時，敏感性為95.45％，特異性為90.91％。

具體實施方式

實施例1：牛支原體mbov_730蛋白的克隆表達

1.1牛支原體mbov_730基因克隆表達

由于大腸桿菌對密碼子的偏愛性，牛支原體中編碼色氨酸的密碼子uga在大腸桿菌被用作終止子，因此，用大腸桿菌表達牛支原體mbov_730基因時，需要對支原體mbov_730基因進行突變，即，使牛支原體密碼子uga突變?yōu)槟茉诖竽c桿菌中表達色氨酸的密碼子ugg。

申請人將突變后得到大腸桿菌命名為大腸桿菌pet-30-mbov-730，escherichiacoli，pet-30-mbov-730，于2015年12月18日送中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏， 保藏編號為cctccno：m2015762。

本實施例利用pcr引物對相應(yīng)基因進行突變。用于突變的起始菌株是牛支原體hb0801，該菌株是申請人2008年6月從湖北省應(yīng)城市某養(yǎng)牛場發(fā)病的黃牛的肺組織中分離得到，申請人將其命名牛支原體hb0801，mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為cctccno：c2010040。該牛支原體的基因組已在genbank登錄，登錄號為：cp002058。

以登錄號為為cp002058的mbov_730基因為模板，利用如下設(shè)計的6個引物對(編號分別為：730a1/730a2，730b1/730b2，730c1/730c2，730d1/730d2，730e1/730e2，730f1/730f2)分別擴增出突變后的mbov_730基因的6個片段，然后，以突變后的6個片段為模板，使利用730a1/730f2擴增出突變后的mbov_730基因的全序列，序列長度為867bp(見序列表seqidno:13)。

具體引物序列如下：

(1)730a1/730a2擴增片段在mbov_730基因中的位置為863600-863101，pcr擴增產(chǎn)物長度為509bp。

正向引物730a1:5’gaattcatgcctaatgatggttca3’(下劃線部分為ecori酶切位點，波浪線部分為保護性堿基；即序列表seqidno：1所示的序列)。

反向引物730a2：5’acaatttttttgccattttttatactgatccagttttta3’(下劃線部分為突變位點，由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：2所示的序列)。)

(2)730b1/730b2擴增片段在mbov_730基因中的位置為863140-863045，pcr擴增產(chǎn)物長度為96bp。

正向引物730b1：5’ataaaaactggatcagtataaaaaatggcaaaaaaattgt3’(下劃線部分為突變位點，由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：3所示的序列)。

反向引物730b2：5’gaagaacagtgagcttaattcctgtccaatc3’(下劃線部分為突變位點，由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：4所示的序列)。

(3)730c1/730c2擴增片段在mbov_730基因中的位置為863081-862913，pcr擴增產(chǎn)物長度為169bp。

正向引物730c1：5’cacaaagattggacaggaattaagctcact3’(下劃線部分為突變位點，由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：5所示的序列)。

反向引物730c2：5’cagcatacttaatatttgatgtatcccattcattaaggtt3’(下劃線 部分為突變位點，由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：6所示的序列)。

(4)730d1/730d2擴增片段在mbov_730基因中的位置為862952-862846，pcr擴增產(chǎn)物長度為107bp。

正向引物730d1：5’aaccttaatgaatgggatacatcaaatattaagtatgctg3’(下劃線部分為突變位點，由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：7所示的序列)。

反向引物730d2：5’acgctacctctaattttccaattttttaaagactgatcta3’(下劃線部分為突變位點，由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：8所示的序列)。

(5)730e1/730e2擴增片段在mbov_730基因中的位置為862875-862771，pcr擴增產(chǎn)物長度為105bp。

正向引物730e1：5’tttaaaaaattggaaaattagaggtagcgttaataccaag3’(下劃線部分為突變位點，由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：9所示的序列)。

反向引物730e2：5’gttttccaagcggtagccatatcctt3’(下劃線部分為突變位點，由t突變?yōu)閏；即序列表seqidno：10所示的序列)。

(6)730f1/730f2擴增片段在mbov_730基因中的位置為862797-862734，pcr擴增產(chǎn)物長度為73bp。

正向引物730f1：5’aaaggatatggctaccgcttggaaaac3’(下劃線部分為突變位點，由a突變?yōu)間；即序列表seqidno：11所示的序列)。

反向引物730f2：5’aagcttttatgcttttttatagttatatagcatattt3’(下劃線部分為hindiii酶切位點，波浪線部分為保護性堿基；即序列表seqidno：1所示的序列)。

以上6個片段的反應(yīng)體系如下：

模板dna2.5μl，pfu酶(thermo)1.5μl，pfubufferwithmgso4(thermo)5μl，10倍dntpmix(thermo)1μl，引物各2μl，超純水36μl。

回收上述六個片段的pcr擴增產(chǎn)物，以此為模板，使用引物730a1至730f2擴增突變后的mbov_730基因，其pcr反應(yīng)體系如下：每個片段2.5μl，pfu酶(thermo)1.5μl，pfubufferwithmgso4(thermo)5μl，10倍dntpmix(thermo)1μl，引物各2μl，超純水36μl。上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

回收mbov_730基因擴增產(chǎn)物，用ecori和hindiii酶切，同時將pet-30a質(zhì)粒(購自默克中國有限公司)用ecori和hindiii進行雙酶切。將酶切后的mbov_730基因和pet-30a質(zhì)粒用dna連接酶(t4dnaligase)連接，得到重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730(見圖2)。用 該重組質(zhì)粒pet-30-mbov_730轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后，置于37℃搖床在180r/min下培養(yǎng)12小時，提取質(zhì)粒經(jīng)過測序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，將該大腸桿菌在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od＝0.6時取1ml菌液作為誘導(dǎo)前對照，同時加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.8mm，37℃搖床誘導(dǎo)表達3小時。取1ml菌液進行處理。樣品處理方法為12000r/min離1min后棄掉上清加入1ml磷酸鹽緩沖液即pbs(配方：kcl0.2g，nacl8g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，1000ml蒸餾水，ph＝7.6)溶液重懸后再以12000r/min離心1min棄掉上清，然后加入30ul的pbs和30ul上樣緩沖液(購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司，1mtris-hcl，ph＝6.8)1ml，200mmddt0.31g，4％sds0.4g，0.2％溴酚藍0.02g，20％甘油2ml，7ml超純水)重懸。100℃沸水中煮沸10min。用sds-page凝膠電泳鑒定是否表達。

1.2牛支原體rmbovp730蛋白的純化

將重組的大腸桿菌bl21按上述方法誘導(dǎo)表達后，取菌液8000r/min離心10min后棄掉上清，用500ml的pbs洗一次后在8000r/min離心10min，再重復(fù)用500ml的pbs洗一次。棄掉上清后加入30ml的pbs重懸，加入蛋白酶抑制劑(購自羅氏公司)，使用液壓破碎儀破碎。破碎后以12000r/min離30min，取30μl上清加入30μl上樣緩沖液，在沸水中煮沸10min作為上清組。取一點沉淀加入30μl的pbs和30μl上樣緩沖液煮沸10min作沉淀組。經(jīng)過sds-page凝膠電泳后，確定rmbovp730蛋白大部分表達于上清中。

rmbovp730蛋白具體純化步驟如下：

(1)向親和層析柱中加入1mlni-nta金屬螯合his蛋白純化介質(zhì)填料(購自ge公司)；

(2)向親和層析柱中加入12mlddh2o洗滌；

(3)加入12ml的bindingbuffer緩沖液(20mmna3po4，0.5mnacl，20mm咪唑，ph＝7.4)平衡柱子；

(4)加入經(jīng)過0.45μm孔徑濾器過濾的蛋白表達上清，收集前幾滴濾出的液體，編號為1；

(5)加入50mlbindingbuffer平衡柱子，收集前幾滴液體，編號為2；

(6)加入50mlwashingbuffer(20mmna3po4，0.5mnacl，60mm咪唑，ph＝7.4)洗去雜蛋白，收集前幾滴，編號為3；

(7)加入12mlelutebuffer(20mmna3po4，0.5mnacl,1m咪唑，ph＝7.4)洗脫目的蛋白，收集前幾滴，編號為4；

(8)將編號為1到4的管中各加入50μl上樣緩沖液煮沸10min；

(9)配置sds-page聚丙酰胺凝膠，將處理好的樣品加入孔中(20μl/每孔)，電泳(濃縮膠電泳條件為直流電壓為80伏特，分離膠電泳條件為直流電壓為120伏特)，電泳完成后，取下凝膠用考馬斯亮藍染色過夜。然后脫色，確定得到純化的目的蛋白。

實施例2：牛支原體rmbovp730蛋白特異性檢測

2.1多克隆抗體的制備

利用上述制備的rmbovp730蛋白免疫balb/c小鼠，免疫程序如下：

(1)初次免疫,牛支原體rnox抗原100μg/只鼠,加弗氏完全佐劑頸背部皮下多點注射，0.2ml/只鼠。

(2)二周后，第二次免疫,牛支原體rmbovp730抗原劑量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐劑頸背部皮下多點注射。

(3)四周后，第三次免疫,牛支原體rmbovp730抗原劑量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐劑頸背部皮下多點注射。

(4)7天后，剪尾尖采血，分離血清，用間接法elisa測其效價，即用牛支原體rnox抗原包板，加入小鼠血清稀釋品于37℃孵育，洗板后加入hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗(購自southernbiotech公司)于37℃孵育，洗板后加入tmb底物顯色。選取效價高的血清做多克隆抗體使用。

2.2mbovp730蛋白特異性檢測

在pplo培養(yǎng)基(pplo10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸鈉0.5g，超純水定容至440ml，121℃滅菌20min后，加入馬血清50ml，滅菌10×mem5ml,無菌8萬單位/ml青霉素溶液5ml，無菌1％酚紅溶液500μl)中分別培養(yǎng)牛支原體hb0801株(cctcc保藏編號cctccno：m2010040)、牛支原體(疫苗株)mbovhb0801-150.2，(該牛支原體mbovhb0801-150.2，mycoplasmabovismbovhb0801-150.2于2011年3月31日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏；保藏編號cctccno:m2011102)、無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株pg2(購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號atccno:35890)。在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴氏桿菌(pm-al)株和溶血曼氏桿菌mh-l株(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室病毒份室臨床分離保存株，文獻見謝倩茹等，2015)，在7h9(4.7g7h9粉末溶解于900ml蒸餾水中(含甘油2ml或者0.5g吐溫-80)，121℃，10min高壓蒸汽滅菌。在培養(yǎng)基溫度降至45℃時，無菌條件下加入100mloadc增菌液(bd公司))中培養(yǎng)牛結(jié)核分枝桿菌1458株(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室病毒份室臨床分離鑒定，文獻見chenetal.,2009)，在牛腎細胞中培養(yǎng)牛傳染性鼻氣管炎病毒bhv-1株(文獻見zhangetal.,2011)。除結(jié)核分枝桿菌全菌蛋白是通過加入2×sds加熱(95℃，30min)獲得外，其余全菌蛋白都通過超聲破碎(功率200w，破碎時間20分鐘)獲得。取hb0801株全菌蛋白、mbovis-150株全菌蛋白、無乳支原體全菌蛋白、巴氏桿菌全菌蛋白、溶血曼氏桿菌全菌蛋白、牛結(jié)核分枝桿菌全菌蛋白、牛傳染性鼻氣管炎病毒總蛋白進行sds-page電泳，經(jīng)過濕轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上(50v，120min)，5％脫脂奶在4℃封閉過夜，tbst洗膜三次，用制備的多克隆抗體(1：500稀釋)做為一抗在室溫下作用1小時，用tbst洗膜三次，與1：10000倍稀釋的hrp-羊抗鼠igg孵育1小時，用tbst洗膜三次，再用tbs洗膜三次，用supersignalwestpicotrialkit(購自thermoscientific)顯色。結(jié)果顯示多克隆抗體可以識別36kd左右的目標(biāo)蛋白(mbovp730)，在牛支原體hb0801株和無乳支原體pg2株中可以檢測到這一特定大小的目的蛋白。

實施例3：牛支原體mbovp730蛋白在區(qū)分牛支原體野毒株自然感染和牛支原體疫苗株免疫中的應(yīng)用

3.1以m.bovishb0801全菌蛋白為包被抗原通過間接elisa方法檢測血清

(1)動物血清樣本收集：牛支原體野毒株自然感染血清來源于臨床試驗的牛支原體疑似感染牛，牛支原體疫苗株mbovhb0801-150.2(即牛支原體mbovhb0801-150.2)(由m.bovishb0801體外接種pplo液體培養(yǎng)基，3天為一代，體外連續(xù)傳代150代所得)免疫血清來源于臨床試驗，陰性血清來源于臨床免疫實驗的空白組。

(2)全菌蛋白制備：m.bovishb0801在pplo培養(yǎng)基上(配制方法：取pplo粉10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸鈉0.5g，用超純水定容至440ml，121℃滅菌20min后，加入馬血清50ml，滅菌10×mem5ml,無菌8萬單位/ml青霉素溶液5ml，無菌1％酚紅溶液500μl)培養(yǎng)2天，取100ml培養(yǎng)液于10000rpm下離心10分鐘，用pbs洗滌2次后，加入1ml的pbs重懸沉淀。使用超聲破碎儀破碎(功率200w，破碎時間20分鐘)，取破碎后的蛋白凍存于-20℃。

(3)包被：用包被液(na2co31.59g，nahco32.93g，加ddh2o至1000ml)稀釋濃縮后的m.bovishb0801hb0801全菌蛋白，96孔酶標(biāo)板按每孔1250ng的量加入稀釋后的m.bovishb0801全菌蛋白液100μl，4℃包被過夜。棄去包被液，每孔加300μlpbst緩沖液(配制方法，pbs緩沖液配制:nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o2.9g，nah2po40.2g，加ddh2o至1000ml。pbst緩沖液配制:加入0.05％的tween-20到pbs中即為pbst緩沖液)洗滌3次，每次2分鐘。

(4)封閉：向96孔酶標(biāo)板每孔加入100μl5％的脫脂牛奶(5g脫脂牛奶加pbst至100ml)，置于37℃溫箱中封閉1h，甩干封閉液，加入300μl的pbst洗3次，每次2分鐘。

(5)加樣：用pbst(按500μl吐溫-20加入1000mlpbs制成)以1:100(v/v)比例稀釋待檢測的血清，向96孔酶標(biāo)板每孔加100μl稀釋后的血清，37℃下培養(yǎng)1h；甩干孔中溶液，加入300μl的pbst洗3次，每次2分鐘。

(6)加羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)二抗)：用pbst(按500μl吐溫-20加入1000mlpbs制成)以1:5000(v/v)的比例稀釋酶標(biāo)二抗(購自southernbiotech公司)，向96孔酶標(biāo)板每孔加入100μl稀釋后的羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)二抗，置于37℃孵育60分鐘；甩干孔中溶液，加入300μlpbst洗5次，每次2分鐘。

(7)加底物顯色：向96孔酶標(biāo)板每孔加入tmb底物顯色液a液和tmb底物顯色液b液(購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司)各50μl，避光顯色10min；每孔加50μl終止液(購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司)終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在630nm波長下測定od630值。

(8)以17份陰性血清od值為樣本計算出平均值(m)和標(biāo)準(zhǔn)差(sd)，待檢測血清od值大于m+2sd時被認為是陽性。將篩選出的陽性血清、免疫后血清、空白組血清使用graphpad軟件進行差異分析。

3.2以本發(fā)明的rmbovp730蛋白為抗原的間接elisa鑒別牛支原體疫苗免疫與野毒株自然感染

以3.1篩選到的陽性血清為牛支原體野毒株自然感染的血清和以牛支原體疫苗株mbovhb0801-150.2免疫后的血清為一抗，通過上述2.1的步驟所述方法檢測血清樣本，血清樣本檢測值見表1。根據(jù)檢測值使用graphpad軟件確定閾值。

表1牛支原體野毒株自然感染和疫苗株免疫后血清鑒別診斷值

實施例3：牛支原體rmbovp730蛋白區(qū)分牛支原體野毒株自然感染和牛支原體疫苗株免疫elisa試劑盒的組裝

本實施例的elisa試劑盒主要核心試劑包括rmbovp730蛋白(作抗原用)包被板2塊(為96孔酶標(biāo)板，50ng/孔)，牛支原體elisa陰性(即牛支原體疫苗株mbovhb0801-150.2免疫后血清)，牛支原體陽性對照(m.bovishb0801自然感染血清)各1管(0.5ml/管)，樣品稀釋液1瓶(40ml/瓶)，羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)記二抗1管(200μl/管)，20倍濃縮洗滌液1瓶(30ml/瓶)，tmb底物顯色液a液，tmb底物顯色液b液各1瓶(10ml/瓶)，終止液1瓶(10ml/瓶)；其余試劑按以下步驟配制：

(1)20倍濃縮洗滌液：nacl160g、kcl4g、na2hpo4·12h2o58g、kh2po44g，tween-2010ml定容至1000ml純化水中。

(2)羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)二抗：購自southernbiotech，用保護劑(含1％bsa的pbst溶液(m/v)稀釋至1:500倍中間濃度。

(3)封閉液：含5％脫脂乳的磷酸鹽緩沖液。

(4)樣品稀釋液：含0.05％的tween-20的磷酸鹽緩沖液。

(5)底物液：tmb底物顯色液a液配制：na2hpo414.6g，檸檬酸9.33g，過氧化氫脲0.52g，加純化水至1000ml，調(diào)至ph值5.0～5.4；tmb底物顯色液b液配制：tmb20mg，無水乙醇10ml，加純化水至1000ml。

(6)終止液：0.25％氫氟酸。

名詞術(shù)語說明：

在本說明書中：

牛支原體野毒株，以mycoplasmabovishb0801表示，簡寫為m.bovishb0801；

牛支原體疫苗株，以mbovhb0801-150.2表示。

主要參考文獻

1.謝倩茹，姜鵬，彭清潔等.牛溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌a型、b型的比較鑒定研究.中國奶牛，2015，14:0048‐0053.

2.cheny,chaoy,dengq,etal.potentialchallengestothestoptbplanforhumansinchina；cattlemaintainm.bovisandm.tuberculosis.tuberculosis,2009,89:95‐100.

3.zhangm,fus,dengm,etal.attenuationofbovineherpesvirustype1bydeletionofitsglycoproteingandtkgenesandprotectionagainstvirulentviralchallenge.vaccine,2011,29(48):8943‐50。