交叉引用本申請(qǐng)要求2014年11月20日提交的第62/082,534號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)、2014年11月20日提交的第62/082,538號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)和2014年11月20日提交的第62/082,541號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)均通過引用以其全文并入本文以用于所有目的。
背景技術(shù)：
：：核酸擴(kuò)增方法允許擴(kuò)增樣品如生物樣品中的核酸分子。核酸分子可以經(jīng)由例如基于熱循環(huán)的方法(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr))或經(jīng)由等溫方法來擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增還可以用于制備核酸分子以供與核酸分析相關(guān)的許多應(yīng)用中的后續(xù)分析，這些應(yīng)用例如是檢測(cè)靶核酸序列、檢測(cè)樣品中的罕見核酸分子/序列和/或制備用于測(cè)序反應(yīng)的核酸分子。因此，由于核酸擴(kuò)增對(duì)于廣泛應(yīng)用的適用性，對(duì)于可用于擴(kuò)增核酸分子和/或可用于分析由核酸擴(kuò)增生成的擴(kuò)增的核酸分子的組合物和方法存在需要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開內(nèi)容提供了用于核酸擴(kuò)增及分析的探針、裝置、引發(fā)寡核苷酸、組合物和方法。本公開內(nèi)容的一方面提供了具有互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的核酸序列的探針。該核酸序列可具有(i)至少一個(gè)可切割部分，(ii)可檢測(cè)部分和(iii)猝滅劑。當(dāng)探針不與該單鏈靶核酸分子雜交時(shí)，該猝滅劑可猝滅該可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，所述探針可以是單鏈的。在一些實(shí)施方案中，該探針可能無法進(jìn)行分子內(nèi)雜交。在一些實(shí)施方案中，該探針可包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可以是熒光團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，該可檢測(cè)部分可適合于在該探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)提供可檢測(cè)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖部分。此外，溶液可以含有探針并且可以例如包含堿性緩沖液。在一些實(shí)施方案中，所述探針可以包含位于所述至少一個(gè)可切割部分側(cè)翼的核苷酸序列a和核苷酸序列b。核苷酸序列a和核苷酸序列b可各自互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的一部分。在一些實(shí)施方案中，在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)，該可切割部分可以是可切割的。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是在堿性條件下可切割的和/或在不借助于酶的情況下可切割的。在一些實(shí)施方案中，所述探針可適合于與單鏈靶核酸分子雜交，使得所述至少一個(gè)可切割部分位于該單鏈靶核酸分子的單核苷酸多態(tài)性(snp)位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分相對(duì)于snp位點(diǎn)處的核苷酸是互補(bǔ)的。此外，所述探針可固定在包含基底例如固體基底的陣列上。該固體基底可包含選自金屬、半金屬、玻璃、聚合物、金屬氧化物、氧化硅和氮化硅的材料。在一些實(shí)施方案中，該探針可固定在陣列的孔中。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)的方法。該方法可包括提供包含單鏈靶核酸分子和探針的反應(yīng)混合物。該探針可具有核酸序列，該核酸序列具有(i)至少一個(gè)可切割部分，(ii)可檢測(cè)部分和(iii)猝滅劑。而且，該探針可互補(bǔ)于該單鏈靶核酸分子，并且當(dāng)該探針不與該單鏈靶核酸分子雜交時(shí)，該猝滅劑可猝滅可檢測(cè)部分。該方法可進(jìn)一步包括使該探針與該單鏈靶核酸分子雜交，其中在雜交時(shí)，該可切割部分被設(shè)置為與該單鏈靶核酸分子的單核苷酸多態(tài)性(snp)位點(diǎn)上的核苷酸相鄰。該方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)來自該探針的信號(hào)，該信號(hào)指示在snp位點(diǎn)上存在核苷酸。在一些實(shí)施方案中，提供反應(yīng)混合物并使探針與單鏈靶核酸分子雜交使得可切割部分被設(shè)置為與該單鏈靶核酸分子的snp位點(diǎn)上的核苷酸相鄰，可在不借助于酶的情況下和/或不對(duì)反應(yīng)混合物的溫度進(jìn)行循環(huán)的情況下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將反應(yīng)混合物的ph維持在7以上，例如8到11。在一些實(shí)施方案中，所述單鏈靶核酸分子可不含有可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)可以切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該可檢測(cè)部分可適合于在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)提供信號(hào)。該信號(hào)可以是，例如光信號(hào)、靜電信號(hào)或電化學(xué)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述探針包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該探針可以包含位于所述至少一個(gè)可切割部分側(cè)翼的核苷酸序列a和核苷酸序列b。核苷酸序列a和核苷酸序列b可各自互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的一部分。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可相對(duì)于snp位點(diǎn)上的核苷酸是互補(bǔ)的。在一些實(shí)施方案中，該探針可固定在陣列的基底上。在一些實(shí)施方案中，該探針可固定在陣列的孔中。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)的方法。該方法可包括提供第一反應(yīng)混合物，其包含(i)靶核酸分子的第一鏈和(ii)第一引物，該第一引物在其核苷酸位點(diǎn)處具有嘌呤衍生物，該核苷酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于懷疑包含單核苷酸多態(tài)性(snp)的第一核苷酸位點(diǎn)的第一鏈的核苷酸位點(diǎn)。相比于第一鏈的其他類型的堿基，該嘌呤衍生物可優(yōu)先與第一鏈的嘧啶堿基雜交。該方法可進(jìn)一步包括提供第二反應(yīng)混合物，其包含(i)靶核酸分子的第一鏈的互補(bǔ)鏈和(ii)第二引物，該第二引物在其核苷酸位點(diǎn)處具有嘧啶衍生物，該核苷酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于懷疑包含該snp的第二核苷酸位點(diǎn)的互補(bǔ)鏈的核苷酸位點(diǎn)。相比于互補(bǔ)鏈的其他類型的堿基，該嘧啶衍生物可優(yōu)先與互補(bǔ)鏈的嘌呤堿基雜交。該方法可進(jìn)一步包括使第一和第二反應(yīng)混合物經(jīng)受這樣的條件，該條件使得第一引物在與第一鏈雜交時(shí)可延伸以產(chǎn)生第一核酸產(chǎn)物，并且使得第二引物在與互補(bǔ)鏈雜交時(shí)可延伸以產(chǎn)生第二核酸產(chǎn)物，以及測(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量。在一些實(shí)施方案中，第一鏈的嘧啶堿基可以是胞嘧啶堿基。在一些實(shí)施方案中，互補(bǔ)鏈的嘌呤堿基可以是腺嘌呤堿基。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤衍生物可以不是鳥嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤衍生物可以是次黃嘌呤或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，該嘧啶衍生物可以不是胸腺嘧啶。在一些實(shí)施方案中，該嘧啶衍生物可以是尿嘧啶或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤衍生物借助于具有3’到5’外切核酸酶活性的酶可被腺嘌呤堿基代替。在一些實(shí)施方案中，該嘧啶衍生物借助于具有3’到5’外切核酸酶活性的酶可被胞嘧啶堿基代替。在一些實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)混合物可以在單獨(dú)的容器中。在一些實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)混合物中的每一個(gè)可包含可檢測(cè)部分，例如光學(xué)可檢測(cè)部分(例如，sybr綠、evageen、bebo、boxto、嵌入染料)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量可借助于解鏈曲線分析來完成。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量可借助于循環(huán)閾值的變化(δct)來完成。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量可借助于凝膠電泳來完成。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定該第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量可借助于被編程為比較第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量的計(jì)算機(jī)處理器來完成。在一些實(shí)施方案中，與第二核酸產(chǎn)物相比第一核酸產(chǎn)物的量較多可表明在該snp的第一核苷酸位點(diǎn)處存在嘌呤堿基。在一些實(shí)施方案中，與第一核酸產(chǎn)物相比第二核酸產(chǎn)物的量較多可表明在該snp的第二核苷酸位點(diǎn)處存在嘧啶堿基。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可鈍化的(inactivatable)引發(fā)寡核苷酸。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含引發(fā)區(qū)，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a，其中核酸序列a的3’端適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈，和(ii)至少一個(gè)可切割部分。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可進(jìn)一步包含可與引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性的與引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的3’端可以僅在等于或高于核酸序列b的解鏈溫度的溫度下可延伸。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)從3’到5’可以包含核酸序列a、可切割部分和可互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以包含不與引發(fā)區(qū)和/或單鏈靶核酸分子互補(bǔ)的間隔區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該間隔區(qū)可以不被聚合酶拷貝。在一些實(shí)施方案中，該間隔區(qū)可以是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的序列。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)可進(jìn)一步包含核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可光解的。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可酶切的，例如，可被具有內(nèi)切核酸酶活性的酶切割。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可化學(xué)切割的。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含在溶液中，在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含堿性緩沖液。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含引發(fā)區(qū)，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a，其中核酸序列a具有適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端，和(ii)至少一個(gè)可切割部分。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸還可以包含與該引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b，其中該引發(fā)區(qū)具有第一解鏈溫度并且核酸序列b具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的3’端可以僅在等于或高于第二解鏈溫度的溫度下是可延伸的。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)從3’到5’可以包含核酸序列a、與核酸序列a相鄰的可切割部分以及與該可切割部分相鄰的核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a’可互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以包含不與引發(fā)區(qū)和/或單鏈靶核酸分子互補(bǔ)的間隔區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該間隔區(qū)可以是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的序列。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低至少約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，第三解鏈溫度可低于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可光解的。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分是可酶切的，例如，可被具有內(nèi)切核酸酶活性的酶切割。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可化學(xué)切割的。在一些實(shí)施方案中，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含在溶液中。這樣的溶液可包含堿性緩沖液。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的方法。該方法可包括提供含有可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸包含(a)引發(fā)區(qū)，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a，其中核酸序列a的3’端適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈，和(ii)至少一個(gè)可切割部分；以及提供與該引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性的與該引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。該方法可進(jìn)一步包括切割可切割部分，從而鈍化該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，可以采用酶，例如采用內(nèi)切核酸酶來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，可以采用光來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由大于7的溶液ph來切割可切割部分。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的方法。該方法可包括提供含有可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸包含(a)引發(fā)區(qū)，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a，其中核酸序列a的3’端適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈，和(ii)至少一個(gè)可切割部分；以及提供與該引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b，其中該引發(fā)區(qū)具有第一解鏈溫度并且核酸序列b具有低于該第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。該方法可進(jìn)一步包括切割可切割部分，從而鈍化該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)從3’到5’可以包含核酸序列a、與核酸序列a相鄰的可切割部分以及與該可切割部分相鄰的核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使溶液的溫度降至等于或低于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以在等于或低于第二解鏈溫度的溶液溫度下切割。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在切割可切割部分之后使該溶液的溫度升至等于或高于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a在等于或高于其解鏈溫度和/或第一解鏈溫度的溫度下可能不與單鏈靶核酸分子穩(wěn)定地雜交。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使溶液的溫度升至等于或高于第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，可切割部分的切割可以采用酶來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，可切割部分的切割可以采用光來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，可切割部分的切割經(jīng)由大于7的溶液ph來進(jìn)行。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可激活的引發(fā)寡核苷酸。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含引發(fā)區(qū)，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a和(ii)至少一個(gè)可切割部分，其中核酸序列a具有適合于僅在切割該可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。該可激活的引發(fā)寡核苷酸還可以包含核酸序列b，核酸序列b位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)并且顯示出與該引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)從5’到3’可以包含核酸序列a、可切割部分和核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a’可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，該引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)可進(jìn)一步包含核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于或高于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可光解的。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可酶切的，例如，可被內(nèi)切核酸酶切割。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可化學(xué)切割的。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可被包含在溶液內(nèi)。這樣的溶液可包含堿性緩沖液。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可激活的引發(fā)寡核苷酸。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含引發(fā)區(qū)，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a和(ii)至少一個(gè)可切割部分，其中核酸序列a具有適合于僅在切割該可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可進(jìn)一步包含核酸序列b，核酸序列b位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)，其中該引發(fā)區(qū)具有第一解鏈溫度并且核酸序列b具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)從5’到3’可以包含核酸序列a、可切割部分和核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)核酸序列a’可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于或高于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可光解的。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可酶切的，例如，可被內(nèi)切核酸酶切割。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以是可化學(xué)切割的。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸。所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含在溶液中。這樣的溶液可包含堿性緩沖液。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法可包括提供含有可激活的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可激活的引發(fā)寡核苷酸包含引發(fā)區(qū)和核酸序列b，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a，(ii)至少一個(gè)可切割部分，該核酸序列b位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)并且顯示出與該引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。核酸序列a可具有適合于僅在切割該可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。該方法進(jìn)一步包括切割該可切割部分以及利用核酸序列a進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以形成該互補(bǔ)核酸鏈。在一些實(shí)施方案中，可以采用酶，例如內(nèi)切核酸酶來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，可以采用光來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由大于7的溶液ph來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)從5’到3’可以包含核酸序列a、可切割部分和核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a’可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，該引發(fā)區(qū)進(jìn)一步包含核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于或高于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括在進(jìn)行引物延伸反應(yīng)之前使溶液的溫度降至等于或低于第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法可包括提供含有可激活的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可激活的引發(fā)寡核苷酸包含引發(fā)區(qū)和核酸序列b，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a，(ii)至少一個(gè)可切割部分，該核酸序列b位于該引發(fā)區(qū)的3’側(cè)。該引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。而且，核酸序列a可具有適合于僅在切割該可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。該方法可進(jìn)一步包括切割該可切割部分以及使用核酸序列a進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以形成該互補(bǔ)核酸鏈。在一些實(shí)施方案中，采用酶，例如內(nèi)切核酸酶來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，采用光來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由大于7的溶液ph來切割可切割部分。在一些實(shí)施方案中，所述引發(fā)區(qū)從5’到3’可以包含核酸序列a、可切割部分和核酸序列a’。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a’可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，第一解鏈溫度可以為至少約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，第二解鏈溫度可以比第一解鏈溫度低約1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有低于第一解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于或高于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可以低于或等于約80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行引物延伸反應(yīng)之前，該方法進(jìn)一步包括使溶液的溫度降至等于或低于第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。在一些實(shí)施方案中，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可包含可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的反應(yīng)混合物。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與靶核酸分子雜交的核酸序列a’以及至少一個(gè)第一可切割部分的第一引發(fā)區(qū)。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可僅在切割第一可切割部分時(shí)被激活，使得核酸序列a’的3’端在引物延伸反應(yīng)中可延伸以形成靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈。此外，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與靶核酸分子雜交的核酸序列a以及至少一個(gè)第二可切割部分的第二引發(fā)區(qū)。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可在切割第二可切割部分時(shí)被鈍化，使得核酸序列a不與靶核酸分子形成穩(wěn)定的復(fù)合體以促進(jìn)基于靶核酸分子序列的引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物可進(jìn)一步包含靶核酸分子。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可進(jìn)一步包含核酸序列b’，該核酸序列b’位于該可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的3'側(cè)并且與該可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可進(jìn)一步包含與該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b，該核酸序列b與該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性。在一些實(shí)施方案中，所述第一可切割部分和/或第二可切割部分可以是核糖。在一些實(shí)施方案中，第一可切割部分和/或第二可切割部分可被酶例如內(nèi)切核酸酶切割。在一些實(shí)施方案中，第一可切割部分和第二可切割部分可以是可被相同的酶切割的。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的寡核苷酸可以在切割可激活的寡核苷酸的第一可切割部分時(shí)是可鈍化的。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的寡核苷酸可以在切割可鈍化的寡核苷酸的第二可切割部分時(shí)是可激活的。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法可包括提供包含靶核酸分子、可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液。該方法進(jìn)一步包括進(jìn)行連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可至少包括第一階段以及隨后的第二階段，其中第一階段包括使用該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分作為引物進(jìn)行靶核酸分子的擴(kuò)增，其中第二階段包括使用該可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分作為另一引物進(jìn)行靶核酸分子或其區(qū)域的擴(kuò)增。在第一階段后，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可被激活并且該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可被鈍化。而且，該連續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)可產(chǎn)生靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可被具有內(nèi)切核酸酶活性的酶分別激活和鈍化。在一些實(shí)施方案中，該酶是熱穩(wěn)定的和/或可激活的。在一些實(shí)施方案中，該酶是核糖核酸酶，例如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可在單一反應(yīng)混合物中發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可在多于一種反應(yīng)混合物中發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，溶液可進(jìn)一步包含至少一種反向引物。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含引發(fā)區(qū)和核酸序列b’，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與靶核酸分子雜交的核酸序列a’，(ii)至少一個(gè)可切割部分，該核酸序列b’位于該引發(fā)區(qū)的3’側(cè)并且顯示出與該引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。核酸序列a’可具有適合于僅在切割該可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含引發(fā)區(qū)和與該引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b，該引發(fā)區(qū)具有(i)可與靶核酸分子雜交的核酸序列a，(ii)至少一個(gè)可切割部分，該核酸序列b顯示出與該引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。核酸序列a可具有適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。在一些實(shí)施方案中，所述可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以在切割可激活的引發(fā)寡核苷酸的可切割部分時(shí)是可鈍化的。在一些實(shí)施方案中，所述可激活的引發(fā)寡核苷酸可以在切割可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的可切割部分時(shí)是可激活的。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。該檢測(cè)可以經(jīng)由例如光學(xué)檢測(cè)、靜電檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)來完成。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法可包括提供包含靶核酸分子、可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的反應(yīng)混合物，其中每一個(gè)均可與靶核酸分子的不同區(qū)域雜交。該方法可進(jìn)一步包括在該反應(yīng)混合物中采用該可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分或該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性地引發(fā)靶核酸分子。該方法可進(jìn)一步包括使用經(jīng)該可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分或該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性引發(fā)的靶核酸分子進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，以產(chǎn)生該靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可在反應(yīng)混合物中被選擇性地引發(fā)而無需去除其內(nèi)含物。在一些實(shí)施方案中，采用可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性地引發(fā)靶核酸分子可通過酶來實(shí)現(xiàn)，該酶激活該可激活的引發(fā)寡核苷酸以允許引物延伸反應(yīng)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，該酶可具有內(nèi)切核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，采用可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性地引發(fā)靶核酸分子可通過酶來實(shí)現(xiàn)，該酶鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，使得其不與靶核酸分子形成穩(wěn)定的復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，該酶可具有內(nèi)切核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，采用可鈍化的引發(fā)寡核苷酸選擇性地引發(fā)靶核酸分子可在不存在具有內(nèi)切核酸酶活性的活性酶的情況下實(shí)現(xiàn)。通過以下僅示出并描述了本公開內(nèi)容的說明性實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本公開內(nèi)容的附加方面和優(yōu)勢(shì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本公開內(nèi)容能夠具有其他且不同的實(shí)施方案，并且在均不脫離本公開內(nèi)容的情況下其若干細(xì)節(jié)能夠在各個(gè)明顯方面進(jìn)行修改。因此，附圖和說明書在本質(zhì)上應(yīng)被視為說明性的，而非限制性的。援引并入本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過引用并入本文，其程度如同具體地且單獨(dú)地指出每一個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過引用并入。附圖說明本發(fā)明的新穎特征在所附權(quán)利要求中具體地描述。通過參考以下對(duì)利用本發(fā)明原理的說明性實(shí)施方案加以闡述的詳細(xì)描述以及附圖(本文也稱為“圖”)將會(huì)獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解，在附圖中：圖1a是描繪實(shí)施例1所述的示例探針的示意圖；圖1b是對(duì)應(yīng)于圖1a中的示例探針的示例靶核酸分子；圖2a是總結(jié)實(shí)施例1所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的表格；圖2b是以圖示方式總結(jié)實(shí)施例1所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖；圖3a是總結(jié)實(shí)施例1所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的表格；圖3b是以圖示方式總結(jié)實(shí)施例1所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖；圖4a是總結(jié)實(shí)施例1所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的表格；圖4b是以圖示方式總結(jié)實(shí)施例1所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖；圖5a示意性地描繪了實(shí)施例2所述的示例探針；圖5b是描繪實(shí)施例2所述的示例無效(null)探針的示意圖；圖5c是描繪實(shí)施例2所述的示例靶核酸分子的示意圖；圖6a和圖6b是以圖示方式總結(jié)實(shí)施例2所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖；圖7a示意性地描繪了實(shí)施例3所述的示例探針；圖7b以圖示方式總結(jié)了實(shí)施例3所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖8a示意性地描繪了實(shí)施例4所述的示例雙鏈探針的示例鏈；圖8b以圖示方式總結(jié)了實(shí)施例4所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖9a示意性地描繪了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸示例及其在擴(kuò)增反應(yīng)中的功能；圖9b示意性地描繪了可激活的引發(fā)寡核苷酸示例及其在擴(kuò)增反應(yīng)中的功能；圖10a示意性地描繪了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸示例及其在擴(kuò)增反應(yīng)中的功能；圖10b示意性地描繪了可激活的引發(fā)寡核苷酸示例及其在擴(kuò)增反應(yīng)中的功能；圖10c提供了總結(jié)圖10a和圖10b所描繪的可鈍化和可激活的引發(fā)寡核苷酸示例的序列的表格；圖10c還提供了總結(jié)使用圖10a和圖10b所描繪的可鈍化和可激活的寡核苷酸示例的示例核酸擴(kuò)增反應(yīng)的示意圖；圖11a是總結(jié)實(shí)施例6所述的各個(gè)實(shí)驗(yàn)的表格；圖11b示意性地描繪了實(shí)施例6所述的實(shí)驗(yàn)所描述的示例處理程序；圖11c是實(shí)施例6所述的凝膠電泳分析的照片；圖12示意性地描繪了示例計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；圖13a是描繪核酸分子中示例單核苷酸多態(tài)性(snp)的示意圖；圖13b和圖13c是描繪用于檢測(cè)圖13a所描繪的示例snp的示例方法的示意圖；圖14a提供了實(shí)施例5所述的具有示例snp位點(diǎn)的示例靶核酸序列和檢測(cè)該snp位點(diǎn)上的核苷酸的示例方法；圖14b提供了實(shí)施例5所述的示例正向和反向引物；圖14c和圖14d提供了各種反應(yīng)混合物的解鏈曲線分析的示例圖形描繪和總結(jié)實(shí)施例5所述的各種反應(yīng)混合物的內(nèi)含物的表格。具體實(shí)施方式雖然本文已示出并描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但此類實(shí)施方案僅通過實(shí)例的方式予以提供對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到許多變化、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案。除非上下文另有明確規(guī)定，如本文所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。例如，術(shù)語“一個(gè)核酸分子”包括多個(gè)核酸分子，包括其混合物。如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)增(amplify)”和“擴(kuò)增(amplication)”可互換使用且通常是指產(chǎn)生核酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝?！皵U(kuò)增反應(yīng)”通常是指發(fā)生核酸擴(kuò)增的反應(yīng)。如本文所用，術(shù)語“退火”和“雜交”通常是指一個(gè)核酸分子(例如，引物或探針)經(jīng)由核酸分子之間的互補(bǔ)性與另一個(gè)核酸分子(例如，模板核酸分子、靶核酸分子)的結(jié)合。如本文所用，術(shù)語“可切割部分”通常是指核酸分子(例如，引發(fā)寡核苷酸、探針)中所包含的不穩(wěn)定物質(zhì)或可分離基團(tuán)，其可被切割使得核酸分子被分成多個(gè)較短的核酸分子?？汕懈畈糠挚赏ㄟ^任何合適的路徑切割，其非限制性實(shí)例包括酶切、光切割和化學(xué)切割(例如，經(jīng)由合適的ph條件)。“互補(bǔ)性”、“互補(bǔ)的”通常是指核酸根據(jù)watson-crick堿基配對(duì)原則或其他類型的堿基配對(duì)原則與另一個(gè)核酸形成氫鍵的能力。核酸鏈的“互補(bǔ)體”通常是指與該核酸鏈互補(bǔ)的核酸的另一條鏈。“部分互補(bǔ)的”通常意指第一核酸序列的一部分會(huì)與第二核酸序列的一部分形成氫鍵(例如，堿基對(duì))?！盎旧匣パa(bǔ)的”或“基本互補(bǔ)性”通常是指在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50個(gè)或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互補(bǔ)性的程度。如本文所用，術(shù)語“循環(huán)閾值”或“ct”通常是指在擴(kuò)增反應(yīng)期間的循環(huán)，其中由擴(kuò)增產(chǎn)物引起的可檢測(cè)信號(hào)的增加達(dá)到背景信號(hào)以上的統(tǒng)計(jì)顯著性水平。如本文所用，術(shù)語“變性(denaturing)”和“變性(denaturation)”可互換使用且通常是指雙鏈核酸的螺旋結(jié)構(gòu)的全部或部分解旋，并且在一些實(shí)施方案中是指單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)的解旋。如本文所用，“可檢測(cè)部分”通常是指產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的組合物，其存在或不存在可用來檢測(cè)核酸和/或核酸的拷貝的存在與否。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可以是可光學(xué)檢測(cè)的部分，使得該可檢測(cè)部分在存在(或不存在)電磁輻射例如光的情況下產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可被包含在探針中。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可與猝滅劑偶聯(lián)，當(dāng)適當(dāng)接近可檢測(cè)部分時(shí)，猝滅劑使可檢測(cè)部分產(chǎn)生其可檢測(cè)信號(hào)降至最低或得以防止。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可以是可鑒定與該可檢測(cè)部分締合的物質(zhì)的標(biāo)記。如本文所用，術(shù)語“解鏈溫度”通常是指雜交并形成雙鏈分子的兩個(gè)單鏈核酸分子彼此解離(例如，通過熱破壞雜交的互補(bǔ)堿基之間的氫鍵鍵合)時(shí)的溫度。在一些實(shí)施方案中，解鏈溫度可指一群相同的雙鏈核酸分子的約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的相同核酸鏈與它們的互補(bǔ)鏈解離時(shí)的溫度。例如，雙鏈核酸分子的解鏈溫度可指該雙鏈核酸分子的約一半的分子解離成其組成鏈時(shí)的溫度。在一些實(shí)施方案中，核酸序列的解鏈溫度可以為約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高。如本文所用，術(shù)語“核酸”和“核酸分子”可互換使用且通常是指任何長(zhǎng)度的聚合物形式的核苷酸——脫氧核糖核苷酸(dntp)或核糖核苷酸(rntp)或其類似物。核酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可行使任何已知或未知的功能。核酸的非限制性實(shí)例包括脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、肽核酸(pna)、鎖定核酸(lna)、基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、由連鎖分析定義的基因座(多個(gè)基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)移rna、核糖體rna、短干擾rna(sirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、微rna(mirna)、核酶、cdna、重組核酸、支鏈核酸、質(zhì)粒、載體、分離的任何序列的dna、分離的任何序列的rna、核酸探針和引物。核酸可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話，可在核酸的組裝之前或之后進(jìn)行核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核酸的核苷酸的序列可被非核苷酸組分中斷。核酸可以在聚合反應(yīng)之后例如通過與可檢測(cè)部分的綴合或結(jié)合進(jìn)一步修飾。在一些實(shí)施方案中，核酸可以為在一些實(shí)施方案中可用來擴(kuò)增另一個(gè)核酸分子的引物。如本文所用，術(shù)語“引物”通常是指能夠與模板核酸分子雜交且能夠經(jīng)由該模板核酸分子以模板指導(dǎo)的方式延伸的核酸分子。如本文所用，“引發(fā)寡核苷酸”通常是指包含可用作引物的核酸序列的寡核苷酸。這樣的核酸序列可以被包含在引發(fā)寡核苷酸的“引發(fā)區(qū)”中。在一些實(shí)施方案中，引物可以是單鏈的或部分雙鏈的。如本文所用，“引物延伸反應(yīng)”通常是指引物與核酸鏈的結(jié)合(例如，“退火”)，然后使用核酸鏈作為模板將核苷酸隨該引物摻入(例如，該引物的“延伸”或“延伸”該引物)。引物延伸反應(yīng)可借助于例如聚合酶的酶來完成。如本文所用，術(shù)語“探針”通常是指在與靶核酸分子雜交和/或擴(kuò)增靶核酸分子時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(或其不存在)的核酸分子(例如，寡核苷酸)。在一些實(shí)施方案中，探針可以包含可檢測(cè)部分、猝滅劑和可切割部分，使得當(dāng)切割該可切割部分時(shí)，該可檢測(cè)部分和猝滅劑分離，從而允許該可檢測(cè)部分產(chǎn)生其可檢測(cè)信號(hào)。如本文所用，術(shù)語“反應(yīng)混合物”或“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”通常是指包含完成引物延伸反應(yīng)和/或核酸擴(kuò)增所需的一種或多種試劑的組合物，此類試劑的非限制性實(shí)例包括對(duì)于靶核酸具有特異性的一種或多種引物、聚合酶、合適的緩沖液、輔因子(例如，二價(jià)和單價(jià)陽離子)、核苷酸(例如，脫氧核糖核苷酸(dntp))以及任何其他的酶。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物還可以包含一種或多種適合于在擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)物質(zhì)的探針和/或可檢測(cè)部分。如本文所用，術(shù)語“靶核酸”和“靶核酸分子”可互換使用且通常是指具有靶序列的核酸分子的起始群體中的核酸分子，需要確定該核酸分子的存在、量和/或核苷酸序列或其中一項(xiàng)或多項(xiàng)的變化。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是雙鏈的。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是單鏈的。例如，單鏈靶核酸分子可包括雙鏈核酸分子的鏈。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是部分單鏈的和部分雙鏈的。靶核酸分子可以是基因、調(diào)節(jié)序列、基因組dna、cdna、包括mrna、mirna、rrna在內(nèi)的rna，或其他的一部分。靶核酸分子可以是來自樣品或二級(jí)靶標(biāo)如擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的靶核酸分子。本公開內(nèi)容的一些方面提供了用于使用這樣的探針檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)的探針和方法。這樣的探針可包含在與靶核酸分子雜交時(shí)可被切割的可切割部分。該可切割部分的切割可以產(chǎn)生來自與探針締合的可檢測(cè)部分的可檢測(cè)信號(hào)。一方面，本公開內(nèi)容提供了一種探針。該探針可包含互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子且具有至少一個(gè)可切割部分、可檢測(cè)部分和猝滅劑的核酸序列。當(dāng)探針不與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)，該猝滅劑可猝滅該可檢測(cè)部分。所述探針可以是單鏈的或雙鏈的。而且，在一些實(shí)施方案中，該探針可能無法進(jìn)行分子內(nèi)雜交。例如，該探針可能無法進(jìn)行自我雜交，如在該探針采取包含與其序列的另一部分雜交的其序列的至少一部分的構(gòu)型的情況下。在一些實(shí)施方案中，該探針可以包含位于至少一個(gè)可切割部分側(cè)翼的核苷酸序列a和核苷酸序列b。核苷酸序列a和核苷酸序列b可各自互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的一部分。所述探針的可切割部分可以是任何合適的可切割部分，其中可切割部分的非限制性實(shí)例包括核糖部分、二硫化物部分、疊氮化物部分、可酶切連接體、親核體/堿敏感性連接體、還原敏感性連接體、可光解連接體、親電體/酸敏感性連接體、金屬輔助切割連接體、氧化敏感性連接體及其組合。在一些實(shí)施方案中，該探針可包含多個(gè)可切割部分。而且，該探針的可切割部分可通過任何合適的路徑而切割。例如，在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)，該探針的可切割部分可以是可切割的。在一些實(shí)施方案中，可切割部分可以在堿性條件(例如，ph大于7)下是可切割的。例如，可切割部分可以在約7到14、約8到11或約9到10的ph下是可切割的。在一些實(shí)施方案中，該可切割部分可以在約7.1、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5或14.0的ph下是可切割的。此外，該探針可以在不借助于酶(例如，聚合酶、包含內(nèi)切核酸酶活性的酶、包含3’到5’內(nèi)切核酸酶活性的酶等)的情況下是可切割的。在一些實(shí)施方案中，所述探針可適合于與單鏈靶核酸分子雜交，使得可切割部分位于該單鏈靶核酸分子的單核苷酸多態(tài)性(snp)位點(diǎn)。該可切割部分可以相對(duì)于snp位點(diǎn)處的核苷酸是互補(bǔ)的或非互補(bǔ)的。該可切割部分與在snp位點(diǎn)上的核苷酸的互補(bǔ)性可以幫助促使該可切割部分更不穩(wěn)定。相反，該可切割部分與在snp位點(diǎn)上的核苷酸缺乏互補(bǔ)性或互補(bǔ)性弱可使該可切割部分較為穩(wěn)定。因此，被設(shè)計(jì)為檢測(cè)snp的探針的可切割部分可被設(shè)計(jì)為使得該可切割部分與該snp位點(diǎn)上的特定核苷酸互補(bǔ)。所述探針的可檢測(cè)部分可以是任何合適的可檢測(cè)部分，包括本文別處所述的可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，該可檢測(cè)部分可以是光學(xué)可檢測(cè)部分，例如熒光團(tuán)或其他的染料。此外，該探針的可檢測(cè)部分可適合于在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)提供可檢測(cè)信號(hào)(例如，光信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)、靜電信號(hào))。而且，可檢測(cè)部分可位于該探針的任何合適的位置，例如，在探針的3’端，在探針的5’端，在探針的3’與5’端之間的位置，在不含有猝滅劑的雙鏈探針的一條鏈上，或在與猝滅劑相對(duì)的探針一端?？蓹z測(cè)部分可與探針直接偶聯(lián)或經(jīng)由連接體間接地偶聯(lián)?？蓹z測(cè)部分的偶聯(lián)可以經(jīng)由任何合適的路徑實(shí)現(xiàn)，包括本文別處所述的共價(jià)和/或非共價(jià)路徑。此外，所述探針的猝滅劑可以是任何合適的猝滅劑，其中猝滅劑的非限制性實(shí)例包括iabkfq猝滅劑、abkfq猝滅劑和黑洞猝滅劑(bhq)。而且，猝滅劑可位于該探針的任何合適的位置，例如，在探針的3’端，在探針的5’端，在探針的3’與5’端之間的位置，在不含有可檢測(cè)部分的雙鏈探針的一條鏈上，或在與可檢測(cè)部分相對(duì)的探針一端。猝滅劑可與探針直接偶聯(lián)或經(jīng)由連接體間接地偶聯(lián)。猝滅劑的偶聯(lián)可以經(jīng)由任何合適的路徑實(shí)現(xiàn)，包括本文別處所述的共價(jià)和/或非共價(jià)路徑。探針的實(shí)例示意性地示于圖1a中。如圖1a所示，示例探針從5’到3’包含可檢測(cè)部分(例如，fam熒光團(tuán))101、可切割部分(例如，核糖部分“rc”)102和猝滅劑(例如，abkfq)103。該探針還包含位于可切割部分102側(cè)翼且與靶核酸分子上的序列互補(bǔ)的核苷酸序列100a和核苷酸序列100b。在探針與序列雜交時(shí)，可切割部分102可被切割，使得可檢測(cè)部分101與猝滅劑103分離，從而導(dǎo)致生成來自可檢測(cè)部分101的可檢測(cè)信號(hào)。在以下提供的實(shí)施例部分提供了另外的示例探針。在一些實(shí)施方案中，所述探針可被包含在溶液例如擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。如本文別處所述，這樣的反應(yīng)混合物可以包含探針、單鏈靶核酸分子和適合于擴(kuò)增該單鏈靶核酸分子的任何附加試劑。溶液的其他實(shí)例包括水、緩沖液、溶劑、生物流體、含鹽的流體、含核苷酸的流體、含酶的流體、含添加劑的流體及其組合。在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含堿性緩沖液，此類緩沖液的非限制性實(shí)例包括包含tris堿的緩沖液、包含氫氧化鈉的緩沖液、包含氫氧化鉀的緩沖液、包含氫氧化銨的緩沖液以及包含碳酸鈉的緩沖液。該溶液中的堿性條件可幫助切割該探針的可切割部分。在一些實(shí)施方案中，所述探針可固定在陣列的基底上。陣列的這種基底可以是固體基底，該固體基底可包含選自金屬、半金屬、玻璃、聚合物(例如，有機(jī)聚合物)、金屬氧化物、氧化硅、氮化硅、其組合以及其復(fù)合物的材料。在一些實(shí)施方案中，該探針可以固定在陣列的基底的孔，例如微孔板的孔中。探針可經(jīng)由包括共價(jià)和非共價(jià)附接在內(nèi)的任何合適的方法固定于陣列的基底。探針與陣列的共價(jià)附接可以是直接的或經(jīng)由探針與陣列之間的連接體間接的。非共價(jià)附接可以經(jīng)由例如范德華力、離子相互作用、疏水相互作用或結(jié)合對(duì)(例如，鏈霉親和素/生物素)的成員的結(jié)合。本公開內(nèi)容的另一方面提供了用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)的方法。該方法可包括提供包含單鏈靶核酸分子和探針的反應(yīng)混合物。該探針可具有核酸序列，該核酸序列具有至少一個(gè)可切割部分、可檢測(cè)部分和猝滅劑。而且，該探針可互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子，并且當(dāng)該探針不與該單鏈靶核酸分子雜交時(shí)，該猝滅劑可猝滅可檢測(cè)部分。該探針與單鏈靶核酸分子雜交，其中在雜交時(shí)，該可切割部分被設(shè)置為與單鏈靶核酸分子的單核苷酸多態(tài)性(snp)位點(diǎn)上的核苷酸相鄰。隨后可從探針檢測(cè)信號(hào)，該信號(hào)指示在snp位點(diǎn)上存在核苷酸。探針與單鏈靶核酸分子的雜交和/或檢測(cè)來自探針的信號(hào)可在不借助于酶(例如，聚合酶、具有內(nèi)切核酸酶活性的酶、具有3’到5’外切核酸酶活性的酶)和/或不對(duì)反應(yīng)混合物的溫度進(jìn)行循環(huán)的情況下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)的ph可以維持在堿性條件(例如，ph大于7)下。例如，該反應(yīng)混合物的ph可以維持在約7到14、約8到11或約9到10的ph。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)的ph可以維持在約7.1、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5或14.0的ph。此外，來自探針的信號(hào)可以是如本文別處所述的光信號(hào)、靜電信號(hào)或電化學(xué)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，單鏈靶核酸分子可不含有可檢測(cè)部分。而且，如本文別處所述，該探針可以固定在陣列的基底上。例如，該探針可固定在陣列的孔中。所述探針可包含任何附加的特征，包括本文別處所述的探針的附加特征。例如，該探針可包含多個(gè)可切割部分和/或可包含位于該可切割部分側(cè)翼的核苷酸序列a和核苷酸序列b，并且其中核苷酸序列a和核苷酸序列b各自互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的一部分。此外，該可切割部分可以相對(duì)于snp位點(diǎn)上的核苷酸是互補(bǔ)的或非互補(bǔ)的。而且，該探針的可檢測(cè)部分可具有任何合適的特征，包括如本文別處所述的探針的可檢測(cè)部分的特征。例如，該可檢測(cè)部分可適合于在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)提供信號(hào)。此外，該探針的可切割部分可具有任何合適的特征，包括如本文別處所述的探針的可切割部分的特征。例如，在探針與單鏈靶核酸分子雜交時(shí)該可切割部分可以被切割。本公開內(nèi)容的附加方面提供了經(jīng)由采用包含嘌呤或嘧啶衍生物的引物的核酸擴(kuò)增來檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)的方法。這類嘌呤或嘧啶衍生物可優(yōu)先與snp位點(diǎn)上特定類型的核苷酸雜交。靶核酸分子可以在平行的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增，其中一組反應(yīng)混合物包含一種引物，該引物在其對(duì)應(yīng)于靶核酸分子的snp位點(diǎn)的位點(diǎn)上包含嘌呤衍生物，并且另一組反應(yīng)混合物包含一種引物，該引物在其對(duì)應(yīng)于靶核酸分子的snp位點(diǎn)的位點(diǎn)上包含嘧啶衍生物?？梢栽诿恳环N反應(yīng)混合物中檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物并比較檢測(cè)結(jié)果。本公開內(nèi)容的一方面提供了用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)的方法。該方法包括提供第一反應(yīng)混合物，其包含靶核酸分子的第一鏈和第一引物，該第一引物在其核苷酸位點(diǎn)處具有嘌呤衍生物，該核苷酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于懷疑包含單核苷酸多態(tài)性(snp)的第一核苷酸位點(diǎn)的第一鏈的核苷酸位點(diǎn)。相比于第一鏈的其他類型的堿基，該嘌呤衍生物可優(yōu)先與第一鏈的嘧啶堿基雜交。該方法進(jìn)一步包括提供第二反應(yīng)混合物，其包含靶核酸分子的第一鏈的互補(bǔ)鏈和第二引物，該第二引物在其核苷酸位點(diǎn)處具有嘧啶衍生物，該核苷酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于懷疑包含snp的第二核苷酸位點(diǎn)的互補(bǔ)鏈的核苷酸位點(diǎn)，其中相比于該互補(bǔ)鏈的其他類型的堿基，該嘧啶衍生物優(yōu)先與該互補(bǔ)鏈的嘌呤堿基雜交。隨后使第一和第二反應(yīng)混合物經(jīng)受這樣的條件，該條件使得第一引物在與第一鏈雜交時(shí)可延伸以產(chǎn)生第一核酸產(chǎn)物，并且第二引物在與互補(bǔ)鏈雜交時(shí)可延伸以產(chǎn)生第二核酸產(chǎn)物。在生成第一和第二核酸產(chǎn)物之后，隨后測(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量。在一些實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)混合物可以彼此分離開，例如位于單獨(dú)的容器中。此外，與第二核酸產(chǎn)物相比所測(cè)定的第一核酸產(chǎn)物的量較多可表明在snp的第一核苷酸位點(diǎn)處存在嘌呤堿基。與第一核酸產(chǎn)物相比所測(cè)定的第二核酸產(chǎn)物的量較多則可表明在snp的第二核苷酸位點(diǎn)處存在嘧啶堿基。第一引物的嘌呤衍生物可以是任何合適的嘌呤衍生物，包括核酸分子的天然嘌呤(例如，腺嘌呤或鳥嘌呤)或非天然嘌呤中的一種。但是，在一些實(shí)施方案中，第一引物的嘌呤衍生物可以不是鳥嘌呤或可以不是腺嘌呤。在這樣的實(shí)施方案中，第一引物的嘌呤衍生物可以是次黃嘌呤或其衍生物。次黃嘌呤可見于肌苷核苷酸中。而且，在一些實(shí)施方案中，第一引物的嘌呤衍生物可以借助于酶，例如具有3’到5’外切核酸酶活性的酶或內(nèi)切核酸酶可被腺嘌呤堿基或鳥嘌呤代替。具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的非限制性實(shí)例包括phusion聚合酶、pfu聚合酶、deepvent聚合酶、外切核酸酶i、外切核酸酶iii、外切核酸酶iv、外切核酸酶v、kod聚合酶、q5聚合酶、accura高保真度聚合酶、phi29聚合酶、bst聚合酶、dna聚合酶i、t4聚合酶和t7聚合酶。具有內(nèi)切核酸酶活性的酶(例如，內(nèi)切核酸酶)的非限制性實(shí)例包括脫氧核糖核酸酶i、i型限制性內(nèi)切核酸酶、ii型限制性內(nèi)切核酸酶、iii型限制性內(nèi)切核酸酶、核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii)、尿嘧啶n-糖基化酶(ung)、t7內(nèi)切核酸酶、t4內(nèi)切核酸酶iv、bal31內(nèi)切核酸酶、s1核酸酶、綠豆核酸酶、內(nèi)切核酸酶i、內(nèi)切核酸酶ii和內(nèi)切核酸酶r。在一些實(shí)施方案中，具有內(nèi)切核酸酶活性的酶可以是熱穩(wěn)定的。在一些實(shí)施方案中，具有內(nèi)切核酸酶活性的酶可以是可激活的或可鈍化的。內(nèi)切核酸酶的激活或鈍化可以例如經(jīng)由熱穩(wěn)定的化學(xué)修飾來實(shí)現(xiàn)。鈍化或激活也可以例如采用適體或抗體來實(shí)現(xiàn)。類似地，第二引物的嘧啶衍生物可以是任何合適的嘧啶衍生物，包括天然嘧啶(例如，胸腺嘧啶或胞嘧啶)中的一種，或可以是核酸分子的非天然嘧啶。但是，在一些實(shí)施方案中，第二引物的嘧啶衍生物可以不是胸腺嘧啶或胞嘧啶。在這樣的實(shí)施方案中，第二引物的嘧啶衍生物可以是尿嘧啶或其衍生物。而且，在一些實(shí)施方案中，第二引物的嘌呤衍生物可以借助于酶，例如具有3’到5’外切核酸酶活性的酶或內(nèi)切核酸酶可被胸腺嘧啶或胞嘧啶堿基代替。此外，第一引物的嘌呤衍生物優(yōu)先雜交的第一鏈的嘧啶堿基可以是任何嘧啶堿基，包括胞嘧啶和胸腺嘧啶。第二引物的嘧啶衍生物優(yōu)先雜交的互補(bǔ)鏈的嘌呤堿基可以是任何嘌呤堿基，包括腺嘌呤和鳥嘌呤。在一些實(shí)施方案中，第一和第二反應(yīng)混合物可以包含可檢測(cè)部分。該可檢測(cè)部分可以是任何合適的可檢測(cè)部分，包括本文別處所述的可檢測(cè)部分的示例類型。例如，該可檢測(cè)部分可以是光學(xué)可檢測(cè)部分，如熒光染料(例如，sybr綠、evagreen、bebo、boxto、嵌入染料)。反應(yīng)混合物中的可檢測(cè)部分可以幫助檢測(cè)在擴(kuò)增期間該反應(yīng)混合物中的擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)由合適的檢測(cè)方式(包括本文別處所述的示例檢測(cè)方式)的檢測(cè)可以幫助測(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量。在一些實(shí)施方案中，第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量的測(cè)定可借助于解鏈曲線分析進(jìn)行。在解鏈曲線分析中，可以加熱包含雙鏈核酸分子(例如，擴(kuò)增產(chǎn)物)的混合物(例如，擴(kuò)增反應(yīng)混合物)，并且可以相對(duì)于溫度測(cè)量該混合物中雙鏈核酸分子的解離(例如，變性)。雙鏈核酸分子的鏈的溫度依賴性解離可利用可嵌入或結(jié)合雙鏈核酸分子的可檢測(cè)部分來測(cè)量。例如，在當(dāng)與雙鏈核酸分子結(jié)合時(shí)發(fā)熒光的嵌入劑(例如，sybr綠)的情況下，在加熱期間雙鏈核酸分子的解離以及結(jié)合的嵌入劑的釋放可以通過產(chǎn)生的熒光的減少來確定。游離的嵌入劑可不發(fā)熒光(或不在與結(jié)合的物質(zhì)相同的波長(zhǎng)下發(fā)熒光)，因此熒光的減少可用來表明雙鏈核酸分子的解離?？蓪⒔怆x相對(duì)于溫度的一階導(dǎo)數(shù)或負(fù)一階導(dǎo)數(shù)(例如，熒光的負(fù)一階導(dǎo)數(shù))進(jìn)行繪圖，以經(jīng)由曲線圖中的峰值來確定解離的溫度(例如，50％解離發(fā)生時(shí)的溫度)。核酸分子可以經(jīng)由獲得的解離譜和/或解離的溫度來鑒定。在一些實(shí)施方案中，第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量的確定可借助于循環(huán)閾值的變化(δct)來進(jìn)行?？梢詼y(cè)定第一和第二核酸產(chǎn)物中的每一個(gè)的ct值，并求差以確定第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量。在一些實(shí)施方案中，第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量的確定可借助于任何其他合適的方法，包括例如凝膠電泳。在一些實(shí)施方案中，第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量的確定可借助于被編程為比較第一和第二核酸產(chǎn)物的相對(duì)量的計(jì)算機(jī)處理器來進(jìn)行。如本文別處所述，這樣的計(jì)算機(jī)處理器可以作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一部分被包含在內(nèi)。檢測(cè)對(duì)應(yīng)于靶核酸分子中的snp的兩種基因型的實(shí)例示意性地描繪在圖13a-13c中。如圖13a所示，特定的靶核酸可具有snp位點(diǎn)1320，在第一基因型1301中，snp位點(diǎn)1320包含其有義鏈1303中的含腺嘌呤的核苷酸(“a”)以及其反義鏈1304中的含胸腺嘧啶的核苷酸(“t”)。在第二基因型1302中，該靶核酸分子在snp位點(diǎn)1320上包含其有義鏈1305中的含鳥嘌呤的核苷酸(“g”)以及其反義鏈中的含胞嘧啶的核苷酸(“c”)。為了檢測(cè)第一基因型1301，靶核酸分子可以與如圖13b示意性描繪的正向引物1307、反向引物1308、包含3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶(例如，pfu聚合酶)以及進(jìn)行靶核酸分子擴(kuò)增所需的任何其他試劑一起提供于反應(yīng)混合物中。如圖13b所示，正向引物1307和反向引物1308均可包含可經(jīng)由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割的尾部。正向引物1307和反向引物1308的尾部可在靶核酸分子的擴(kuò)增期間幫助引物二聚體副產(chǎn)物的生成降至最低。在其尾部中，正向引物1307可包含肌苷核苷酸1309(“i”)，當(dāng)與靶核酸分子的反義鏈1304的snp位點(diǎn)1330上的含胸腺嘧啶的核苷酸結(jié)合時(shí)，肌苷核苷酸1309可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶來去除。肌苷核苷酸1309包含次黃嘌呤堿基，與含胸腺嘧啶的核苷酸(肌苷核苷酸1309的“非優(yōu)選”互補(bǔ)核苷酸)相比，該次黃嘌呤堿基在靶核酸分子的反義鏈1304的snp位點(diǎn)1330處通常與含胞嘧啶的核苷酸(肌苷核苷酸1309的“優(yōu)選”互補(bǔ)核苷酸)更好地結(jié)合。由于肌苷核苷酸1309與靶核酸分子的反義鏈1304的含胸腺嘧啶的核苷酸的相對(duì)較弱的結(jié)合，在正向引物1307的尾部的切割期間，聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可從正向引物1307去除肌苷核苷酸1309。在尾部從正向引物1307切割之后，聚合酶隨后可延伸正向引物1307的3’端，使得反義鏈1304的snp位點(diǎn)1330上的含胸腺嘧啶的核苷酸的天然互補(bǔ)核苷酸(含腺嘌呤的核苷酸“a”)在snp位點(diǎn)1330處被添加至正向引物1307。如本文別處所述，所述反應(yīng)混合物的溫度從退火到延伸溫度進(jìn)行循環(huán)，使得正向引物1307與靶核酸分子的反義鏈1304退火，經(jīng)由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性去除包含肌苷核苷酸1309的尾部，并延伸正向引物1307的3’端。延伸可導(dǎo)致包含含腺嘌呤的核苷酸的擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的生成，該含腺嘌呤的核苷酸在雙鏈核酸分子的有義鏈snp位點(diǎn)上代替肌苷核苷酸1309。因?yàn)橥ㄟ^聚合酶去除了肌苷核苷酸1309，所以該雙鏈核酸分子隨后可經(jīng)歷使用正向引物1307和反向引物1308的擴(kuò)增1340的多個(gè)循環(huán)，以生成附加的擴(kuò)增的雙鏈核酸分子1350?？蓹z測(cè)到擴(kuò)增的雙鏈核酸分子1350，并且靶核酸分子的基因型根據(jù)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子1350的存在而被確定為基因型1301。在一些情況下，引物1307可在正向引物1307的肌苷核苷酸1309沒有切割的情況下延伸。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，反向引物1308可與新合成的鏈退火，而聚合酶(例如，pfu聚合酶)可在遇到作為模板核苷酸的肌苷核苷酸1309時(shí)失去活性或不再具有活性。聚合酶活性的這種降低或喪失可使包含肌苷核苷酸1309的不良擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生量降至最低。例如，如果使用正向引物1307擴(kuò)增包含基因型1302的核酸鏈，則肌苷核苷酸1309將通常不被切割，而是存在于包含正向引物1307的延伸鏈中。然而，如上所討論的，在與肌苷核苷酸1309接觸時(shí)該延伸鏈中的這種肌苷核苷酸1309將導(dǎo)致聚合酶的喪失或抑制。因此，相對(duì)于包含基因型1302的核酸，正向引物1307可用來選擇性地?cái)U(kuò)增含有基因型1301的核酸。為了檢測(cè)第二基因型1302，靶核酸可以與如圖13c示意性描繪的正向引物1317、反向引物1318、包含3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶(例如，pfu聚合酶)以及進(jìn)行靶核酸分子擴(kuò)增所需的任何其他試劑一起提供于反應(yīng)混合物中。如圖13c所示，正向引物1317和反向引物1318均可包含可經(jīng)由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割的尾部。在其尾部中，正向引物1317可包含含尿嘧啶的核苷酸1319(“u”)，當(dāng)與靶核酸分子的有義鏈1305的snp位點(diǎn)1360上的含鳥嘌呤的核苷酸結(jié)合時(shí)，含尿嘧啶的核苷酸1319可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶去除。含尿嘧啶的核苷酸1319包含尿嘧啶堿基，與含鳥嘌呤的核苷酸(含尿嘧啶的核苷酸1319的“非優(yōu)選”互補(bǔ)核苷酸)相比，該尿嘧啶堿基在靶核酸分子的有義鏈1305的snp位點(diǎn)1360處通常與含腺嘌呤的核苷酸(含尿嘧啶的核苷酸1319的“優(yōu)選”互補(bǔ)核苷酸)更好地結(jié)合。由于含尿嘧啶的核苷酸1319與靶核酸分子的有義鏈1305的含鳥嘌呤的核苷酸的相對(duì)較弱的結(jié)合，在正向引物1317的尾部的切割期間，聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可從正向引物1317去除含尿嘧啶的核苷酸1319。在尾部從正向引物1317切割之后，聚合酶隨后可延伸正向引物1317的3’端，使得有義鏈1305的snp位點(diǎn)1360上的含鳥嘌呤的核苷酸的天然互補(bǔ)核苷酸(含胞嘧啶的核苷酸“c”)在snp位點(diǎn)1360處被添加至正向引物1317。如本文別處所述，所述反應(yīng)混合物的溫度可從退火到延伸溫度進(jìn)行循環(huán)，使得正向引物1317與靶核酸分子的有義鏈1305退火，經(jīng)由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性去除包含含尿嘧啶的核苷酸1319的尾部，并延伸正向引物1317的3’端。延伸可導(dǎo)致包含含胞嘧啶的核苷酸的擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的生成，該含胞嘧啶的核苷酸在雙鏈核酸分子的反義鏈snp位點(diǎn)上代替含尿嘧啶的核苷酸1319。因?yàn)橥ㄟ^聚合酶去除了含尿嘧啶的核苷酸1319，所以該雙鏈核酸分子隨后可經(jīng)歷使用正向引物1317和反向引物1318的擴(kuò)增1370的多個(gè)循環(huán)，以生成附加的擴(kuò)增的雙鏈核酸分子1380?？蓹z測(cè)到擴(kuò)增的雙鏈核酸分子1380，并且靶核酸分子的基因型根據(jù)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子1380的存在而被確定為基因型1302。在一些情況下，正向引物1317可在正向引物1317的尿嘧啶核苷酸1319沒有切割的情況下延伸。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，反向引物1318可與新合成的鏈退火，而聚合酶(例如，pfu聚合酶)可在遇到作為模板核苷酸的尿嘧啶核苷酸1319時(shí)失去活性或不再具有活性。聚合酶活性的這種降低或喪失可使包含尿嘧啶核苷酸1319的不期望的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生量降至最低。例如，如果使用正向引物1317擴(kuò)增包含基因型1301的核酸鏈，則尿嘧啶核苷酸1319將通常不被切割，而是存在于包含正向引物1317的延伸鏈中。然而，如上所討論的，在與尿嘧啶核苷酸1319接觸時(shí)，該延伸鏈中的這種尿嘧啶核苷酸1319將導(dǎo)致聚合酶的喪失或抑制。因此，相對(duì)于包含基因型1301的核酸，正向引物1317可用來選擇性地?cái)U(kuò)增含有基因型1302的核酸。圖13a-圖13c所示的用于檢測(cè)基因型1301和1302的示例方法可同時(shí)用來檢測(cè)核酸樣品中的特定基因型。該核酸樣品可以分開并且提供給兩種擴(kuò)增反應(yīng)混合物。除了合適的反向引物、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶以及擴(kuò)增核酸樣品中的靶核酸分子所需的任何其他試劑以外，反應(yīng)混合物中的每一種還可以包含正向引物1307或正向引物1317。反應(yīng)混合物隨后可經(jīng)受適合于擴(kuò)增核酸樣品中的靶核酸分子的條件。在每種反應(yīng)混合物中的擴(kuò)增產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于經(jīng)由正向引物1307或正向引物1317的擴(kuò)增)的相對(duì)水平可一起用來確定哪一種基因型存在于最初的核酸樣品中。如果包含正向引物1307的反應(yīng)混合物與包含正向引物1317的反應(yīng)混合物相比生成更高水平的擴(kuò)增產(chǎn)物，則通常可以確定該核酸樣品包含基因型1301。如果包含正向引物1317的反應(yīng)混合物與包含反向引物1307的反應(yīng)混合物相比生成更高水平的擴(kuò)增產(chǎn)物，則通?？梢源_定該核酸樣品包含基因型1302。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸以及用于鈍化這類引發(fā)寡核苷酸的方法?？赦g化的引發(fā)寡核苷酸可包含具有不同解鏈溫度的可切割部分和/或序列。這類可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可經(jīng)由可切割部分的切割和/或溫度的操縱而被鈍化。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a的引發(fā)區(qū)。核酸序列a的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈。該引發(fā)區(qū)還可以包含至少一個(gè)可切割部分。此外，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸還可以包含與引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性的與引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。在另一方面，本公開內(nèi)容提供了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a的引發(fā)區(qū)。核酸序列a的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈。該引發(fā)區(qū)還可以包含至少一個(gè)可切割部分。此外，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸還可以包含與引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。該引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。本文所述的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，因?yàn)槠湫蛄锌砂舜嘶パa(bǔ)的區(qū)域。環(huán)形可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的這類區(qū)域可彼此雜交，以在該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸中形成環(huán)形結(jié)構(gòu)(例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu))。例如，核酸序列b的全部或一部分可與可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性。而且，在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的3’端可以僅在等于或高于核酸序列b的解鏈溫度的溫度下是可延伸的。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)從3’到5’可以包含核酸序列a、可切割部分和互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的核酸序列a'。核酸序列a’可以與或可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度。例如，引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以為約50℃至約80℃、約60℃至約75℃或約65℃至約70℃。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)特定的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度為至少約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。核酸序列b的第二解鏈溫度可以是可低于引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度的任何合適的解鏈溫度。例如，根據(jù)特定的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，核酸序列b的第二解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度低約1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可包含核酸序列a的附加序列。例如，引發(fā)區(qū)可包含核酸序列a’。在這樣的實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有可低于引發(fā)區(qū)整體的第一解鏈溫度和/或核酸序列b的第二解鏈溫度的第三解鏈溫度。核酸序列a的第三解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)特定的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，核酸序列a的第三解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的第三解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度和/或核酸序列b的第二解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。而且，核酸序列b可以與或可以不與單鏈靶核酸分子和/或該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以包含不與引發(fā)區(qū)和/或單鏈靶核酸分子互補(bǔ)的間隔區(qū)。這樣的間隔區(qū)可以是可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域在引物延伸反應(yīng)中不能經(jīng)由聚合酶拷貝。例如，該間隔區(qū)可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)、十三個(gè)、十四個(gè)、十五個(gè)、十六個(gè)、十七個(gè)、十八個(gè)、十九個(gè)、二十個(gè)或更多個(gè)核苷酸的序列。寡核苷酸的這種序列可包含抑制聚合酶作用的一種或多種物質(zhì)，其非限制性實(shí)例包括dspacer(脫堿基(abasic)呋喃)、間隔區(qū)c3、己二醇間隔區(qū)、間隔區(qū)9、間隔區(qū)12和間隔區(qū)18?？赦g化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以是任何合適的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分?？砂诳赦g化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)中的可切割部分的非限制性實(shí)例包括核糖、二硫化物鍵、重氮苯衍生物(例如，可用na2s2o4切割的)、基于腙的連接體、可光解的間隔區(qū)(例如，pc間隔區(qū))、熱可切割的亞胺堿/異氰酸酯加合物、含疊氮化物的連接體、基于乙酰丙基酯的連接體以及烯丙基連接體。而且，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可通過任何合適的路徑而切割。例如，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以是可光解的(例如，經(jīng)由可切割部分暴露于光)、可酶切的(例如，經(jīng)由酶如內(nèi)切核酸酶、限制酶、核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii、核糖核酸酶hiii)的作用)或可化學(xué)切割的(例如，經(jīng)由合適的還原劑、ph條件或反應(yīng)混合物中的其他條件)。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以在堿性ph下是可切割的。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可被包含在溶液例如擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。如本文別處所述，這樣的反應(yīng)混合物可以包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸、單鏈靶核酸分子和適合于擴(kuò)增該單鏈靶核酸分子的任何附加試劑。本文別處所述的示例溶液的其他類型的附加類型實(shí)例還可以包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。例如，包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液可包含堿性緩沖液。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的方法。該方法包括提供含有可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a的引發(fā)區(qū)。核酸序列a的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈。該引發(fā)區(qū)還可以包含至少一個(gè)可切割部分。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸還可以包含與引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性的與引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。該方法進(jìn)一步包括切割可切割部分，所述切割使可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)鈍化。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的方法。該方法包括提供含有可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a的引發(fā)區(qū)。核酸序列a的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈。此外，該引發(fā)區(qū)還可以包含至少一個(gè)可切割部分。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸還可以包含與引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。該引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且該核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。該方法進(jìn)一步包括切割可切割部分，所述切割使可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)鈍化。發(fā)生可鈍化的引發(fā)寡核苷酸鈍化的溶液可以是任何合適的溶液，包括在其中擴(kuò)增單鏈靶核酸分子的擴(kuò)增反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，可切割部分可以在等于或低于核酸序列b的第二解鏈溫度的溶液溫度下切割。因此，方法可進(jìn)一步包括使溶液的溫度降至低于或等于核酸序列b的第二解鏈溫度。在使溶液的溫度降至等于或低于核酸序列b的第二解鏈溫度并切割可切割部分之后，該溶液的溫度可隨后升至等于或高于引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度的溫度。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a在等于或高于其解鏈溫度和/或第一解鏈溫度的溫度下可能不與單鏈靶核酸分子穩(wěn)定地雜交。而且，在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)從3’到5’可以包含核酸序列a、與核酸序列a相鄰的可切割部分以及與可切割部分相鄰的核酸序列a'。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可具有高于核酸序列b的第二解鏈溫度的第一解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可包含核酸序列a的附加序列(例如，核酸序列a’)。在這樣的實(shí)施方案中，核酸序列a可具有第三解鏈溫度，在切割可切割部分時(shí)，該第三解鏈溫度可低于引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度，在一些實(shí)施方案中，還低于核酸序列b的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，方法可進(jìn)一步包括使溶液的溫度升至等于或高于核酸序列a的第三解鏈溫度的溫度。這樣的溫度升高可幫助防止可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的切割核酸序列a與單鏈靶核酸分子退火。引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度、核酸序列b的第二解鏈溫度以及必要時(shí)核酸序列a的第三解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度。例如，根據(jù)特定的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以為至少約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的第三解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的第三解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度和/或核酸序列b的第二解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以是可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的任何合適的可切割部分，包括本文別處所述的實(shí)例(例如，核糖)。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。而且，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可通過任何合適的方法被切割。例如，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以采用酶(例如，內(nèi)切核酸酶，包括本文別處所述的示例內(nèi)切核酸酶，如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii、核糖核酸酶hiii、切口限制性內(nèi)切核酸酶、nb、bbvci、ntalwi、nbbsmi、bsai、sapi、nbbsrdi)、采用光、采用還原劑(例如，dtt或tcep)以及采用大于7的溶液ph(例如，堿性溶液)中的一種或多種來切割。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以是如本文別處所述的環(huán)形可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。圖9a示意性地描繪了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的實(shí)例、采用這種可鈍化的引發(fā)寡核苷酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增的示例方法以及用于鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的示例方法。如圖9a所示，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸900從3’到5’包含核酸序列900a、可切割部分(例如，核糖r)、核酸序列900a’和核酸序列900b。核酸序列900a和900a’以及可切割部分r被包含在該引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)901中。核酸序列900b互補(bǔ)于引發(fā)區(qū)901且不與單鏈靶核酸分子904互補(bǔ)。而且，核酸序列900b包含間隔區(qū)s，該間隔區(qū)s是不與引發(fā)區(qū)901或單鏈靶核酸分子904互補(bǔ)的核苷酸的序列。間隔區(qū)s可防止序列900b在經(jīng)由聚合酶作用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板。而且，核酸序列900b的解鏈溫度低于引發(fā)區(qū)901的解鏈溫度。如圖9a所示，在等于或低于核酸序列900b的解鏈溫度的溫度902下，核酸序列900b與引發(fā)區(qū)901雜交，從而產(chǎn)生了采取環(huán)形寡核苷酸結(jié)構(gòu)的引發(fā)寡核苷酸910。可切割部分r被切割903，并且核酸序列900a經(jīng)由可切割部分r的切割903從環(huán)形寡核苷酸910釋放，以生成鈍化的結(jié)構(gòu)920。切割可經(jīng)由任何合適的路徑實(shí)現(xiàn)，例如，經(jīng)由酶(例如，具有內(nèi)切核酸酶活性的熱穩(wěn)定的和/或可激活的酶，如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii)的作用。游離核酸序列900a在等于或高于其解鏈溫度的溫度下不與單鏈靶核酸分子904穩(wěn)定雜交。因此，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)被鈍化。如圖9a所示，在等于或高于核酸序列900b的解鏈溫度的溫度905下，核酸900b從引發(fā)區(qū)901變性，并且引發(fā)區(qū)901可引發(fā)其在單鏈靶核酸分子904上的互補(bǔ)序列。如圖9a所示，核酸序列900a’和900a互補(bǔ)于靶核酸分子904。經(jīng)由聚合酶的作用，單鏈靶核酸分子904可以在引物延伸反應(yīng)中延伸906，以生成核酸產(chǎn)物907。在生成核酸產(chǎn)物907之后，可切割部分r可被切割以去除核酸序列900a’和900b，從而在核酸產(chǎn)物907上生成“粘性末端”。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可激活的引發(fā)寡核苷酸以及在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用這類引物的方法?？杉せ畹囊l(fā)寡核苷酸可包含具有不同解鏈溫度的可切割部分和/或序列。這類可激活的引發(fā)寡核苷酸可經(jīng)由可切割部分的切割和/或溫度的操縱而被激活。本公開內(nèi)容的另一方面提供了可激活的引發(fā)寡核苷酸。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a以及至少一個(gè)可切割部分的引發(fā)區(qū)。核酸序列a可具有適合于僅在切割可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。此外，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以包含核酸序列b，它位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)并且顯示出與該引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。本公開內(nèi)容的附加方面提供了可激活的引發(fā)寡核苷酸。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a以及至少一個(gè)可切割部分的引發(fā)區(qū)。核酸序列a可具有適合于僅在切割可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。此外，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以包含核酸序列b，該核酸序列b位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)。該引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且該核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。本文所述的可激活的引發(fā)寡核苷酸可以是環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸，因?yàn)槠湫蛄锌砂舜嘶パa(bǔ)的區(qū)域。環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸的這類區(qū)域可彼此雜交以在該可激活的引發(fā)寡核苷酸中形成環(huán)形結(jié)構(gòu)(例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu))。例如，核酸序列b的全部或一部分可與可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性。而且，核酸序列b可以與或可以不與單鏈靶核酸分子和/或該單鏈核酸分子的互補(bǔ)體互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以至少部分互補(bǔ)于靶核酸分子的互補(bǔ)體。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以包含不與引發(fā)區(qū)和/或單鏈靶核酸分子互補(bǔ)的間隔區(qū)。這樣的間隔區(qū)可以是可激活的引發(fā)寡核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域在引物延伸反應(yīng)中不能經(jīng)由聚合酶拷貝。例如，該間隔區(qū)可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)、十三個(gè)、十四個(gè)、十五個(gè)、十六個(gè)、十七個(gè)、十八個(gè)、十九個(gè)、二十個(gè)或更多個(gè)核苷酸的序列。寡核苷酸的這類序列可包含抑制聚合酶作用的一種或多種物質(zhì)，其非限制性實(shí)例包括dspacer(脫堿基呋喃)、間隔區(qū)c3、己二醇間隔區(qū)、間隔區(qū)9、間隔區(qū)12和間隔區(qū)18。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)從5’到3’可以包含核酸序列a、可切割部分和核酸序列a'。核酸序列a’可以與或可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度。例如，引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以為約50℃至約80℃、約60℃至約75℃或約65℃至約70℃。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)特定的可激活的引發(fā)寡核苷酸，引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以為至少約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。核酸序列b的第二解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度并且可低于引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度。例如，根據(jù)特定的可激活的引發(fā)寡核苷酸，核酸序列b的第二解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可低于引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度。例如，核酸序列b的第二解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度低約1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可包含核酸序列a的附加序列。例如，引發(fā)區(qū)可包含核酸序列a’。在這樣的實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有可低于引發(fā)區(qū)整體的解鏈溫度和/或核酸序列b的解鏈溫度的第三解鏈溫度。核酸序列a的第三解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度并且可低于第一解鏈溫度和/或第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，第三解鏈溫度可低于第一解鏈溫度而高于第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)特定的可激活的引發(fā)寡核苷酸，核酸序列a的第三解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的第三解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度和/或核酸序列b的第二解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以是任何合適的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分?？砂诳杉せ畹囊l(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)中的可切割部分的非限制性實(shí)例包括核糖、二硫鍵、重氮苯衍生物(例如，可用na2s2o4切割的)、基于腙的連接體、可光解的間隔區(qū)(例如，pc間隔區(qū))、熱可切割的亞胺堿/異氰酸酯加合物、含疊氮化物的連接體、基于乙酰丙基酯的連接體以及烯丙基連接體。而且，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可通過任何合適的路徑而切割。例如，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以是可光解的(例如，經(jīng)由可切割部分暴露于光)、可酶切的(例如，經(jīng)由酶如內(nèi)切核酸酶、限制酶、核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii、核糖核酸酶hiii)的作用)或可化學(xué)切割的(例如，經(jīng)由還原劑(例如，dtt、tcep)、合適的ph條件或反應(yīng)混合物中的其他條件)。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以在堿性ph下切割。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸可被包含在溶液例如擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。如本文別處所述，這樣的反應(yīng)混合物可以包含可激活的引發(fā)寡核苷酸、單鏈靶核酸分子和適合于擴(kuò)增該單鏈靶核酸分子的任何附加試劑。本文別處所述的示例溶液的其他類型的附加類型實(shí)例還可以包含可激活的引發(fā)寡核苷酸。例如，包含可激活的引發(fā)寡核苷酸的溶液可包含堿性緩沖液。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法包括提供含有可激活的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可激活的引發(fā)寡核苷酸包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a和至少一個(gè)可切割部分的引發(fā)區(qū)。該可激活的引發(fā)寡核苷酸還可以包含核酸序列b，它位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)并且顯示出與引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。核酸序列a可具有適合于僅在切割可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。該方法進(jìn)一步包括切割可切割部分以及使用核酸序列a進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以形成互補(bǔ)核酸鏈。本公開內(nèi)容的另一方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法包括提供含有可激活的引發(fā)寡核苷酸的溶液，該可激活的引發(fā)寡核苷酸包含具有可與單鏈靶核酸分子雜交的核酸序列a和至少一個(gè)可切割部分的引發(fā)區(qū)。該可激活的引發(fā)寡核苷酸還可以包含核酸序列b，核酸序列b位于引發(fā)區(qū)的3’側(cè)。該引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。而且，核酸序列a可具有適合于僅在切割可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。該方法進(jìn)一步包括切割可切割部分以及使用核酸序列a進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以形成互補(bǔ)核酸鏈。發(fā)生可激活的引發(fā)寡核苷酸激活的溶液可以是任何合適的溶液，包括在其中擴(kuò)增單鏈靶核酸分子的擴(kuò)增反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)從5’到3’可以包含核酸序列a、可切割部分和核酸序列a’。核酸序列a’可以與或可以不與單鏈靶核酸分子互補(bǔ)。而且，在一些實(shí)施方案中，核酸序列b可以與或可以不與單鏈靶核酸分子和/或該單鏈靶核酸分子的互補(bǔ)體互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)可具有第一解鏈溫度，并且核酸序列b可具有低于第一解鏈溫度的第二解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，引發(fā)區(qū)可包含核酸序列a的附加序列(例如，核酸序列a’)。在這樣的實(shí)施方案中，在切割可切割部分時(shí)，核酸序列a可具有可低于引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度且在一些實(shí)施方案中低于或高于核酸序列b的第二解鏈溫度的第三解鏈溫度。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括在切割可切割部分和/或進(jìn)行引物延伸反應(yīng)之前使溶液的溫度降至等于或低于第三解鏈溫度的溫度。這樣的溫度降低可幫助使可激活的引發(fā)寡核苷酸的切割核酸序列a與用于引物延伸反應(yīng)的單鏈靶核酸分子退火。引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度、核酸序列b的第二解鏈溫度以及必要時(shí)核酸序列a的第三解鏈溫度可以是任何合適的解鏈溫度。例如，根據(jù)特定的可激活的引發(fā)寡核苷酸，引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度可以為至少約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的第三解鏈溫度可以低于或等于約50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列b的第二解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃。在一些實(shí)施方案中，核酸序列a的第三解鏈溫度可以比引發(fā)區(qū)的第一解鏈溫度和/或核酸序列b的第二解鏈溫度低約1℃至約80℃、約5℃至約30℃或約10℃至約20℃?？杉せ畹囊l(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以是可激活的引發(fā)寡核苷酸的任何合適的可切割部分，包括本文別處所述的實(shí)例(例如，核糖)。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含多個(gè)可切割部分。而且，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可通過任何合適的方法予以切割。例如，可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的可切割部分可以采用酶(例如，內(nèi)切核酸酶，其包括本文別處所述的實(shí)例內(nèi)切核酸酶，如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii、核糖核酸酶hiii、切口限制性內(nèi)切核酸酶、nb、bbvci、ntalwi、nbbsmi、bsai、sapi、nbbsrdi)、采用光以及采用大于7的溶液ph(例如，堿性溶液)中的一種或多種來切割。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸可以是如本文別處所述的環(huán)形可激活的引發(fā)寡核苷酸。圖9b示意性地描繪了可激活的引發(fā)寡核苷酸的實(shí)例、激活這種可激活的引發(fā)寡核苷酸以及采用該可激活的引發(fā)寡核苷酸實(shí)例擴(kuò)增單鏈靶核酸分子的示例方法。如圖9b所示，可激活的引發(fā)寡核苷酸950從5’到3’包含核酸序列950a、可切割部分(例如，核糖r)、核酸序列950a’和核酸序列950b。核酸序列950a和950a’以及可切割部分r被包含在該引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)951中。核酸序列950a’不與單鏈靶核酸分子954互補(bǔ)。核酸序列950b互補(bǔ)于引發(fā)區(qū)951且不與單鏈靶核酸分子954互補(bǔ)。核酸序列950b的解鏈溫度低于引發(fā)區(qū)951的解鏈溫度。如圖9b所示，在等于或高于核酸序列950b的解鏈溫度的溫度952下，核酸950b從引發(fā)區(qū)951變性，并且引發(fā)區(qū)951的核酸序列950a可引發(fā)其在單鏈靶核酸分子954上的互補(bǔ)序列。然而，由于核酸序列950a’和950b不與單鏈靶核酸分子954互補(bǔ)，因此引發(fā)區(qū)的3’端不能在經(jīng)由聚合酶作用的引物延伸反應(yīng)中被延伸。因此，在沒有激活的情況下，可激活的引發(fā)寡核苷酸950不能參與擴(kuò)增單鏈靶核酸分子954的擴(kuò)增反應(yīng)。如圖9b所示，在等于或低于核酸序列950b的解鏈溫度的溫度955下，核酸序列950b與引發(fā)區(qū)951雜交，從而產(chǎn)生了采用環(huán)形寡核苷酸結(jié)構(gòu)的引發(fā)寡核苷酸960。環(huán)形寡核苷酸960的可切割部分r可被切割953，并且核酸序列950a從環(huán)形寡核苷酸960得以釋放。切割可經(jīng)由任何合適的路徑實(shí)現(xiàn)，例如，經(jīng)由酶(例如，具有內(nèi)切核酸酶活性的熱穩(wěn)定的酶和/或可激活的酶，如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii)的作用?？汕懈畈糠謗的切割通過釋放核酸序列950a激活引發(fā)寡核苷酸。如圖9b所示，在等于或低于其解鏈溫度的溫度下，游離核酸序列950a可引發(fā)956單鏈靶核酸分子954。退火的核酸序列950a隨后可在引物延伸反應(yīng)中延伸957，以生成核酸產(chǎn)物958。本公開內(nèi)容的附加方面提供了包含可激活的和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸二者的反應(yīng)混合物，以及在一系列擴(kuò)增反應(yīng)中使用可激活的和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸二者的方法。這樣的擴(kuò)增反應(yīng)可通過在時(shí)間過程中調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物中的條件和/或試劑而在單一反應(yīng)混合物中發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，在可激活和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的存在下靶核酸分子的擴(kuò)增可允許實(shí)現(xiàn)巢式擴(kuò)增反應(yīng)。這種巢式擴(kuò)增反應(yīng)可以在單一擴(kuò)增反應(yīng)混合物中進(jìn)行，或可以在多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)混合物中進(jìn)行。本公開內(nèi)容的附加方面提供了包含可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的反應(yīng)混合物。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與靶核酸分子雜交的核酸序列a’以及至少一個(gè)第一可切割部分的引發(fā)區(qū)。該可激活的引發(fā)寡核苷酸可僅在切割第一可切割部分時(shí)被激活，使得核酸序列a’的3’端在引物延伸反應(yīng)中可延伸以形成靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與靶核酸分子雜交的核酸序列a以及至少一個(gè)第二可切割部分的引發(fā)區(qū)。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可在切割第二可切割部分時(shí)被鈍化，使得核酸序列a不與靶核酸分子形成穩(wěn)定的復(fù)合體以促進(jìn)基于靶核酸分子序列的引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可激活的引發(fā)寡核苷酸可進(jìn)一步包含核酸序列b’，核酸序列b’位于可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的3'側(cè)并且與可激活的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性。類似地，在一些實(shí)施方案中，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可進(jìn)一步包含與可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b，核酸序列b與可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性。所述反應(yīng)混合物還可以包含靶核酸分子，并且可以包含擴(kuò)增該靶核酸分子所需的任何其他試劑(例如，聚合酶、內(nèi)切核酸酶、輔因子、dntp、合適的緩沖液、附加引物等)。而且，該反應(yīng)混合物還可以包含可用來檢測(cè)該反應(yīng)混合物中的擴(kuò)增產(chǎn)物的可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，第一可切割部分和/或第二可切割部分可以是可酶切的。在一些實(shí)施方案中，第一可切割部分和第二可切割部分可被相同的酶切割。這樣的酶可以是任何合適的酶(例如，內(nèi)切核酸酶，包括本文別處所述的示例內(nèi)切核酸酶，可激活的酶(例如，可激活的內(nèi)切核酸酶))并且因此也可以被包含在該反應(yīng)混合物中。在酶是可激活的酶的情況下，該酶可最初提供于該反應(yīng)混合物中，并隨后被激活以切割第一和/或第二可切割部分。而且，第一和第二可切割部分可以是任何合適的可切割部分，包括本文別處所述的可切割部分的示例類型。例如，第一和/或第二可切割部分可以是核糖。可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以在切割可激活的引發(fā)寡核苷酸的第一可切割部分時(shí)是可鈍化的。類似地，可激活的引發(fā)寡核苷酸可以在切割可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的第二可切割部分時(shí)是可激活的。例如，該可激活的引發(fā)寡核苷酸的第一可切割部分和該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的第二可切割部分可經(jīng)由相同的切割方法(例如，經(jīng)由相同的酶)而切割。在切割可激活的引發(fā)寡核苷酸的第一可切割部分時(shí)，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的第二可切割部分也可以被切割。如本文別處所述，該第二可切割部分的切割可以鈍化該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸。此外，在切割可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的第二可切割部分時(shí)，可激活的引發(fā)寡核苷酸的第一可切割部分也可以被切割。如本文別處所述，第一可切割部分的切割可以激活該可激活的引發(fā)寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，第一和第二可切割部分的切割可以是同時(shí)的或可以是按順序進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，酶(可激活的內(nèi)切核酸酶)可以被激活或鈍化以鈍化可鈍化的引物以及激活可激活的引物。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法包括提供包含靶核酸分子、可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的溶液，以及進(jìn)行連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)以產(chǎn)生該靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。該連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可至少包含第一階段以及隨后的第二階段，其中第一階段可包括使用可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分作為引物進(jìn)行靶核酸分子的擴(kuò)增，并且其中第二階段可包括使用可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分作為另一引物進(jìn)行靶核酸分子或其區(qū)域的擴(kuò)增。而且，在第一階段后，可激活的引發(fā)寡核苷酸可被激活且可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可被鈍化。在一些實(shí)施方案中，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與靶核酸分子雜交的核酸序列a’以及至少一個(gè)可切割部分的引發(fā)區(qū)。該可激活的引發(fā)寡核苷酸還可以包含核酸序列b’，它位于可激活的寡核苷酸的引發(fā)區(qū)的3’側(cè)且顯示出與該引發(fā)區(qū)的序列互補(bǔ)性。核酸序列a’可具有適合于僅在切割可切割部分時(shí)在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。在一些實(shí)施方案中，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可包含具有可與靶核酸分子雜交的核酸序列a以及至少一個(gè)可切割部分的引發(fā)區(qū)。該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸還可以包含與引發(fā)區(qū)顯示出序列互補(bǔ)性的與可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的引發(fā)區(qū)相鄰的核酸序列b。核酸序列a可具有適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸分子的互補(bǔ)核酸鏈的3’端。此外，在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以在切割如本文別處所述的可激活的引發(fā)寡核苷酸的第一可切割部分時(shí)是可鈍化的。類似地，該可激活的引發(fā)寡核苷酸可以在切割如本文別處所述的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的第二可切割部分時(shí)是可激活的。在一些實(shí)施方案中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以在可激活的引發(fā)寡核苷酸激活的同時(shí)是可鈍化的。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可在單一反應(yīng)混合物中發(fā)生?；蛘撸B續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可在多于一種反應(yīng)混合物中發(fā)生。而且，該溶液可以包含擴(kuò)增靶核酸分子所需的任何其他試劑(例如，聚合酶、內(nèi)切核酸酶、輔因子、dntp、合適的緩沖液、附加引物等)。而且，該溶液還可以包含可用來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，該溶液包含至少一種反向引物。此外，可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可分別被酶激活和鈍化。這樣的酶可包含在該溶液中(或隨后提供)，并且可以是例如熱穩(wěn)定的酶和/或具有內(nèi)切核酸酶活性的酶。本文別處描述了具有內(nèi)切核酸酶活性的酶的實(shí)例(例如，核糖核酸酶，如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii)。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以經(jīng)由任何合適的路徑，包括本文別處所述的檢測(cè)方法。例如，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以經(jīng)由光學(xué)檢測(cè)、靜電檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可以幫助檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法包括提供包含靶核酸分子、可激活的引發(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的反應(yīng)混合物?？杉せ畹囊l(fā)寡核苷酸和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸中的每一個(gè)均可與靶核酸分子的不同區(qū)域可雜交。該方法進(jìn)一步包括在該反應(yīng)混合物中采用可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分或可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性地引發(fā)靶核酸分子。該方法進(jìn)一步包括使用經(jīng)可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分或可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性引發(fā)的靶核酸分子進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，以產(chǎn)生靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可在反應(yīng)混合物中被選擇性地引發(fā)而無需去除其內(nèi)含物。在一些實(shí)施方案中，采用可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性地引發(fā)靶核酸分子可通過酶來實(shí)現(xiàn)，所述酶激活可激活的引發(fā)寡核苷酸以允許引物延伸反應(yīng)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣的酶可以是任何合適的酶，例如如本文別處所述的具有內(nèi)切核酸酶活性的酶。而且，在一些實(shí)施方案中，采用可激活的引發(fā)寡核苷酸的至少一部分選擇性地引發(fā)靶核酸可通過酶來實(shí)現(xiàn)，所述酶鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸，使得其不與該靶核酸分子形成穩(wěn)定的復(fù)合體。這樣的酶可以是任何合適的酶，例如如本文別處所述的具有內(nèi)切核酸酶活性的酶。在一些實(shí)施方案中，采用可鈍化的引發(fā)寡核苷酸選擇性地引發(fā)靶核酸分子可在不存在酶，例如如本文別處所述具有內(nèi)切核酸酶活性的酶的情況下實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，采用可鈍化的引發(fā)寡核苷酸選擇性地引發(fā)靶核酸分子可在不存在活性酶，例如如本文別處所述具有內(nèi)切核酸酶活性的活性(例如，激活的)酶的情況下實(shí)現(xiàn)。這樣的條件可以防止可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的鈍化。圖10a-圖10c示意性地描繪了可激活和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的實(shí)例以及它們?cè)趩我环磻?yīng)混合物、巢式擴(kuò)增反應(yīng)中的示例應(yīng)用。圖10a示意性地描繪了從3’到5’包含核酸序列1000a、可切割部分1002(例如，核糖部分“rc”)、核酸序列1000a’和核酸序列1000b的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000。可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的引發(fā)區(qū)包含核酸序列1000a、可切割部分1002和核酸序列1000a’。核酸序列1000b包含間隔區(qū)并且不與靶核酸分子1005互補(bǔ)。核苷酸序列1000b的間隔區(qū)不與自身或引發(fā)區(qū)互補(bǔ)。而且，核苷酸序列1000b至少部分互補(bǔ)于引發(fā)區(qū)。在等于或高于核酸序列1000b的解鏈溫度(例如，對(duì)于圖10a所示的核酸序列1000b為約60℃)的溫度1008下，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000可采取線性構(gòu)型。在合適的溫度條件下，線性可鈍化的引發(fā)寡核苷酸可以引發(fā)單鏈靶核酸分子1005并參與引物延伸反應(yīng)。引物延伸反應(yīng)可以生成單鏈靶核酸分子1005的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物包含對(duì)應(yīng)于核酸序列1000b的5’端處的單鏈區(qū)。這樣的單鏈區(qū)可作為“粘性末端”用于下游雜交事件(例如，固定于陣列，等)1010?；蛘撸赏ㄟ^切割1009可切割部分1002進(jìn)一步處理該擴(kuò)增產(chǎn)物，以生成3’端處的單鏈區(qū)，該單鏈區(qū)也可作為“粘性末端”用于下游雜交事件1010。在一些實(shí)施方案中，切割可以經(jīng)由酶，如具有內(nèi)切核酸酶活性的酶(例如，核糖核酸酶如核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii)來進(jìn)行。在等于或低于核酸序列1000b的解鏈溫度的溫度1006下，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000采取環(huán)形寡核苷酸構(gòu)型。在其環(huán)形寡核苷酸構(gòu)型中，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的可切割部分1002可被切割1007以釋放核酸序列1000a，并使可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000鈍化。在一些實(shí)施方案中，切割可以經(jīng)由酶，如具有內(nèi)切核酸酶活性的酶(例如，核糖核酸酶如核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii，可激活的內(nèi)切核酸酶)來進(jìn)行。釋放的核酸序列1000a在等于或高于其解鏈溫度的溫度下不與單鏈靶核酸分子1000穩(wěn)定雜交。擴(kuò)增反應(yīng)混合物可包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000，并且可以經(jīng)受合適的條件，使得可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的引物功能活化。經(jīng)由可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的擴(kuò)增可進(jìn)行所需的循環(huán)數(shù)和/或進(jìn)行到生成所需量的擴(kuò)增產(chǎn)物的程度。在該程度下，可通過使反應(yīng)混合物處于合適的溫度條件(例如，在處于或低于核酸序列1000b的解鏈溫度的溫度)和切割條件(例如，可激活的內(nèi)切核酸酶的激活)來鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000，以阻止可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000參與其他輪次的擴(kuò)增。圖10b示意性地描繪了從5’到3’包含核酸序列1050a、可切割部分1052(例如，核糖部分“ra”)、核酸序列1050a’和核酸序列1050b的可激活的引發(fā)寡核苷酸1050?？杉せ畹囊l(fā)寡核苷酸1050的引發(fā)區(qū)包含核酸序列1050a、可切割部分1052和核酸序列1050a’。核酸序列1050a’和1050b不與靶核酸分子(未示出)互補(bǔ)并且被間隔區(qū)隔開。間隔區(qū)不與自身互補(bǔ)。而且，核苷酸序列1050b至少部分互補(bǔ)于引發(fā)區(qū)。在等于或高于核酸序列1050b的解鏈溫度(例如，對(duì)于圖10b所示的核酸序列1050b為約70℃)的溫度下，可激活的引發(fā)寡核苷酸1050可采取線性構(gòu)型。線性可激活的引發(fā)寡核苷酸可經(jīng)由其核酸序列1050a引發(fā)單鏈靶核酸分子。然而，由于在引發(fā)區(qū)的3’端存在非互補(bǔ)的核酸序列1050b和核酸序列1050a’，因此引發(fā)區(qū)不能在引物延伸反應(yīng)中延伸。因此，可激活的引發(fā)寡核苷酸是鈍化的。在等于或低于核酸序列1050b的解鏈溫度的溫度1053下，可激活的引發(fā)寡核苷酸1050采取環(huán)形寡核苷酸構(gòu)型。在其環(huán)形寡核苷酸構(gòu)型中，可激活的引發(fā)寡核苷酸的可切割部分1052可被切割1054以釋放核酸序列1050a，并激活可激活的引發(fā)寡核苷酸1050。在一些實(shí)施方案中，切割可以經(jīng)由酶，如具有內(nèi)切核酸酶活性的酶(例如，核糖核酸酶如核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii，可激活的內(nèi)切核酸酶)來進(jìn)行。在等于或低于其解鏈溫度的溫度下，釋放的核酸序列1050a可與單鏈靶核酸分子(未示出)雜交并在引物延伸反應(yīng)中用作引物。引物延伸反應(yīng)中雜交的核酸序列1050a的3’端的延伸1055可生成單鏈靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物1056。擴(kuò)增反應(yīng)混合物可包含可激活的引發(fā)寡核苷酸1050，并且可以經(jīng)受合適的條件，使得可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的引物功能被激活。經(jīng)由可激活的引發(fā)寡核苷酸的擴(kuò)增可進(jìn)行所需的循環(huán)數(shù)和/或進(jìn)行到生成所需量的擴(kuò)增產(chǎn)物的程度。圖10c示意性地描繪了示例巢式擴(kuò)增反應(yīng)，其使用可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000和可激活的引發(fā)寡核苷酸1050在單一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增靶核酸分子。圖10c的表格中顯示了可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000和可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的線性序列。該表格中還顯示了與兩種引發(fā)寡核苷酸一起使用的示例反向引物1060的序列?？赦g化的引發(fā)寡核苷酸1000的引發(fā)區(qū)互補(bǔ)于靶核酸分子的區(qū)域，該區(qū)域位于可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的核酸序列1050a所互補(bǔ)的靶核酸分子區(qū)域的5’側(cè)。因此，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的引發(fā)區(qū)可以被認(rèn)為是正向“外”引物，而可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的核酸序列1050a則可以被認(rèn)為是正向“內(nèi)”引物。除了擴(kuò)增靶核酸分子所需的任何其他試劑(例如，聚合酶、內(nèi)切核酸酶、dntp、輔因子、合適的緩沖液等)以外，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000、可激活的引發(fā)寡核苷酸1050、反向引物1060和靶核酸分子也可提供于反應(yīng)混合物中。靶核酸分子可以在連續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。在該連續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)的第一階段，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000是活化的并且可選擇性地引發(fā)其在靶核酸分子鏈上的靶序列。連同反向引物1060一起，靶核酸分子可以在一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中經(jīng)由可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000(如圖10a所示)擴(kuò)增1062，以生成第一擴(kuò)增產(chǎn)物1070。在所需次數(shù)的擴(kuò)增循環(huán)之后并且/或者當(dāng)生成所需量的第一擴(kuò)增產(chǎn)物1070時(shí)，酶(例如，具有內(nèi)切核酸酶活性的酶，例如核糖核酸酶hi、核糖核酸酶hii或核糖核酸酶hiii，具有內(nèi)切核酸酶活性的可激活的酶)可添加1065至反應(yīng)混合物或在反應(yīng)混合物中激活(在它被包含在最初的反應(yīng)混合物中的情況下)，以切割可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的可切割部分1002以及切割可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的可切割部分1052。可切割部分1002的切割使引發(fā)寡核苷酸1000鈍化，使得它可能不再參與如圖10a所示的靶核酸分子的擴(kuò)增。而且，可切割部分1052的切割使可激活的引發(fā)寡核苷酸1050激活，使得其核酸序列1050a可以擴(kuò)增如圖10b所示的靶核酸分子。連同反向引物1060一起，靶核酸分子可以在一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中經(jīng)由激活的可激活的引發(fā)寡核苷酸1050(如圖10b所示)擴(kuò)增1065，以生成第二擴(kuò)增產(chǎn)物1080。由于可激活的引發(fā)寡核苷酸的核酸序列1050a用作“內(nèi)”引物，所以第二擴(kuò)增產(chǎn)物1080的長(zhǎng)度要短于第一擴(kuò)增產(chǎn)物1070。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)混合物還可以包含可用來檢測(cè)第一擴(kuò)增產(chǎn)物1070和/或第二擴(kuò)增產(chǎn)物1080的可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，例如，第一擴(kuò)增產(chǎn)物1070和第二擴(kuò)增產(chǎn)物1080的檢測(cè)可以經(jīng)由凝膠電泳或本文所述的其他合適的檢測(cè)方式來實(shí)現(xiàn)。通常，核酸擴(kuò)增可在反應(yīng)混合物中進(jìn)行，其中待擴(kuò)增的核酸分子與擴(kuò)增核酸分子所需的任何附加試劑(例如，正向引物、反向引物、聚合酶、dntp、輔因子、合適的緩沖液等)一起提供。該反應(yīng)混合物隨后可經(jīng)受適合于擴(kuò)增該核酸分子的條件(例如，合適的溫度、熱的添加/移除、緩沖液濃度等)。例如，可在反應(yīng)混合物中提供單鏈或雙鏈核酸分子，該反應(yīng)混合物還包含附加試劑(例如，本文別處所述的正向引物和反向引物，聚合酶、dntp、輔因子、緩沖液、擴(kuò)增單鏈或雙鏈核酸分子所需的任何其他酶(例如，用于由rna生成cdna的逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶等))。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物的溫度可經(jīng)過變性溫度(例如，以使雙鏈核酸分子變性、分離或解鏈為組分核酸鏈)、退火溫度(例如，以使引物與組分核酸鏈中的每一個(gè)退火或雜交)和延伸溫度(例如，以在引物延伸反應(yīng)中經(jīng)由聚合酶的作用延伸或?qū)⒑塑账崽砑又镣嘶鸬囊?重復(fù)循環(huán)，以便擴(kuò)增該單鏈或雙鏈核酸分子。反應(yīng)混合物的溫度循環(huán)可以例如借助于任何合適的熱循環(huán)儀儀器或其他類型的能夠循環(huán)加熱的裝置(包括，例如，基于對(duì)流的加熱裝置)來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸分子的變性可以經(jīng)由變性劑例如堿劑(例如，氫氧化鈉(naoh))來實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，核酸的擴(kuò)增可以等溫地，例如在沒有反應(yīng)混合物的溫度變化的情況下實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，本文所述的核酸擴(kuò)增方法可以無需對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)混合物的溫度進(jìn)行循環(huán)而完成。例如，可以進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)而無需對(duì)反應(yīng)混合物的溫度進(jìn)行循環(huán)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以包括聚合酶的使用和作用。在引物延伸反應(yīng)期間，聚合酶可通常以模板指導(dǎo)的方式將核苷酸添加至與單鏈核酸分子退火的引物的3’端。任何合適的聚合酶可以用于引物延伸反應(yīng)，包括商購可得的聚合酶。聚合酶的非限制性實(shí)例包括taq聚合酶、tth聚合酶、tli聚合酶、pfu聚合酶、vent聚合酶、deepvent聚合酶、ex-taq聚合酶、la-taq聚合酶、expand聚合酶、sso聚合酶、poc聚合酶、pab聚合酶、mth聚合酶、pho聚合酶、phusion聚合酶、es4聚合酶、tru聚合酶、tac聚合酶、tne聚合酶、tma聚合酶、tih聚合酶、tfi聚合酶、platinumtaq聚合酶、hi-fi聚合酶、tbr聚合酶、tfl聚合酶、pfutubo聚合酶、pyrobest聚合酶、pwo聚合酶、kod聚合酶、bst聚合酶、sac聚合酶、klenow片段、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶，及其變體、經(jīng)修飾的產(chǎn)物和衍生物。在一些實(shí)施方案中，合適的變性溫度可以為，例如，約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃或更高。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的合適的變性時(shí)間可以為，例如約0.1秒(“s”)、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘或更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，合適的退火溫度可以為，例如約15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些實(shí)施方案中，退火溫度可以為環(huán)境溫度(例如，室溫)。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的合適的退火時(shí)間可以為，例如約0.1s、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘或更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，合適的延伸溫度可以為，例如約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的合適的延伸時(shí)間可以為，例如約0.1s、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘或更長(zhǎng)。任何合適類型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以用來擴(kuò)增核酸分子。核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例是聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，它依賴于如上所述的引物退火、引物延伸和擴(kuò)增的核酸分子的變性的重復(fù)循環(huán)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型的附加非限制性實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄、連接酶鏈反應(yīng)、巢式擴(kuò)增、多重?cái)U(kuò)增、解旋酶依賴性擴(kuò)增、不對(duì)稱擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、多重置換擴(kuò)增(mda)；以及pcr的變化形式，其包括實(shí)時(shí)pcr、熱啟動(dòng)pcr、反向pcr、甲基化特異性pcr、等位基因特異性pcr、裝配pcr、不對(duì)稱pcr、微引物pcr、多重pcr、巢式pcr、重疊延伸pcr、數(shù)字pcr、乳液pcr、撥出pcr、解旋酶依賴性pcr、巢式pcr、熱不對(duì)稱交錯(cuò)pcr和降落pcr。在本文所述的各個(gè)方面，方法可包括檢測(cè)本文所述的一種或多種核酸分子，例如靶核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物、雙鏈核酸分子、單鏈核酸分子、靶核酸分子、可鈍化的引發(fā)寡核苷酸以及可激活的引發(fā)寡核苷酸。本文所述的任何類型的核酸分子的檢測(cè)可經(jīng)由任何合適的檢測(cè)方法或方式來實(shí)現(xiàn)。所使用的檢測(cè)方法或方式的具體類型可依賴于例如被檢測(cè)的具體物質(zhì)、檢測(cè)期間存在的其他物質(zhì)、可檢測(cè)的部分是否存在、待使用的可檢測(cè)部分的具體類型和/或具體應(yīng)用。檢測(cè)方法的非限制性實(shí)例包括光學(xué)檢測(cè)、光譜檢測(cè)、靜電檢測(cè)和電化學(xué)檢測(cè)。因此，可通過檢測(cè)指示存在或不存在核酸分子的信號(hào)(例如，指示核酸分子或相關(guān)的可檢測(cè)部分的光學(xué)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、靜電性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)的信號(hào))檢測(cè)本文所述的核酸分子。光學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于目視檢查(例如，經(jīng)由眼睛的檢測(cè)、未借助于光學(xué)檢測(cè)器觀察光學(xué)性質(zhì)或光學(xué)事件)、熒光測(cè)定法和uv-可見光吸光度。光譜檢測(cè)方法包括但不限于質(zhì)譜法、核磁共振(nmr)光譜法和紅外光譜法。靜電檢測(cè)方法包括但不限于基于凝膠的技術(shù)，例如，凝膠電泳。電化學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于安培滴定法。在一些實(shí)施方案中，本文所述的核酸分子的檢測(cè)可借助于可檢測(cè)部分來實(shí)現(xiàn)?？蓹z測(cè)部分可與核酸分子連接或偶聯(lián)，包括共價(jià)地和非共價(jià)地(例如，包括雙鏈核酸分子的嵌入)。此外，如本文別處所述，可檢測(cè)部分可被包含在用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物中。在一些實(shí)施方案中，本文所述的核酸擴(kuò)增方法可包括實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如，實(shí)時(shí)pcr反應(yīng))，借此在核酸分子擴(kuò)增期間或之后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。可檢測(cè)部分的非限制性實(shí)例包括光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)(例如，光學(xué)響應(yīng)性染料、光學(xué)響應(yīng)性寡核苷酸探針(例如，taqman探針、taqmantamara探針、taqmanmgb探針、lion探針、分子信標(biāo)))和放射性標(biāo)記(例如，14c、123i、124i、125i、131i、99mtc、35s或3h)。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分可以是當(dāng)經(jīng)受適當(dāng)條件時(shí)生成(或不能生成)信號(hào)的光學(xué)響應(yīng)性染料(例如，熒光染料)。染料的非限制性實(shí)例包括sybr綠、sybr藍(lán)、dapi、碘化丙錠、hoeste、sybr金、evagreen、溴化乙錠、吖啶、原黃素、吖啶橙、吖啶黃素、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰樹堿、道諾霉素、氯喹、偏端霉素d、色霉素、乙菲啶、光神霉素、聚吡啶釕、氨茴霉素、菲啶和吖啶、溴化乙錠、碘化丙錠、碘化己錠(hexidiumiodide)、二氫乙錠、乙錠同型二聚體-1和-2、單疊氮化乙錠和acma、hoechst33258、hoechst33342、hoechst34580、dapi、吖啶橙、7-aad、放線菌素d、lds751、羥芪巴脒、sytox藍(lán)、sytox綠、sytox橙、popo-1、popo-3、yoyo-1、yoyo-3、toto-1、toto-3、jojo-1、lolo-1、bobo-1、bobo-3、po-pro-1、po-pro-3、bo-pro-1、bo-pro-3、to-pro-1、to-pro-3、to-pro-5、jo-pro-1、lo-pro-1、yo-pro-1、yo-pro-3、picogreen、oligreen、ribogreen、sybr金、sybr綠i、sybr綠ii、sybrdx、syto-40、-41、-42、-43、-44、-45(藍(lán))、syto-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(綠)、syto-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、syto-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(紅)、熒光素、異硫氰酸熒光素(fitc)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tritc)、羅丹明、四甲基羅丹明、r-藻紅蛋白、cy-2、cy-3、cy-3.5、cy-5、cy5.5、cy-7、德克薩斯紅、phar-red、別藻藍(lán)蛋白(apc)、sybrgreen、sybrgreeni、sybrgreenii、sybrgold、celltracker綠、7-aad、乙錠同源二聚體i、乙錠同源二聚體ii、乙錠同源二聚體iii、溴化乙錠、傘形酮、曙紅、綠色熒光蛋白、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石綠、芪、熒光黃、級(jí)聯(lián)藍(lán)、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯、諸如包含銪和鋱的那些的熒光鑭系元素絡(luò)合體、羧基四氯熒光素、5和/或6-羧基熒光素(fam)、5-(或6-)碘乙酰胺熒光素、5-{[2(和3)-5-(乙酰巰基)-琥珀酰基]氨基}熒光素(samsa-熒光素)、麗絲胺羅丹明b磺酰氯、5和/或6羧基羅丹明(rox)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(amca)、bodipy熒光團(tuán)、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽、3,6-二磺酸鹽-4-氨基-萘酰亞胺、藻膽蛋白、alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料、dylight350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其他熒光團(tuán)。本文所述的方法可借助于計(jì)算機(jī)處理器來完成。在一些實(shí)施方案中，該計(jì)算機(jī)處理器可以作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一部分被包含在內(nèi)。例如，如圖12所示，計(jì)算機(jī)處理器1205(例如，中央處理單元(cpu))可以作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201的一部分被包含在內(nèi)，并且可以是單核或多核處理器以及用于并行處理的多個(gè)處理器。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201還可以包含存儲(chǔ)器或存儲(chǔ)器位置1210(例如，隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、只讀存儲(chǔ)器、閃速存儲(chǔ)器)，電子存儲(chǔ)單元1215(例如，硬盤)，用于與一個(gè)或多個(gè)其他系統(tǒng)通信的通信接口1220(例如，網(wǎng)絡(luò)適配器)，以及外圍設(shè)備1225，如高速緩存、其他存儲(chǔ)器、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和/或電子顯示適配器。存儲(chǔ)器1210、存儲(chǔ)單元1215、接口1220和外圍設(shè)備1225(例如，鍵盤、鼠標(biāo)、語音系統(tǒng)、麥克風(fēng)、打印機(jī)或其他輸入或輸出設(shè)備)可以通過通信總線(實(shí)線)如主板與計(jì)算機(jī)處理器1205進(jìn)行通信。存儲(chǔ)單元1215可以是用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元(或數(shù)據(jù)儲(chǔ)存庫)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201可以借助于通信接口1220與計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)(“網(wǎng)絡(luò)”)1230可操作地耦合。網(wǎng)絡(luò)1230可以是因特網(wǎng)、互聯(lián)網(wǎng)和/或外聯(lián)網(wǎng)，或者與因特網(wǎng)通信的內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和/或外聯(lián)網(wǎng)。在一些實(shí)施方案中，網(wǎng)絡(luò)1230可以是電信和/或數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)1230可以包括可以實(shí)現(xiàn)分布式計(jì)算如云計(jì)算的一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)服務(wù)器。在一些實(shí)施方案中，網(wǎng)絡(luò)1230可以借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201實(shí)現(xiàn)對(duì)等網(wǎng)絡(luò)，該對(duì)等網(wǎng)絡(luò)可以使與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201耦合的設(shè)備能夠起到客戶端或服務(wù)器的作用。計(jì)算機(jī)處理器1205可以執(zhí)行可在程序或軟件中體現(xiàn)的一系列機(jī)器可讀指令。該指令可以存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器位置如存儲(chǔ)器1210中。計(jì)算機(jī)處理器1205進(jìn)行的操作的實(shí)例可以包括讀取、解碼、執(zhí)行和回寫。存儲(chǔ)單元1215可以存儲(chǔ)文件，如驅(qū)動(dòng)程序、程序庫和保存的程序。存儲(chǔ)單元1215可以存儲(chǔ)由用戶生成的程序以及記錄的會(huì)話，以及與該程序相關(guān)的輸出。存儲(chǔ)單元1215可以存儲(chǔ)用戶數(shù)據(jù)，例如，用戶偏好和用戶程序。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201可以包括計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201外部的一個(gè)或多個(gè)附加數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元，如位于通過內(nèi)聯(lián)網(wǎng)或因特網(wǎng)與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201進(jìn)行通信的遠(yuǎn)程服務(wù)器上的附加存儲(chǔ)單元。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201可以通過網(wǎng)絡(luò)1230與一個(gè)或多個(gè)遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行通信。例如，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201可以與用戶的遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行通信。遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的實(shí)例包括個(gè)人計(jì)算機(jī)(便攜式個(gè)人計(jì)算機(jī))、平板或平板個(gè)人計(jì)算機(jī)(例如，ipad、galaxytab)、電話、智能電話(例如，iphone、支持android的設(shè)備、)或個(gè)人數(shù)字助理。用戶可以經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)1230訪問計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201。在一些實(shí)施方案中，遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以由可無線充電的電池來運(yùn)行。與遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的通信可以例如無線地(例如，經(jīng)由wi-fi、wimax、藍(lán)牙、光或微波)來實(shí)現(xiàn)。本文所述的方法以及用于操作檢測(cè)池、檢測(cè)器和系統(tǒng)的任何其他組件(例如，泵)的指令可以通過存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201的電子存儲(chǔ)位置如存儲(chǔ)器1210或電子存儲(chǔ)單元1215上的機(jī)器(例如，計(jì)算機(jī)處理器)可執(zhí)行代碼來實(shí)現(xiàn)。機(jī)器可執(zhí)行或機(jī)器可讀代碼可以以軟件的形式提供。在使用過程中，該代碼可由處理器1205執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，可以從存儲(chǔ)單元1215檢索該代碼并將其存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器1210中，以備處理器1205存取。在一些情況下，可以不包括電子存儲(chǔ)單元1215，而將機(jī)器可執(zhí)行指令存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器1210上。該代碼可以被預(yù)編譯和配置為與具有適于執(zhí)行該代碼的處理器的機(jī)器一起使用，或者可以在運(yùn)行過程中編譯。該代碼可以以編程語言提供，可以選擇該編程語言以使該代碼能夠以預(yù)編譯或編譯的方式執(zhí)行。本文提供的系統(tǒng)和方法的方面，如計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1201，可以體現(xiàn)在編程中。所述技術(shù)的各個(gè)方面可以被認(rèn)為是通常以機(jī)器(或處理器)可執(zhí)行代碼和/或相關(guān)數(shù)據(jù)的形式的“產(chǎn)品”或“制品”，所述可執(zhí)行代碼和/或相關(guān)數(shù)據(jù)在一種類型的機(jī)器可讀介質(zhì)中攜帶或體現(xiàn)。機(jī)器可執(zhí)行代碼可以存儲(chǔ)在電子存儲(chǔ)單元如存儲(chǔ)器(例如，只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、閃速存儲(chǔ)器)或硬盤上?！按鎯?chǔ)”型介質(zhì)可以包括計(jì)算機(jī)、處理器等的任何或所有有形存儲(chǔ)器或其相關(guān)的模塊，如各種半導(dǎo)體存儲(chǔ)器、磁帶驅(qū)動(dòng)器、磁盤驅(qū)動(dòng)器等，其可以在軟件編程的任何時(shí)間提供非暫時(shí)性存儲(chǔ)。有時(shí)可以通過因特網(wǎng)或各種其他電信網(wǎng)絡(luò)來傳送軟件的全部或部分。例如，這樣的通信可以使軟件能夠從一個(gè)計(jì)算機(jī)或處理器加載到另一個(gè)，例如從管理服務(wù)器或主機(jī)計(jì)算機(jī)加載到應(yīng)用服務(wù)器的計(jì)算機(jī)平臺(tái)。因此，可承載軟件元素的另一種類型的介質(zhì)包括光波、電波和電磁波，如跨過在本地設(shè)備之間的物理接口、通過有線和光學(xué)陸路網(wǎng)絡(luò)以及沿著各種空中鏈路使用的。攜帶這類波的物理元件如有線或無線鏈路、光學(xué)鏈路等也可以被認(rèn)為是承載該軟件的介質(zhì)。如本文所用，除非限于非暫時(shí)性、有形“存儲(chǔ)”介質(zhì)，否則術(shù)語如計(jì)算機(jī)或機(jī)器“可讀介質(zhì)”是指參與向處理器提供指令以供執(zhí)行的任何介質(zhì)。因此，機(jī)器可讀介質(zhì)如計(jì)算機(jī)可執(zhí)行代碼可以采用許多形式，包括但不限于有形存儲(chǔ)介質(zhì)、載波介質(zhì)或物理傳輸介質(zhì)。非易失性存儲(chǔ)介質(zhì)包括例如光盤或磁盤，如任何計(jì)算機(jī)中的任何存儲(chǔ)設(shè)備等，如可用于實(shí)現(xiàn)附圖中所示的數(shù)據(jù)庫等。易失性存儲(chǔ)介質(zhì)包括動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)器，如這樣的計(jì)算機(jī)平臺(tái)的主存儲(chǔ)器。有形傳輸介質(zhì)包括同軸電纜；銅線和光纖，包括在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成總線的導(dǎo)線。載波傳輸介質(zhì)可以采用電信號(hào)或電磁信號(hào)或者聲波或光波的形式，如在射頻(rf)和紅外(ir)數(shù)據(jù)通信期間生成的那些。因此，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的常見形式包括例如：軟盤、柔性盤、硬盤、磁帶、任何其他磁性介質(zhì)、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光學(xué)介質(zhì)、穿孔卡片紙帶、具有孔洞圖案的任何其他物理存儲(chǔ)介質(zhì)、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存儲(chǔ)器芯片或筒匣、載波傳輸數(shù)據(jù)或指令、傳輸這類載波的電纜或鏈路，或計(jì)算機(jī)可從中讀取編程代碼和/或數(shù)據(jù)的任何其他介質(zhì)。這些形式的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的許多種可以參與將一個(gè)或多個(gè)順序的一個(gè)或多個(gè)指令攜帶到處理器以供執(zhí)行。實(shí)施例實(shí)施例1：示例探針的測(cè)試針對(duì)四種靶核酸分子評(píng)估單鏈測(cè)試探針。圖1a示意性地描繪了該測(cè)試探針。如圖1a所示，該測(cè)試探針從5’到3’包含可檢測(cè)部分101(例如，fam熒光染料)、核苷酸序列100a、可切割部分(例如，核糖部分“rc”)102、核酸序列100b以及猝滅劑103(例如，abkfq猝滅劑)。圖1b示意性地描繪了四種靶核酸分子pm、rm、r3m和5mr。靶核酸分子pm包含與該測(cè)試探針完全互補(bǔ)的序列；靶核酸分子rm在其對(duì)應(yīng)于該探針的可切割部分102的位點(diǎn)上包含單個(gè)錯(cuò)配；靶核酸分子r3m包含兩個(gè)錯(cuò)配——一個(gè)在其對(duì)應(yīng)于該探針的可切割部分102的位點(diǎn)上，而一個(gè)位于第一錯(cuò)配的3’側(cè)；而靶核酸分子5mr包含兩個(gè)錯(cuò)配——一個(gè)在其對(duì)應(yīng)于該探針的可切割部分102的位點(diǎn)上，而一個(gè)在第一錯(cuò)配序列的5’側(cè)。在第一組八個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在不同濃度的edta中針對(duì)各種靶核酸分子(“ds”)以及無模板對(duì)照(“ss”)來評(píng)估探針。將各種反應(yīng)混合物的總結(jié)列表顯示于圖2a中。每一種反應(yīng)混合物均為20μl的體積，并且包含測(cè)試探針(0.1μm)、合適的靶核酸分子(0.1μm)、合適濃度的edta(1xedta＝1.25mm)連同共同的試劑混合物。該共同的試劑混合物含有來自newenglandbiolabs(neb)的1xthermopol緩沖液(包含2mmmgcl2，ph8.8)和50mmk2so4。該反應(yīng)混合物不包含聚合酶或任何其他類型的酶。該反應(yīng)混合物經(jīng)受98℃下1秒(“s”)變性、60℃下30s退火以及72℃下5s延伸的10個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)程序。在每個(gè)循環(huán)之后，測(cè)量每一種反應(yīng)混合物的熒光。第一組八個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖2b中。如圖2b所示，當(dāng)反應(yīng)混合物包含靶核酸分子并且當(dāng)采用了完全匹配的靶核酸分子時(shí)，熒光信號(hào)較強(qiáng)。圖2b所示的結(jié)果提示，探針與其靶核酸分子雜交形成雙鏈復(fù)合體可以產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào)。而且，圖2b中的結(jié)果還提示，結(jié)合以下靶核酸分子的探針可產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)，該靶核酸分子在其對(duì)應(yīng)于探針的可切割部分的位點(diǎn)之中及附近不包含錯(cuò)配。在第二組八個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在不同濃度、不同ph、存在或不存在mgcl2的情況下以及在將反應(yīng)混合物加熱至不同溫度時(shí)，針對(duì)不同濃度的pm靶核酸分子來評(píng)估探針。將各種反應(yīng)混合物(1-8)的總結(jié)列表顯示于圖3b中。每一種反應(yīng)混合物均為20μl的體積，并且包含測(cè)試探針(0.1μm)、pm靶核酸分子(1x＝0.1μm)和mgcl2(當(dāng)包含mgcl2時(shí)為2mm)連同共同的試劑混合物。該共同的試劑混合物含有20mmtrishcl(在ph7或ph9下)和50mmk2so4。該反應(yīng)混合物不包含聚合酶或任何其他類型的酶。將反應(yīng)混合物在熱循環(huán)儀中加熱至溫度為60℃或70℃。在加熱期間的多個(gè)溫度點(diǎn)處測(cè)量每一種反應(yīng)混合物的熒光。第二組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3b中。如圖3b所示，在ph條件較高為9(其中不存在mgcl2)以及在較低的加熱溫度下，當(dāng)測(cè)試較大濃度的靶核酸分子時(shí)，信號(hào)較強(qiáng)。圖3b中的數(shù)據(jù)提示，信號(hào)可以是靶核酸分子濃度依賴性的，較強(qiáng)的信號(hào)可在堿性條件下達(dá)到，以及反應(yīng)混合物中的二價(jià)陽離子可能是抑制性的。在第三組八個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在不同濃度和不同溫度下針對(duì)各種靶核酸分子來評(píng)估探針。將各種反應(yīng)混合物的總結(jié)列表顯示于圖4a中。每一種反應(yīng)混合物均為20μl的體積，并且包含測(cè)試探針(0.1μm)、合適的靶核酸分子(1x＝0.1μm)連同共同的試劑混合物。該共同的試劑混合物含有來自newenglandbiolabs(neb)的1xthermopol緩沖液(包含2mmmgcl2，ph8.8)和50mmk2so4。該反應(yīng)混合物不包含聚合酶或任何其他類型的酶。在熱循環(huán)儀中90℃下加熱該反應(yīng)混合物10s，并測(cè)量每一種反應(yīng)混合物的熒光。然后，以階梯降溫的方式將反應(yīng)混合物的溫度降至70℃、60℃、45℃、35℃和25℃的溫度。在每一次溫度降低之后，測(cè)量每一種反應(yīng)混合物的熒光。第三組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4b中。如圖4b所示，熒光信號(hào)隨著溫度且也隨著靶核酸分子的濃度而變化。圖4b中的數(shù)據(jù)提示，信號(hào)可以是靶核酸分子濃度和溫度依賴性的。實(shí)施例2：示例探針的測(cè)試針對(duì)靶核酸分子評(píng)估兩種單鏈測(cè)試探針。圖5a示意性地描繪了第一測(cè)試探針(“r探針”)。如圖5a所示，該測(cè)試探針從5’到3’包含可檢測(cè)部分501(例如，fam熒光染料)、核苷酸序列500a、可切割部分(例如，核糖部分“rc”)502、核酸序列500b以及猝滅劑503(例如，iabkfq猝滅劑)。第二測(cè)試探針(“脫氧探針(deoxyprobe)”)除了不包含可切割部分502而是在與第一測(cè)試探針的可切割部分502相同的位置處具有標(biāo)準(zhǔn)脫氧堿基以外，它在結(jié)構(gòu)上與第一測(cè)試探針相同。圖5c示意性地描繪了靶核酸分子，并且它完全互補(bǔ)于兩種測(cè)試探針。在第一組24個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在不采用靶核酸分子、采用靶核酸分子以及在無效探針(如圖5b示意性地所描繪的，不具有可檢測(cè)部分或猝滅劑的與“脫氧探針”相同的探針)的存在下采用靶核酸分子的情況下，針對(duì)不同的酶條件(無酶(僅緩沖液)、pfu聚合酶、phusion聚合酶、2xphusion主混合物、核糖核酸酶hii、pfu聚合酶+核糖核酸酶hii、phusion聚合酶+核糖核酸酶hii、2xphusion主混合物+核糖核酸酶hii)來評(píng)估第一測(cè)試探針。每一種反應(yīng)混合物均為20μl的體積，并且包含第一測(cè)試探針(0.2μm)、靶核酸分子(如果存在的話)(0.22μm)、無效探針(如果存在的話)(0.22μm)、合適濃度的酶以及緩沖液。在適當(dāng)?shù)那闆r下，酶的濃度如下：pfu＝0.02個(gè)單位/μl，phusion＝0.02個(gè)單位/μl，核糖核酸酶hii＝0.1個(gè)單位/μl。該緩沖液含有ph8.8的20mmtris-hcl、10mm(nh4)so4、10mmkcl、50mmk2so4、2mmmgso4、0.1％triton-x-100。將反應(yīng)混合物在37℃下溫育15min，隨后在65℃下溫育15min，然后經(jīng)歷95℃下1min且58℃下1min的5個(gè)熱循環(huán)程序。對(duì)于包含模板核酸分子的反應(yīng)混合物，第一測(cè)試探針和靶核酸分子經(jīng)歷55℃下5min的初步溫育并隨后冷卻至4℃。在循環(huán)的58℃階段中，測(cè)量每一種反應(yīng)混合物的熒光。第一組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖6a中。圖6a所示的數(shù)據(jù)顯示了在參考染料(rox1x)的校正/歸一化下跨越5個(gè)循環(huán)所測(cè)的平均熒光信號(hào)(任意熒光單位)。僅包含測(cè)試探針的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(沒有靶核酸分子)在圖6a所示的條形圖中用“r”表示。包含測(cè)試探針和靶核酸分子的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(沒有無效探針)在圖6a的條形圖中用“r+t”表示。包含測(cè)試探針、靶核酸分子和無效探針的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖6a的條形圖中用“r+t+n”表示。如圖6a所示，當(dāng)反應(yīng)混合物中包含靶核酸分子時(shí)，信號(hào)明顯較強(qiáng)。而且，無效探針(作為競(jìng)爭(zhēng)劑)的存在似乎未減弱所觀測(cè)到的信號(hào)。圖6a中的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)與靶核酸分子雜交時(shí)第一測(cè)試探針可產(chǎn)生信號(hào)，并且因?yàn)闊o效探針?biāo)坪醪⑽从绊懹^測(cè)到的信號(hào)，所以探針與靶核酸分子的結(jié)合可以是不可逆的。在第二組12個(gè)實(shí)驗(yàn)中，采用靶核酸分子針對(duì)不同的酶條件(無酶(僅緩沖液)、phusion聚合酶、核糖核酸酶hii、phusion2x主混合物、taq聚合酶和phusion2x混合物+核糖核酸酶hii)評(píng)估第一測(cè)試探針和第二測(cè)試探針。每一種反應(yīng)混合物均為20μl的體積，并且包含合適的測(cè)試探針(0.2μm)、靶核酸分子(0.22μm)、合適濃度的酶以及緩沖液。酶的濃度如下：taq聚合酶＝0.075個(gè)單位/μl，phusion聚合酶＝0.02個(gè)單位/μl，核糖核酸酶hii＝0.10個(gè)單位/μl。用于phusion聚合酶和核糖核酸酶hii反應(yīng)的緩沖液含有ph8.8的20mmtris-hcl、10mm(nh4)so4、10mmkcl、50mmk2so4、2mmmgso4、0.1％triton-x-100。用于taq聚合酶反應(yīng)的緩沖液含有來自newenglandbiolabs的1xtaq緩沖液。將反應(yīng)混合物在37℃下溫育1min，隨后在65℃下溫育1min，隨后在95℃下溫育30s，并在60℃下測(cè)量每一種反應(yīng)混合物的熒光。在溫育之前，測(cè)試探針和靶核酸分子經(jīng)歷55℃下5min的初步溫育并隨后冷卻至4℃。第一組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖6b中。圖6b所示的數(shù)據(jù)顯示了對(duì)于針對(duì)參考染料(rox1x)校正/歸一化的每一種反應(yīng)混合物在60℃下所測(cè)的熒光信號(hào)(任意熒光單位)。如圖6b所示，當(dāng)與含有第二測(cè)試探針的反應(yīng)混合物相比時(shí)，含有第一測(cè)試探針的反應(yīng)混合物的信號(hào)明顯較強(qiáng)。而且，盡管使用了具有不同性質(zhì)的酶或甚至在不存在酶(例如，僅緩沖液的條件)的情況下，但對(duì)于所測(cè)試的每一個(gè)探針，信號(hào)沒有顯著不同。圖6b中的數(shù)據(jù)提示，第一測(cè)試探針可以在不存在酶的情況下產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，并且第一測(cè)試探針的功能可不依賴于特定類型的酶(例如，具有3’或5’外切核酸酶活性的酶)的功能。實(shí)施例3：示例探針的測(cè)試針對(duì)靶核酸分子評(píng)估三種測(cè)試探針。圖7a示意性地描繪了這三種測(cè)試探針：“r探針”、“脫氧探針1”和“脫氧探針2”。如圖7a所示，r探針測(cè)試探針從5’到3’包含可檢測(cè)部分701(例如，fam熒光染料)、核苷酸序列700a、可切割部分(例如，核糖部分“rc”)702、核酸序列700b以及猝滅劑703(例如，iabkfq猝滅劑)。脫氧探針1除了不包含可切割部分702而是在與r探針的可切割部分702相同的位置處具有標(biāo)準(zhǔn)脫氧堿基以外，在結(jié)構(gòu)上與r探針測(cè)試探針相同。脫氧探針2除了具有bhq_13猝滅劑而非iabkfq猝滅劑以外，在結(jié)構(gòu)上與脫氧探針1相同。將這三種測(cè)試探針各自提供給20μl反應(yīng)混合物，并在靶核酸分子的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行評(píng)估。該反應(yīng)混合物包含該靶核酸分子的約1000個(gè)拷貝；0.3μm的正向引物(5’-gcagtcccaaatctccagtcactca-3’)和0.3μm的反向引物(5’-gggcaacataccttgatagtccag-3’)；0.15μm的脫氧探針1或2或0.1μm的r探針、10mmtris-hcl，ph8.3；50mmkcl；1.5mmmgcl2；0.2mmdntp混合物；1x參考rox染料；以及0.0375u/μltaq聚合酶。擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀中進(jìn)行，其中該反應(yīng)混合物在98℃下預(yù)熱20s，然后進(jìn)行包含95℃下7s、59℃下35s和72℃下15s的循環(huán)的溫度循環(huán)程序的45個(gè)循環(huán)。在溫度循環(huán)程序的每一個(gè)循環(huán)的59℃階段中監(jiān)測(cè)該反應(yīng)混合物中的信號(hào)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖7b中。圖7b描繪了擴(kuò)增曲線圖，其顯示在對(duì)數(shù)尺度下信號(hào)相對(duì)于循環(huán)數(shù)的變化(δrn)。如圖7b所示，r探針測(cè)試探針在信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)轉(zhuǎn)換效率方面顯示出與脫氧探針2類似的性能。由于擴(kuò)增反應(yīng)在taq聚合酶的存在下進(jìn)行，因此圖7b中的數(shù)據(jù)表明r探針測(cè)試探針可以在具有5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下以類似于脫氧探針2的效率起作用。實(shí)施例4：示例探針的測(cè)試針對(duì)靶核酸分子評(píng)估兩種雙鏈測(cè)試探針和包含可切割部分的r探針。這兩種雙鏈探針包含如圖8a描繪的與兩條猝滅鏈“猝滅鏈1”或“猝滅鏈2”之一雜交的“熒光鏈”。如圖8a所示，該熒光鏈從5’到3’包含核酸序列和可檢測(cè)部分801(例如，fam熒光染料)。猝滅鏈1從5’到3’包含猝滅劑803(例如，iabkfq猝滅劑)和與熒光鏈的序列互補(bǔ)的序列。猝滅鏈2除了還在其3’端處包含終止子(例如，雙脫氧胞苷(ddc))核苷酸804以外，在結(jié)構(gòu)上與猝滅鏈1相同。當(dāng)作為單鏈提供給反應(yīng)混合物時(shí)，雙鏈測(cè)試探針中的每一種的兩條組成鏈雜交在一起形成它們各自的雙鏈測(cè)試探針。將所述雙鏈測(cè)試探針中的每一種或r探針的鏈提供給20μl反應(yīng)混合物，并在靶核酸分子的擴(kuò)增反應(yīng)中評(píng)估這三種測(cè)試探針中的每一種。該反應(yīng)混合物包含該靶核酸分子的約1000個(gè)拷貝；0.4μm的正向引物(5’-tcccaaatctccagtcactcdudu-3’)和0.4μm的反向引物(5’-caacataccttgatagtccagdudu-3’)；0.15μm的熒光鏈和猝滅鏈1或猝滅鏈2，或0.1μm的r探針；以及1xphusion主混合物(thermo)。擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀中進(jìn)行，其中該反應(yīng)混合物在98℃下預(yù)熱20s，然后進(jìn)行包含96℃下10s、60℃下35s和72℃下15s的循環(huán)的溫度循環(huán)程序的45個(gè)循環(huán)。在溫度循環(huán)程序的每一個(gè)循環(huán)的60℃階段中監(jiān)測(cè)該反應(yīng)混合物中的信號(hào)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖8b中。在圖8b中，包含熒光鏈和猝滅鏈1的雙鏈測(cè)試探針用“dd對(duì)1”表示，并且包含熒光鏈和猝滅鏈2的雙鏈測(cè)試探針用“dd對(duì)2”表示。r探針測(cè)試探針在圖8b中表示為“r探針”。圖8b描繪了擴(kuò)增曲線圖，其顯示在對(duì)數(shù)尺度下信號(hào)相對(duì)于循環(huán)數(shù)的變化(δrn)。如圖8b所示，兩種雙鏈測(cè)試探針顯示出類似的性能并且是定量的。而且，r探針在不存在5’外切核酸酶活性的情況下也似乎定量地起作用。因此，圖8b中顯示的結(jié)果提示，雙鏈探針可在不存在5’外切核酸酶活性的情況下定量地用來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例5：檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(snp)研究了包含snp位點(diǎn)的靶核酸分子并示于圖14a中。snp位點(diǎn)的核苷酸位點(diǎn)由圖14a所示的框中的“n”核苷酸表示。如圖14b所示，在其3’端包含序列“iuu”的正向引物(“a-正向”)用來檢測(cè)snp位點(diǎn)n處的“a/t”snp。肌苷核苷酸是可用來檢測(cè)snp位點(diǎn)上的嘌呤堿基的嘌呤衍生物。圖14b還顯示了用來檢測(cè)snp位點(diǎn)處的a/tsnp且在其3’端包含序列“uu”的相應(yīng)反向引物(“a-反向”)。而且，如圖14b所示，在其3’端包含序列“uuu”的反向引物(“g-反向”)用來檢測(cè)snp位點(diǎn)n處的“c/g”snp。3個(gè)u核苷酸的最5’側(cè)是可用來檢測(cè)snp位點(diǎn)上的嘧啶堿基的嘧啶衍生物。圖14b還顯示了用來檢測(cè)snp位點(diǎn)處的c/gsnp且在其3’端包含序列“uu”的相應(yīng)正向引物(“g-正向”)。在一系列六種反應(yīng)混合物(a-f)中，每一個(gè)引物組(a-正向/a-反向或g-正向/g-反向)在區(qū)分其靶snp(a/t與c/g)方面進(jìn)行評(píng)估。六種反應(yīng)混合物中的兩種包含圖14a中的靶核酸分子的100或1000個(gè)拷貝，其中在snp位點(diǎn)上測(cè)試引物組的靶snp(例如，對(duì)于a-正向/a-反向引物組，在snp位點(diǎn)上“a”替換n，對(duì)于g-正向/g-反向引物組，在snp位點(diǎn)上“g”替換n)。每一組的其他四種反應(yīng)混合物包含圖14a中的靶核酸分子的1000、10000、100000或1000000個(gè)拷貝，其中在snp位點(diǎn)上測(cè)試引物組的非靶snp(例如，對(duì)于a-正向/a-反向引物組，在snp位點(diǎn)上“g”替換n，對(duì)于g-正向/g-反向引物組，在snp位點(diǎn)上“a”替換n)。每一種反應(yīng)混合物均為20μl的總體積。每一種反應(yīng)混合物包含合適的靶核酸分子(snp位點(diǎn)上的a或snp位點(diǎn)上的g)的合適數(shù)目的拷貝、0.25μm的各自的正向和反向引物、200μmdntp、0.02個(gè)單位/μlphusiondna聚合酶和來自newenglandbiolabs的緩沖液，以及從lifetechnologies獲得的sybr綠(濃度為0.3x)和rox(濃度為1x)熒光染料。為了完成靶核酸分子的擴(kuò)增，每一種反應(yīng)混合物經(jīng)歷熱循環(huán)程序，該熱循環(huán)程序包括98℃下10s的初始變性步驟，然后是98℃下1s、60℃下30s和72℃下10s的45個(gè)循環(huán)。在完成該熱循環(huán)程序之后，完成每一種反應(yīng)混合物的解鏈曲線分析。描繪每一組反應(yīng)混合物的解鏈曲線分析的結(jié)果的曲線圖示于圖14c(對(duì)于評(píng)估a-正向/a-反向的反應(yīng)混合物)和圖14d(對(duì)于評(píng)估g-正向/g-反向的反應(yīng)混合物)。在圖14c和圖14d的每一幅圖中均顯示了表格，該表格指出哪一個(gè)靶核苷酸在靶核酸分子的snp位點(diǎn)上，以及每一種反應(yīng)混合物(a-f)中合適的靶核酸分子的拷貝數(shù)。在圖14c和圖14d中，每一種反應(yīng)混合物的解鏈曲線分析示于曲線圖中，其中每一個(gè)標(biāo)記的曲線的字母對(duì)應(yīng)于該表格中合適的反應(yīng)混合物。如圖14c所示，當(dāng)正向-a和反向-a引物用于擴(kuò)增時(shí)，在snp位點(diǎn)上包含a的靶核酸分子的解鏈曲線分析期間，在靶核酸分子的基本上較低的拷貝數(shù)下觀察到類似的熒光變化。例如，對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有a的靶核酸分子的100個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(a)觀察到的熒光變化類似于對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有g(shù)的靶核酸分子的100000個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(e)觀察到的熒光變化。此外，對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有a的靶核酸分子的1000個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(b)觀察到的熒光變化類似于對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有g(shù)的靶核酸分子的1000000個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(f)觀察到的熒光變化。在兩個(gè)比較中，根據(jù)兩種反應(yīng)混合物中每一個(gè)靶核酸分子的拷貝數(shù)，觀察到在檢測(cè)靶snp時(shí)約1000倍的區(qū)別。類似地，如圖14d所示，當(dāng)正向-g和反向-g引物用于擴(kuò)增時(shí)，在snp位點(diǎn)上包含g的靶核酸分子的解鏈曲線分析期間，在靶核酸分子的基本上較低的拷貝數(shù)下觀察到類似的熒光變化。例如，對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有g(shù)的靶核酸分子的100個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(a)觀察到的熒光變化高于對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有a的靶核酸分子的100000個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(e)觀察到的熒光變化。此外，對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有g(shù)的靶核酸分子的1000個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(b)觀察到的熒光變化類似于對(duì)于包含在snp位點(diǎn)上具有a的靶核酸分子的1000000個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物(f)觀察到的熒光變化。在兩個(gè)比較中，根據(jù)兩種反應(yīng)混合物中每一個(gè)靶核酸分子的拷貝數(shù)，觀察到在檢測(cè)靶snp時(shí)至少1000倍的區(qū)別。實(shí)施例6：采用可激活和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸的巢式擴(kuò)增反應(yīng)使用如本文別處所述且描繪于圖10a-圖10c的可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000、可激活的引發(fā)寡核苷酸1050和反向引物1060在一系列三組反應(yīng)混合物中擴(kuò)增靶核酸分子。每組反應(yīng)混合物經(jīng)歷特定的處理程序(a、b或c)并且包括包含反向引物1060和可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的反應(yīng)混合物；包含反向引物1060和可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的反應(yīng)混合物；以及包含反向引物1060、可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000和可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的反應(yīng)混合物。因此，評(píng)估總計(jì)九種反應(yīng)混合物(3組x每組3種反應(yīng)混合物)。一組反應(yīng)混合物中的每種反應(yīng)混合物的總結(jié)示于圖11a的表格中。每一種反應(yīng)混合物均具有20μl的總體積，其含有1xphusion快速pcr試劑(由來自newenglandbiolabs的2x主混合物制成)、作為背景的約100皮克(“pg”)人dna、靶核酸分子的約1000個(gè)拷貝。在反應(yīng)混合物包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的情況下，該可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000以0.1μm的濃度被包含在內(nèi)。在反應(yīng)混合物包含可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的情況下，可激活的引發(fā)寡核苷酸1050以0.5μm的濃度被包含于其中。反向引物1060以0.5μm的濃度包含在反應(yīng)混合物中。在反應(yīng)混合物包含核糖核酸酶hii的情況下或在加入核糖核酸酶hii的情況下，核糖核酸酶以0.125個(gè)單位/μl的濃度存在。每一組三種反應(yīng)混合物經(jīng)歷特定的處理程序a、b或c。處理程序a、b和c的總結(jié)以圖形方式描繪在圖11b中。如圖11b所示，提供了初始溫度為98℃(持續(xù)10s)且不具有核糖核酸酶hii的程序a反應(yīng)混合物。在這樣的反應(yīng)條件下，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000是活化的且可以參與擴(kuò)增反應(yīng)以擴(kuò)增靶核酸分子。而且，在這樣的條件下，可激活的引發(fā)寡核苷酸1050不是活化的且不能參與擴(kuò)增反應(yīng)以擴(kuò)增靶核酸分子。反應(yīng)混合物隨后經(jīng)歷兩個(gè)系列的擴(kuò)增循環(huán)1110和1120。系列1110包括98℃下1s、60℃下5s和72℃下10秒的15個(gè)循環(huán)。系列1120包括98℃下1s、60℃下5s和72℃下10秒的30個(gè)循環(huán)。由于可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000是活化的且可激活的引發(fā)寡核苷酸1050是鈍化的，類似于圖10c中那些擴(kuò)增產(chǎn)物1070(例如，約100bp)的擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)計(jì)在包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的反應(yīng)混合物中。如圖11b所示，程序b反應(yīng)混合物與核糖核酸酶hii一起提供并在37℃下溫育30min。在這樣的反應(yīng)條件下，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000被鈍化且不能參與擴(kuò)增反應(yīng)以擴(kuò)增靶核酸分子。而且，在這樣的條件下，可激活的引發(fā)寡核苷酸1050被激活且其核酸序列1050a’可以參與擴(kuò)增反應(yīng)以擴(kuò)增靶核酸分子。反應(yīng)混合物隨后經(jīng)歷系列1110和1120擴(kuò)增循環(huán)。由于可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000是鈍化的且可激活的引發(fā)寡核苷酸1050是活化的，類似于圖10c中那些擴(kuò)增產(chǎn)物1080(例如，約70bp)的擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)計(jì)在包含可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的反應(yīng)混合物中。如圖11b所示，以初始溫度98℃(持續(xù)10s)提供程序c反應(yīng)混合物，并經(jīng)歷調(diào)節(jié)的條件使得靶核酸分子的擴(kuò)增經(jīng)由可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000和可激活的引發(fā)寡核苷酸1050二者來實(shí)現(xiàn)。在初始條件下，如上所述，可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000是活化的且可激活的引發(fā)寡核苷酸1050不是活化的。對(duì)于反應(yīng)混合物，在開始時(shí)加入核糖核酸酶hii。在反應(yīng)混合物1(僅具有可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000)中，核糖核酸酶最初是活化的，并因此可鈍化的引發(fā)寡核苷酸是鈍化的且預(yù)計(jì)不會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)混合物隨后經(jīng)歷系列1110擴(kuò)增循環(huán)以生成擴(kuò)增產(chǎn)物1070。隨后將反應(yīng)混合物在37℃下溫育30分鐘并激活核糖核酸酶hii(或者，添加至反應(yīng)混合物)以激活可激活的引發(fā)寡核苷酸1050和鈍化可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000。反應(yīng)混合物隨后經(jīng)歷系列1120擴(kuò)增循環(huán)以生成擴(kuò)增產(chǎn)物。由于引發(fā)寡核苷酸1050在反應(yīng)混合物2(僅包含可激活的引發(fā)寡核苷酸1050)和3(包含可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000和可激活的引發(fā)寡核苷酸1050二者)中是活化的，因此預(yù)期產(chǎn)生類似于圖10c中那些擴(kuò)增產(chǎn)物1080的擴(kuò)增產(chǎn)物。由于可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000在反應(yīng)混合物1(僅具有可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000)中是鈍化的，因此預(yù)期不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。在完成擴(kuò)增反應(yīng)之后，在溴化乙錠的存在下通過4％瓊脂糖凝膠電泳分析10μl的每一種反應(yīng)混合物。如上所述，擴(kuò)增產(chǎn)物1070的預(yù)期產(chǎn)物大小為約100bp且擴(kuò)增產(chǎn)物1080的預(yù)期產(chǎn)物大小為約75bp。凝膠電泳分析的結(jié)果示于圖11c中。如圖11c所示，在存在可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的情況下，在程序a反應(yīng)混合物(例如，反應(yīng)混合物1和3)中觀察到約100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物1070。在不存在可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的情況下(例如，反應(yīng)混合物2)，未觀察到100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物1070。在一些反應(yīng)混合物中，觀察到較短的產(chǎn)物1090，并且該產(chǎn)物可能是引物二聚體副產(chǎn)物。如圖11c所示，在存在可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的情況下，在程序b反應(yīng)混合物(例如，反應(yīng)混合物2和3)中觀察到約75bp的擴(kuò)增產(chǎn)物1080。在不存在可激活的引發(fā)寡核苷酸1050的情況下(例如，反應(yīng)混合物1)，未觀察到75bp的擴(kuò)增產(chǎn)物1080。而且，如圖11c所示，當(dāng)不存在可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000的情況下，可激活的引發(fā)寡核苷酸1050存在且活化(例如，反應(yīng)混合物2)時(shí)，對(duì)于程序c反應(yīng)混合物，在第二反應(yīng)混合物中觀察到約75bp的擴(kuò)增產(chǎn)物1080。在可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000也存在且活化的情況下(例如，反應(yīng)混合物3)，觀察到100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物1070。在可激活的引發(fā)寡核苷酸1050不存在時(shí)可鈍化的引發(fā)寡核苷酸1000存在且被鈍化的情況下(例如，反應(yīng)混合物1)，未觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。雖然本文已顯示并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，此類實(shí)施方案僅通過舉例的方式來提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到許多變化、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案可用于實(shí)施本發(fā)明。旨在由以下權(quán)利要求來限定本發(fā)明的范圍，以及旨在由此涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12