相關(guān)申請的交叉引用

本申請參考2014年11月5日遞交的新加坡專利申請“穩(wěn)定化、自主、無二硫鍵的抗體vh結(jié)構(gòu)域”并要求其的優(yōu)先權(quán)，該申請正式分配申請?zhí)?0201407244p。根據(jù)pct第4.18條，所述于2014年11月5日遞交的申請的內(nèi)容通過引用并入本文用于所有目的，包括并入未包含于本文中且涉及遵循pct第20.5(a)條的說明書、權(quán)利要求書或附圖的任何要素或部分。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及單域抗體。更特別地，本發(fā)明涉及基于抗體vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的穩(wěn)定化且自主(autonomous)的單域抗體。

發(fā)明背景

制藥業(yè)占約6000億美元的市場，其中1000億美元歸因于迄今為止批準的～200種生物藥品?；诳贵w的產(chǎn)品占生物藥品市場的40％左右，其中一些拳頭產(chǎn)品(例如單克隆抗體rituxan(用于治療非霍普金氏淋巴瘤)、herceptin(乳腺癌)和avastin(多種癌癥))占每年～100億美元的銷售額(walsh.natbiotechnol2010；28,917-924)。它們的應用不斷擴張至包括廣泛的疾病，以及許多不同的形式以用最有效的方式靶向疾病。完整的igg仍然代表規(guī)范，但是抗體片段、抗體-藥物綴合物和雙特異性抗體躋身于擴張基于抗體的療法的新領(lǐng)域最有希望的方法(byrne等人trendsbiotechnol2013；31,621-632；zolot等人natrevdrugdiscov2013；12,259-260；nelson.mabs2010；2,77-83)。盡管有一些成功報道(hong&zeng.febslett2014；588,350-355)，但抗體靶向細胞內(nèi)靶標仍然是很大程度上難以到達的一個領(lǐng)域。

vh結(jié)構(gòu)域是人免疫球蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。它們具有生成結(jié)合物(binder)和用于制藥應用的潛能。vh結(jié)構(gòu)域的小尺寸允許增強的腫瘤滲透、從血流中快速清除，并且使其成為靶向所謂的隱性表位(即，病毒表面抗原中存在的完整抗體不易接近的窄腔)的良好候選者(barthelemy等人jbiolchem2008；283,3639-3654；holliger&hudson.natbiotechnol2005；23,1126-1136)。然而，這些支架(scaffold)的開發(fā)受到穩(wěn)定性差的阻礙，穩(wěn)定性差主要是由于與完整抗體中存在的輕鏈的穩(wěn)定化相互作用喪失(barthelemy等人jbiolchem2008；283,3639-3654；holliger&hudson.natbiotechnol2005；23,1126-1136)。

以前的穩(wěn)定化vh結(jié)構(gòu)域的嘗試已經(jīng)取得了一些成功。winterg.及其同事開發(fā)出了鑒定耐熱并在體外呈現(xiàn)可逆折疊的vh結(jié)構(gòu)域的方法(jespers等人natbiotechnol2004；22,1161-1165)。使用這種方法，它們鑒定了結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)域抗體(christ等人proteinengdessel:peds2007；20,413-416)。dimitrovd.s.及其同事偶然鑒定出了具有有利穩(wěn)定性的自主vh結(jié)構(gòu)域。使用這種支架，他們能夠基于來自供體的人cdr的移植生成噬菌體展示文庫，并鑒定針對牛痘蛋白b5r、igf-1和igf-2的結(jié)合物(chen等人jmolbiol2008；382,779-789；chen等人molimmunol2010；47,912-921)。sidhus.s.及其同事嘗試4d5抗體(曲妥單抗(transtuzumab))vh結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定化，鑒定允許自主折疊和穩(wěn)定性的突變。當使用這種支架生成合成的噬菌體展示文庫時，可以鑒定出針對vegf的結(jié)合物。然而，該分子以非常規(guī)方式結(jié)合靶標：大部分結(jié)合歸因于cdr-h3和之前的輕鏈相互作用表面，而不是由cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3構(gòu)成的對流抗體互補位(barthelemy等人jbiolchem2008；283,3639-3654；ma等人jmolbiol2013；425,2247-2259)。

此外，盡管生成自主穩(wěn)定的vh結(jié)構(gòu)域有進展，但是在生成可用于細胞內(nèi)應用的穩(wěn)定的無二硫鍵(disulfide-free)的vh結(jié)構(gòu)域方面尚未獲得成功。

因此，本領(lǐng)域仍然需要克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點的穩(wěn)定化抗體。

發(fā)明概述

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過提供本發(fā)明的單域抗體能夠滿足所述需要。

在第一方面，本發(fā)明涉及單域抗體，其中所述抗體是免疫球蛋白vh結(jié)構(gòu)域，其相對于人種系vh結(jié)構(gòu)域或vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列包含至少一種修飾，所述修飾選自h35d、a78v、s93v、s93g和w103r，其中所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案。

在多種實施方式中，所述抗體相對于人種系vh結(jié)構(gòu)域或vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列還包含至少一種另外的修飾，所述修飾選自c22s、a24i、a24l和c92t，其中所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案，前提條件是存在c22s和c92t中的至少一種。

在多種實施方式中，抗體基于4d5抗體支架或人種系vh3結(jié)構(gòu)域。

在多種實施方式中，抗體具有氨基酸序列evqlvesggglvqpggslrlscaasgf-(xaa)n-wvrqapgkglewva-(xaa)p-adsvkgrftisadtsknt-xaa-ylqmnslraedtavyyc-xaa-(xaa)q-y-xaa-gqgtlvtvss(seqidno：1)，其中所述抗體包含至少一種選自h35d、a78v、s93v、s93g和w103r的修飾；或具有氨基酸序列evqlvesggglvqpggslrls-xaa-a-xaa-sgf-(xaa)n-wvrqapgkglewva-(xaa)p-adsvkgrftisadtsknt-xaa-ylqmnslraedtavyy-xaa-xaa-(xaa)q-y-xaa-gqgtlvtvss(seqidno：2)，其中所述抗體包含至少一種選自h35d、a78v、s93v、s93g和w103r的修飾以及至少一種選自c22s、a24i、a24l和c92t的修飾，前提條件是存在c22s和c92t中的至少一種，其中n、p和q各自獨立地為0或1-30之間的整數(shù)，并且其中所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案。

在多種實施方式中，抗體具有一個或不具有分子內(nèi)二硫鍵。

在第二方面，本發(fā)明涉及包含單域抗體的多模塊(multi-modular)抗體分子，其中所述分子是單特異性的、雙特異性的或多特異性的，和/或是單價的、二價的或多價的。

在第三方面，本發(fā)明包括包含單域抗體或多模塊抗體分子以及治療劑、可檢測標志物、任何其它有效載荷分子(payloadmolecule)或其組合的抗體綴合物。

在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子的文庫，其中每種抗體均包含具有氨基酸序列xaa-xaa-xaa-xaa-t-xaa-i-d(seqidno:3)的cdr-h1、具有氨基酸序列r-i-xaa-p-xaa-xaa-g-xaa-t-xaa-y(seqidno:4)的cdr-h2和具有氨基酸序列r-(xaa)n-xaa-xaa-d(seqidno:5)的cdr-h3，其中n為6-20之間的整數(shù)。

在第五方面，本發(fā)明提供了選擇與抗原結(jié)合的抗體分子的方法，所述方法包括：a.提供本發(fā)明的文庫；b.使所述文庫與抗原接觸以使得文庫中的一種或多種抗體分子與抗原結(jié)合；和c.選擇編碼與抗原結(jié)合的抗體分子的核酸。

在第六方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。

在多種實施方式中，核酸分子包含在運載體中。

在第七方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸分子，以及藥學上可接受的載體。

在第八方面，本發(fā)明提供了將本發(fā)明的抗體綴合物遞送至受試者的細胞、腫瘤、組織或器官的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的所述抗體綴合物，其中所述抗體綴合物中包含的抗體對細胞、腫瘤、組織或器官的抗原是特異性的。

在第九方面，本發(fā)明提供了診斷受試者的病癥或疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體綴合物或藥物組合物，其中所述抗體與可檢測標志物偶聯(lián)，所述受試者是哺乳動物，優(yōu)選地人。

在第十方面，本發(fā)明提供了治療受試者的病癥或疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物、核酸分子或藥物組合物，所述受試者是哺乳動物、優(yōu)選地人。

在第十一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子或運載體的宿主細胞。

在第十二方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子的方法，所述方法包括：在允許編碼所述單域抗體或多模塊抗體分子的核酸表達的條件下，表達所述核酸。

在多種實施方式中，在宿主細胞或無細胞系統(tǒng)中表達單結(jié)構(gòu)域抗體或多模塊抗體分子。

在最后一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物、核酸分子或藥物組合物在診斷或治療物病癥或疾病的方法中的用途。

附圖簡介

結(jié)合非限制性示例和附圖考慮時，參考詳細描述能夠更好地理解本發(fā)明。

圖1顯示了改進的vh-ntu(+)結(jié)構(gòu)域(a)、vh-ntu(-)結(jié)構(gòu)域(b)的序列，以及與genentech的vh1b1(gne；c)的比較。展示了4d5vh結(jié)構(gòu)域的原始序列，優(yōu)選的穩(wěn)定化突變顯示在野生型氨基酸下方，用框突出顯示。位置編號是根據(jù)kabat編號方案。白框是發(fā)生突變從而提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的位置，灰框是發(fā)生突變從而產(chǎn)生無二硫鍵版本的蛋白質(zhì)的位置，下劃線是可以用任何序列替代以產(chǎn)生與任何給定靶標結(jié)合的vh結(jié)構(gòu)域變體的cdr位置。

圖2顯示了比較表達和穩(wěn)定性的支架vh-ntu(-)(a)和genentech的vh支架1b1(b)的序列。展示了4d5vh結(jié)構(gòu)域的原始序列，優(yōu)選的穩(wěn)定化突變顯示在野生型氨基酸下方，用框突出顯示。位置編號是根據(jù)kabat編號方案。cdr-h3在第95-100a位被柔性序列sss替代，以負責當針對不同靶標生成不同結(jié)合物時該cdr中預期的可變性。白框是發(fā)生突變從而提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的位置，灰框是發(fā)生突變從而產(chǎn)生無二硫鍵版本的蛋白質(zhì)的位置，下劃線是可以用任何序列替代以產(chǎn)生與任何給定靶標結(jié)合的vh結(jié)構(gòu)域變體的cdr位置。淺灰色序列是表達和檢測所需的額外序列。

圖3顯示了通過western印跡比較gne和vh-ntu(-)可溶性表達水平。將gne可溶性級分的未稀釋樣品與vh-ntu(-)可溶性級分的1:2系列稀釋物進行比較。

圖4顯示了針對gne和vh-ntu獲得的熔解溫度。一式三份地進行tm測定。繪制平均tm和標準偏差。

圖5顯示了vh文庫1和vh文庫2的設(shè)計。(a)cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3中突變的位置。請注意，在cdr-h3中，[xaa]7-12表示文庫1以頻率“xaa”引入的殘基數(shù)(7-12個殘基)，而[xaa]6-20表示文庫2以頻率“xaa”引入的殘基數(shù)(6-20個殘基)。在這些文庫中，“xaa”由簡并密碼子xyz編碼，其中x＝0.2g+0.2a+0.5t+0.1c，y＝0.4a+0.2t+0.4c，z＝0.1g+0.9c。(b)針對顯示為“xaa”的位置設(shè)計和獲得的突變頻率。“x”表示琥珀密碼子。

圖6顯示了針對grb2(通過表面等離子體共振測量的動力學)、shep1(通過表面等離子體共振測量的動力學)、dhfr-ts(通過表面等離子體共振測量的動力學)、her3(通過生物層干涉測量的動力學)和eif4e(通過生物層干涉測量的動力學)獲得的vh-ntu(-)結(jié)構(gòu)域的親和性測量。獲得的親和性(kd)如圖所示?？?grb2vh:固定化grb2；從625nm開始，以1:2系列稀釋抗-grb2vh?？?shep1vh:固定化shep1；從250nm開始，以1:2系列稀釋抗-shep1vh?？?dhfr-tsvh:固定化dhfr-ts；從125nm開始，以1:2系列稀釋抗-dhfr-tsvh?？?her3vh:固定化vh；從200nm開始，以1:2系列稀釋her3?？?eif4evh:固定化eif4e；從125nm開始，以1:2系列稀釋抗-eif4evh。

圖7顯示了表達對照vh-egfp(頂部)和抗-grb2vh-egfp(底部)的細胞的熒光圖像。

發(fā)明詳述

以下詳細描述通過說明的方式涉及可以實施本發(fā)明的具體細節(jié)和實施方式。對這些實施方式進行了足夠的詳細描述，以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以利用其它實施方式，并且可以進行結(jié)構(gòu)和邏輯上的改變。多種實施方式不一定是相互排斥的，因為一些實施方式可以與一個或多個其它實施方式組合以形成新的實施方式。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。如果發(fā)生沖突，則以本文件(包括定義)為準。

本發(fā)明的目標是提供穩(wěn)定化且自主的單域抗體。

為此，本發(fā)明的發(fā)明人基于抗體vh結(jié)構(gòu)域通過以下產(chǎn)生了單域抗體：如發(fā)明人(asial等人natcommun2013；4,2901；cornvik等人natmethods2005；2,507-509)所開發(fā)地進化蛋白質(zhì)溶解度(使用集落過濾印跡或cofi)、抗聚集性和熱穩(wěn)定性(通過熱集落過濾或hot-cofi)，并與定向進化方法組合。

在第一方面，本發(fā)明涉及單域抗體，其中所述抗體是免疫球蛋白重鏈可變(vh)結(jié)構(gòu)域，其相對于人種系vh結(jié)構(gòu)域或vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列包含至少一種修飾，所述修飾選自h35d(第35位的his→asp)、a78v(第78位的ala→val)、s93v(第93位的ser→val)、s93g(第93位的ser→gly)和w103r(第103位的trp→arg)，所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案。

不使用數(shù)量詞限定在本文中用于指代一個或多于一個(即至少一個)指代物。例如，“要素”是指至少一個要素并且可以包括多于一個要素。

在本文中使用時，術(shù)語“抗體”是指能夠非共價地、可逆地并以特異性方式結(jié)合相應抗原的蛋白質(zhì)性分子?？贵w的典型實例是免疫球蛋白、以及仍保留結(jié)合特異性的其衍生物或功能片段。

如本領(lǐng)域所公知的，“免疫球蛋白”通常是指包含通過二硫鍵連接的至少兩個重(h)鏈和兩個輕鏈(l)的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每個重鏈具有重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)(ch)。術(shù)語“可變”是指在其序列中展示出可變性并參與決定特定抗體的特異性和結(jié)合親和性的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域部分(即“可變結(jié)構(gòu)域”)?？勺冃圆⒎蔷鶆蚍植荚诳贵w的整個可變結(jié)構(gòu)域中；其集中在每個重鏈和輕鏈可變區(qū)的子結(jié)構(gòu)域中。這些子結(jié)構(gòu)域被稱為“高變區(qū)”或“互補決定區(qū)”(cdr)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的較保守(即，非高變)部分被稱為“框架”區(qū)(fr)。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個fr區(qū)，所述四個fr區(qū)大多采用β-夾心構(gòu)型，其由三個高變區(qū)連接形成環(huán)狀連接，并且在某些情況下形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。fr使得每條鏈的高變區(qū)與其它鏈的高變區(qū)靠近在一起，從而有助于抗原-結(jié)合位點的形成。通常，天然存在的免疫球蛋白包括6個cdr：vh中的3個(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和vl中的3個(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。抗體vh結(jié)構(gòu)域包含四個框架區(qū)：fr1、fr2、fr3和fr4，以下列結(jié)構(gòu)穿插有cdr：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。在天然存在的免疫球蛋白中，cdr-h3和cdr-l3展示了六種cdr中的最大的多樣性，特別是cdr-h3被認為在賦予免疫球蛋白精細的特異性方面起著獨特的作用。

研究抗體結(jié)構(gòu)和功能的研究人員已經(jīng)開發(fā)出不同的方案來鑒定存在于任何特定vh區(qū)或vl區(qū)的氨基酸序列內(nèi)的重鏈和輕鏈cdr。這些方案中有許多根據(jù)與可變重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)的周圍框架相關(guān)聯(lián)的不變或幾乎不變的模式來鑒定cdr。然后使用對應于cdr在vh區(qū)和vl區(qū)環(huán)境中的組成殘基的位置的數(shù)值范圍來限定cdr。因為cdr(特別是第三cdr)的長度可以變化，所以所述方案有時還使用字母來限定組成殘基。首先出現(xiàn)的此類方案之一被稱為kabat編號系統(tǒng)，其基于比對當時已知的vh和vl序列，以確定可變cdr子序列在更高度保守的框架區(qū)環(huán)境中的位置。例如handbookoftherapeuticantibodies(2007),stefandubel編,wiley-vchverlaggmbh&co.kgaa,weinheim中更詳細地描述了kabat編號方案，該文件通過引用并入本文。

應當注意，除了序列表(見下文)之外，權(quán)利要求和整個說明書中采用的位置編號是根據(jù)kabat方案的編號。

本申請涉及“單域抗體(singledomainantibody)”，即包含單個蛋白結(jié)構(gòu)域的抗體片段，所述單個蛋白結(jié)構(gòu)域獨立于其它可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域與抗原或表位特異性結(jié)合。單域抗體通常是抗體的最小功能性結(jié)合單元，并且對應于抗體的重鏈可變區(qū)(vh)或輕鏈可變區(qū)(vl)。單域抗體的分子量約為13kda，或小于完整抗體大小的十分之一。根據(jù)本發(fā)明的抗體是基于vh結(jié)構(gòu)域的單域抗體，所述vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列對應于人種系vh結(jié)構(gòu)域或vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列。

術(shù)語“種系抗體”是指在不存在體細胞超突變的情況下，與由基因組dna序列編碼的抗體具有高氨基酸序列同源性的抗體。與最接近的種系基因所編碼的氨基酸序列相比，種系抗體通常在可變區(qū)展示出至少60％的氨基酸序列同源性，優(yōu)選地范圍從60％至100％的序列同源性，或更優(yōu)選地介于75％至99％的序列同源性。此類抗體經(jīng)歷了最低程度的體細胞超突變或沒有經(jīng)歷體細胞超突變，這是非種系抗體的特征。

相對于本文公開的氨基酸序列的“序列同一性百分比(％)”被定義為：在比對序列并且必要時引入間隙以實現(xiàn)最大序列同一性百分比，并且不考慮任何保守性取代作為序列同一性的一部分之后，候選序列中與參照序列(即本公開的抗體分子)中的氨基酸殘基兩兩相同的氨基酸殘基的百分比。出于確定氨基酸序列同一性百分比的目的所進行的比對可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式實現(xiàn)，例如使用公眾可獲得的計算機軟件，諸如blast、align或megalign(dnastar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定測量比對的適當參數(shù)，包括在所比較的序列的全長上實現(xiàn)最大比對所需的任何算法。

根據(jù)基于序列同源性的分類方法將抗體序列歸類為不同的家族(tomlinson等人jmolbiol1992；227(3):776-798；williams和winter.eurjimmunol1993；23(7):1456-1461)；cox等人eurjimmunol1994；24(4):827-36)。在本文中使用時，術(shù)語“vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列”是指通過對具有至少70％序列同源性的vh結(jié)構(gòu)域序列進行比對和分組而產(chǎn)生的共有序列。不同vh結(jié)構(gòu)域家族的共有序列是本領(lǐng)域公知的，可以在例如kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242中找到。

例如，4d5框架是源自人共有序列的人工框架，其基本上對應于種系序列igvh3-66和igvk1-39(imgt命名法)(carter等人procnatlacadsciusa.1992；89(10):4285-9)且最初用于抗-c-erbb2(p185^her2-ecd)mab4d5的人源化。

值得注意的是，本發(fā)明的單域抗體相對于人種系vh結(jié)構(gòu)域或vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列包含至少一種修飾，所述修飾選自h35d、a78v、s93v、s93g和w103r，其中所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案。發(fā)明人通過廣泛的實驗鑒定出了這些修飾，并引入其以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在4d5抗體支架中，vh結(jié)構(gòu)域的第78、93和103位處于框架區(qū)內(nèi)，而第35位處于cdr-h1內(nèi)。應當注意，雖然可以用任何氨基酸殘基替代cdr序列以產(chǎn)生與任何給定靶標結(jié)合的vh結(jié)構(gòu)域變體，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用cdr-h1內(nèi)第35位的asp殘基提高4d5支架的穩(wěn)定性。這與下述最近的發(fā)現(xiàn)相一致：可變結(jié)構(gòu)域中的一些殘基也是保守的(hsu等人structure.2014jan7；22(1):22-34)。

在多種實施方式中，抗體相對于人種系vh結(jié)構(gòu)域或vh結(jié)構(gòu)域家族共有序列還包含至少一種另外的修飾，所述修飾選自c22s(第22位的cys→ser)、a24i(第24位的ala→ile)、a24l(第24位的ala→leu)和c92t(第92位的cys→thr)，所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案，前提條件是存在c22s和c92t中的至少一種。引入這些修飾以產(chǎn)生無二硫鍵版本的蛋白質(zhì)。

通過提供在e.coli細胞質(zhì)中重組表達可溶形式的vh結(jié)構(gòu)域的可能性，去除二硫鍵是有利的。大多數(shù)治療性抗體目前在哺乳動物細胞系中以分泌形式表達，這是因為它們需要形成二硫鍵和翻譯后修飾(walsh.natbiotechnol2010；28,917-924)。一些抗體片段可以在細菌中產(chǎn)生，但是它們通常以不溶性形式產(chǎn)生，隨后再在體外重新折疊(huang等人jindmicrobiolbiotechnol2012；39,383-399)。這是一個繁瑣的過程，從而減緩開發(fā)時間。有時可以在e.coli周質(zhì)中生產(chǎn)，但這需要顯著優(yōu)化表達條件，而且產(chǎn)量通常較低(huang等人jindmicrobiolbiotechnol2012；39,383-399；kwong&rader.currprotocproteinsci/editorialboard,johne.coligan...[等]2009；第六章,第610單元)。vh結(jié)構(gòu)域不需要用于折疊、結(jié)合或穩(wěn)定性的翻譯后修飾，因此可以在細菌中以可溶性折疊形式以高產(chǎn)率表達無二硫鍵的vh。細菌相較于哺乳動物細胞的高生長速率、簡單的培養(yǎng)條件以及通過以可溶形式生產(chǎn)這些分子能夠獲得的流水線型純化方法減少了生產(chǎn)和純化與其它免疫球蛋白形式相比的這些分子所需的時間和成本。

在多種實施方式中，抗體基于4d5抗體支架或人種系vh3結(jié)構(gòu)域。以下出版物中明確定義了vh3種系：tomlinson等人jmb1992；227,776-798和matsuda等人natgenet1993；3(1),88-94，其通過引用并入本文。

應當注意，所有上述修飾均是在4d5支架序列的環(huán)境中通過廣泛的實驗得到的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，這些修飾可轉(zhuǎn)移到其它vh結(jié)構(gòu)域，特別是與4d5vh結(jié)構(gòu)域具有顯著同源性的vh3種系的vh結(jié)構(gòu)域。

為了確定這些修飾是否可以轉(zhuǎn)移到另一vh結(jié)構(gòu)域，通?；趦蓚€vh結(jié)構(gòu)域的序列之間的序列或結(jié)構(gòu)同源性來確定兩個序列之間等同或相應的對等殘基。為了確定同源性，將第一vh結(jié)構(gòu)域(即，4d5抗體的vh結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列與第二vh結(jié)構(gòu)域的序列直接比較。比對序列之后，使用一種或多種本領(lǐng)域眾所周知的同源性比對程序，例如clustalw(例如使用物種之間的保守殘基)，允許必要的插入和缺失以維持比對(即，通過任意缺失和插入避免消除保守殘基)，確定與第一vh結(jié)構(gòu)域的一級序列中的特定氨基酸殘基等同或相應的殘基。保守殘基的比對優(yōu)選地應保留至少20％、優(yōu)選地至少30％、優(yōu)選地至少40％、優(yōu)選地至少50％、優(yōu)選地至少60％、優(yōu)選地至少70％、優(yōu)選地至少80％、優(yōu)選地至少90％、優(yōu)選地至少95％、更優(yōu)選地至少96％、甚至更優(yōu)選地至少98％、甚至更優(yōu)選地至少99％、最優(yōu)選地100％的殘基。也可以通過確定第一vh結(jié)構(gòu)域和第二vh結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)同源性(即，在結(jié)構(gòu)已確定的vh結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)的水平上)來確定等同或相應的對等殘基。在這種情況下，等同或相應的殘基被確定為：比對之后，第一vh結(jié)構(gòu)域或前體的特定氨基酸殘基的兩個或更多個主鏈原子(n對n，ca對ca，c對c，o對o)的原子坐標在0.13nm以內(nèi)，優(yōu)選地為0.1nm。在最佳模型已被定向和定位以給出蛋白質(zhì)的非氫蛋白原子的原子坐標的最大重疊之后實現(xiàn)比對。不管如何確定等同或相應的殘基，也不管其中引入替代突變的第一vh結(jié)構(gòu)域的同一性如何，旨在傳達的是根據(jù)本發(fā)明的vh結(jié)構(gòu)域多肽均可被構(gòu)建成與第一vh結(jié)構(gòu)域具有顯著的序列同源性或結(jié)構(gòu)同源性的任何第二vh結(jié)構(gòu)域。

在多種實施方式中，抗體基于4d5支架，并具有氨基酸序列evqlvesggglvqpggslrlscaasgf-(xaa)n-wvrqapgkglewva-(xaa)p-adsvkgrftisadtsknt-xaa-ylqmnslraedtavyyc-xaa-(xaa)q-y-xaa-gqgtlvtvss(seqidno:1)，其中所述抗體包含至少一種選自h35d、a78v、s93v、s93g和w103r的修飾，其中n、p和q各自獨立地為0或1-30之間的整數(shù)，并且其中所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案。這種抗體具有分子內(nèi)二硫鍵。它具有高穩(wěn)定性和低聚集傾向，即便在高濃度下亦是如此。

本文所限定的n、p和q中的每一個獨立地為0或1-30之間的整數(shù)，并且cdr內(nèi)的每個殘基均可以是任何氨基酸殘基或不存在。然而，在某些實施方式中，獨立折疊的分子(例如，100-200個氨基酸的完整額外結(jié)構(gòu)域)也可以接枝到cdr-h3。這意味著cdr可以具有不同的長度。然而，使用kabat編號方案來指定位置編號確保了cdr長度的變化不會影響vh結(jié)構(gòu)域位置(特別是框架位置)的編號。

在多種實施方式中，抗體基于4d5支架并具有氨基酸序列evqlvesggglvqpggslrls-xaa-a-xaa-sgf-(xaa)n-wvrqapgkglewva-(xaa)p-adsvkgrftisadtsknt-xaa-ylqmnslraedtavyy-xaa-xaa-(xaa)q-y-xaa-gqgtlvtvss(seqidno:2)，其中所述抗體包含至少一種選自h35d、a78v、s93v、s93g和w103r的修飾，以及至少一種選自c22s、a24i、a24l和c92t的修飾，前提條件是存在c22s和c92t中的至少一種，其中n、p和q各自獨立地為0或1-30之間的整數(shù)，并且其中所述位置編號是根據(jù)kabat編號方案。通過發(fā)現(xiàn)可以取代上述版本的分子內(nèi)二硫鍵中涉及的半胱氨酸的突變，獲得了這種抗體。

其是首次描述的在沒有二硫鍵的情況下穩(wěn)定，且對于靶向細胞內(nèi)分子展示出獨特優(yōu)點的vh支架。另一個優(yōu)點是可以在細菌細胞質(zhì)中以可溶形式表達該支架，這提高了產(chǎn)率，減少了生產(chǎn)和純化時間，并因此降低了生產(chǎn)成本。一個或幾個游離半胱氨酸也可被重新引入表面，并用作化學交聯(lián)毒性有效載荷、熒光團、放射性同位素等的錨點。

本發(fā)明的單域抗體，無論是否具有分子內(nèi)二硫鍵，無論是否基于4d5支架，均被設(shè)計為具有較高的熱穩(wěn)定性和較高的抗聚集性。

在第二方面，本發(fā)明涉及包含單域抗體的多模塊抗體分子，其中所述分子是單特異性的、雙特異性的或多特異性的，和/或是單價的、二價的或多價的。

術(shù)語“特異性”是指特定抗體可以結(jié)合的不同類型的表位的數(shù)目。如果抗體僅與一種類型的表位結(jié)合，則該抗體是單特異性的。如果抗體與不同類型的表位結(jié)合，則抗體是多特異性的。例如，雙特異性多模塊抗體允許識別兩種不同類型的表位。表位是給定抗體結(jié)合的抗原上的位點。

術(shù)語“效價”是指抗體具有的針對特定表位的抗原結(jié)合位點的數(shù)目。例如，單價抗體具有一個針對特定表位的結(jié)合位點。

根據(jù)本發(fā)明的單域抗體是自主結(jié)合分子。因此，它表現(xiàn)為獨立結(jié)合模塊。若干此類抗體的組裝(例如憑借通過肽接頭的遺傳融合)允許產(chǎn)生多特異性的多價結(jié)合分子。例如，通過肽接頭融合兩個與不同靶標結(jié)合的單域抗體產(chǎn)生雙特異性分子，融合三個與不同靶標結(jié)合的此類單域抗體產(chǎn)生三特異性分子，以此類推。通過融合與單個靶標結(jié)合的相同的單域抗體，可以產(chǎn)生多價分子。

也可以融合其它模塊以增加新功能。例如，添加fc抗體片段允許產(chǎn)生具有延長的血液半衰期的分子以及抗體效應子功能(例如補體激活)。這種fc融合物可以在本發(fā)明的單特異性單域抗體上產(chǎn)生，也可以在由融合幾個單域抗體產(chǎn)生的多特異性分子或多價分子上產(chǎn)生。作為另一個實例，這種單域抗體可以與標準igg融合以向igg添加一種或幾種結(jié)合功能。

產(chǎn)生多模塊分子的技術(shù)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。

在第三方面，本發(fā)明包括包含單域抗體或多模塊抗體分子以及治療劑、可檢測標志物、任何其它有效載荷分子或其組合的抗體綴合物。

在本文中使用時，術(shù)語“治療劑”是指能夠在受試者中產(chǎn)生治療效果的任何試劑；在本文中使用時，術(shù)語“可檢測標記物”是指能夠在受試者中產(chǎn)生通過任何方法可檢測的診斷信號的任何試劑。

本發(fā)明的治療劑或可檢測標記物可以是具有適合實施本發(fā)明的期望特性的蛋白質(zhì)、核酸分子、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物或任何其它分子。

在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的可檢測標記物可以是成像劑。成像劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于對細胞、組織或生物膜成像的任何試劑，優(yōu)選地是醫(yī)學成像劑。醫(yī)學成像劑的實例包括但不限于磁共振成像(mri)劑、核磁共振成像(nmr)劑、正電子發(fā)射斷層攝影(pet)劑、x射線劑、光學劑、超聲劑和中子捕獲治療劑。

在一些實施方式中，可檢測標記物可以是熒光化合物，例如熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻紅蛋白等；或可檢測的酶，例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等等。當抗體與可檢測的酶綴合時，通過添加這樣的額外試劑來對其進行檢測，酶使用所述額外試劑來產(chǎn)生可檢測的反應產(chǎn)物。也可以用生物素衍生化抗體，然后通過間接測定親和素或鏈霉親和素結(jié)合來檢測。

在本文中使用時，“任何其它有效載荷分子”是指可以與本發(fā)明的抗體直接或間接綴合的任何分子。例如，抗體綴合物在血清中的半衰期取決于許多因素，但較小的抗體片段傾向于從循環(huán)中迅速消除。因此，較小的構(gòu)建體(例如包含單域抗體和小肽毒素)有利地與增加血清半衰期的多肽偶聯(lián)。例如，它們可以與hsa偶聯(lián)。優(yōu)選地，與hsa之間的鍵不穩(wěn)定，例如具有確定的半衰期，以使得當與細胞結(jié)合時，構(gòu)建體從hsa釋放，并且在沒有hsa的情況下被內(nèi)化。可用的方法是使用多特異性配體構(gòu)建體，以使得配體也結(jié)合hsa，從而將其保持在循環(huán)中。

在一些實施方式中，治療劑或可檢測標記物可以通過共價、靜電或疏水相互作用與抗體直接或間接偶聯(lián)。

將藥物或其它小分子藥物連接到抗體片段的方法是眾所周知的。本領(lǐng)域中確立了各種肽綴合化學物質(zhì)，包括雙功能化學連接劑，例如n-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸酯；磺基琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸酯；4-琥珀酰亞胺基-氧羰基-[α]-(2-吡啶基二硫代)甲苯；磺基琥珀酰亞胺基-6-[[α]-甲基-[α]-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基]己酸酯；n-琥珀酰亞胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯；琥珀酰亞胺基-6-[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰氨基]己酸酯；磺基琥珀酰亞胺基-6-[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯；3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰肼、ellman試劑、二氯三嗪酸(dichlorotriazinicacid)、s-(2-硫代吡啶基)-l-半胱氨酸等。美國專利nos.5,349,066；5,618,528；4,569,789；4,952,394和5,137,877以及corson等人acschembiol2008；3(11):677-692中公開了其它雙官能連接分子。

在一些實施方式中，抗體包括用于釋放有效載荷的可切割接頭。當抗體綴合物到達預期作用位點時，某些有效載荷分子通過逃避抑制(諸如由抗體分子施加的空間位阻)正常發(fā)揮功能可需要這種構(gòu)型。在一個實施方式中，接頭可以是酸不穩(wěn)定接頭，例如腙鍵。酸不穩(wěn)定接頭的其它實例包括通過使用順式烏頭酸、順式羧酸亞烷基三烯、聚馬來酸酐和其它酸不穩(wěn)定接頭而形成的接頭，例如美國專利nos.5,563,250和5,505,931中所述的接頭。在一個實施方式中，接頭是光不穩(wěn)定接頭。光不穩(wěn)定接頭的實例包括美國專利nos.5,767,288和4,469,774中所述的接頭，所述專利文獻的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

多肽試劑和多肽配體(包括抗體)可以通過一個(或兩個)多肽上的官能團或反應性基團綴合。它們通常由在多肽聚合物中存在的特定氨基酸的側(cè)鏈形成。這些反應性基團可以是半胱氨酸側(cè)鏈、賴氨酸側(cè)鏈或n-末端胺基或任何其它合適的反應性基團。反應性基團能夠與待連接的配體形成共價鍵。官能團是形成官能團的天然或非天然氨基酸中的特定原子的組。

天然氨基酸的合適官能團是半胱氨酸的硫醇基、賴氨酸的氨基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基、精氨酸的胍基、酪氨酸的酚基或絲氨酸的羥基。非天然氨基酸可以提供寬范圍的官能團，包括疊氮化物、酮-羰基、炔、乙烯基或芳基鹵基。多肽末端的氨基和羧基也可以用作與期望的配體形成共價鍵的官能團?？梢允褂脦€基介導的綴合的替代物，通過共價相互作用使配體與多肽連接。這些方法可以代替巰基介導的方法(或與巰基介導的方法組合)使用：通過產(chǎn)生具有必需化學官能團的帶有非天然氨基酸的多肽，結(jié)合帶有互補官能團的小分子；或者當在選擇/分離階段之后制造分子時，通過將非天然氨基酸摻入化學或重組合成的多肽中。

carter&senter.cancerj2008；14(3):154-69以及ducry和stump.bioconjugchem2010；21(1):5-13中也描述了將抗體綴合到藥物和其它化合物的技術(shù)。

在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子的文庫，其中每種抗體均包含具有氨基酸序列xaa-xaa-xaa-xaa-t-xaa-i-d(seqidno:3)的cdr-h1、具有氨基酸序列r-i-xaa-p-xaa-xaa-g-xaa-t-xaa-y(seqidno:4)的cdr-h2和具有氨基酸序列r-(xaa)n-xaa-xaa-d(seqidno:5)的cdr-h3，其中n為6-20之間的整數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的文庫是基于與本文所述的cdr綴合的本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子設(shè)計的，其中文庫中包含的每種單域抗體均基于4d5支架或另一種vh結(jié)構(gòu)域，并含有或不含分子內(nèi)二硫鍵。作為說明性實例，本說明書的實施例4描述了本發(fā)明的無二硫鍵單域抗體的文庫。

可以使用本領(lǐng)域中的多種已確立的標準方法來生成本發(fā)明的文庫。作為優(yōu)選的實例，可以使用噬菌粒載體，其包含(從5'-3')周質(zhì)信號序列，隨后是與噬菌體基因iii(編碼piii)或基因viii(編碼pviii)融合的vh結(jié)構(gòu)域。寡核苷酸被設(shè)計為包含期望的隨機化cdr序列，并通過使用適當設(shè)計的限制性位點進行克隆，通過基于pcr的定點誘變或通過kunkel誘變(kunkel.procnatlacadsciusa1985；82(2):488-92)被并入運載體中。將dna文庫轉(zhuǎn)化到可被輔助噬菌體感染的e.coli菌株(例如tg1或xl1-bluemrf')中。輔助噬菌體包含噬菌體基因組，并允許產(chǎn)生含有展示在表面的抗體且在核心包裝相應dna的噬菌體顆粒。

多種文庫格式是已知的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括但不限于下文在本發(fā)明的第五方面描述的那些。

在多種實施方式中，文庫是噬菌體展示文庫。

在第五方面，本發(fā)明提供了選擇與抗原結(jié)合的抗體分子的方法，所述方法包括：a.提供根據(jù)第四方面的文庫；b.使所述文庫與抗原接觸以使得文庫中的一種或多種抗體分子與抗原結(jié)合；和c.選擇編碼與抗原結(jié)合的抗體分子的核酸。

選擇步驟可以包括分離與抗原結(jié)合的抗體分子，例如抗原可以連接到可以回收的磁珠或其它分子上，從而也回收抗體?？贵w分子可以連接到其編碼核酸，例如，它可以是包含核酸的顆粒或可復制遺傳包的一部分?；蛘?，選擇步驟可以包括分離表達抗體分子的細菌，例如通過如下所述的迭代集落濾器篩選(iterativecolonyfilterscreening)技術(shù)。如果期望，之后可以分離編碼與抗原結(jié)合的抗體分子的核酸。

多種文庫形式和合適的篩選方法是已知的。

抗體分子文庫可以是細菌文庫，例如e.coli。因此，可以在細菌中表達抗體分子。這可以通過下述來實現(xiàn)：提供含有編碼文庫的抗體分子的核酸分子的細菌，并培養(yǎng)細菌以使其表達所述抗體分子。編碼抗體分子文庫的核酸分子是本發(fā)明的一個方面，含有所述核酸的細菌也是本發(fā)明的一個方面。細菌可以作為甘油儲液方便地儲存。

抗體分子可以由細菌分泌。這允許使用迭代集落濾器篩選(icfs)技術(shù)，該技術(shù)是一種雙濾器夾心試驗，其中可以篩選數(shù)億個表達抗體的細菌集落(giovannoni等人,nucleicacidsres2001；1；29(5):e27)。在icfs中，表達文庫的細菌細胞(通常為e.coli)在多孔主濾器上生長，該濾器與包被有感興趣抗原的第二濾器接觸?？贵w分子由細菌分泌并擴散到第二濾器上，從而與抗原接觸。檢測結(jié)合在第二濾器上的抗原允許回收一些細菌細胞，包括表達感興趣的結(jié)合特異性的細菌細胞。接下來，可使這些細菌經(jīng)受第二輪篩選以分離特異性抗體分子。步驟的迭代優(yōu)化(refine)所選抗體分子的群體。通過使用該方法，可以回收一些不同氨基酸序列的特異性結(jié)合抗體。

或者，文庫的抗體分子可以展示在顆粒或分子復合物上，而不是被分泌。合適的可復制遺傳包(geneticpackage)包括酵母、細菌或噬菌體(例如t7)顆粒、病毒、細胞或共價、核糖體或其它體外顯示系統(tǒng)，每種顆?；蚍肿訌秃衔锖芯幋a其上展示的抗體vh可變結(jié)構(gòu)域的核酸。

使用細胞或蛋白質(zhì)混合物的選擇也已經(jīng)在文獻中有記載(liu等人cancerres2004；64,704-710；mutuberria等人jimmunolmethods2004；287,31-47；rubinstein等人analbiochem2003；314,294-300)，這些技術(shù)可用于本發(fā)明中。

噬菌體展示是用于選擇具有期望特異性的抗體分子的已知技術(shù)，其中抗體分子文庫展示在絲狀噬菌體上(marks等人jmolbiol1991；222,581-597；winter等人annurevimmunol1994；12,433-455)。絲狀噬菌體是感染細菌的病毒，因此噬菌體文庫可以保持在細菌文庫中。通過將編碼肽的合成dna分別插入噬菌體基因iii或基因viii中，抗體分子可以與噬菌體的內(nèi)部外殼蛋白piii或主要外殼蛋白pviii融合。認為三個(或可能是五個)piii拷貝位于噬菌體顆粒的頂部，并且認為每個噬菌體中存在約2500個pviii拷貝。piii負責噬菌體與細菌f-菌毛的附著和感染，pviii負責包被單鏈噬菌體dna。piii蛋白具有三個結(jié)構(gòu)域：n1、n2和ct?？梢詫iii的n末端進行融合，或者可以去除n末端結(jié)構(gòu)域n1和n2，并對c端ct結(jié)構(gòu)域進行融合?？梢詫⒕幋a單域抗體的基因插入基因iii中，導致融合到piii的n末端并且并入噬菌體中的抗體分子的表達，從而允許噬菌體結(jié)合抗原。

本文所述的核酸分子可以包含編碼融合到絲狀噬菌體的外殼蛋白(例如，piii或pviii)的抗體分子的核苷酸序列。這種核酸分子可用于表達感染細菌的噬菌體上展示的抗體分子文庫或獲得由細菌分泌的可溶性抗體。通過在抗體分子基因和外殼蛋白基因之間插入琥珀終止密碼子，當噬菌體在e.coli的琥珀抑制因子菌株中生長時，琥珀密碼子被讀取為氨基酸，且與外殼蛋白融合的抗體被展示在噬菌體表面。當噬菌體在非抑制因子菌株中生長時，琥珀密碼子被讀取為終止密碼子，且細菌分泌可溶性蛋白質(zhì)。

選擇能夠結(jié)合抗原并展示在噬菌體或其它文庫顆?；蚍肿訌秃衔锷系目贵w分子之后，可以從展示所述選擇的抗體分子的噬菌體或其它顆?；蚍肿訌秃衔镏蝎@取核酸。所述核酸可用于隨后通過由核酸表達而產(chǎn)生單域抗體，其中所述核酸的序列取自展示所述選擇的抗體分子的噬菌體或其它顆?；蚍肿訌秃衔铩?/p>

因此，選擇之后，可以表達編碼與抗原結(jié)合的抗體分子的核酸以產(chǎn)生抗體分子。

從文庫中選擇一種或多種抗體之后，可以進一步表征抗體分子以根據(jù)抗體分子的預期目的在各種檢測中測定其性質(zhì)。檢測可以包括測定抗體分子與感興趣的抗原結(jié)合的親和性、與其它抗原的交叉反應性、表位作圖以確定抗原的哪個區(qū)域與抗體分子結(jié)合、免疫組織化學和其它體外試驗或體內(nèi)試驗。

需要時，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，使所鑒定的抗體進一步成熟或優(yōu)化以獲得用于特定應用中的改善的性質(zhì)。抗體分子也可以被改造為不同的形式或包含附加特征。

在第六方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。

編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的一條或多條鏈的核酸分子可以是任何可能構(gòu)型(例如單鏈、雙鏈或其組合)的任何核酸。核酸包括例如dna分子、rna分子、使用核苷酸類似物或使用核酸化學產(chǎn)生的dna類似物或rna類似物、鎖核酸分子(lna)和蛋白質(zhì)核酸分子(pna)。dna或rna可以是基因組來源或合成來源的，并且可以是單鏈或雙鏈的。這種核酸可以是例如mrna、crna、合成rna、基因組dna、cdna合成dna、dna與rna的共聚物、寡核苷酸等。單獨的核酸還可以含有非天然核苷酸類似物或與親和標記物或標簽連接。術(shù)語“運載體”是指能夠轉(zhuǎn)運已與其連接的另一核酸的核酸分子。在一個實施方式中，運載體是“質(zhì)?！?，其是指額外的dna區(qū)段可以連接到其中的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。在另一個實施方式中，運載體是病毒載體，其中額外的dna區(qū)段可以連接到病毒基因組中。本文公開的運載體可以能夠在其被引入的宿主細胞中(例如，具有細菌復制起點和附加體型哺乳動物載體的細菌載體)自主復制，或者可以在引入宿主細胞后被整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組(例如，非附加體型哺乳動物載體)一起復制。

在多種實施方式中，編碼根據(jù)本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子的核酸序列包含在運載體(例如，質(zhì)粒)中。

在第七方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸分子，以及藥學上可接受的載體。

術(shù)語“藥學上可接受的”在本文中用于指在合理的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)適合用于與人類和動物的組織接觸，而沒有過度的毒性、刺激性、變態(tài)反應或其它問題或并發(fā)癥，與合理的利益/風險比相稱的那些材料、組合物或劑型。

在本文中使用時，術(shù)語“藥學上可接受的載體”是指藥學上可接受的材料、組合物或載劑，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料，其涉及將主題提取物從一個器官或身體的一部分運送或運輸?shù)搅硪粋€器官或身體的一部分。每種載體必須是“可接受的”，意思是與制劑的其它成分兼容，并且不會對患者造成傷害?？捎米魉帉W上可接受的載體的材料的一些實例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無菌蒸餾水；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；ph緩沖溶液；聚酯、聚碳酸酯或聚酐；和藥物制劑中使用的其它無毒相容物質(zhì)。參見remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第19版(easton,pa.:mackpublishingco.,1995)，其公開了制備藥物制劑的典型載體和常規(guī)方法。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還將意識到，適當?shù)闹苿┤Q于針對特定應用選擇的施用途徑，且向受試者施用本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸的適當途徑和模式應當根據(jù)具體情況來確定。

本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸分子可以通過對基于蛋白質(zhì)性或核酸的藥物具有治療有效性的任何腸胃外或非腸胃外(腸內(nèi))途徑施用。腸胃外應用方法包括例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注技術(shù)，例如以注射溶液、輸注溶液或酊劑的形式，以及氣霧劑裝置和吸入劑，例如，以氣霧劑混合物、噴霧劑或粉末的形式。例如patton等人procamerthoracicsoc2004；第1卷第338-344頁給出了關(guān)于肺部藥物遞送的概述，即通過氣霧劑吸入(其也可以用于鼻內(nèi)施用)或氣管內(nèi)滴注。非腸胃外遞送模式為，例如，經(jīng)口，例如以丸劑、片劑、膠囊、溶液或混懸劑的形式，或經(jīng)直腸，例如以栓劑的形式。根據(jù)需要，本發(fā)明的抗體分子可以在含有常規(guī)無毒的藥學上可接受的賦形劑或載體、添加劑和載體的制劑中全身或局部施用。

在本發(fā)明的一個實施方式中，將藥物將腸胃外施用于哺乳動物，特別是人。相應的施用方法包括但不限于例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、氣管內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注技術(shù)，例如，以注射溶液、輸注溶液或酊劑的形式，以及氣霧劑裝置和吸入劑，例如，以氣霧劑混合物、噴霧劑或粉末的形式。在具有相對短的血清半衰期的化合物的情況下，靜脈內(nèi)和皮下輸注和/或注射的組合可能是最方便的。藥物組合物可以是水性溶液、水包油乳劑或油包水乳劑。

如meidanvm和michniakbb.amjther2004；11(4):312-316中所述的經(jīng)皮遞送技術(shù)(例如離子電滲、超聲波導入或微針增強遞送)也可以用于經(jīng)皮遞送本文所述的本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸分子。非胃腸外遞送模式為例如經(jīng)口，例如以丸劑、片劑、膠囊、溶液或混懸劑的形式，或經(jīng)直腸施用，例如以栓劑的形式。本發(fā)明的抗體分子可以在含有多種常規(guī)無毒的藥學上可接受的賦形劑或載體、添加劑和載體的制劑中全身或局部施用。

所應用的本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸分子的劑量可以在寬范圍內(nèi)變化以實現(xiàn)期望的預防作用或治療反應。例如，其取決于抗體分子對所選靶標的親和性以及抗體分子與配體之間的復合物在體內(nèi)的半衰期。此外，最佳劑量取決于抗體分子或其綴合物的生物分布、施用模式、所治療的疾病/病癥的嚴重程度以及患者的醫(yī)療狀況。例如，當用在用于局部應用的藥膏中時，可以使用高濃度的抗體分子。然而，如果期望，也可以在持續(xù)釋放制劑中給予抗體分子，所述持續(xù)釋放制劑例如脂質(zhì)體分散體或水凝膠基聚合物微球，如polyactive^tm或octodex^tm(參見bos等人,businessbriefing:pharmatech2003:1-6)。可用的其它持續(xù)釋放制劑有例如基于plga的聚合物(prpharmaceuticals)、基于pla-peg的水凝膠(medincell)和基于pea的聚合物(medivas)。

因此，可以使用藥學上可接受的成分以及已確立的制備方法將本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物或核酸分子配制成組合物(gennaro,a.l.和gennaro,a.r.(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第20版,lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa)。為了制備藥物組合物，可以使用藥學惰性的無機或有機賦形劑。為了制備例如丸劑、粉末、明膠膠囊或栓劑，可以使用例如乳糖、滑石粉、硬脂酸及其鹽、脂肪、蠟、固體或液體多元醇、天然油和硬化油。用于生產(chǎn)在使用前重構(gòu)成溶液或氣霧劑混合物的溶液、懸浮液、乳劑、氣霧劑混合物或粉末的合適的賦形劑包括水、醇、甘油、多元醇及其合適的混合物以及植物油。

可以通過許多方式對制劑進行滅菌，包括通過細菌保留濾器的過濾，或通過摻入無菌固體組合物形式的滅菌劑，可以在使用前不久將所述無菌固體組合物溶解或分散在無菌水或其它無菌介質(zhì)中。

在第八方面，本發(fā)明提供了將根據(jù)第三方面的抗體綴合物遞送至受試者的細胞、腫瘤、組織或器官的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的所述抗體綴合物，其中所述抗體綴合物中包含的抗體對所述細胞、腫瘤、組織或器官的抗原是特異性的。

術(shù)語“有效量”的本發(fā)明的抗體綴合物是指提供期望效果的無毒但足量的綴合物。

在第九方面，本發(fā)明提供了診斷受試者的病癥或疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體綴合物，其中所述抗體與可檢測標志物偶聯(lián)，所述受試者是哺乳動物、優(yōu)選地人。

術(shù)語“疾病”或“病癥”在本文中可互換使用，其是指身體或一些器官的狀態(tài)的任何變化，中斷或干擾功能的表現(xiàn)或引起患病的人或與人接觸者諸如不適、機能障礙、痛苦或甚至死亡等癥狀。疾病或病癥也可以涉及瘟熱(distemper)、生病(ailing)、微恙(ailment)、痼疾(malady)、病癥(disorder)、疾恙(sickness)、病患(illness)、病痛(complaint)、不適(inderdisposion)或疾患(affectation)。

在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體對于分子成像應用是有利的，這是因為相對于常規(guī)抗體其血漿半衰期較短，從而更快地實現(xiàn)了成像所需的對比度噪聲比(contrast-to-noiseratio)。

在第十方面，本發(fā)明提供了治療受試者的病癥或疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物、核酸分子或藥物組合物，所述受試者是哺乳動物、優(yōu)選地人。

在本文中使用時，術(shù)語“治療”是指降低癥狀的嚴重性或頻率、消除癥狀或基本病因、預防癥狀或其基本病因的發(fā)生以及改善或修復損傷。例如，通過施用本發(fā)明的抗癌劑來治療患者包括化學預防易于發(fā)生癌癥的患者(例如，由于遺傳易感性、環(huán)境因素等而具有較高的風險)或具有癌癥復發(fā)風險的癌癥幸存者，以及通過抑制病癥或疾病或引起病癥或疾病消退來雙重治療癌癥患者。

根據(jù)本發(fā)明的抗體分子可以針對任何期望的靶標表位/抗原。取決于所選擇的表位/抗原，抗體可適用于治療病癥或疾病且應該根據(jù)具體情況確定。

雖然igg形式的單克隆抗體和fab(利用目前的技術(shù))僅允許靶向用于治療應用的細胞外分子，但是其無二硫鍵版本的單域抗體允許靶向細胞內(nèi)靶標。細胞內(nèi)的還原環(huán)境導致二硫鍵解離以及隨后的igg和fab聚集。由于本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域支架已針對不存在二硫鍵時的穩(wěn)定性進化，因此其細胞內(nèi)穩(wěn)定性不受影響。因此，本文所述的單域抗體可用于靶向細胞內(nèi)分子，或在細胞內(nèi)遞送毒性有效載荷。其最有力的競爭對手是genentech的穩(wěn)定vh結(jié)構(gòu)域1b1(gne，圖1c)，它仍含有二硫鍵，當二硫鍵被去除時，其穩(wěn)定性顯著低于本發(fā)明的支架，從而使得該分子與細胞內(nèi)應用不相容。

此外，本發(fā)明的小尺寸抗體有益于微環(huán)境(niche)治療應用例如眼科治療(例如濕性老年黃斑變性，其中藥物被注射到眼睛中，而較小的分子允許每體積包裝更多分子)、肺部遞送(較小的尺寸可以允許藥物較深地滲透到肺)以及實體瘤治療(較小的尺寸允許快速組織滲透)。較小的尺寸可導致藥物施用頻率降低。

應當理解，使用編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子的基因療法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過這種方法，可以重組改變細胞以在其中插入一個或多個感興趣的基因，例如編碼單域抗體或多模塊抗體分子、特別是可用于抵抗微生物的抗體的基因，所述微生物例如病毒或其它病原體，包括呼吸道微生物例如細菌、真菌和寄生蟲。通過遞送其它抗體、特別是可用于治療不同類型眼科疾病的那些抗體，這種方法也可用于其它疾病。也可將這種細胞(例如肌肉和呼吸細胞)插入接受患者的給定器官的組織中，其中細胞表達外源dna，合成抗體蛋白質(zhì)并將其分泌到細胞周圍的空間中以遞送至血流或局部組織，這取決于抗體在哪兒實現(xiàn)其臨床效果。這種施用方式允許插入的工程化細胞產(chǎn)生恒定(可能甚至可誘導的)水平的抗體蛋白質(zhì)，而沒有產(chǎn)生大批抗體(其然后必須被儲存直至使用)的商業(yè)成本和問題。此外，根據(jù)需要，可以對細胞進行工程改造以響應患者在產(chǎn)生不同量抗體蛋白質(zhì)方面的需要。

在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體可以分泌形式使用，而本發(fā)明的無二硫鍵抗體也可以在細胞內(nèi)表達以調(diào)節(jié)感興趣的生物學過程用于治療目的。

在第十一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子或運載體的宿主細胞。

術(shù)語“宿主細胞”是指已經(jīng)引入了表達運載體的細胞。宿主細胞包括細菌、微生物、植物或動物細胞，優(yōu)選escherichiacoli、bacillussubtilis；saccharomycescerevisiae、pichiapastoris、cho(中國倉鼠卵巢系)或nso細胞。

在第十二方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子的方法，所述方法包括：在允許編碼所述單域抗體或多模塊抗體分子的核酸表達的條件下，表達所述核酸。

在多種實施方式中，在宿主細胞或無細胞系統(tǒng)中表達本發(fā)明的單域抗體或多模塊抗體分子。

可以使用任何已知且完善的表達系統(tǒng)和重組細胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)本發(fā)明的抗體分子，例如通過在細菌宿主(原核系統(tǒng))或真核系統(tǒng)(例如酵母、真菌、昆蟲細胞或哺乳動物細胞)中表達。可以在轉(zhuǎn)基因生物(例如，山羊、植物或xenomouse轉(zhuǎn)基因小鼠、具有人免疫球蛋白基因座的大片段且小鼠抗體產(chǎn)生有缺陷的工程化小鼠品系)中生產(chǎn)本發(fā)明的抗體分子。也可以通過化學合成來生產(chǎn)抗體。

為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體分子，通常分離編碼抗體的多核苷酸并將其插入可復制運載體(例如質(zhì)粒)中用于進一步克隆(擴增)或表達。合適表達系統(tǒng)的說明性實例有谷氨酸合成酶系統(tǒng)(例如由lonzabiologies出售)，其中宿主細胞是例如cho或ns0。編碼抗體的多核苷酸易于使用常規(guī)程序進行分離和測序?？梢允褂玫倪\載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微染色體，其中質(zhì)粒是一個典型的實施方式。通常，這種運載體還包括與單域抗體多核苷酸可操作性連接的信號序列、復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列以便于表達。

使用重組技術(shù)時，抗體分子可以在細胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體是在細胞內(nèi)產(chǎn)生的，則作為第一步，通過例如離心或超濾除去顆粒碎片(宿主細胞或裂解片段)。carter等人,bio/technology1992；10:163-167描述了分離分泌到ecoli周質(zhì)空間的抗體的程序。多肽可以以可溶和折疊狀態(tài)直接獲得或以包涵體的形式回收，然后在體外復性。對于含有分子內(nèi)二硫鍵的抗體，另外的選擇是使用具有氧化性細胞內(nèi)環(huán)境的特定宿主菌株，因此可以在細胞質(zhì)中形成二硫鍵(venturim,seifertc,huntec.jmolbiol2002；315,1-8)。

可以使用任何常規(guī)純化技術(shù)來純化細胞所產(chǎn)生的抗體分子，例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析，其中親和層析是一種優(yōu)選的純化技術(shù)。用于本發(fā)明的特定抗體分子的純化方法的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。

在最后一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單域抗體、多模塊抗體分子、抗體綴合物、核酸分子或藥物組合物在診斷或治療物病癥或疾病的方法中的用途。

通過以下實施例進一步闡釋本發(fā)明。但應當理解，本發(fā)明不限于示例性實施方式。

實施例

方法

用于穩(wěn)定性改善的文庫生成。使用genemorphii誘變試劑盒(stratagene)通過易錯pcr產(chǎn)生隨機誘變文庫。將克隆的野生型基因(用于第一文庫)或改良的變體(用于隨后的文庫)用作模板，并根據(jù)制造商的方案進行反應。使用的引物與待產(chǎn)生突變的開放閱讀框(orf)側(cè)翼的序列退火。在使用磷酸化引物的30個循環(huán)的pcr反應中，使用平均50ng插入模板，從而導致最終質(zhì)粒文庫中每個基因平均～2-3個氨基酸突變。對易錯pcr產(chǎn)物進行凝膠純化(qiagen凝膠純化試劑盒)。

使用本文所述的經(jīng)優(yōu)化方案，通過全質(zhì)粒的大引物pcr(megawhop)反應(miyazaki.methodsmolbiol2003；231,23)來產(chǎn)生質(zhì)粒文庫。通常，使用1-10ng含有野生型(wt)基因的質(zhì)粒作為模板，并使用～1ng插入物/bp插入長度的純化的eppcr插入物作為大引物(例如，對于500bp插入物為500ng)，在利用kodxtreme聚合酶(merck)的pcr反應中進行擴增。緩沖組合物是制造商推薦的標準品，添加1mmnad+和40utaqdna連接酶，并使用0.5ukodxtreme聚合酶。pcr條件如下：94℃持續(xù)2分鐘，(98℃持續(xù)10秒，65℃持續(xù)30秒，68℃持續(xù)6分鐘)持續(xù)30個循環(huán)，保持4℃。pcr后，將20udpni(neb)加入pcr反應中，并在37℃下孵育3小時。

為了生成允許鑒定無二硫鍵版本的vh36的文庫，首先通過定點誘變?nèi)コ齭tii信號序列，從而產(chǎn)生克隆vh36i。然后，通過megawhop生產(chǎn)定點誘變文庫，其中殘基第c22、a24和c96位被隨機化。根據(jù)制造商的方案，使用vh36i作為模板和kodhotstart聚合酶(merck)，使用磷酸化正向引物(5’-ggctcactccgtttgtccnnkgcannktctggcttcaacattaaagac-3’)和反向引物(5’-cctccccagcggccmnnataatagacggcagtg-3’)進行pcr。凝膠純化pcr產(chǎn)物，并如前所述進行megawhop反應，然后進行dpni處理。用經(jīng)dpni處理的純化的megawhop產(chǎn)物電穿孔dh10b細胞，從而產(chǎn)生～10⁵個獨特成員的文庫。

溶解性和穩(wěn)定性篩選。用誘變文庫轉(zhuǎn)化rosetta2細胞，然后涂布在補充有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的直徑為24.5cm的方形lb-瓊脂平板上。這些被視為母平板(masterplate)。將集落轉(zhuǎn)移到durapore0.45μm濾膜(millipore)上，然后置于補充有抗生素和30μm異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)的lb-瓊脂平板(集落面向上)上。在室溫(rt)下過夜誘導用于蛋白質(zhì)表達。

蛋白質(zhì)產(chǎn)生后，使誘導板經(jīng)受期望的溫度(用于溶解度篩選的rt，或用于穩(wěn)定性篩選的較高溫度)持續(xù)30分鐘。將durapore膜轉(zhuǎn)移到由浸在cofi裂解緩沖液[20mmtris,ph8.0,100mmnacl,0.2mg/ml溶菌酶,11.2u/mlbenzonase核酸內(nèi)切酶(merck)和1:1000稀釋的不含edta的蛋白酶抑制劑混合物集合iii(merck)]中的whatman紙和硝酸纖維素膜(millipore)構(gòu)成的裂解夾層結(jié)構(gòu)中，并在篩選溫度下孵育另外30分鐘。

通過三個分別在-80℃和rt下的凍融循環(huán)(每次30分鐘)進一步改善細胞裂解。棄去durapore膜和whatman紙，將硝酸纖維素膜在封閉緩沖液[tbs-t緩沖液(20mmtris,ph7.5,500mmnacl,0.05％(體積/體積)tween20)和1％牛血清白蛋白(bsa)]在室溫下孵育1小時。

封閉之后，將硝酸纖維素膜在tbs-t中洗滌三次，在室溫下10分鐘，并以70轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)振搖。通過下述方法來檢測可溶性蛋白質(zhì)的存在：在含有1:5000稀釋的hisprobe-hrp(thermoscientific)的tbs-t中孵育膜，或者在含1％bsa的tbs-t中將膜與1:10000稀釋的蛋白質(zhì)a-hrp探針(lifetechnologies)一起孵育，在室溫下持續(xù)1小時，以30rpm振搖。然后如上所述進行三次洗滌步驟。

利用ccd相機(fujifilmlas-4000)，使用supersignalwestdura化學發(fā)光試劑盒(thermoscientific)使硝酸纖維素膜顯影。

實施例1：通過定向進化和hot-cofi產(chǎn)生穩(wěn)定的vh結(jié)構(gòu)域

選擇4d5vh結(jié)構(gòu)域作為我們用于穩(wěn)定化的親本支架，這是因為其親本igg曲妥單抗是具有有利免疫原性特征的經(jīng)批準fda藥物，且其穩(wěn)定性已得到廣泛研究(barthelemy等人jbiolchem2008；283,3639-3654)。產(chǎn)生了4d5vh開放閱讀框(orf)的隨機誘變文庫，并且在80℃下通過熱集落過濾(hot-cofi)篩選了約40000個克隆，鑒定出了22個獨特的陽性克隆。

將這些變體合并在一起，并用作新的隨機誘變文庫的模板。第二輪篩選在90℃進行，鑒定出了31個額外的獨特的陽性克隆，并對其進行進一步表征。這些克隆的生物物理學表征是通過以修改的版本測定細胞聚集溫度(tcagg)(asial等人naturecommunications2013；4,2901)進行的。在這種情況下，使用40℃-95℃的梯度，在pcr儀器中對全蛋白裂解物進行熱應激，然后離心并過濾以除去聚集體。然后將可溶性級分點在硝酸纖維素膜上并顯影。針對wt估計的tcagg為～50℃，而最佳突變體vh36的tcagg為～73℃。這相當于比wt的聚集溫度提高23℃。

通過該工作鑒定的最好的兩個突變體vh33和vh36分別含有突變r50s、a78v、s93g，a100bp和h35d、s93g、a100bp、w103r。有趣的是，在所選擇的所有克隆中，r50和h35d的突變是相互排斥的。

實施例2：用于去除vh分子內(nèi)二硫鍵的進一步進化

選擇vh36作為無二硫鍵版本進化的熱穩(wěn)定起始模板。去除將vh36導向周質(zhì)的信號肽stii，從而產(chǎn)生了聚集在e.coli細胞質(zhì)中的模板vh36i。通過kunkel誘變，使用nnk密碼子，利用所有20個氨基酸將三個位置c22、a24和c92隨機化。通過cofi印跡從這個庫篩選大致～20000個克隆，并通過蛋白質(zhì)a-hrp探針使硝酸纖維素膜顯影以鑒定可溶性的折疊的vh36i變體。鑒定出了五種不同的變體，vh36i.1是最穩(wěn)定的，tm＝58℃。該克隆含有突變c22s、a24c和c96t。

為了使vh36i.1可用于生成結(jié)合物，其穩(wěn)定性不應該依賴于其cdr，特別是cdr-h3。此外，突變a100bp在cdr-h3中產(chǎn)生向下的扭結(jié)，這降低了cdr-h3的柔韌性，因此降低了cdr-h3的可塑性。由于該原因，移除了cdr-h3，并用從第w95位到第p100b位序列sssa替代，從而產(chǎn)生了構(gòu)建體vh37i。vh37i具有降低的穩(wěn)定性，tm＝46℃。為了進一步穩(wěn)定vh37i，利用在室溫下的篩選步驟和在50℃下的更嚴格的陽性確認，通過cofi篩選新的隨機誘變文庫并通過蛋白質(zhì)a-hrp探針顯影。鑒定出了四個穩(wěn)定的克隆，vh37i.1和vh37.2是最穩(wěn)定的，具有tm～56℃的穩(wěn)定性。vh37i.1包含核心突變a78v，而vh37i.2包含位于cdr-h3附近的突變g93v。組合來自兩個克隆的突變以產(chǎn)生最終克隆vh38i，其穩(wěn)定性為tm～57℃。該變體接受對第c24位(分子中唯一的半胱氨酸)的幾種取代：原始野生型ala，以及朝向ile、val、tyr、ser和trp的突變。c24i和c24l是最穩(wěn)定的變體，tm～58℃。在整個研究中獲得的所有知識的組合導致鑒定出了允許在存在或不存在二硫鍵的情況下vh結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性較高的突變。這些優(yōu)選的突變分別突出顯示在圖1a和1b中，其對應于本發(fā)明的最終支架，即分別為vh-ntu(+)和vh-ntu(-)。

實施例3：vh-ntu(-)和genentech的vh1b1在不存在二硫鍵時的表達和穩(wěn)定性的比較

為了比較vh支架與genentech的vh支架1b1在不存在二硫鍵時的穩(wěn)定性，生成待在e.coli的細胞質(zhì)中表達兩個蛋白質(zhì)構(gòu)建體(圖2)。

將genentech的支架(gne)和具有氨基酸序列evqlvesggglvqpggslrlssaisgfnikdtyidwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntvylqmnslraedtavyytgrsssamdyrgqgtlvtvss(seqidno：6)的支架vh-ntu(-)克隆到基于pet的表達運載體中，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到rosetta2表達菌株中。在800mltb培養(yǎng)基中于18℃下進行表達過夜。本文所述的vh-ntu(-)抗體基于4d5vh結(jié)構(gòu)域，其中其cdr-h3在第95-100a位被柔性序列sss替代，以賦予當針對多種靶標生成不同結(jié)合物時該cdr中預期的可變性。

針對gne和vh-ntu(-)獲得的細胞沉淀分別為18g和20g。將其重懸于30ml裂解緩沖液中并通過超聲處理裂解。

將裂解物在4℃下以35000g離心15分鐘，并保留上清液(可溶性級分)。將來自gne和vh-ntu(-)的可溶級分的等份式樣裝載到sds-page凝膠上。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用抗-myc抗體探測以比較gne和vh-ntu(-)的可溶性表達的相對水平。

通過差示掃描熒光測定法(ericsson等人analbiochem2006；357,289-298)測定熔解溫度(tm)(圖4)。gne和vh-ntu(-)的熔解溫度分別為tm＝40.6℃和tm＝56.1℃。因此，在不存在二硫鍵的情況下，vh-ntu(-)支架比genentech的支架穩(wěn)定16℃。

數(shù)據(jù)顯示：在不存在二硫鍵的情況下，支架vh-ntu(-)優(yōu)于genentech的1b1。vh-ntu(-)在e.coli中的可溶性表達產(chǎn)率為128倍，且穩(wěn)定性更優(yōu)(提高16℃)。這些優(yōu)點使得本發(fā)明的支架成為生成針對細胞內(nèi)靶標的抗體的理想選擇。這明顯應用于靶向細胞內(nèi)分子以用于治療，但也用于研究和成像目的。較高的表達產(chǎn)率可以簡化和加快生產(chǎn)和純化過程。

實施例4：使用vh-ntu支架生成針對不同靶標的結(jié)合物

為了驗證我們的支架的有用性，使用圖2a中所述的序列作為模板以生成噬菌體展示抗體文庫。該文庫1在所有三個cdrh1、cdrh2和cdrh3中都含有突變，其中氨基酸組成偏向tyr和ser(圖5)。

通過使用文庫1，鑒定出了針對三種不同靶標：人生長因子受體結(jié)合蛋白2(grb2)、含人sh2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)3c(shep1)和p.falciparum雙功能二氫葉酸還原酶-胸苷酸合酶(dhfr-ts)的結(jié)合物。所獲得的親和性在180nm至17nm之間(圖6)。

通過對先前的設(shè)計增加改進，生成了第二代文庫(文庫2)：更寬的cdr-h3長度范圍；cdr-h1中優(yōu)選的殘基t32；和取代同一cdr-h1中的殘基i29以及cdr-h3中的殘基m100c的疏水殘基(圖5)。從該文庫中鑒定出了針對真核翻譯起始因子4e(eif4e)和受體酪氨酸-蛋白激酶erbb-3(her3)的結(jié)合物。使用文庫2獲得的親和性范圍在48nm和8nm之間(圖6)。

實施例5：在人類癌細胞中表達結(jié)合物

為了證明這些vh結(jié)構(gòu)域在人細胞內(nèi)是穩(wěn)定的，生成融合構(gòu)建體，其中vh與增強的綠色熒光蛋白(egfp)融合，從而在以可溶形式產(chǎn)生vh時給出綠色熒光讀出。圖7顯示了用抗grb2vh-egfp或?qū)φ誺h-egfp轉(zhuǎn)染的人乳腺癌細胞mcf-7的結(jié)果。來自轉(zhuǎn)染細胞的熒光信號證實了vh能夠在細胞內(nèi)表達并在人細胞中維持穩(wěn)定性(如實施例3所述，在本發(fā)明的vh-ntu與genentech的gne之間的比較中，已經(jīng)針對在e.coli細胞質(zhì)中的表達證明了這一點)。

本文已經(jīng)廣泛且一般性地描述了本發(fā)明。落入一般公開內(nèi)容內(nèi)的每一個較窄種類和亞組都形成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的具有前提條件或負面限制(從類別中去除任何主題)的一般描述，而無論去除的物質(zhì)是否在本文中具體提及。其它實施方式也入所附權(quán)利要求內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組進行描述的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明由此還以該馬庫什組的任何單獨成員或成員亞組的形式進行了描述。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易認識到，本發(fā)明非常適于實現(xiàn)目標并獲得所提及的目的和優(yōu)點以及其中固有的目的和優(yōu)點。此外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可以對本文公開的本發(fā)明進行各種替換和修改。本文描述的組合物、方法、程序、處理、分子和具體化合物目前代表優(yōu)選的實施方式，其是示例性的，并不意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的精神內(nèi)所包含的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到其中的變化和其它用途由權(quán)利要求的范圍限定。在本說明書中列出或討論先前公開的文件不應必然理解為承認所述文件是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或者是公知常識。

本文說明性地描述的本發(fā)明可以適當?shù)卦诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何要素、限制的情況下實施。因此，例如，術(shù)語“包括”、“包括”、“含有”等應被廣泛且非限制性地理解。因此，術(shù)語“包括”、“包括”、“含有”等應被理解為表示包括所述整數(shù)或整數(shù)組，而不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。此外，本文使用的術(shù)語和表述作為說明性而非限制性術(shù)語使用，并且不旨在使用這些術(shù)語和表述來排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，但是應該認識到，可以在所要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)進行各種修改。因此，應當理解，雖然通過示例性實施方式和任選特征具體公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行本文所公開的其中實施的本發(fā)明的修改和變化，并且這些修改和變化是被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文引用的所有文件和專利文件的內(nèi)容通過引用整體并入本文。

序列表

<110>南洋理工大學

<120>經(jīng)穩(wěn)定化且自主的抗體vh結(jié)構(gòu)域

<130>p110041

<150>新加坡專利申請?zhí)?0201407244p

<151>2014-11-05

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>180

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工修飾的抗體

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(56)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

<221>misc_feature

<222>(57)..(57)

<223>xaa是任何氨基酸（優(yōu)選地h）或d。

<220>

<221>misc_feature

<222>(72)..(101)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

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<221>misc_feature

<222>(120)..(120)

<223>xaa是a或v.

<220>

<221>misc_feature

<222>(138)..(138)

<223>xaa是s、v或g.

<220>

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<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<223>xaa是w或r。

<400>1

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180

<210>2

<211>180

<212>prt

<213>人工序列

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<223>人工修飾的抗體

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<222>(22)..(22)

<223>xaa是c或s.

<220>

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<222>(24)..(24)

<223>xaa是a、i或l.

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<222>(28)..(56)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<222>(57)..(57)

<223>xaa是任何氨基酸（優(yōu)選地h）或者是d。

<220>

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<222>(72)..(101)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<222>(120)..(120)

<223>xaa是a或v.

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<223>xaa是c或t.

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<222>(138)..(138)

<223>xaa是s、v或g.

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<222>(139)..(168)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<223>xaa是w或r.

<400>2

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151015

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202530

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180

<210>3

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工修飾的抗體

<220>

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<222>(1)..(1)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<222>(2)..(2)

<223>xaa是f、l、i或v.

<220>

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<222>(3)..(4)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<400>3

xaaxaaxaaxaathrxaaileasp

15

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<211>11

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<213>人工序列

<220>

<223>人工修飾的抗體

<220>

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<222>(3)..(3)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<222>(5)..(6)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<222>(10)..(10)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<400>4

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1510

<210>5

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<213>人工序列

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<223>人工修飾的抗體

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<221>misc_feature

<222>(2)..(7)

<223>xaa是任何氨基酸.

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<222>(8)..(21)

<223>xaa是任何氨基酸或不存在。

<220>

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<222>(22)..(22)

<223>xaa是a或g.

<220>

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<222>(23)..(23)

<223>xaa是m、f、l、i或v.

<400>5

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151015

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20

<210>6

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工修飾的抗體

<400>6

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151015

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115