本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法。

背景技術(shù)：

雞蛋作為人們膳食中獲取蛋白質(zhì)的主要食品，深受人們的青睞。雞蛋蛋清主要由蛋白質(zhì)和水組成，占整個蛋重的60％以上，其中富含多種生物活性蛋白，主要有占54％的卵白蛋白、占13％的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、占11％的卵類黏蛋白等，這些蛋白的生物活性功能已經(jīng)得到人們越來越廣泛的認(rèn)可。

我國雖然是雞蛋產(chǎn)量大國，連續(xù)數(shù)年雞蛋總產(chǎn)量位居世界第一，然而，蛋品加工業(yè)發(fā)展緩慢，產(chǎn)品附加值較低。在蛋品生產(chǎn)過程中，由于飲食習(xí)慣和食品行業(yè)的特殊需求，以蛋黃為原料生產(chǎn)卵磷脂、膽堿等已實現(xiàn)工業(yè)化，蛋黃需求量較大，而蛋清在生產(chǎn)過程中卻被大量丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。同時，有醫(yī)學(xué)研究者認(rèn)為雞蛋是不健康的食品，主要原因是雞蛋中膽固醇和脂肪含量較高，尤其不適合老年人食用。

常用的蛋白質(zhì)提取方法有水溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法和酶法提取；但是，水溶液提取法提取率低，提取時間較長；有機(jī)溶劑提取法需要鹽析及透析等步驟除雜，操作繁瑣且存在有害物質(zhì)殘留；酶法提取具有時間短、反應(yīng)條件溫和、且不會產(chǎn)生有害物質(zhì)等優(yōu)點，但是該法成本較高，同時胰蛋白酶對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。因此，采用簡單、快速的方法有效提取雞蛋蛋清中的活性蛋白，對充分利用我國豐富的禽蛋資源，提高蛋產(chǎn)品附加值，推動雞蛋清中的蛋白質(zhì)在食品、醫(yī)藥及保健品當(dāng)中的應(yīng)用具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法，該方法可快速簡單的對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，且提取率高。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

一種雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，取新鮮雞蛋清硬性發(fā)泡，然后干燥，再將干燥后的雞蛋清碾磨，過篩，得雞蛋清粉末，備用；

步驟2，向所述雞蛋清粉末中加入提取劑，并同時置于超聲波和微波的條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，提取后離心，取上清液，即得蛋白質(zhì)粗品。

優(yōu)選地，步驟1中，所述干燥為冷凍干燥。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述冷凍干燥的溫度為-60℃～60℃，所述冷凍干燥的時間為至少12小時。

優(yōu)選地，步驟1中，所述過篩的篩孔為40目。

優(yōu)選地，步驟2中，所述提取劑為去離子水。

優(yōu)選地，步驟2中，所述雞蛋清粉末與所述提取劑的比例為1g:(4-20)ml。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雞蛋清粉末與所述提取劑的比例為1g:(10.5-13.5)ml。

優(yōu)選地，步驟2中，所述超聲波的功率密度為440～920w/dm³。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述超聲波的功率密度為650～750w/dm³。

優(yōu)選地，步驟2中，所述微波的功率密度為600～1400w/dm³。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微波的功率密度為900～1100w/dm³。

優(yōu)選地，步驟2中，所述提取的時間為3min～15min。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述提取的時間為7.5min～10.5min。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明采用超聲波協(xié)同微波的方式對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，提取劑采用去離子水而非有機(jī)溶劑，具有提取效率高、用時短、操作簡單、安全、環(huán)保等優(yōu)點。本發(fā)明提供的雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法推動了雞蛋加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，提高了雞蛋附加值，為雞蛋的綜合開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

附圖說明

圖1為微波功率對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)為微波功率，單位為w；縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖2為雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)為雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例，單位為g:ml；縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖3為超聲功率對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)為超聲功率，單位為w；縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖4為提取時間對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)為提取時間，單位為min；縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖5為微波功率和雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖；其中，a為微波功率，單位為w；b為雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例，單位為g:ml；y為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖6為微波功率和超聲功率對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖；其中，a為微波功率，單位為w；c為超聲功率，單位為w；y為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖7為微波功率和提取時間對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖；其中，a為微波功率，單位為w；d為提取時間，單位為min；y為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖8為超聲功率和雞蛋清粉末與去離子水的比例對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖；其中，b為雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例，單位為g:ml；c為超聲功率，單位為w；y為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖9為提取時間和雞蛋清粉末與去離子水的比例對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖；其中，b為雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例，單位為g:ml；d為提取時間，單位為min；y為蛋白質(zhì)提取率，單位為％；

圖10為超聲功率和提取時間對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖；其中，c為超聲功率，單位為w；d為提取時間，單位為min，y為蛋白質(zhì)提取率，單位為％。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。

1、材料與儀器

1.1材料

雞蛋購自陜西省咸陽市購物超市；水為去離子水；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(bsa)，來自中國藥品生物制品檢定所；考馬斯亮藍(lán)g-250，生產(chǎn)廠家為德國達(dá)姆施塔特市默克公司。

1.2儀器

xo-sm200微波超聲波組合反應(yīng)系統(tǒng)，生產(chǎn)廠家為南京先歐儀器制造有限公司；蛋清分離器(s-star)，生產(chǎn)廠家為順財不銹鋼廚具廠；精密電子天平，型號為hr120；真空干燥箱(dzf-6053)，生產(chǎn)廠家為上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2、實驗方法

2.1原料預(yù)處理

將新鮮雞蛋打碎在干凈的燒杯里，采用蛋清分離器分離出蛋清，硬性發(fā)泡30min，然后均勻涂層于載體表面冷凍干燥，再將干燥后的雞蛋清碾磨，過篩，得雞蛋清粉末，備用。

其中，載體為能夠承載雞蛋清的物質(zhì)，包括玻璃器皿或陶瓷器皿，如載玻片、表面皿、坩堝等。

2.1.1將雞蛋清粉末在-60℃溫度條件下預(yù)冷2小時，再在40℃條件下真空干燥10小時，然后將干燥后的雞蛋清碾磨，過40目篩，得雞蛋清粉末，備用；

2.1.2將雞蛋清粉末在-45℃溫度條件下預(yù)冷2小時，再在30℃條件下真空干燥12小時，然后將干燥后的雞蛋清碾磨，過40目篩，得雞蛋清粉末，備用；

2.1.3將雞蛋清粉末在-20℃溫度條件下預(yù)冷3小時，再在40℃條件下真空干燥12小時，然后將干燥后的雞蛋清碾磨，過40目篩，得雞蛋清粉末，備用；

2.1.4將雞蛋清粉末在-15℃溫度條件下預(yù)冷3小時，再在50℃條件下真空干燥12小時，然后將干燥后的雞蛋清碾磨，過40目篩，得雞蛋清粉末，備用；

2.1.5將雞蛋清粉末在0℃溫度條件下預(yù)冷5小時，再在60℃條件下真空干燥8小時，然后將干燥后的雞蛋清碾磨，過40目篩，得雞蛋清粉末，備用。

2.2蛋白質(zhì)的提取：

取2.1.1～2.1.5中任一項的雞蛋清粉末4.000g，置于xo-200微波超聲波組合反應(yīng)系統(tǒng)的500ml的專用玻璃反應(yīng)瓶中，加入提取劑去離子水，然后密封，連接回流裝置，設(shè)定超聲波功率、微波功率和提取時間，進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。提取結(jié)束后，離心處理，取上清液，并采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，蛋白質(zhì)提取率按照下式計算

蛋白質(zhì)提取率/％＝(蛋白質(zhì)質(zhì)量/g/雞蛋清粉末質(zhì)量/g)×100％。

實施例1微波功率對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗方法：按照2.2中雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取；其中，雞蛋清粉末與去離子水的比例為1g:12ml；超聲功率為350w，微波功率分別設(shè)置為300w、400w、500w、600w、700w，提取時間為9min，在此條件下，考察微波功率對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如圖1所示，蛋白質(zhì)提取率隨微波功率的增大而增大，當(dāng)功率增大到500w時，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值；之后，隨微波功率的增大開始下降，實驗結(jié)果表明微波功率選擇500w時，蛋白質(zhì)的提取率最高。

實施例2雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗方法：按照2.2中雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取；其中，微波功率為500w，超聲功率為350w，提取時間為9min，雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例分別設(shè)置為1g:4ml、1g:8ml、1g:12ml、1g:16ml、1g:20ml，在此條件下，考察雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如圖2所示，試驗結(jié)果表明當(dāng)雞蛋清粉末與去離子水的比例為1g:12ml時，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值。

實施例3超聲功率對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗方法：按照2.2中雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取；其中，微波功率為500w，雞蛋清粉末與去離子水的比例為1g:12ml，提取時間為9min，超聲功率分別設(shè)置為220w、280w、340w、400w、460w，考察超聲功率對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如圖3所示，實驗結(jié)果表明當(dāng)超聲功率為340w時，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值。

實施例4提取時間對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗方法：按照2.2中雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取；其中，微波功率為500w，超聲功率為350w，雞蛋清粉末與去離子水的比例為1g:12ml，分別考察提取時間為3min、6min、9min、12min、15min時，考察提取時間對雞蛋清中蛋白質(zhì)提取率的影響。

試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如圖4所示，試驗結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，蛋白質(zhì)提取率逐漸增大，當(dāng)提取時間為9min，提取率達(dá)到最大值，且9min以后即9min～15min提取率無明顯提升。

實施例5響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗：

按照2.2中雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取；其中，各提取參數(shù)采用響應(yīng)曲面法(box－behnken，bbd)設(shè)計，對共計27個試驗點進(jìn)行試驗，并計算雞蛋清中的蛋白質(zhì)提取率。試驗設(shè)計影響因素和蛋白質(zhì)的提取率如表1所示，其中a表示微波功率、b表示雞蛋清粉末與去離子水的比例、c表示超聲功率、d表示提取時間。

表1響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計和實驗結(jié)果

回歸模型方程的建立及顯著性檢驗：

利用design-expert7.0.0統(tǒng)計軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到多元二次回歸方程模型：

y1＝-360.411+0.297×a+11.718×b+1.231×c+12.264×d+7.000e-004×ab+4.095e-004×ac-8.333e-006×ad+5.433e-006×bc–0.128×bd–7.433e-003×cd-4.485e-004×a²–0.526×b²–2.053e-003×c²-0.452×d²，r²＝0.9067。

對模型進(jìn)行顯著性檢驗：p值小于0.05，對應(yīng)因素對響應(yīng)值的影響顯著；失擬項f值<p表明失擬項相對于絕對誤差不顯著；相關(guān)系數(shù)r²值一般要求90％以上，表明回歸方程是高度顯著。二次回歸模型的方差分析結(jié)果如表2所示。

表2二次回歸模型的方差分析結(jié)果

由表2可以看出，模型的p值為0.0004，小于0.05，表明試驗所選用的二次多項模型方程具有顯著性；失擬項f值為0.61，p＝0.7564，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著；回歸方程是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)r²值為0.9067。因此，該模型對試驗的擬合程度良好，能較好的反映各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該模型分析和預(yù)測不同提取條件下蛋白的提取率變化。模型的一次項對蛋白的提取率影響均不顯著(p＞0.05)；微波功率和超聲功率交互項顯著(p＜0.05)，其他交互相均不顯著(p＞0.05)；二次項均顯著(p＜0.05)，表明各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響都不是簡單的線性關(guān)系。

響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化：

根據(jù)上述回歸方程模型可以繪制響應(yīng)曲面圖，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析微波功率、雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例、超聲功率和提取時間各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響。響應(yīng)曲面圖直觀地反映了各因素及交互作用對各響應(yīng)值的影響。

圖5為微波功率和雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖，由圖可以看出，隨著微波功率和雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例的逐漸增大，曲面呈上升趨勢，當(dāng)微波功率為500w，雞蛋清粉末與去離子水的比例為1g:12ml時，提取率開始趨于下降。從圖中可以確定出最佳范圍：微波功率450w～550w，雞蛋清粉末與提取劑去離子水的比例為1g:(10.5-13.5)ml。

圖6、圖7、圖8、圖9、圖10依次分別為微波功率和超聲功率、微波功率和提取時間、超聲功率和雞蛋清粉末與去離子水的比例、提取時間和雞蛋清粉末與去離子水的比例、超聲功率和提取時間對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖。由圖6至圖10可以看出，隨著相應(yīng)兩個因素的增大，蛋白質(zhì)提取率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，響應(yīng)曲面開口向下，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)曲面最高點，同時也是等高線最小橢圓的中心點。從圖中可以確定出最佳水平范圍：微波功率為450w～550w，雞蛋清粉末與去離子水的比例為1g:(10.5-13.5)ml，超聲波功率為325w～375w，提取時間為7.5min～10.5min。

通過軟件分析，本發(fā)明采用超聲波協(xié)同微波的方式對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取的最佳條件為：微波功率499.66w，雞蛋清粉末與所述提取劑的比例為1g:12.20ml，超聲功率為349.50w，提取時間為8.96min。

考慮到實際操作情況，將提取方法參數(shù)修正為微波功率為500w，雞蛋清粉末與所述提取劑的比例為1g:12.20ml，超聲功率為350w，提取時間為9.0min。三次平行試驗得到提取率為56.21％±0.92％。

本發(fā)明采用超聲波協(xié)同微波的方式對雞蛋清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，提取劑采用去離子水而非有機(jī)溶劑，并采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法中的條件進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明提供的雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取方法具有提取效率高、用時短、操作簡單、安全、環(huán)保等優(yōu)點。

雖然，本說明書中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。