本發(fā)明屬于肽的合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種樹脂催化法合成偽脯氨酸雜環(huán)肽的方法。

背景技術(shù)：

生物合成的多肽和蛋白質(zhì)中所有的氨基酸序列均以trans構(gòu)型的狀態(tài)存在；在核糖體中蛋白質(zhì)生物合成形成二級(jí)結(jié)構(gòu)中已經(jīng)開始形成，并且是一個(gè)快速的過程，而cis/trans異構(gòu)化是蛋白質(zhì)總體折疊速率的瓶頸。在多肽序列中，脯氨酸同其前的氨基酸殘基所形成的酰胺肽鍵稱為肽脯酰胺鍵(xaa-probond)，cis肽鍵在蛋白中很少見，但是含有脯氨酸的xaa-probond卻含有10-30％的cis式比率，在短鏈多肽溶液中，cis/trans構(gòu)象的比率甚至相等。

xaa-probond的這種不尋常的cis/trans比率的分配，可用脯氨酸的特殊結(jié)構(gòu)來解釋。脯氨酸與一般的α-氨基酸不同，其沒有自由的α-氨基，而是以亞氨基連接在α碳原子上，因此是一種α-亞氨基酸。xaa-probond的cis/trans平衡，對(duì)環(huán)境條件的變化很敏感，有眾多的影響因素。這表明cis/trans異構(gòu)化的xaa-pro肽鍵往往是參與決定各種蛋白質(zhì)折疊和復(fù)性反應(yīng)速度的步驟。cis/trans是xaa-probond最為穩(wěn)定的兩種構(gòu)象，這種cis到trans的轉(zhuǎn)換，可以形象地稱其為分子開關(guān)，在生命現(xiàn)象發(fā)揮著重大的調(diào)控作用。這種轉(zhuǎn)換影響的因素非常多，可能會(huì)導(dǎo)致一些蛋白結(jié)構(gòu)、活性變化，從而引發(fā)疾病，如癌癥，老年癡呆癥。鑒于cis/trans的重要性不僅在高分子結(jié)構(gòu)中如蛋白質(zhì)，而且在規(guī)模較小的分子肽樣多肽等一些模型系統(tǒng)中已經(jīng)提出了準(zhǔn)確了解以分子為基礎(chǔ)的動(dòng)力學(xué)過程。

實(shí)現(xiàn)這一途徑的方法是用非天然類似物替換pro，以增大pro在多肽和蛋白質(zhì)骨架中的影響作用，例如通過ψpro提高xaa-pro鍵中的cis構(gòu)象的比率。除了為ser、thr和cys提供一個(gè)正交保護(hù)技術(shù)(ψpro的脯氨酰環(huán)對(duì)強(qiáng)酸敏感，遇強(qiáng)酸時(shí)ψpro的脯氨酰環(huán)裂解)，還能為多肽和蛋白質(zhì)的固相合成(spps)提供二級(jí)結(jié)構(gòu)擾亂劑。另外，有研究顯示：替代的雜環(huán)原子xaa-ψpro肽鍵的cis構(gòu)象的含量和比率的增加可能有助于減少肽鍵之間的電子密度和不同的環(huán)型折疊。

科學(xué)證實(shí)偽脯氨酸二肽可以用作ser、thr和cys的可逆保護(hù)基并且被證明是肽化學(xué)領(lǐng)域中克服某些內(nèi)在問題的萬能工具。肽序列中ψpro的存在引起了認(rèn)為是分子間聚集來源的β-折疊結(jié)構(gòu)的破壞。在肽組裝例如fmoc固相肽合成中引起溶劑化和偶聯(lián)動(dòng)力學(xué)的增加使鏈長延長容易，特別是對(duì)于包含“困難序列”的肽。

將偽脯氨酸二肽用于多肽藥物的合成已有文獻(xiàn)報(bào)道，中國專利cn102942625a報(bào)道了一種艾塞那肽的固相合成方法，采用氨基樹脂作為載體，在偶聯(lián)溶劑中依肽序連接偽脯氨酸二肽，制得側(cè)鏈全保護(hù)的艾塞那肽氨基樹脂，最后裂解脫除側(cè)鏈保護(hù)基，得到艾塞那肽藥物。專利cn104017064a公開了一種制備特立帕肽的方法，在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和fmoc-phe-oh偶聯(lián)得到fmoc-phe-樹脂，然后通過固相合成法在肽序的16-17位氨基酸引入偽脯氨酸二肽fmoc-asn(trt)-ser(ψme,mepro)-oh，最終得到純度高的特立帕肽。專利cn104418948a公開了一種多肽藥物diapep277的合成方法，以樹脂p作為載體，得到fmoc-asp(otbu)-p樹脂，然后通過與一個(gè)偽脯氨酸二肽fmoc-asp(otbu)-ser(ψme,mepro)-oh進(jìn)行偶聯(lián)，最終得到diapep277多肽。上述文獻(xiàn)中的多肽藥物的合成均應(yīng)用到了偽脯氨酸二肽(是一種雜環(huán)肽)，但是關(guān)于偽脯氨酸二肽的合成方法并未報(bào)道。

關(guān)于偽脯氨酸雜環(huán)肽的合成：有文獻(xiàn)(cn101472939a)經(jīng)過反復(fù)成鹽縮合，操作復(fù)雜，總收率低；另有文獻(xiàn)記載可采用對(duì)甲苯磺酸或者吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽進(jìn)行催化，但是利用常規(guī)的酸催化縮合所造成的弊端是必須除盡酸才能得到高純度的產(chǎn)品。而要除掉酸，必須有水分參與，而雜環(huán)二肽產(chǎn)品在酸水體系中穩(wěn)定性極差，容易分解成原料，導(dǎo)致產(chǎn)品的收率低，很難得到理想收率和純度的目標(biāo)品。文獻(xiàn)方法經(jīng)回流反應(yīng)20小時(shí)后，仍然反應(yīng)不完全，而且產(chǎn)物雜質(zhì)多，成份復(fù)雜，需要柱層析純化，產(chǎn)物收率不到40％。

因此，能否避開酸水共存的體系，提供一種既能使得催化反應(yīng)順利進(jìn)行，又能保證目標(biāo)產(chǎn)物收率高，雜質(zhì)成分少的雜環(huán)肽的合成方法，成為亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了解決上述技術(shù)問題，而提供一種樹脂催化法合成偽脯氨酸雜環(huán)肽的方法，具備反應(yīng)過程簡單，產(chǎn)品收率高，雜質(zhì)含量少，且無需堿溶液后處理，制備成本低廉，能夠適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種樹脂催化法合成偽脯氨酸雜環(huán)肽的方法，包括如下步驟：

(1)將經(jīng)氨基保護(hù)的α-氨基酸與絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸中的一種進(jìn)行反應(yīng)生成二肽；

(2)將步驟(1)所得二肽在催化劑的作用下與2,2-二甲氧基丙烷進(jìn)行縮合反應(yīng)，所述催化劑為dowex50樹脂；

(3)將縮合反應(yīng)所得物經(jīng)過濾除去催化劑，然后經(jīng)濃縮分離得到目標(biāo)產(chǎn)物偽脯氨酸雜環(huán)肽。

其中，所述偽脯氨酸雜環(huán)肽具有如下結(jié)構(gòu)式ⅰ：

其中，r1是氨基保護(hù)基，r2是α-氨基酸側(cè)鏈，x是o或s；當(dāng)x是o時(shí)，r3是h或ch3，當(dāng)x是s時(shí)，r3是h。

本發(fā)明采用酸性樹脂dowex50樹脂作為二肽縮合反應(yīng)的催化劑，發(fā)現(xiàn)該樹脂催化劑既能很好地催化縮合反應(yīng)形成偽脯氨酸雜環(huán)肽，所得偽脯氨酸雜環(huán)肽又能不經(jīng)過堿處理就能很好地除去催化劑，后處理簡單，偽脯氨酸雜環(huán)肽的收率高達(dá)90％，純度達(dá)97％。

進(jìn)一步的，所述催化劑dowex50樹脂的用量為二肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5～10％。

進(jìn)一步的，步驟(2)中所述縮合反應(yīng)的操作為：將步驟(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，向其中加入催化劑dowex50樹脂，然后在攪拌狀態(tài)下加熱回流1～3h。

進(jìn)一步的，步驟(2)中所述濃縮分離的操作為：將反應(yīng)結(jié)束濾去催化劑的反應(yīng)液進(jìn)行濃縮，濃縮后的剩余物在乙酸乙酯-石油醚中進(jìn)行重結(jié)晶，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

進(jìn)一步的，對(duì)α-氨基酸的氨基采用fmoc進(jìn)行保護(hù)。

進(jìn)一步的，步驟(1)中將絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸的羧基先進(jìn)行芐基保護(hù)后再與α-氨基酸反應(yīng)生成二肽。

進(jìn)一步的，步驟(3)在縮合反應(yīng)結(jié)束后，還包括脫除芐基的步驟，操作如下：將縮合反應(yīng)產(chǎn)物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量的5％pd-c催化劑和2～3當(dāng)量的甲酸，于室溫下攪拌12h，反應(yīng)結(jié)束后停止反應(yīng)，濾除催化劑，再進(jìn)行濃縮分離操作。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的偽脯氨酸雜環(huán)肽的合成方法，選取酸性dowex50樹脂作為縮合反應(yīng)的催化劑，制備得到了偽脯氨酸雜環(huán)肽，經(jīng)檢測(cè)，所得偽脯氨酸雜環(huán)肽產(chǎn)品的收率可達(dá)85％以上，純度達(dá)96％以上。產(chǎn)物中雜質(zhì)含量少，且后處理簡單，無需堿液去除酸，與現(xiàn)有的合成方法(cn101472939a)相比，產(chǎn)物的獲得不需要反復(fù)成鹽和解鹽，產(chǎn)物的純化也無需反復(fù)柱層析，工藝成本大大降低。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要指出的是，以下實(shí)施例僅僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋和說明，并不用于限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

按照以下方法合成偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅰ)：

(1)將經(jīng)fmoc保護(hù)的異亮氨酸(n-芴甲氧羰基-l-異亮氨酸)，與絲氨酸反應(yīng)生成二肽，其中絲氨酸的羧基經(jīng)過芐基保護(hù)，二肽的合成方法按照現(xiàn)有的常規(guī)方法，得到二肽的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，bn為芐基；

(2)將步驟(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，然后向其中加入催化劑dowex50樹脂，催化劑用量為二肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5％，然后加熱回流攪拌2h，采用薄層監(jiān)測(cè)縮合反應(yīng)是否完畢；

(3)將縮合反應(yīng)產(chǎn)物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量的5％pd-c催化劑和2當(dāng)量的甲酸，室溫下攪拌12小時(shí)左右，采用薄層監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢后停止反應(yīng)，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行過濾除去dowex50樹脂，然后經(jīng)濃縮分離，得到白色固體殘余物，將該白色固體殘余物在乙酸乙酯-石油醚中進(jìn)行柱層析，然后經(jīng)重結(jié)晶，得到目標(biāo)產(chǎn)物偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅰ)。

偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅰ)的結(jié)構(gòu)式如下：

經(jīng)測(cè)定，偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅰ)的收率為85.7％，純度為97.1％。

氫譜測(cè)定結(jié)果為：h1-nmr

7.74(dd,1h)；7.73(dd,1h)；7.56(dd,1h)；7.54(dd,1h)；7.34-7.38(m,)；7.31-7.26(s,1h)；5.58-5.56(d,1h)；5.12-5.19(t,1h),4.29-4.40(m,3h),4.14-4.17(t,1h)；3.93-3.97(q,2h),1.43-1.56(t,3h),1.59-1.62(t,3h),0.90-0.92(t,3h)。

實(shí)施例2

按照以下方法合成偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅱ)：

(1)將經(jīng)fmoc保護(hù)的異亮氨酸(n-芴甲氧羰基-l-異亮氨酸)，與蘇氨酸反應(yīng)生成二肽，其中蘇氨酸的羧基經(jīng)過芐基保護(hù)，二肽的合成方法按照現(xiàn)有的常規(guī)方法，得到二肽的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，bn為芐基；

(2)將步驟(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解，然后向其中加入催化劑dowex50樹脂，催化劑用量為二肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的10％，然后加熱回流攪拌2h，采用薄層監(jiān)測(cè)縮合反應(yīng)是否完畢；

(3)將縮合反應(yīng)產(chǎn)物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量5％的pd-c催化劑和3當(dāng)量的甲酸，室溫下攪拌12小時(shí)左右，采用薄層監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢后停止反應(yīng)，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行過濾除去dowex50樹脂，然后經(jīng)濃縮分離，得到白色固體殘余物，將該白色固體殘余物在乙酸乙酯-石油醚中進(jìn)行柱層析，然后經(jīng)重結(jié)晶，得到目標(biāo)產(chǎn)物偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅱ)。

偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅱ)的結(jié)構(gòu)式如下：

經(jīng)測(cè)定，偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅱ)的收率為87.1％，純度為97.6％。

實(shí)施例3

按照以下方法合成偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅲ)：

(1)將經(jīng)fmoc保護(hù)的亮氨酸(fmoc-l-亮氨酸)，與半胱氨酸反應(yīng)生成二肽，其中半胱氨酸的羧基經(jīng)過芐基保護(hù)，二肽的合成方法按照現(xiàn)有的常規(guī)方法，得到二肽的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，bn為芐基；

(2)將步驟(1)所得二肽先用2,2-二甲氧基丙烷溶解后，向其中加入催化劑dowex50樹脂，催化劑用量為二肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5％，然后加熱回流攪拌2h，采用薄層監(jiān)測(cè)縮合反應(yīng)是否完畢；

(3)將縮合反應(yīng)產(chǎn)物溶于甲醇溶液中，向其中加入催化量5％的pd-c催化劑和2當(dāng)量的甲酸，室溫下攪拌12小時(shí)左右，采用薄層監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢后停止反應(yīng)，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行過濾除去dowex50樹脂，然后經(jīng)濃縮分離，得到白色固體殘余物，將該白色固體殘余物在乙酸乙酯-石油醚中進(jìn)行柱層析，然后經(jīng)重結(jié)晶，得到目標(biāo)產(chǎn)物偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅲ)。

偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅲ)的結(jié)構(gòu)式如下：

經(jīng)測(cè)定，偽脯氨酸雜環(huán)肽(ⅲ)的收率為90.7％，純度為97.3％。