基于特異結合黃曲霉毒素納米抗體的親和吸附材料的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術)的免疫親和吸附材料，特 別是針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料。 技術背景
[0002] 黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌產生的劇毒次級代謝產 物。它們的化學結構類似，為二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素仏（4?8 1)、B2 (AFBAGKAFGOjXAFGiWPMAFMO等。在天然污染的食品和飼料中，AFBi的污染最為常 見，其毒性和致癌性也最強，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。世界各國 及地區(qū)指定了嚴格的黃曲霉毒素限量標準，例如歐盟嬰幼兒食品中AFBi允許量<0.10yg/ kg〇
[0003] 現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法以及薄層層析法。其 中儀器分析法具有靈敏度高、準確性和重復性好等優(yōu)點，但是對于分析樣品前處理要求較 高，需要盡量去除樣品中的雜質以減少對后續(xù)檢測的干擾。傳統(tǒng)的前處理方法有液相萃取、 固相萃取等，處理過程繁瑣且特異性不高。親和層析技術基于配基與待測物質之間特異性 的識別，可通過一步操作實現(xiàn)對復雜混合樣品中待測物的分離純化。目前使用的黃曲霉毒 素親和純化介質一般采用多克隆抗體或單克隆抗體作為配基，存在不耐有機試劑、活性迅 速降低的問題。因此，需要開發(fā)活性高、穩(wěn)定性好的新型配基替換傳統(tǒng)抗體。單域重鏈抗體 是由羊駝重鏈抗體的可變區(qū)組成，又稱為納米抗體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特 性，相較于傳統(tǒng)抗體具有明顯的優(yōu)勢。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料及其應用。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0006] 針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料包括載體和配基，所述配基為單域重鏈抗 體，具有SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別黃曲霉毒素。
[0007] 所述配基還可以為在前述單域重鏈抗體基礎上通過隨機或定點突變技術進行改 造所獲得的能與黃曲霉毒素特異性結合的抗體。
[0008] 所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
[0009] 上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：
[00?0]所述載體為磁珠時，制備方法為:取lmg羧基磁珠于離心管中，加入500~1000μ1活 化緩沖液（10mM，NaH2P04，pH6.0)，禍旋混合均勾，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2 遍。分別加入1~5mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后，靜置30min。用 偶聯(lián)緩沖液（10mM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌磁珠3遍，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反 應2~6h，得到共價偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠；
[0011]所述載體為瓊脂糖凝膠微球時，制備方法為:將CNBr活化的干膠用0.1M HC1洗滌 10~15次，每次平衡5~lOmin。用偶聯(lián)緩沖液（10mM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌5~15次，加入抗 黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反應2~10h，得到共價偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體 的免疫親和吸附材料；
[0012] 所述載體為硅膠微球時，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液（PBS， 1 OmM，pH 6.0)交替洗滌5~10次，用roS緩沖液懸浮硅膠微球，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈 抗體，混勻，加入終濃度1~1 〇mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4°C攪拌反應12~24h，得 到共價偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
[0013] 將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填至層析柱，即 得到黃曲霉毒素免疫親和層析柱，方法為:根據層析柱容量，取適量上述免疫親和吸附材料 于層析柱，加入5~10倍柱床體積的PBS(1 OmM，pH 7.4)洗滌后，4°C，保存于20 %乙醇溶液。
[0014] 共價偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠無需裝柱，直接吸附后磁鐵分 離。
[0015] 本發(fā)明還涉及裝載有所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的親和層析柱。
[0016] 上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的應用，用所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料 對樣品提取液進行凈化，富集黃曲霉毒素以?81^?8 2^?61或4?62)。黃曲霉毒素免疫親和吸 附材料在去除黃曲霉毒素、凈化黃曲霉毒素污染物料中的應用。這種處理不以疾病診斷治 療為目的。當免疫吸附材料的載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球時，方法為:首先用純水清 洗免疫吸附材料，加入樣品提取液，然后用純水淋洗，再用甲醇洗脫特異性吸附的黃曲霉毒 素，收集的洗脫液，即為凈化和富集后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測。當載體為磁珠 時，方法為:將免疫磁珠加入純水中，磁力架回收磁珠，重復清洗3~5次，然后將免疫磁珠加 入樣品提取液中，混勻，磁力架回收磁珠，純水清洗1~3次后，甲醇洗脫特異性吸附的黃曲 霉毒素，收集的洗脫液，即為凈化和富集后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測。
[0017] 本發(fā)明針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識別黃曲霉毒素。該單域重鏈抗體容易獲得，可 以通過生物學方法大量培養(yǎng)生產配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產方法， 大大降低了生產成本。生產過程無需接觸黃曲霉毒素，避免了對生產人員身體傷害。具有耐 酸堿、耐高溫以及易于生產等特性，這些特性對于黃曲霉毒素的低成本、可重復使用的免疫 學檢測方法有重要的實用價值。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備及應用，對本發(fā)明做進一步說明， 這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應用范圍。
[0019] 實施例1:
[0020] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體（即針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)免疫文庫的構 建
[0021 ] 將黃曲霉毒素 Βι與匙孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)共價偶聯(lián)， 得到黃曲霉毒素人工抗原AFBi-KLH，取300yg AFBi-KLH與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝 (Lama pacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150yg AFBi-KLH與弗氏不完全佐劑乳 化，間隔2周進行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清效價 最尚的樣品分1?淋巴細胞，提取RNA。
[0022] RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板，oligo dT為引 物，參照TAKARA公司反轉錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
[0023] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因（采 用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA，反應條件為，98°C， 10s，55°C，20s，72°C，lmin，20 個循環(huán)，98°C，10s，68°C，lmin，72°C 延伸 lOmin。
[0024]將第一輪PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp~750bp的DNA片段，作為 第二輪 PCR的模板，分別用引物AlpVh-Sfil 和AlpVHHRl-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進行擴增，反應條件為，98°C，10s，50°C，20s，72°C，40s，5個循環(huán)，98°C，10s，68°C， 40s，30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。經DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20°C保存?zhèn)溆?。將?菌粒pHENl和PCR擴增產物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1:3摩 爾比，在16°C，過夜連接。
[0025]表1文庫構建及鑒定所用的引物
[0026]
[0027]
[0028] 注：卜劃線表不|很制性內切_識別序列
[0029]連接產物經乙醇沉淀后，溶于10此無菌水，分十次進行電穿孔轉化大腸桿菌TG1。 取10yL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨節(jié)青霉素2XYT培養(yǎng)板，37 °C，倒置培養(yǎng)12~ 16h，采用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR，計算庫容；其余部分全部涂布于24cm X 24cm氨 芐青霉素2 X YT培養(yǎng)板，37°C，倒置培養(yǎng)12~16h。用10mL，2 X YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮 洗后，加入終濃度15~30%甘油，分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 根據計算的庫容量結果，接種10倍庫容量的活細胞于20mL的2 XYT(含2 %葡萄糖， 100yg/mL氨芐青霉素），30°C，220r/min培養(yǎng)至0D600達0.5，按感染復數20:1加入輔助噬菌 體，37°C，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50mL的2 X YT (含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/ mL卡那霉素)重懸沉淀，30°C，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5 X PEG/NaCl溶 液，冰上放置lh或4°C過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10 %甘油的磷酸緩沖液 (PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫，取10yL測定滴度，其余 分裝于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 實施例2:
[0032] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的淘選與鑒定
[0033] 采用固相親和淘選的方法從實施例1所得抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫文 庫中淘選針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體。將AFB!與卵清白蛋白（albumin，0VA)共價偶聯(lián)， 得到人工抗原AFBi-OVA。每孔加入100yL用PBS稀釋的人工抗原AFBi-OVAdt，包被過夜，每 輪淘選的包被濃度分別為100，75，50yg/mL;吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300yL3 % BSA-PBS，37°C，封閉2h;PBS洗板6次，加入100yL噬菌體抗體文庫(約含2 X 10nCFU)，37°C，孵 育1.5h;吸出未結合的噬菌體，用PBST(含0.5 % Tween-20)洗板5次(逐輪增加5次），再用PBS 洗板10次(洗板次數逐輪增加5次）；以100yL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH2.2)洗脫吸附在酶標 孔中的噬菌體，用50yLTris-HCl(lm 〇l/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10yL用于滴度測定，其余 洗脫物擴增后用于下一輪淘選。第二輪和第三輪淘選采用競爭洗脫，分別用50和25ng/mL的 AFB!溶液在37°C，孵育lh。
[0034] 經三輪淘選后采用輔助噬菌體KM13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展示 抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA和間接競爭phage-ELISA測