本發(fā)明涉及一種特異性地識別感染了乙型肝炎病毒的細(xì)胞的嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)，表達(dá)其的免疫反應(yīng)性細(xì)胞及利用其來調(diào)節(jié)或治療源自乙型肝炎病毒的肝疾病的方法。

背景技術(shù)：

乙型肝炎是全世界范圍內(nèi)主要的問題性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(who，worldhealthorganization)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，約有20億人感染有乙型肝炎，其中，推定約有2億4千萬人患有慢性肝炎。肝細(xì)胞癌在世界范圍的癌癥死亡原因中排第三位，每年有600,000名以上的患者因源自乙型肝炎病毒的慢性肝疾病(肝硬化或肝癌)而死亡。

基礎(chǔ)的慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染會誘發(fā)肝硬化或肝細(xì)胞癌(hcc，hepatocellularcarcinoma)。與其它癌癥相比，肝細(xì)胞癌的預(yù)后差，其原因在于，肝癌細(xì)胞在早期通過血管大范圍地?cái)U(kuò)散，并具有可加快生長速度的腫瘤生物學(xué)特性。另外，由于大部分肝細(xì)胞癌會伴有慢性肝炎或肝硬化，因此成為積極治療癌癥方面的阻礙。

在乙型肝炎患者居多的亞洲或非洲，肝癌患者中有約70～80％的乙型肝炎病毒攜帶者。據(jù)臺灣的一個(gè)報(bào)道，乙型肝炎病毒攜帶者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)度與非攜帶者相比，約高出200倍。尤其是在病毒增殖速度快的情況下，即血清hbve抗原或hbv-dna為陽性時(shí)，他們中年齡較高或患有肝硬化的人更易患上肝癌。

用于治療源自hbv的慢性肝疾病的藥物有干擾素-α(interferon-α；ifn-α)、聚乙二醇干擾素(peg-ifn)、核苷類似物(拉米夫定、恩替卡韋及替比夫定)及核苷酸類似物(阿德福韋及替諾福韋)等。優(yōu)選的藥物為，能夠完全去除乙型肝炎病毒，并能夠?qū)崿F(xiàn)從乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)陽性到抗表面抗原陽性的血清轉(zhuǎn)化(seroconversion)的 藥物，然而，上述藥物沒有顯示出這種效果。

ifn-α為長期使用的抗hbv藥物，但已知其具有嚴(yán)重的副作用，并且在治療效果方面有限。對乙型肝炎病毒表面抗原的去除率約在8％以下。核苷類似物及核苷酸類似物等藥物雖然能夠抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(viralreversetranscriptase)，但不能去除乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀dna(hbvcccdna)。這些藥物雖然能抑制hbv的復(fù)制，但由于hbvcccdna一直存在于宿主細(xì)胞的核中，且hbvdna會插入到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)，因此無法實(shí)現(xiàn)患者對hbv免疫環(huán)境的調(diào)節(jié)或去除病毒。而且，在患者中斷治療的情況下，hbv的復(fù)制會退回到治療前的狀態(tài)，從而使肝炎癥狀大大惡化。雖然需要使用這種藥物持續(xù)進(jìn)行治療，但是難以期待大的效果，而且患者可能需要面對這種持續(xù)治療所帶來的變異病毒所導(dǎo)致的耐藥性等嚴(yán)重的副作用。

由于肝細(xì)胞癌在早期沒有癥狀，因此，大部分患者為在進(jìn)展到一定程度后才被發(fā)現(xiàn)，在這種情況下，目前還沒有有效的治療方法，對于早期診斷的肝細(xì)胞癌，首選的治療方法為肝移植或肝切除術(shù)，但在患者中能夠進(jìn)行肝切除術(shù)的比例僅為30-40％。作為其它治療方法，雖然可以使用肝移植、全身性化療、放射治療、射頻消蝕治療方法等，但是復(fù)發(fā)率高，且在移植后排斥反應(yīng)等副作用較嚴(yán)重。目前為止，作為酪氨酸激酶抑制劑的索拉非尼是能夠治療已進(jìn)行的肝細(xì)胞癌的唯一藥物，但是生存延長期僅為3個(gè)月左右。更主要的問題是在實(shí)施了現(xiàn)有的治療術(shù)之后會引起肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)或向肝細(xì)胞以外的器官轉(zhuǎn)移。上述問題是由插入有未完全被去除的hbv的肝細(xì)胞所導(dǎo)致的。因此，需要開發(fā)出一種用于治療源自hbv的肝細(xì)胞癌的新型治療方法。

免疫治療方法可以增強(qiáng)存在于體內(nèi)的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)，或?qū)π滦筒《净虬┘?xì)胞誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，從而能夠有效且選擇性地對病毒感染細(xì)胞或肝細(xì)胞癌進(jìn)行標(biāo)記。即，可以通過非特異性宿主的免疫反應(yīng)或hbv特異性輔助性t細(xì)胞(t-helper)或細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(cytotoxictlimphocytes，ctl)的活性化來去除病毒或肝細(xì)胞癌。

目前最受矚目的治療途徑為，將經(jīng)過基因操作(geneticallymodified)的hbv特異性t細(xì)胞進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)的方法。t細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移是通過對新型病毒或癌細(xì)胞誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，從而可以恢復(fù)喪失的抗hbv的免疫功能。

在初期，為了標(biāo)記癌細(xì)胞而使用的過繼轉(zhuǎn)移t細(xì)胞為在體外增殖的自體來源的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(til，tumorinfiltratinglymphocytes)或腫瘤特異性t細(xì)胞克隆(tumor-specifictcellclones)。然而，不能在所有患者或所有癌癥的外周血單核細(xì)胞中分離出til細(xì)胞或癌特異性t細(xì)胞克隆。

為了克服這種限制，已研究出通過基因操作來將腫瘤特異性t細(xì)胞受體(tcr，tcellreceptor)導(dǎo)入到t細(xì)胞中的方法。該方法是將病毒或腫瘤特異性受體導(dǎo)入到自體來源t細(xì)胞(autologoustcells)中，并在體外增殖后再注入患者的方法。表達(dá)對t細(xì)胞受體具有高的結(jié)合活性的α和β鏈的情況下，能夠重構(gòu)(redirect)t細(xì)胞的抗原特異性。導(dǎo)入了新型tcrs的t細(xì)胞在體內(nèi)遇到抗原，則會起到誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的作用。但導(dǎo)入了tcrs的t細(xì)胞僅限制于人白細(xì)胞抗原(hla)形態(tài)。即，僅適用于與插入了tcrs的hla形態(tài)相同的患者。

為了克服導(dǎo)入了tcr基因的t細(xì)胞受hla形態(tài)的限制的問題，被導(dǎo)入的為嵌合抗原受體。car是由能夠附著在癌或病毒抗原上的單鏈抗體區(qū)域和根據(jù)抗原刺激而活化t細(xì)胞并能夠使t細(xì)胞增殖的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域構(gòu)成。car基本上是通過抗原-抗體反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，因此對hla的形態(tài)沒有限制，從而具有可以適用于所有患者的優(yōu)點(diǎn)。

導(dǎo)入了附著在乙型肝炎抗原上的抗原和tcr的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的cart細(xì)胞能夠識別hbsag陽性肝細(xì)胞，分泌作為增強(qiáng)免疫細(xì)胞因子的ifn-γ和il-2，并能夠殺滅感染hbv的肝細(xì)胞等，從而顯示出能夠有效治療慢性乙型肝炎或源自hbv的肝癌的治療可能性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的目的在于，提供一種特異性地識別感染了乙型肝炎病毒的細(xì)胞的嵌合抗原受體。

本發(fā)明的另一目的在于，提供一種表達(dá)上述嵌合抗原受體的免疫反應(yīng)性細(xì)胞。

本發(fā)明的又一目的在于，提供一種用于調(diào)節(jié)或治療源自乙型肝炎的肝疾病的所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞的應(yīng)用。

技術(shù)方案

根據(jù)上述目的，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體在n-末端至c-末端的方向上包含(1)乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)結(jié)合區(qū)域、(2)跨膜區(qū)域、(3)共刺激性信號傳遞區(qū)域及(4)cd3ζ信號傳遞區(qū)域。

根據(jù)上述的另一目的，本發(fā)明提供一種編碼所述嵌合抗原受體的核酸序列及包含其的載體。

根據(jù)上述又一目的，本發(fā)明提供一種導(dǎo)入有所述載體的免疫反應(yīng)性細(xì)胞和所述的免疫反應(yīng)性細(xì)胞在制備用于治療源自hbv的肝疾病的藥物中的應(yīng)用，以及為了治療源自乙型肝炎的肝細(xì)胞癌或慢性乙型肝炎而利用這些免疫反應(yīng)性細(xì)胞的方法。

附圖說明

圖1為hbvcar表達(dá)用慢病毒載體(ppvl01/hbvcar)的模擬圖；

圖2為利用人宮頸癌細(xì)胞系(hela)對hbvcar慢病毒進(jìn)行效價(jià)分析的結(jié)果；

圖3為采用流式細(xì)胞術(shù)對通過hbvcar慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞表面進(jìn)行分析的結(jié)果；

圖4為轉(zhuǎn)導(dǎo)有hbvcar基因的t細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效果的分析結(jié)果。

發(fā)明的詳細(xì)說明

定義

在未進(jìn)行其它定義的情況下，本說明書中所使用的所有技術(shù)性及科 學(xué)性術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義。

本說明書中所使用的術(shù)語“抗原識別受體”是指在進(jìn)行抗原結(jié)合的反應(yīng)時(shí)，能夠活化免疫細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)的受體。作為抗原識別受體的例子，可以使用自然型或內(nèi)因性t細(xì)胞受體，或者可以使用腫瘤抗原-結(jié)合區(qū)域融合在能夠活化免疫細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)的細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域上的嵌合抗原受體(car)。

本說明書中所使用的術(shù)語“抗體”不僅是指完整的抗體分子，還表示維持免疫原(immunogen)-結(jié)合能力的抗體分子的片段。這些片段在本領(lǐng)域中已被熟知，經(jīng)常被導(dǎo)入到試管內(nèi)或生物體內(nèi)。因此，本說明書中所使用的術(shù)語“抗體”不僅是指完整的免疫球蛋白分子，還表示已被熟知的活性片段f(ab')2及fab。完整抗體的無fc片段的f(ab')2及fab片段通過循環(huán)而被更加迅速地去除，并且可以具有很少的完整抗體的非-特異性組織結(jié)合(wahletal.，j.nucl.med.24:316-325(1983))。本發(fā)明的抗體包括完整的自然型抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、fab、fab'、單鏈v區(qū)域片段(scfv)、融合多肽及非傳統(tǒng)型抗體。

本說明書中所使用的術(shù)語“單-鏈可變片段”或“scfv”是免疫球蛋白的重鏈(vh)及輕鏈(vl)的可變區(qū)域通過共價(jià)鍵而連接，從而形成vh:：vl異質(zhì)二聚體的融合蛋白質(zhì)。所述重鏈(vh)及輕鏈(vl)是直接連接，或者是通過連接vh的n-末端與vl的c-末端，或連接vh的c-末端與vl的n-末端的肽-編碼連接體(例如，10、15、20、25個(gè)氨基酸)來進(jìn)行連接。通常，所述連接體為了維持柔韌性而富含甘氨酸，并且為了具有優(yōu)異的溶解度而富含絲氨酸或蘇氨酸。即使被去除了恒定區(qū)域并導(dǎo)入了連接體，scfv蛋白質(zhì)也能夠維持原來的免疫球蛋白的特異性。

本說明書中所使用的“親和力”是指測定的結(jié)合強(qiáng)度。

本說明書中所使用的術(shù)語“嵌合抗原受體”或“car”是表示融合在能夠活化或刺激免疫細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域上的抗原-結(jié)合區(qū)域。通常，所述car的細(xì)胞外結(jié)合區(qū)域由通過融合鼠科(murine)或人性化單克隆抗體的可變重鏈及輕鏈區(qū)域而形成的單鏈可變片段(scfv)構(gòu)成。在多 個(gè)具體例中，所述scfv融合到跨膜區(qū)域上之后，再與細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域融合?！?代”car包括抗原結(jié)合時(shí)只提供cd3ζ信號的car，“2代”car包括同時(shí)提供共刺激(例如，cd28或cd137)及活性化(cd3ζ)的car。“3代”car包括提供多個(gè)共刺激(例如，cd28及cd137)及活性化(cd3ζ)的car。在多個(gè)具體例中，選擇與抗原的親和力或結(jié)合度高的car。

本說明書中所使用的術(shù)語“免疫刺激活性”是指，在細(xì)胞(例如，活化的免疫反應(yīng)性細(xì)胞)內(nèi)誘導(dǎo)信號傳遞，或使蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。免疫刺激活性可以包含前-炎性活性。已知是通過其結(jié)合來刺激或增加免疫反應(yīng)的多肽包括cd28、cd137、b7-1、b7-2及cd137l和對應(yīng)其的配體。這種多肽存在于腫瘤微環(huán)境中，并且活化新生物細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在多個(gè)具體例中，促進(jìn)、刺激或增強(qiáng)前-炎性多肽和/或其配體，則能夠提高免疫反應(yīng)性細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

本說明書中所使用的“cd28多肽”是指ncbi參考編號為np_006130或者是與其片段至少具有85、90、95、96、97、98、99或100％的同源性的、具有刺激活性的蛋白質(zhì)。示例性的cd28細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域的氨基酸序列提供為下述seqidno：7。

本發(fā)明中所使用的“cd137多肽”是指起到腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，tnf)配體的作用的ncbi參考編號為p41273或np_001552，或與其片段至少具有85、90、95、96、97、98、99或100％的同源性的蛋白質(zhì)。示例性的cd137細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域的氨基酸序列提供為下述seqidno：8。

本發(fā)明中所使用的“cd3ζ多肽”是指ncbi參考編號為np_932170或與其片段具有85、90、95、96、97、98、99或100％的同源性的、具有活化或刺激活性的蛋白質(zhì)。示例性的cd3ζ細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域的氨基酸序列提供為下述seqidno：9。

本說明書中所使用的“有效量”是指，對于具有治療效果來說充分的量。在一具體例中，“有效量”是指，對于使新生物的持續(xù)性增殖、生長或轉(zhuǎn)移(例如，侵入或移動(dòng))停止、改善或抑制來說充分的量。

本說明書中所使用的“免疫反應(yīng)性細(xì)胞”表示在免疫反應(yīng)中起作用的細(xì)胞或其的祖細(xì)胞(progenitor)或后代細(xì)胞(progeny)。

本發(fā)明中所使用的“肝炎”是由肝的炎癥而定義的醫(yī)學(xué)上的狀態(tài)。

本說明書中所使用的“人白細(xì)胞抗原(hla，humanleukocyteantigen)”是人i類或ii類主要組織相容性復(fù)合體(mhc，majorhistocompatibilitycomplex)蛋白質(zhì)。

嵌合抗原受體(car)

本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體(car)，所述嵌合抗原受體包含細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域及細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。所述細(xì)胞外區(qū)域包含作為抗原結(jié)合的一部分的抗原特異性結(jié)合元件。所述細(xì)胞內(nèi)區(qū)域包含共刺激性信號傳遞區(qū)域及ζ鏈的一部分。所述共刺激性信號傳遞區(qū)域是指，包含淋巴細(xì)胞的有效反應(yīng)所必需的細(xì)胞表面共刺激性分子的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的、car的一部分。

在所述細(xì)胞外區(qū)域與跨膜區(qū)域之間或所述跨膜區(qū)域與所述細(xì)胞內(nèi)區(qū)域之間可以增加有間隔區(qū)域。本文中所使用的“間隔區(qū)域”是指，具有能夠?qū)⒖缒^(qū)域連接到細(xì)胞外區(qū)域及細(xì)胞內(nèi)區(qū)域中的一個(gè)區(qū)域上的功能的任一低聚糖或多肽。間隔區(qū)域最多可包含300個(gè)氨基酸。

具體而言，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體在n-末端至c-末端的方向上包含(1)hbsag結(jié)合區(qū)域、(2)跨膜區(qū)域、(3)共刺激性信號傳遞區(qū)域及(4)cd3ζ信號傳遞區(qū)域。

本發(fā)明的一具體例中，所述car在n-末端至c-末端方向上具有以下結(jié)構(gòu)。即，由鼠(murine)免疫球蛋白的前導(dǎo)序列(leadersequence)、抗-hbv表面抗原抗體的scfv部分、連接體a、人免疫球蛋白的恒定區(qū)域(constantregion)、連接體b、人cd28跨膜(transmembrane)區(qū)域、人cd28細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域、人cd137細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域及人cd3ζ細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域依次連接而成。

編碼目標(biāo)區(qū)域的核酸序列可以通過重組的方法來獲得，例如可以通過以下方式獲得，即可以通過利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方法來從表達(dá)所述區(qū)域的細(xì) 胞中篩選文庫的方式，或從公知的載體中誘導(dǎo)基因，以使其包含上述區(qū)域的基因的方法，或從包含所述區(qū)域的基因的細(xì)胞及組織中直接分離的方式來獲得。作為替代方案，還可以通過非克隆的合成方式來生成上述目標(biāo)區(qū)域的基因。

載體

本發(fā)明還提供一種插入有本發(fā)明的dna的載體。編碼car的核酸的表達(dá)可以通過以下典型的方式來實(shí)現(xiàn)。將編碼car多肽或其一部分的核酸可操作地連接到啟動(dòng)子上，并將所述結(jié)構(gòu)體導(dǎo)入到表達(dá)載體中而實(shí)現(xiàn)。所述載體適合用于復(fù)制及結(jié)合真核生物。典型的克隆載體包括對轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯終止因子、起始序列及目標(biāo)核酸序列的表達(dá)的調(diào)節(jié)有幫助的啟動(dòng)子。

所述核酸可以克隆到諸如質(zhì)粒、噬菌粒、動(dòng)物病毒及粘粒等多種類型的載體中。尤其是作為有用的載體，可以例舉如表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針生成載體及測序載體。所述表達(dá)載體可以以病毒性載體的形態(tài)提供到細(xì)胞中，本發(fā)明的一具體例中使用慢病毒載體。

免疫反應(yīng)性細(xì)胞

本發(fā)明提供一種通過導(dǎo)入包含所述抗原識別受體的載體來對結(jié)合到hbv表面抗原的單鏈可變片段(scfv，singlechainvariablefragment)進(jìn)行表達(dá)，從而降低或去除所述抗原活性的免疫反應(yīng)性細(xì)胞。所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞可以為t細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(nk，naturalkiller)或細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl，cytotoxictlymphocyte)。更具體地，所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞可以為t細(xì)胞。

源自乙型肝炎的疾病的治療

本發(fā)明的另一方面，提供一種本發(fā)明的免疫反應(yīng)性細(xì)胞在用于治療源自乙型肝炎的疾病方面的應(yīng)用。

所述源自乙型肝炎的疾病可以例舉如肝細(xì)胞癌或慢性乙型肝炎。

一方面，本發(fā)明提供一種在個(gè)體(subject)中治療或預(yù)防源自乙型肝炎的肝細(xì)胞癌或慢性乙型肝炎的方法，所述方法包括以下步驟。即，將有效量的免疫反應(yīng)性細(xì)胞施用于需要治療或預(yù)防源自乙型肝炎的肝細(xì)胞 癌或慢性乙型肝炎的個(gè)體。

另一方面，本發(fā)明提供一種在個(gè)體中減少腫瘤負(fù)荷的方法，該方法包括以下步驟。即，將有效量的免疫反應(yīng)性細(xì)胞施用于需要減少腫瘤負(fù)荷的個(gè)體中，從而在所述個(gè)體中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞的死亡。

另一方面，本發(fā)明提供一種使具有源自乙型肝炎的肝細(xì)胞癌或慢性乙型肝炎的個(gè)體的生存時(shí)間得到延長的方法，所述方法包括以下步驟。即，通過將有效量的免疫反應(yīng)性細(xì)胞施用于所述個(gè)體中，從而延長所述個(gè)體的生存時(shí)間。

具體實(shí)施方式

在沒有另外特殊定義的情況下，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，引入本技術(shù)領(lǐng)域范圍內(nèi)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)等現(xiàn)有技術(shù)。

下述實(shí)施例是為了向本領(lǐng)域的技術(shù)人員說明本發(fā)明的方法而提供的，本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1.對hbv具有特異性的car基因的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)一種具有以下結(jié)構(gòu)的car。所述car在n-末端至c-末端的方向上具有以下結(jié)構(gòu)。即，由鼠免疫球蛋白的前導(dǎo)序列、抗-hbv表面抗原抗體的scfv部分(kuerschner，t.(2000)，constructionandscreeningofantibodylibrariesagainstsurfaceantigens(針對表面抗原構(gòu)建和篩選抗體文庫).phdthesis(博士論文)，ruprecht-karls-heidelberg，germany)、連接體a、人免疫球蛋白的恒定區(qū)域、連接體b、人cd28跨膜區(qū)域、人cd28細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域、人cd137細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域及人cd3ζ細(xì)胞內(nèi)信號化區(qū)域依次連接而成。所述car對hbv具有特異性反應(yīng)。然后，將編碼所述組成部分的堿基序列進(jìn)行連接，從而制備對hbv具有特異性的car基因。car的各組成部分的氨基酸序列表示在下述表1中。另外，通過對氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化(codonoptimization)來獲得編碼表1中的各組成部分的堿基序列，它們分別具有seqidno：10～18的堿基序列。

[表1.對hbv具有特異性的car氨基酸序列]

實(shí)施例2.載體的制備

在實(shí)施例1中制備的car基因的n-末端上導(dǎo)入ecorv限制性內(nèi)切 酶堿基序列，在c-末端上導(dǎo)入ecori限制性內(nèi)切酶堿基序列。通過genscript公司的「全基因合成服務(wù)(genesynthesisservices)」來進(jìn)行基因合成。用ecorv/ecori限制性內(nèi)切酶來處理合成的基因片段后，將其克隆到事先用相同的限制性內(nèi)切酶切斷的、用于表達(dá)慢病毒的psmpuw-ires-puro(cellbiolab)載體上，并將該表達(dá)載體命名為ppvl01/hbvcar(圖1)。

實(shí)施例3.慢病毒載體的生成

通過將嵌入有hbvcar基因的載體和慢病毒性包裝質(zhì)粒導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)來生產(chǎn)慢病毒載體。為了產(chǎn)生這種慢病毒載體，從atcc中獲得了作為宿主細(xì)胞的293t細(xì)胞(-3216^tm)。在dmem(hyclone，sh30243.01)中含有10％的胎牛血清(hyclone，sh30919.03)及1％的pen-strep(gibco，15140-122)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)293t細(xì)胞并使其得到維持。獲得培養(yǎng)中的293t細(xì)胞，將該細(xì)胞接種到100-mm的平板上，以使板面上覆蓋有70-90％左右。次日，將實(shí)施例2中制得的載體ppvl01/hbvcar和包裝質(zhì)粒(pmdlg/prre、prsv-rev及pmd.g)以2:1:1:1的比例混合，并利用脂質(zhì)體3000(lipofectamine3000)(英杰公司，l3000)來導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入基因后，在37℃的5％的co2培養(yǎng)器中培養(yǎng)30-48小時(shí)后，獲取上清液，并在450xg下離心分離15分鐘。利用0.45μm的聚偏二氟乙烯濾膜來對慢病毒載體上清液進(jìn)行過濾，并利用超高速離心分離器在20,000xg下，于4℃下離心分離2小時(shí)，從而濃縮100-300倍后儲存于-80℃的超低溫冷庫中。

實(shí)施例4.慢病毒載體的效價(jià)(titer)的確定

用0.05％的胰蛋白酶edta溶液(gibco，25200-072)對培養(yǎng)中的293t細(xì)胞或hela細(xì)胞(-2^tm)進(jìn)行處理，并從培養(yǎng)板上分離出來?；厥占?xì)胞，并在dmem中含有10％的牛胎兒血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮，使得每ml的細(xì)胞數(shù)為2×10⁵個(gè)，然后在每ml中添加8μg的聚凝胺。用5-50μl的慢病毒載體對1ml的細(xì)胞進(jìn)行處理后，將其接種于6-孔板上，并在37℃的5％的co2培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。次日，更換培養(yǎng)基 后培養(yǎng)2天。接種慢病毒的第三天回收細(xì)胞，然后為了檢測細(xì)胞表面的hbvcar的表達(dá)，使用抗-人免疫球蛋白gfc受體-生物素抗體和鏈霉親和素-pe來進(jìn)行熒光染色后，使用流式細(xì)胞分析儀來進(jìn)行分析。通過下述方式來計(jì)算慢病毒載體的效價(jià)(轉(zhuǎn)導(dǎo)單元(transductionunit)，tu)(圖2)。

tu/ml＝{(表達(dá)hbvcar的細(xì)胞的％/100)×感染時(shí)的細(xì)胞總數(shù)}/添加的病毒原液(virusstock)的體積(ml)。

實(shí)施例5.向細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過利用聚蔗糖密度梯度離心法，從外周血液中分離出外周血單核細(xì)胞(pmbc)。為了分離及刺激t細(xì)胞，可以在分離獲得pbmc后立即使用，或者可以在冷凍保藏后解凍使用?？梢酝ㄟ^與cd3/cd28cts^tm等的抗-cd3/抗-cd28連接超順磁性磁珠(superparamagneticbeads)一起培養(yǎng)，并根據(jù)兩性選擇技術(shù)方法來分理獲得用于刺激的t細(xì)胞。在每ml為1×10⁷個(gè)的pbmc中以1:1～1:3的比例來混合抗-cd3/抗-cd28連接磁珠，并培養(yǎng)30-60分鐘后，通過使其附著到磁鐵上而分離出來。為了活化分離的t細(xì)胞，在imsf100(sofco，el08-11r)無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮，使得每ml中含有1×10⁷個(gè)，并在每ml中添加100iu的il-2(bmi韓國，rhuil-2)后，在37℃的5％的co2中培養(yǎng)2天。收集細(xì)胞并用每ml中包含有100iuil-2的imsf100培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，使得每ml的細(xì)胞數(shù)為1-3×10⁶個(gè)，并在每ml中添加8μg的聚凝胺后，將其以每孔1ml的量接種于12-孔板中。在其中，添加0.5-8moi的慢病毒載體后，將培養(yǎng)板在1,200xg，26℃下離心分離1-2小時(shí)。將培養(yǎng)板在37℃的5％的co2培養(yǎng)器中開始進(jìn)行培養(yǎng)，次日，去除上清液，然后替換為每ml中包含有500iu的il-2的imsf100培養(yǎng)基。之后，以2-3天為間隔更換新的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)9-12天，從而獲得hbvcart細(xì)胞(圖3)。

實(shí)施例6.hbvcart細(xì)胞的靶細(xì)胞的殺傷效果

為了評價(jià)對所述hbvcar進(jìn)行表達(dá)的t細(xì)胞對靶細(xì)胞的選擇性去 除能力，準(zhǔn)備了作為hbv-陽性及hbv-陰性細(xì)胞系的hepg2細(xì)胞(-8065^tm)及hepg2.2.15細(xì)胞后，用cfse(thermofisher，c34554)來進(jìn)行染色。將這些細(xì)胞與感染了hbvcar慢病毒的t細(xì)胞以1:0.5～1:3的比例進(jìn)行混合后，培養(yǎng)4～24小時(shí)，從而獲得細(xì)胞。培養(yǎng)后收集細(xì)胞，然后用7-aad(bdpharmingen，559925)進(jìn)行染色后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。測定cfse陽性細(xì)胞中的7-aad的檢出比例，從而計(jì)算出細(xì)胞的殺傷效果％。其結(jié)果為，作為hbv-陰性細(xì)胞系的hepg2未能增加7-aad的檢出比例，但是，本發(fā)明的hbvcart細(xì)胞顯示出的結(jié)果為，其能夠選擇性地增加hbv-陽性細(xì)胞系hepg2.2.15細(xì)胞的7-aad檢出比例(圖4)。

如上所述的結(jié)果表明，超表達(dá)hbvcar的t細(xì)胞能夠選擇性地僅識別出hbv-陽性細(xì)胞，并將其去除。該結(jié)果表明，可以將該t細(xì)胞有效地用于源自hbv的肝細(xì)胞癌或源自hbv的慢性肝炎中。

通過以上部分，主要對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了說明。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)特性的情況下，可以實(shí)現(xiàn)多種變形例。因此，應(yīng)從說明的角度來考慮上述實(shí)施例，而非限定的角度。本發(fā)明的范圍顯示在本發(fā)明的權(quán)利要求書中，而非上述說明中，在與其等同范圍內(nèi)的所有不同點(diǎn)均應(yīng)解釋為包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。