相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2014年10月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/061,644、2015年7月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/198,673和2015年9月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/220,764的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，在此將每篇的全部?jī)?nèi)容按引用并入。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及結(jié)合腫瘤壞死因子受體超家族成員18/糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的tnfr-相關(guān)蛋白(“gitr”)的抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子，并且更特別地，刺激通過該受體的信號(hào)傳輸和/或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的激動(dòng)劑。發(fā)明背景糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的tnfr-相關(guān)蛋白(“gitr”)是腫瘤壞死因子超家族(tnfrsf)的成員，其包括超過20種的i型跨膜蛋白、幾個(gè)剪接變體和幾個(gè)病毒蛋白，所有都具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域作為共同的結(jié)構(gòu)特征。gitr的胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)由3個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(crd)組成，接著是跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)。在小鼠和人cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞上組成型地檢測(cè)到gitr表達(dá)，其在激活時(shí)被進(jìn)一步提高。相反，效應(yīng)cd4+cd25-t細(xì)胞和cd8+cd25-t細(xì)胞表達(dá)低至不可檢測(cè)水平的gitr，在t細(xì)胞受體激活后快速上調(diào)。在激活的nk細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上也已經(jīng)檢測(cè)到gitr的表達(dá)。已經(jīng)表明gitr下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路涉及mapk和標(biāo)準(zhǔn)nfκb通路。多種traf家族成員已經(jīng)被提示是gitr下游的信號(hào)傳導(dǎo)中間分子(nocentini等(2005)eur.j.immunol.，35:1016-1022)。據(jù)認(rèn)為，取決于細(xì)胞類型和微環(huán)境，通過gitr的細(xì)胞激活可以起到幾個(gè)作用，包括，但不限于，共同刺激以提高增殖和效應(yīng)子功能、抑制調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的遏制作用、和提供保護(hù)作用以對(duì)抗激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(shevach和stephens(2006)nat.rev.immunol.,6:613-618)。ko等((2005)j.exp.med.，202:885-891)首次證明了抗小鼠gitr的激動(dòng)劑單克隆抗體在小鼠同基因腫瘤模型中有效地誘導(dǎo)了腫瘤特異性免疫并根除了已建立的腫瘤。另外地和/或備選地，在一些臨床前模型中已經(jīng)證實(shí)，具有功能性fc效應(yīng)子活性的抗-mgitr可以在選擇的腫瘤環(huán)境中耗竭調(diào)節(jié)t細(xì)胞，以及增強(qiáng)t效應(yīng)細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。這些發(fā)明表明，mgitr的激動(dòng)劑抗體可以破壞免疫耐受平衡，其轉(zhuǎn)而允許t細(xì)胞對(duì)抗腫瘤和持續(xù)的病毒感染。然而，迄今為止的研究很大程度上聚焦于在嚙齒動(dòng)物系統(tǒng)中使用替代物抗體。由于小鼠和人gitr在結(jié)構(gòu)上的差異，小鼠中使用替代物研究獲得的發(fā)現(xiàn)是否可以翻譯成人gitr功能的改變是未知的。發(fā)明概述我們已經(jīng)鑒定特異性結(jié)合人糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體超家族成員18(“gitr”)的抗體，其中所述抗體在體外交聯(lián)時(shí)具有體外hgitr激動(dòng)劑活性，并且其中所述抗體賦予體內(nèi)hgitr活性并在腫瘤部位誘導(dǎo)升高的teff:treg比例，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的抑制。因此，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人gitr并通過靶向表達(dá)人gitr的細(xì)胞促進(jìn)胞內(nèi)信號(hào)傳輸和/或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的激動(dòng)劑抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人gitr的分離抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子，其中所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合表位，所述表位包含富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域1(“crd1”，seqidno:4：cgpgrlllgtgtdarccrvhttrccrdypgeeccsewdc)和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域2(“crd2”，seqidno:5：mcvqpefhcgdpccttcrhhpcppgqgvqsqgkfsfgfqc)，并且其中所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子是gitr的激動(dòng)劑，并且其中所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子任選具有完整或提高的fcr效應(yīng)子功能。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與人gitr的seqidno:88中包含的表位結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與結(jié)合人gitr的seqidno:88中的表位的抗體或抗體片段競(jìng)爭(zhēng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合人gitr的seqidno:88中的至少一個(gè)氨基酸殘基，例如，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合與人gitr的seqidno:88重疊的表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合人gitr的crd1(殘基34-72，seqidno:4)和殘基78中包含的表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與結(jié)合人gitr的crd1(殘基34-72，seqidno:4)和殘基78中的表位的抗體或抗體片段競(jìng)爭(zhēng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合人gitr的crd1(殘基34-72，seqidno:4)和殘基78內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，例如，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合與人gitr的crd1(殘基34-72，seqidno:4)和殘基78重疊的表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合seqidno:1并包含：(a)包含重鏈可變區(qū)的人重鏈，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22，和ii)重鏈cdr2包含選自seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26和seqidno:27任一個(gè)的序列，和iii)重鏈cdr3包含seqidno:29或seqidno:109；和(b)輕鏈可變區(qū)，其中i)輕鏈cdr1包含seqidno:30或seqidno:31，和ii)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和iii)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合seqidno:88并包含：(a)包含重鏈可變區(qū)的人重鏈，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22，和ii)重鏈cdr2包含選自seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26和seqidno:27任一個(gè)的序列，和iii)重鏈cdr3包含seqidno:29或seqidno:109；和(b)輕鏈可變區(qū)，其中i)輕鏈cdr1包含seqidno:30或seqidno:31，和ii)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和iii)輕鏈cdr3包含seqidno:34。關(guān)于所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的進(jìn)一步實(shí)施方案，在一些實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)與seqidno:16的可變區(qū)具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，而輕鏈可變區(qū)與seqidno:17具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在特定實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子包括包含seqidno:16的重鏈和包含seqidno:17的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與包括包含seqidno:16的重鏈和包含seqidno:17的輕鏈的抗體競(jìng)爭(zhēng)。在一些實(shí)施方案中，重鏈fr4是人種系fr4。在特定實(shí)施方案中，重鏈fr4是seqidno:42。在一些實(shí)施方案中，輕鏈fr4是人種系fr4。在特定實(shí)施方案中，輕鏈fr4是seqidno:50。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22或seqidno:84；ii)重鏈cdr2包含seqidno:28或seqidno:80；iii)重鏈cdr3包含seqidno:29或seqidno:109；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:30或seqidno:85；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33或seqidno:82，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34或seqidno:83。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22；ii)重鏈cdr2包含seqidno:23；iii)重鏈cdr3包含seqidno:29；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:30；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22；ii)重鏈cdr2包含seqidno:24；iii)重鏈cdr3包含seqidno:29；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:31；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22；ii)重鏈cdr2包含seqidno:25；iii)重鏈cdr3包含seqidno:29；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:30；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22；ii)重鏈cdr2包含seqidno:26；iii)重鏈cdr3包含seqidno:29；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:30；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22；ii)重鏈cdr2包含seqidno:27；iii)重鏈cdr3包含seqidno:29；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:30；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：i)重鏈cdr1包含seqidno:22；ii)重鏈cdr2包含seqidno:25；iii)重鏈cdr3包含seqidno:109；iv)輕鏈cdr1包含seqidno:30；v)輕鏈cdr2包含seqidno:33，和vi)輕鏈cdr3包含seqidno:34。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合gitr的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中：i)重鏈的cdr1包含選自seqidno:22、seqidno:79或seqidno:84的氨基酸序列；ii)重鏈的cdr2包含選自seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:62和seqidno:80的氨基酸序列；iii)重鏈的cdr3包含seqidno:29或seqidno:109；iv)輕鏈的cdr1包含選自seqidno:30、seqidno:31、seqidno:63、seqidno:81、seqidno:85和seqidno:86的氨基酸序列；v)輕鏈的cdr2包含選自seqidno:33、seqidno:64和seqidno:82的氨基酸序列；和輕鏈的cdr3包含seqidno:34或seqidno:83。在抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的其他實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)與選自seqidno:6、seqidno:8、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:99和seqidno:105的序列的可變區(qū)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，且輕鏈可變區(qū)與選自seqidno:9和seqidno:7的序列的可變區(qū)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在特定實(shí)施方案中，分離的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子包括包含seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:99和seqidno:105的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和包含seqidno:7或seqidno:9的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子包含seqidno:6的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和seqidno:7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包括包含seqidno:8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含seqidno:9的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包括包含seqidno:10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含seqidno:7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包括包含seqidno:12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含seqidno:7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包括包含seqidno:14的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含seqidno:7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。關(guān)于抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的進(jìn)一步實(shí)施方案，在一些實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno:99的可變區(qū)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，且輕鏈可變區(qū)與seqidno:7的可變區(qū)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包括包含seqidno:99的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含seqidno:7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。關(guān)于抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的進(jìn)一步實(shí)施方案，在一些實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno:105的可變區(qū)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，而輕鏈可變區(qū)與seqidno:7的可變區(qū)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包括包含seqidno:105的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含seqidno:7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合gitr的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子是人源化的。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段包含人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體片段是fab’片段。在一些實(shí)施方案中，抗體片段是單鏈抗體(scfv)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體片段是單域抗體或納米抗體(nanobody)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段與第二抗體或抗體片段交聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是糖基化的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子是igg。在某些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子包含igg同種型抗體fc區(qū)。在特定實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子包含igg1或igg2同種型抗體fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子是igg1或igg2抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子含有至少一個(gè)調(diào)節(jié)(即，提高或降低)抗體或抗體片段與fc受體的結(jié)合的突變。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子含有至少一個(gè)調(diào)節(jié)(即，提高或降低)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子激活fc受體的突變。在特定實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子含有至少一個(gè)提高抗體或抗體片段與fc受體結(jié)合的突變。在某些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子含有至少一個(gè)提高抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子激活fc受體的突變。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與人和非人靈長(zhǎng)類gitr交叉反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子不與嚙齒動(dòng)物gitr(例如，大鼠gitr或小鼠gitr)交叉反應(yīng)。在相關(guān)方面中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本文中所述的本發(fā)明的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸與選自seqidno:52、seqidno:54和seqidno:102的核酸序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸與選自seqidno:51、seqidno:53、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:101和seqidno:107的核酸序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸具有選自seqidno:52、seqidno:54和seqidno:102的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸具有選自seqidno:51、seqidno:53、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:101和seqidno:107的核酸序列。在相關(guān)方面中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子和藥物學(xué)上可接受的載體的組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于向個(gè)體施用的包含本發(fā)明的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含靶抗原，例如，癌癥相關(guān)抗原或腫瘤相關(guān)抗原。在一些實(shí)施方案中，靶抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生物抗原。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含ctla4的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含lag3的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含tim3的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含pd-1/pd-l1(例如，b7-h1或其類似物，pd-1抗體)相互作用的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含pd-1的拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含pd-l1的拮抗劑。在再一方面中，本發(fā)明還提供了包含如本文中所述的本發(fā)明的抗體或抗體片段的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于與抗體共施用的第二藥劑。在一些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是靶抗原，例如，癌癥相關(guān)的抗原或腫瘤相關(guān)的抗原。在一些實(shí)施方案中，所述靶抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或寄生物抗原。在一些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是ctla4的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是tim3的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是lag3的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是pd-1/pd-l1(例如，b7-h1或其類似物，pd-1抗體)相互作用的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是pd-1的拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是pd-l1的拮抗劑。任選，以混合物形式提供所述抗體或抗體片段和第二藥劑。任選，在分開制劑中提供所述抗抗體或抗體片段和第二藥劑。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了在有需要的個(gè)體中增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括將治療有效量的如本文中所述的本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段施用于個(gè)體。在再一方面中，本發(fā)明提供了用于個(gè)體中增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答的本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)個(gè)體中的t細(xì)胞應(yīng)答的包含本發(fā)明的抗體或抗體片段的組合物。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了在有需要的個(gè)體中治療表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括將治療有效量的如本文中所述的本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子施用于個(gè)體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于個(gè)體中治療癌癥的腫瘤生長(zhǎng)的本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于降低、抑制或防止個(gè)體中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的腫瘤生長(zhǎng)的、包含本發(fā)明的抗體或抗體片段的組合物。關(guān)于方法和醫(yī)藥用途的實(shí)施方案，在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與抗原共施用。在一些實(shí)施方案中，所述抗原是癌癥相關(guān)抗原或腫瘤相關(guān)抗原。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段與來自患者的癌細(xì)胞(即，自體癌細(xì)胞)共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與ctla4的拮抗劑共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與lag3的拮抗劑共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與tim3的拮抗劑共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與pd-1/pd-l1(例如，b7-h1)相互作用的抑制劑共施用。在某些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與pd-1的拮抗劑共施用。在某些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與pd-l1的拮抗劑共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與化療劑或細(xì)胞毒素共施用。在一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞應(yīng)答是cd8+細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)t細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞應(yīng)答是cd4+輔助t細(xì)胞(th)應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，患者患有表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥選自黑素瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)和乳癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥類型選自：胰腺癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌、食道癌、宮頸癌、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔或咽喉的癌癥、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(hnscc)、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤和血液組織的癌癥。在一些實(shí)施方案中，患者患有感染性疾病，例如，病毒感染、細(xì)菌感染、真菌抗原或寄生物抗原。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體與病毒抗原(例如，來自hcv、hsv或hiv)共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體與細(xì)菌抗原共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體與真菌抗原共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr激動(dòng)劑抗體與寄生物抗原(例如，絲蟲病)共施用。再在其他實(shí)施方案中，提供了用于治療中的分離抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子。在某些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，用于在有需要的個(gè)體中增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，用于有需要的個(gè)體中治療腫瘤生長(zhǎng)。定義“抗體”是指能夠非共價(jià)地、可逆地和特異性地結(jié)合相應(yīng)抗原的免疫球蛋白家族的多肽。示例性抗體結(jié)構(gòu)單位包括四聚體。每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一個(gè)“輕”鏈(約25kd)和一個(gè)“重”鏈(約50-70kd)，通過二硫鍵連接。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈歸類為κ或λ。重鏈歸類為γ、μ、α、δ或ε，其轉(zhuǎn)而分別限定免疫球蛋白類別，igg、igm、iga、igd和ige。本發(fā)明的抗體可以是任何同種型/類(例如，igg、igm、iga、igd和ige)，或任何亞類(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2)。每條鏈的n-端定義約100至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語可變輕鏈(vl)和可變重鏈(vh)分別是指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域。除了v區(qū)，重鏈和輕鏈都含有恒定(c)區(qū)或結(jié)構(gòu)域。分泌形式的免疫球蛋白c區(qū)由三個(gè)c結(jié)構(gòu)域ch1、ch2、ch3，任選ch4(cμ)和鉸鏈區(qū)構(gòu)成。膜結(jié)合形式的免疫球蛋白c區(qū)還具有膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在n-端具有vl，接著在其另一端是恒定結(jié)構(gòu)域(c)。vl與vh對(duì)齊，cl與重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R。vh和vl配對(duì)在一起形成單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。如本文中使用的“常規(guī)抗體”igg免疫球蛋白是指具有天然構(gòu)象的抗體。通常，常規(guī)抗體igg具有四條鏈，兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過二硫鍵連接在一起。如本文中使用的，“抗體”還包括具有特定結(jié)合特異性(即，對(duì)于gitr)的抗體和常規(guī)抗體結(jié)構(gòu)的變化形式。因此，對(duì)gitr具有特定結(jié)合特異性的全長(zhǎng)抗體、嵌合抗體和人源化抗體都在這個(gè)概念的范圍內(nèi)?？贵w可以作為完整的免疫球蛋白存在，或可以作為通過各種肽酶消化產(chǎn)生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中的二硫鍵下方消化抗體，產(chǎn)生f(ab’)2，即fab’的二聚體，其自身是通過二硫鍵連接的vh-ch1和輕鏈。f(ab’)2可以在溫和條件下還原，以斷開鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，由此將f(ab’)2二聚體轉(zhuǎn)化成fab’單體。fab’單體實(shí)質(zhì)上是具有部分鉸鏈區(qū)的fab。paul，fundamentalimmunology，第3版(1993)。盡管根據(jù)完整抗體的消化來定義各種抗體片段，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了這些片段可以通過化學(xué)方法或使用重組dna方法重頭合成。如本文中使用的，“抗體片段”是指抗體的一個(gè)或多個(gè)部分，可以通過完整抗體的修飾來產(chǎn)生，或使用重組dna方法重頭合成，其保留對(duì)gitr的結(jié)合特異性和激動(dòng)劑活性?？贵w片段的實(shí)例包括fv片段、單鏈抗體(scfv)、fab、fab’、fd(vh和ch1結(jié)構(gòu)域)、dab(vh和分離的cdr)；和這些片段的具有相同結(jié)合特異性的多聚體形式(例如，f(ab’)2)。還可以將抗體片段并入單域抗體、maxibodies、微抗體、二抗體(diabodies)、三抗體(tribodies)、四抗體(tetrabodies)、vnar、雙-scfv和其他抗體樣化合物變化形式中，以獲得本發(fā)明中提供的結(jié)合特異性和活性。本發(fā)明中使用的“fab”結(jié)構(gòu)域包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)ch1結(jié)構(gòu)域、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)cl結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的相互作用可以通過ch1和cl結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵穩(wěn)定。在一些實(shí)施方案中，fab的重鏈結(jié)構(gòu)域按順序從n-末端至c-末端為vh-ch，fab的輕鏈結(jié)構(gòu)域按順序從n-末端至c-末端為vl-cl。在一些實(shí)施方案中，fab的重鏈結(jié)構(gòu)域按順序從n-末端至c-末端為ch-vh，fab的輕鏈結(jié)構(gòu)域按順序?yàn)閏l-vl。盡管fab在歷史上通過完整免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化而獲得鑒定，但在本發(fā)明中，典型地可以通過任何方法重組地產(chǎn)生“fab”。就抗原結(jié)合而言，每個(gè)fab片段是單價(jià)的，即，其具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。免疫球蛋白重鏈的c-端部分，包含ch2和ch3結(jié)構(gòu)域，是“fc”結(jié)構(gòu)域。如本文中使用的“fc區(qū)”是指抗體的恒定區(qū)，不包括第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。fc是指iga、igd和igg的最后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，ige和igm的最后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及在這些結(jié)構(gòu)域的n-端的柔性鉸鏈。對(duì)于iga和igm，fc可以包括j鏈。對(duì)于igg，fc包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域cγ2和cγ3以及cγ1和cγ之間的鉸鏈。在本領(lǐng)域中，將理解fc區(qū)的邊界可以變化，然而，使用根據(jù)kabat等(1991，nihpublication91-3242，nationaltechnicalinformationservice，springfield，va.)中的eu索引進(jìn)行編號(hào)，通常人igg重鏈fc區(qū)被定義為包含殘基c226或p230至其羧基-末端?！癴c區(qū)”可以指分離的該區(qū)域或存在于抗體或抗體片段中的該區(qū)域。“fc區(qū)”包括fc區(qū)的天然等位基因變體(例如，在ch2和ch3區(qū)域中)、以及調(diào)節(jié)效應(yīng)子功能的修飾。fc區(qū)還包括不導(dǎo)致生物功能改變的變體。例如，可以從免疫球蛋白的fc區(qū)的n-末端或c-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而基本上不喪失生物功能。例如，在某些實(shí)施方案中，c-末端賴氨酸可以被修飾而替代或去除。在特定實(shí)施方案中，改變或去除fc區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)c-末端殘基。在某些實(shí)施方案中，缺失fc中的一個(gè)或多個(gè)c-末端殘基(例如，末端賴氨酸)。在某些其他實(shí)施方案中，fc中的一個(gè)或多個(gè)c-末端殘基被替換為其它氨基酸(例如，末端賴氨酸被置換)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則來選擇這樣的變體，以對(duì)活性具有最小的影響(參見，例如，bowie等，science247:306-1310，1990)。fc結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞受體(例如，fcr)所識(shí)別的ig的部分，并且補(bǔ)體激活蛋白c1q與其結(jié)合。在ch2外顯子的5’部分中編碼的下鉸鏈區(qū)提供了抗體內(nèi)用于結(jié)合fcr受體的靈活性。“互補(bǔ)性決定結(jié)構(gòu)域”或“互補(bǔ)決定區(qū)(“cdr”)可互換來指vl和vh的超變區(qū)。cdr是抗體鏈的靶蛋白結(jié)合部位，包含針對(duì)該靶蛋白的特異性。在每個(gè)人vl或vh中各有三個(gè)cdr(cdr1-3，從n-末端按序編號(hào))，占可變區(qū)的約15-20％。cdr在結(jié)構(gòu)上與靶蛋白的表位互補(bǔ)并且因此直接負(fù)責(zé)結(jié)合特異性。vl或vh的剩余鏈，稱為框架區(qū)，在氨基酸序列中呈現(xiàn)較少變化(kuby，immunology，第4版，第4章，w.h.freeman&co.，newyork，2000)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域各種公知的定義來確定cdr和框架區(qū)的位置，例如，kabat，chothia，國(guó)際immunogenetics數(shù)據(jù)庫(imgt)(在萬維網(wǎng)imgt.cines.fr/上)和abm(參見，例如，johnson等，nucleicacidsres.,29:205-206(2001)；chothia和lesk，j.mol.biol.，196:901-917(1987)；chothia等，nature,342:877-883(1989)；chothia等，j.mol.biol.，227:799-817(1992)；al-lazikani等，j.mol.biol.，273:927-748(1997))。以下也描述了抗原結(jié)合位點(diǎn)的定義：ruiz等，nucleicacidsres.,28:219–221(2000)；和lefranc,m.p.,nucleicacidsres.,29:207-209(2001)；maccallum等，j.mol.biol.,262:732-745(1996)；和martin等，proc.natl.acad.sci.usa,86:9268-9272(1989)；martin等，methodsenzymol.，203:121-153(1991)；和rees等，見sternbergm.j.e.(編輯)，proteinstructureprediction(蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè))，牛津大學(xué)出版社，oxford，141-172(1996)。根據(jù)kabat，vh中的cdr氨基酸殘基編號(hào)為31-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；vl中的cdr氨基酸殘基編號(hào)為24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。根據(jù)chothia，vh中的cdr氨基酸殘基編號(hào)為26-32(hcdr1)、52-56(hcdr2)和95-102(hcdr3)；vl中的cdr氨基酸殘基編號(hào)為26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。通過結(jié)合kabat和chothia的cdr定義，人vh中cdr由氨基酸殘基26-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)組成，人vl中cdr由氨基酸殘基24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)組成。術(shù)語“結(jié)合特異性決定簇”或“bsd”可互換來表示，確定抗體結(jié)合特異性所必需的、互補(bǔ)性決定結(jié)構(gòu)域中的最小連續(xù)或非連續(xù)氨基酸序列。最小結(jié)合特異性決定簇可以在一個(gè)或多個(gè)cdr序列內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，最小結(jié)合特異性決定簇位于抗體重鏈和輕鏈的cdr3序列的一部分或全長(zhǎng)中(即，僅由其決定)。如本文中使用的“抗體輕鏈”或“抗體重鏈”是指分別包含vl或vh的多肽。內(nèi)源性vl由基因區(qū)段v(可變)和j(連接)編碼，而內(nèi)源性vh由v、d(多樣性)和j編碼。每個(gè)vl或vh各包括cdr以及框架區(qū)。在本申請(qǐng)中，抗體輕鏈和/或抗體重鏈有時(shí)可以統(tǒng)稱為“抗體鏈”。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到的，這些術(shù)語涵蓋含有不破壞vl或vh基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的突變的抗體鏈。本文中使用的術(shù)語“價(jià)”是指多肽中的潛在靶結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)特異性地結(jié)合一個(gè)靶分子或靶分子上的一個(gè)特定位點(diǎn)。多肽包含一個(gè)以上靶結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)可以特異性地結(jié)合相同或不同的分子(例如，可以結(jié)合不同的分子，例如，不同的抗原，或同一分子上的不同表位)。例如，常規(guī)抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此是二價(jià)的?？贵w、抗原結(jié)合分子及其片段，可以是單價(jià)(即，結(jié)合一個(gè)靶分子)、二價(jià)或多價(jià)(即，結(jié)合一個(gè)以上靶分子)。對(duì)于單克隆或多克隆抗體的制備，可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)(參見，例如，kohler&milstein,nature256:495-497(1975)；kozbor等，immunologytoday4:72(1983)；cole等，monoclonalantibodiesandcancertherapy,pp.77-96.alanr.liss,inc.1985)。用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利no.4,946,778)可以經(jīng)調(diào)整以適用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體和多肽。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠，或其他生物體，如其他哺乳動(dòng)物，可以用于表達(dá)靈長(zhǎng)類化或人源化抗體?；蛘?，噬菌體展示技術(shù)可以用于鑒定特異性結(jié)合選定抗原的抗體和異聚fab片段(參見，例如，mccafferty等，上文；marks等，biotechnology,10:779-783，(1992))。用于靈長(zhǎng)類化或人源化非人抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。通常，靈長(zhǎng)類化或人源化抗體在其中引入來自非靈長(zhǎng)類或非人來源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非靈長(zhǎng)類或非人氨基酸殘基常常被稱為輸入殘基，其通常取自輸入可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可以按照winter和同事的方法來進(jìn)行(參見，例如，jones等，nature321:522-525(1986)；riechmann等，nature332:323-327(1988)；verhoeyen等，science239:1534-1536(1988)和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992))，其中用嚙齒動(dòng)物cdr或cdr序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利no.4,816,567)，其中來自非人物種的相應(yīng)序列已經(jīng)替代了實(shí)質(zhì)性少于完整的人可變結(jié)構(gòu)域。在實(shí)踐中，靈長(zhǎng)類化或人源化抗體通常是靈長(zhǎng)類或人抗體，其中一些互補(bǔ)性決定區(qū)(“cdr”)殘基和可能地一些框架(“fr”)殘基被來自來源物種(例如，嚙齒動(dòng)物抗體)中的類似位點(diǎn)的殘基替代，以賦予結(jié)合特異性。“嵌合抗體”是這樣的抗體：其中(a)恒定區(qū)，或其部分，被改變、替換、或交換，從而使抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接至類別、效應(yīng)子功能和/或物種不同或改變的恒定區(qū)、或連接至可以賦予嵌合抗體新特性的完全不同分子，例如，酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子和藥物；或(b)可變區(qū)，或其部分，被改變、替換或交換為具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)。本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合分子還可以包括在化學(xué)上與其他蛋白綴合、或作為與其他蛋白的融合蛋白表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白鏈。其還包括雙特異性抗體。雙特異或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜合抗體。本發(fā)明的其他抗原結(jié)合片段或抗體片段包括二價(jià)scfv(二抗體)、雙特異性scfv抗體(其中抗體分子識(shí)別兩個(gè)不同表位)、單結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dab)和微抗體。可以通過完整抗體的酶或化學(xué)修飾來產(chǎn)生本文中所述的各種抗體或抗原結(jié)合片段，或使用重組dna方法重頭合成(例如，單鏈fv)，或使用噬菌體展示文庫來鑒定(參見，例如，mccafferty等，nature348:552-554，1990)。例如，可以使用本領(lǐng)域中所述的方法來產(chǎn)生微抗體，例如，vaughan和sollazzo，combchemhighthroughputscreen.4:417-302001。可以通過各種方法，包括雜交瘤的融合或fab’片段的連接，來產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如，songsivilai&lachmann,clin.exp.immunol.79:315-321(1990)；kostelny等，j.immunol.148,1547-1553(1992)?？梢允褂檬删w展示文庫或核糖體展示文庫、基因改組文庫來鑒定單鏈抗體。可以從合成的、半合成的、或天然的、具有免疫活性(immunocompetent)的來源，構(gòu)建這樣的文庫。術(shù)語“抗原結(jié)合分子”或“非抗體配體”是指使用非免疫球蛋白蛋白支架的抗體模擬物，包括但不限于，adnectins、avimers、單鏈多肽結(jié)合分子和抗體樣結(jié)合肽模擬物。術(shù)語“可變區(qū)”或“v-區(qū)”可互換地表示包含fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的重鏈或輕鏈。內(nèi)源性可變區(qū)由免疫球蛋白重鏈v-d-j基因或輕鏈v-j基因編碼。v-區(qū)可以是天然的、重組或合成的。如本文中使用的，術(shù)語“可變區(qū)段”或“v-區(qū)段”可互換表示包括fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3的可變區(qū)的子序列。內(nèi)源性v-區(qū)段由免疫球蛋白v-基因編碼。v-區(qū)段可以是天然的、重組或合成的。如本文中使用的，術(shù)語“j-區(qū)段”是指包含cdr3的c-末端部分和fr4的編碼的可變區(qū)的子序列。內(nèi)源性j-區(qū)段由免疫球蛋白j基因編碼。j-區(qū)段可以是天然、重組或合成的?！叭嗽椿笨贵w是保留非人抗體的反應(yīng)性(例如，結(jié)合特異性、活性)同時(shí)在人體中具有較低免疫原性的抗體。例如，這可以通過保留非人cdr區(qū)并用人對(duì)應(yīng)物替代剩余的抗體部分來實(shí)現(xiàn)。參見，例如，morrison等，proc.natl.acad.sci.usa，81:6851-6855(1984)；morrison和oi，adv.immunol.，44:65-92(1988)；verhoeyen等，science，239:1534-1536(1988)；padlan,molec.immun.,28:489-498(1991)；padlan，molec.immun.,31(3):169-217(1994)。術(shù)語“相應(yīng)的人種系序列”是指這樣的核酸序列，所述核酸序列編碼的人可變區(qū)氨基酸序列或子序列，與人種系免疫球蛋白可變區(qū)序列編碼的所有其他已知可變區(qū)氨基酸序列相比，與參照可變區(qū)氨基酸序列或子序列具有最高的確定氨基酸序列同一性。相應(yīng)的人種系序列還可以指，與所有其他評(píng)價(jià)的可變區(qū)氨基酸序列相比，與參照可變區(qū)氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可變區(qū)氨基酸序列或子序列。相應(yīng)的人種系序列可以是僅僅框架區(qū)、僅僅互補(bǔ)決定區(qū)、框架和互補(bǔ)性決定區(qū)、可變區(qū)段(如上定義的)，或包含可變區(qū)的序列或子序列的其他組合。可以使用本文中描述的方法來確定序列同一性，例如，使用blast、align或本領(lǐng)域已知的其他比對(duì)算法來比對(duì)兩個(gè)序列。相應(yīng)的人種系核酸或氨基酸序列可以與參照可變區(qū)核酸或氨基酸序列具有至少約90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性?？梢酝ㄟ^公眾可利用的國(guó)際immunogenetics數(shù)據(jù)庫(imgt)(在萬維網(wǎng)imgt.cines.fr/上)和v-數(shù)據(jù)庫(在萬維網(wǎng)vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上)，確定相應(yīng)的人種系序列。短語“特異性結(jié)合”或“選擇性結(jié)合”，用于描述抗原(如，蛋白)與抗體、抗體片段或抗體衍生的結(jié)合劑之間的相互作用時(shí)，是指決定異質(zhì)蛋白群體和其他生物制劑中抗原存在的結(jié)合反應(yīng)，所述其他生物制劑例如為生物樣品，例如，血液、血清、血漿或組織樣品。因此，在一定的指定免疫試驗(yàn)條件下，具有特定結(jié)合特異性的抗體或結(jié)合劑，與特定抗原的結(jié)合至少兩倍于背景，并且基本上不以顯著量結(jié)合樣品中存在的其他抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，具有特定結(jié)合特異性的抗體或結(jié)合劑，與特定抗原的結(jié)合至少十(10)倍于背景，并且基本上不以顯著量結(jié)合樣品中存在的其他抗原。在如此條件下與抗體或結(jié)合劑的特異性結(jié)合可能需要抗體或結(jié)合劑已經(jīng)針對(duì)其對(duì)特定蛋白(例如，人gitr)的特異性進(jìn)行過選擇。如本文中使用的，特異性結(jié)合包括選擇性結(jié)合人gitr的抗體片段和結(jié)合分子，并且不包括與例如鼠gitr分子或其他tnf受體超家族成員交叉反應(yīng)的抗體。在一些實(shí)施方案中，選擇與非人靈長(zhǎng)類gitr(例如，獼猴gitr)交叉反應(yīng)的抗體或抗體片段。各種免疫試驗(yàn)形式可以用于選擇與特定蛋白具有特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相elisa免疫試驗(yàn)常規(guī)用于選擇與蛋白具有特異性免疫反應(yīng)的抗體(對(duì)于可以用于確定特定的免疫反應(yīng)性的免疫試驗(yàn)形式和條件的描述，參見，例如，harlow&lane,usingantibodies,alaboratorymanual(1998))。通常，特異性或選擇性結(jié)合反應(yīng)將產(chǎn)生超過背景信號(hào)至少兩倍的信號(hào)，并且更常見地，超過背景至少10至100倍。術(shù)語“平衡解離常數(shù)(kd，m)”是指解離速率常數(shù)(kd，時(shí)間-1)除以結(jié)合速率常數(shù)(ka，時(shí)間-1，m-1)。可以使用本領(lǐng)域任何已知方法來測(cè)量平衡解離常數(shù)。本發(fā)明的抗體通常將具有小于約10-7或10-8m的平衡解離常數(shù)，例如，小于約10-9m或10-10m，在一些實(shí)施方案中，小于約10-11m、10-12m或10-13m。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段以約1nm或更小的平衡解離常數(shù)(kd)結(jié)合人gitr。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段以小于1nm的kd結(jié)合人gitr。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段以約0.5nm至約1.0nm范圍的kd結(jié)合人gitr。如本文中使用的，術(shù)語“抗原結(jié)合區(qū)”是指，本發(fā)明的gitr-結(jié)合分子中負(fù)責(zé)分子和gitr之間的特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合區(qū)包括至少一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)和至少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的每個(gè)gitr-結(jié)合分子中存在至少一個(gè)這樣的抗原結(jié)合區(qū)，并且每個(gè)抗原結(jié)合區(qū)可以彼此相同或不同。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明gitr-結(jié)合分子的抗原結(jié)合區(qū)中的至少一個(gè)作為gitr的激動(dòng)劑起作用。術(shù)語“抗體激動(dòng)劑”或“激動(dòng)劑”可互換表示，能夠激活受體以誘導(dǎo)全部或部分受體介導(dǎo)的應(yīng)答的抗體。例如，gitr的激動(dòng)劑結(jié)合gitr并且誘導(dǎo)gitr介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳輸(例如，提高的nf-κb表達(dá)激活)?？贵w激動(dòng)劑，與天然配體gitr-l相似，刺激通過gitr的信號(hào)傳輸。通過iκb的降解，gitr-l與gitr的結(jié)合誘導(dǎo)nfκb激活。在一些實(shí)施方案中，gitr抗體激動(dòng)劑可以通過其結(jié)合gitr并誘導(dǎo)t細(xì)胞(例如，cd8+ctl或cd4+th細(xì)胞)增殖、存活、細(xì)胞溶解活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生(ifnγ、il-10、il-13、tnfα)的能力，或按照本文中另外描述的，來鑒定。術(shù)語“gitr”或“糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體”或“腫瘤壞死因子受體超家族成員18”或“tnfrsf18”)可互換表示，作為tnf-受體超家族成員的i型跨膜蛋白。gitr以高水平在cd4+cd25+上以及在激活的效應(yīng)cd4+和cd8+t細(xì)胞上表達(dá)。gitr的核酸和氨基酸序列是已知的，并且已經(jīng)公開于genbankaccessionnos.nm_004195.2→np_004186.1(同種型1前體)，seqidno:1：nm_148901.1→np_683699.1(同種型2前體)，seqidno:2:和nm_148902.1→np_683700.1(同種型3前體)，seqidno:3:還可以參見，genbankaccessionno.nm_005092→np_005083.2。結(jié)構(gòu)上，gitr氨基酸序列是tnf-受體超家族成員的i型跨膜蛋白，其具有信號(hào)肽、包含三個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(crd)的胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)，并且在其全長(zhǎng)上與genbank登錄號(hào)np_004186.1(seqidno:1)、np_683699.1(seqidno:2)、np_683700.1(seqidno:3)或np_005083.2的氨基酸序列具有至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在結(jié)構(gòu)上，gitr核酸序列在其全長(zhǎng)上與genbank登錄號(hào)nm_004195.2,nm_148901.1、nm_148902.1、nm_005092或seqidnos:1-4的核酸序列具有至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在功能上，嚙齒動(dòng)物gitr的激動(dòng)可以至少暫時(shí)地抑制cd25+調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)的遏制劑活性。gitr的激動(dòng)還可以增強(qiáng)免疫活性，例如，激活的效應(yīng)cd4+和cd8+t細(xì)胞的增殖、存活、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞溶解活性。參見，例如，nocentini等，eurjimmunol(2007)37:1165-1169；expertopintherpatents(2007)17(5):567-757；shevach和stephens，naturereviewsimmunology(2006)6:613-618。本發(fā)明多肽的“活性”是指，多肽在其天然細(xì)胞或組織中的結(jié)構(gòu)的、調(diào)控的或生物化學(xué)的功能。多肽活性的實(shí)例包括直接活性和間接活性。gitr激動(dòng)的示例性活性包括胞內(nèi)信號(hào)傳輸，其導(dǎo)致提高的nf-κb激活，增加的激活的效應(yīng)cd4+和cd8+t細(xì)胞的增殖、存活、細(xì)胞因子產(chǎn)生(例如，ifnγ、il-10、il-13、tnfα)和細(xì)胞溶解活性。在治療上，gitr的激活可以增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤和抗病毒t-細(xì)胞應(yīng)答。應(yīng)用于核酸或蛋白時(shí)，術(shù)語“分離的”表示，核酸或蛋白基本上不含天然狀態(tài)下與其結(jié)合的其他細(xì)胞組分。優(yōu)選是均質(zhì)狀態(tài)的。其可以是干的或水溶液。通常使用分析化學(xué)技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜，來測(cè)定純度和均質(zhì)性。作為制備物中的主要物質(zhì)存在的蛋白是基本上純化的。特別地，分離的基因與位于該基因兩側(cè)并且編碼目標(biāo)基因以外的其他蛋白的開放閱讀框分開。術(shù)語“純化的”表示，核酸或蛋白在電泳凝膠上基本上只產(chǎn)生一個(gè)條帶。特別地，其表示核酸或蛋白為至少85％純，更優(yōu)選至少95％純和最優(yōu)選至少99％純。術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其單-或雙-鏈形式的聚合物。除非另外指出，該術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其與參照核酸具有相似的結(jié)合特性并且以類似于天然核苷酸的方式代謝。除非另外指出，否則一個(gè)具體核酸序列還隱含地包括其保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換)、等位基因、直系同源物、snp和互補(bǔ)序列以及明確指示的序列。具體地，可以通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選定的(或全部)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列，來實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子置換(batzer等，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等，mol.cell.probes8:91-98(1994))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換表示氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及適用于天然的氨基酸聚合物和非天然的氨基酸聚合物。術(shù)語“氨基酸”是指，天然的和合成的氨基酸，以及以天然氨基酸相似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸、以及之后修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，結(jié)合氫、羧基基團(tuán)、氨基基團(tuán)和r基團(tuán)的α-碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的r基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留與天然氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指，結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)但以天然氨基酸相似的方式起作用的化學(xué)化合物?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”對(duì)氨基酸和核酸序列都適用。關(guān)于特定的核酸序列，保守修飾的變體是指，編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不編碼氨基酸序列的情況下，指基本上相同的序列。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，任何給定的蛋白都可以由多個(gè)功能上相同的核酸編碼。例如，密碼子gca、gcc、gcg和gcu全部編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每個(gè)被密碼子規(guī)定為丙氨酸的位置，可以將該密碼子改變成所述任何相應(yīng)密碼子，而不改變編碼的多肽。這樣的核酸變體是“沉默變體”，其是保守修飾變體的一種。本文中編碼多肽的每個(gè)核酸序列還描述核酸的每個(gè)可能的沉默變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核酸中的每個(gè)密碼子(除了aug，其通常是編碼甲硫氨酸的唯一密碼子，和tgg，其通常是編碼色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，在描述的每個(gè)序列中都隱含了編碼多肽的核酸的每個(gè)沉默變體。關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，“保守修飾變體”是對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行的置換、刪除或添加，從而在編碼的序列中改變、添加或刪除單個(gè)氨基酸或小比例的氨基酸，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸置換。提供功能上相似氨基酸的保守性置換表是本領(lǐng)域公知的。這樣的保守性修飾變體是本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源物和等位基因以外的變體，并且不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源物和等位基因。以下八組各自含有互為保守性置換的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、賴氨酸(k)；5)異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、纈氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(參見，例如，creighton,proteins(1984))。通過在比較窗口比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來確定“序列同一性百分比”，其中為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，與不包含添加或刪除的參照序列(例如，本發(fā)明的多肽)相比，比較窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或刪除(即，缺口)。該百分比通過如下計(jì)算：確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)量來產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，以匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100來產(chǎn)生序列同一性百分比。與兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列相關(guān)的術(shù)語“相同”或百分比“同一性”是指，兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列是相同序列。當(dāng)使用以下序列比較算法之一或通過人工比對(duì)和目視觀察測(cè)量、在比較窗口或指定區(qū)域中為最大對(duì)應(yīng)性而進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，如果兩個(gè)序列具有規(guī)定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在指定的區(qū)域中，或在沒有指定時(shí)，在參照序列的整個(gè)序列上，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，則兩個(gè)序列是“基本上相同的”。本發(fā)明提供，分別與本文中示例的多肽或多核苷酸(例如，seqidno:6-10、12、14、59和61任一個(gè)中示例的可變區(qū)；seqidno:16-17任一個(gè)中示例的可變區(qū)段；seqidno:22-34任一個(gè)中示例的cdr；seqidno:35-50任一個(gè)中示例的fr；和seqidno:51-58和60任一個(gè)中示例的核酸序列)基本上相同的多肽或多核苷酸。任選，同一性存在于至少約15、25或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的區(qū)域上，或更優(yōu)選存在于100至500或1000個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)的區(qū)域上，或全長(zhǎng)參照序列上。關(guān)于氨基酸序列，同一性或?qū)嵸|(zhì)上的同一性可以存在于至少5、10、15或20個(gè)氨基酸長(zhǎng)，任選至少約25、30、35、40、50、75或100個(gè)氨基酸長(zhǎng)，任選至少約150、200或250個(gè)氨基酸長(zhǎng)的區(qū)域上，或全長(zhǎng)參照序列上。對(duì)于較短的氨基酸序列，例如，20或更少氨基酸的氨基酸序列，當(dāng)一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基根據(jù)本文中定義的保守性置換被保守性置換時(shí)，存在實(shí)質(zhì)上的同一性。對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列作為參照序列，測(cè)試序列與其進(jìn)行比較。使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參照序列輸入計(jì)算機(jī)中，如果需要，隨后指定子序列的坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)。可以使用缺省程序參數(shù)，或可以指定替換的參數(shù)。基于程序參數(shù)，序列比較算法隨后計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參照序列的百分比序列同一性。如本文中使用的，“比較窗口”包括，具有選自20至600，通常約50至約200，更常見約100至約150的任何連續(xù)位置數(shù)的區(qū)段，在所述窗口中序列可以與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參照序列在兩個(gè)序列最佳比對(duì)后進(jìn)行比較。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可以通過smith和waterman(1970)adv.appl.math.2:482c的局部同源性算法，通過needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443的同源性比對(duì)算法，通過pearson和lipman(1988)proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444的相似性搜索方法，通過這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(wisconsingenetics軟件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi)，或通過人工比對(duì)和目視觀察(參見，例如，ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(1995年增補(bǔ))，進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。適用于確定百分比序列同一性和序列相似性的兩個(gè)算法實(shí)例是blast和blast2.0算法，其分別描述于altschul等(1977)，nuc.acidsres.25:3389-3402和altschul等(1990)，j.mol.biol.215:403-410。用于進(jìn)行blast分析的軟件可以通過nationalcenterforbiotechnologyinformation公開獲得。該算法涉及：首先通過鑒定查詢序列中字長(zhǎng)w的短字來鑒定高得分序列對(duì)(hsp)，其中所述短字與數(shù)據(jù)庫序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)匹配或滿足一定的正值閾值分?jǐn)?shù)t。t被稱為相鄰字得分閾值(altschul等，上引文)。這些初始的相鄰字命中物作為種子用于啟動(dòng)搜索，以發(fā)現(xiàn)含有它們的較長(zhǎng)hsp。字命中物沿著每個(gè)序列在兩個(gè)方向延伸，只要累積比對(duì)得分可以增加即可。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)m(給予一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是>0)和n(給予錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)，計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序列，使用評(píng)分矩陣來計(jì)算累積得分。當(dāng)：累積比對(duì)得分從其最大獲得值下降數(shù)量x；由于累積一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)，累積得分變?yōu)榱慊虻陀诹悖换蜻_(dá)到任一個(gè)序列的末端時(shí)，停止字命中物在各方向上的延伸。blast算法參數(shù)w、t和x決定了比對(duì)的靈敏度和速度。blastn程序(對(duì)于核苷酸序列)以11的字長(zhǎng)(w)、10的期望值(e)、m＝5、n＝-4和雙鏈比較作為缺省值。對(duì)于氨基酸序列，blastp參數(shù)使用3的字長(zhǎng)和10的期望值(e)以及blosum62評(píng)分矩陣(參見henikoff和henikoff(1989)，proc.natl.acad.sci.usa89:10915)，50的比對(duì)(b)、10的期望值(e)、m＝5、n＝-4和雙鏈比較，作為缺省值。blast算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如，karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787)。一種由blast算法提供的相似性量度是最小和概率(p(n))，其指示兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間碰巧發(fā)生匹配的概率。例如，如果測(cè)試核酸與參照核酸比較中的最小和概率為小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01和最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為核酸與參照序列相似。兩個(gè)核酸序列或多肽基本上相同的一個(gè)指示是，由第一個(gè)核酸編碼的多肽與針對(duì)第二個(gè)核酸編碼的多肽產(chǎn)生的抗體具有免疫上的交叉反應(yīng)，如下文所述。因此，例如，當(dāng)多肽與第二多肽的差異僅在于保守性置換時(shí)，兩個(gè)肽通?；旧舷嗤?。兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一個(gè)指示是，兩個(gè)分子或其互補(bǔ)物在嚴(yán)格條件下彼此雜交，如下文所述。兩個(gè)核苷酸序列基本上相同的再一個(gè)指示是，可以使用相同引物來擴(kuò)增該序列。在描述抗原結(jié)合區(qū)如何在本發(fā)明的gitr-結(jié)合分子中連接的上下文中使用的術(shù)語“連接”，涵蓋用于物理連接這些區(qū)域的所有可能方式。多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)常?？梢酝ㄟ^化學(xué)鍵連接，如共價(jià)鍵(例如，肽鍵或二硫鍵)或非共價(jià)鍵，其可以是直接的鍵(即，在兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)之間沒有銜接物)或間接的鍵(即，在兩個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)之間借助至少一個(gè)銜接物分子的連接)。術(shù)語“受試者”、“患者”和“個(gè)體”可互換表示哺乳動(dòng)物，例如，人或非人靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物也可以是實(shí)驗(yàn)室哺乳動(dòng)物，例如，小鼠、大鼠、兔子、倉(cāng)鼠。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物可以是農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物(例如，馬、綿羊、牛、豬、駱駝)或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物(例如，犬、貓)。如本文中使用的，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于任何疾病或病癥，術(shù)語“治療(treat)”、“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指減輕疾病或病癥(即，減緩或停止或減少疾病的發(fā)展或其至少一個(gè)臨床癥狀)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療(treat)”、“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指緩解或減輕至少一個(gè)身體參數(shù)，包括患者不可辨別的那些參數(shù)。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療(treat)”、“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指在身體上(例如，可辨別的癥狀的穩(wěn)定)、生理上(例如，身體參數(shù)的穩(wěn)定)，或兩者上調(diào)節(jié)疾病或病癥。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療(treat)”、“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指防止或延遲疾病或病癥的發(fā)作或發(fā)展或進(jìn)展。術(shù)語“治療上可接受的量”或“治療有效劑量”可互換表示足以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果(即，減小腫瘤的大小，抑制腫瘤生長(zhǎng)，防止轉(zhuǎn)移，抑制或防止病毒、細(xì)菌、真菌或寄生物感染)的量。在一些實(shí)施方案中，治療上可接受的量不誘導(dǎo)或?qū)е虏幌胍母弊饔??？梢酝ㄟ^首先施用低劑量，并且隨后逐漸遞增劑量直至實(shí)現(xiàn)所需效果，來確定治療上可接受的量。本發(fā)明的gitr激動(dòng)抗體的“預(yù)防有效劑量”和“治療有效劑量”可以分別防止疾病癥狀的發(fā)作或?qū)е录膊“Y狀嚴(yán)重性的降低，所述疾病癥狀包括與癌癥或感染性疾病相關(guān)的癥狀。術(shù)語“共施用”是指兩種活性劑同時(shí)存在于個(gè)體的血液中。共施用的活性劑可以同時(shí)或相繼遞送。如本文中使用的，短語“基本上由……組成”是指，包括在方法或組合物中的上位或下位概念的活性藥劑、以及用于方法或組合物的預(yù)期目的的任何無活性載體或賦形劑。在一些實(shí)施方案中，短語“基本上由……組成”明確排除包含除本發(fā)明激動(dòng)劑抗-gitr抗體以外的一種或多種其他的活性劑。在一些實(shí)施方案中，短語“基本上由……組成”明確排除包含除本發(fā)明激動(dòng)劑抗-gitr抗體和第二共施用藥劑之外的一種或多種其他活性劑。術(shù)語“癌相關(guān)抗原”或“腫瘤相關(guān)抗原”或“腫瘤特異性標(biāo)志物”或“腫瘤標(biāo)志物”可互換表示，與正常細(xì)胞相比，優(yōu)先在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的分子(典型地蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì))，其可用于將藥劑優(yōu)先靶向癌細(xì)胞。一些方案中，癌相關(guān)抗原是與正常細(xì)胞相比在癌細(xì)胞中超表達(dá)的細(xì)胞表面分子，例如，與正常細(xì)胞相比，1倍超表達(dá)、2倍超表達(dá)、3倍超表達(dá)或更高。一些方案中，癌相關(guān)抗原是在癌細(xì)胞中不適當(dāng)?shù)睾铣傻募?xì)胞表面分子，例如，與正常細(xì)胞上表達(dá)的分子相比，含有缺失、添加或突變的分子。一些方案中，癌相關(guān)抗原僅在癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)并且不在正常細(xì)胞的表面上合成或表達(dá)。示例的細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物包括，乳癌的蛋白c-erbb2和人表皮生長(zhǎng)因子受體(her)，前列腺癌的psma，和各種癌癥(包括乳癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌)中的碳水化合物粘蛋白。如本文中使用的，關(guān)于抗原結(jié)合部分(例如，fab)，當(dāng)一個(gè)部分存在超過一個(gè)時(shí)，為了方便區(qū)分，使用術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”和“第四”。除非另外指出，否則使用這些術(shù)語不旨在賦予抗體特定的順序或方向。術(shù)語“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非文中明確另外指出。激動(dòng)劑抗-gitr抗體本發(fā)明提供了結(jié)合gitr并刺激通過gitr的信號(hào)傳輸和/或誘導(dǎo)增強(qiáng)的體內(nèi)免疫應(yīng)答的抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子。該抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子可以用于增強(qiáng)對(duì)抗靶抗原的cd4+t輔助細(xì)胞(th)和/或cd8+細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)應(yīng)答。它們還可以用于治療其增殖可以通過有效的免疫應(yīng)答逆轉(zhuǎn)或抑制的疾病狀況(包括癌癥和感染性疾病)。本發(fā)明的抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子顯示出用于人患者中的合適特性，例如，它們具有與人用免疫原性問題相關(guān)的低風(fēng)險(xiǎn)(除了結(jié)合特異性決定區(qū)(bsd)，特別是至少cdr3外，它們由人種系核酸序列編碼)；對(duì)gitr具有高親和性(例如，kd至少小于5nm)；與tnfr超家族的其他成員沒有交叉反應(yīng)；與人和非人靈長(zhǎng)類gitr交叉反應(yīng)；以及在低劑量下(例如，在體外試驗(yàn)中，在低于5nm的濃度)激活gitr信號(hào)傳輸。在整個(gè)說明書中還闡明了其他活性和特征。因此，本發(fā)明提供了作為gitr激動(dòng)劑的抗體、抗體片段和抗原結(jié)合分子。提供的抗體-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子含有源自來源或參照單克隆抗體(例如，以下表1和2中所述的抗體)的重鏈和輕鏈的cdr3中的最小結(jié)合序列決定簇(bsd)。重鏈和輕鏈可變區(qū)(vdr和fr)的剩余序列，例如，v-區(qū)段和j-區(qū)段，來自相應(yīng)的人種系和親和力成熟的氨基酸序列。v-區(qū)段可以選自人v-區(qū)段文庫?？梢酝ㄟ^親和力成熟或本領(lǐng)域已知的其他方法，進(jìn)行進(jìn)一步的序列精化，以優(yōu)化本發(fā)明的抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的結(jié)合活性或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗體片段的重鏈和輕鏈含有來自相應(yīng)的人種系序列的人v-區(qū)段(fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3)，例如，選自人v-區(qū)段文庫，和來自來源單克隆抗體(例如，表1和表2中所述的抗體)的cdr3-fr4序列區(qū)段。cdr3-fr4序列區(qū)段可以通過用相應(yīng)的人種系序列替代序列區(qū)段和/或通過親和力成熟來進(jìn)一步精化。例如，圍繞bsd的fr4和/或cdr3序列可以用相應(yīng)的人種系序列替代，而保留來自來源單克隆抗體的cdr3的bsd。在一些實(shí)施方案中，用于重鏈v-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列是vh33-13/30：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavirydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak(seqidno：89).在一個(gè)實(shí)施方案中，seqidno：89中的最后一個(gè)氨基酸，賴氨酸(“k”)，用精氨酸(“r”)替代。在一些實(shí)施方案中，用于重鏈j-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列是jh4。在一些實(shí)施方案中，重鏈j-區(qū)段包含人種系jh4部分序列wgqgtlvtvss(seqidno：90)。來自人種系jh4的全長(zhǎng)j-區(qū)段是yfdywgqgtlvtvss(seqidno：91)。對(duì)于免疫球蛋白可變區(qū)基因，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)命名來提及可變區(qū)基因。目前的免疫球蛋白基因信息可以通過萬維網(wǎng)獲得，例如，immunogenetics(imgt)、v-數(shù)據(jù)庫和pubmed數(shù)據(jù)庫。還可以參見，lefranc，expclinimmunogenet.2001；18(2)：100-16；lefranc，expclinimmunogenet.2001；18(3)：161-74；expclinimmunogenet.2001；18(4)：242-54；和giudicelli等，nucleicacidsres.2005年1月1日；33(數(shù)據(jù)庫專輯)：d256-61在一些實(shí)施方案中，用于輕鏈v-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列為vkiiil16/a27：eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsvssnlawyqqkpgqaprlliygastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygssp(seqidno：92).在一些實(shí)施方案中，用于輕鏈j-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列為jk2。在一些實(shí)施方案中，輕鏈j-區(qū)段包含人種系jk2部分序列fgqgtkleik(seqidno：93)。來自人種系jk2的全長(zhǎng)j區(qū)段為ytfgqgtkleik(seqidno：94)。在一些實(shí)施方案中，重鏈v-區(qū)段與氨基酸序列(e/q)vqlvesggglvq(p/s)ggslrlscaasgfslssygvdwvrqapgkglew(l/v)gviwggggtyy(a/t)(a/s)s(l/v)m(a/g)rftisrdnskntlylqmnslraedtavyyca(k/r)(h/n)ayghdggfamdywgqgtlvtvss(seqidno：16).具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些實(shí)施方案中，輕鏈v-區(qū)段與氨基酸序列eivmtqspatlsvspgeratlscras(e/q)svssn(l/v)awyqq(k/r)pgqaprlliygasnratgip(d/a)rfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycgqsysypftfgqgtkleik(seqidno：17).具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些實(shí)施方案中，i)重鏈cdr3包含氨基酸序列hayghdggfamdy(seqidno：29)或nayghdggfamdy(seqidno：109)；和ii)輕鏈cdr3可變區(qū)包含氨基酸序列g(shù)qsysypft(seqidno:34)或sysypf(seqidno:83)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列sygvd(seqidno:22)或gfslssy(seqidno:84)的cdr1；包含氨基酸序列viwggggtyy(a/t)(a/s)s(l/v)m(a/g)(seqidno:28)或wgggg(seqidno:80)的cdr2；和包含氨基酸序列hayghdggfamdy(seqidno:29)或nayghdggfamdy(seqidno:109)的cdr3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含輕鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列ras(e/q)svssn(l/v)a(seqidno:32)或s(e/q)svssn(seqidno:87)的cdr1；包含氨基酸序列g(shù)asnrat(seqidno:33)或gas(seqidno:82)的cdr2；和包含氨基酸序列g(shù)qsysypft(seqidno:34)或sysypf(seqidno:83)的cdr3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列sygvd(seqidno:22)或gfslssy(seqidno:84)的cdr1；包含氨基酸序列viwggggtyy(a/t)(a/s)s(l/v)m(a/g)(seqidno:28)或wgggg(seqidno:80)的cdr2；和包含氨基酸序列hayghdggfamdy(seqidno:29)或nayghdggfamdy(seqidno:109)的cdr3。該抗體或抗體片段可以進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列ras(e/q)svssn(l/v)a(seqidno:32)或s(e/q)svssn(seqidno:87)的cdr1；包含氨基酸序列g(shù)asnrat(seqidno:33)或gas(seqidno:82)的cdr2；和包含氨基酸序列g(shù)qsysypft(seqidno:34)或sysypf(seqidno:83)的cdr3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列sygvd(seqidno:22)或gfslrsy(seqidno:79)的cdr1；包含氨基酸序列viwggggtnynsalma(seqidno:62)或wgggg(seqidno:80)的cdr2；和包含氨基酸序列hayghdggfamdy(seqidno:29)或nayghdggfamdy(seqidno:109)的cdr3。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是人源化的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含輕鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列kasenvdtfvs(seqidno:63)或senvdtf(seqidno:81)的cdr1；包含氨基酸序列g(shù)asnryt(seqidno:64)或gas(seqidno:82)的cdr2；和包含氨基酸序列g(shù)qsysypft(seqidno:34)或sysypf(seqidno:83)的cdr3。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是人源化的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列sygvd(seqidno:22)或gfslrsy(seqidno:79)的cdr1；包含氨基酸序列viwggggtnynsalma(seqidno:62)或wgggg(seqidno:80)的cdr2；和包含氨基酸序列hayghdggfamdy(seqidno:29)或nayghdggfamdy(seqidno:109)的cdr3。這樣的抗體或抗體片段可以進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)，其包括：包含氨基酸序列kasenvdtfvs(seqidno:63)或senvdtf(seqidno:81)的cdr1；包含氨基酸序列g(shù)asnryt(seqidno:64)或gas(seqidno:82)的cdr2；和包含氨基酸序列g(shù)qsysypft(seqidno:34)或sysypf(seqidno:83)的cdr3。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是人源化的。在一些實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)包括包含氨基酸序列(e/q)vqlvesggglvq(p/s)ggslrlscaasgfsls(seqidno:37)的fr1；包含氨基酸序列wvrqapgkglew(l/v)g(seqidno:40)的fr2；包含氨基酸序列rftisrdnskntlylqmnslraedtavyyca(k/r)(seqidno:41)的fr3；和包含氨基酸序列wgqgtlvtvss(seqidno:42)的fr4。在一些實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)包括：包含選自qvqlvesggglvqpggslrlscaasgfsls(seqidno:35)和qvqlvesggglvqpggslrlscaasgfsls(seqidno:36)的氨基酸序列的fr1；包含選自wvrqapgkglewvg(seqidno:38)和wvrqapgkglewlg(seqidno：39)的氨基酸序列的fr2；包含seqidno：41的氨基酸序列的fr3；和包含seqidno：42的氨基酸序列的fr4。這些鑒定的氨基酸序列可以具有一個(gè)或多個(gè)置換的氨基酸(例如，來自親和力成熟)或一個(gè)或兩個(gè)保守置換的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)包括：包含氨基酸序列eivmtqspatlsvspgeratlsc(seqidno：43)的fr1；包含氨基酸序列wyqq(k/r)pgqaprlliy(seqidno：46)的fr2；包含氨基酸序列g(shù)ip(a/d)rfsgsgsgtdftltisrlepedfavyyc(seqidno：49)的fr3；和包含seqidno：50的氨基酸序列的fr4。在一些實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)包括：包含seqidno：43的氨基酸序列的fr1；包含選自wyqqrpgqaprlliy(seqidno：44)和wyqqkpgqaprlliy(seqidno：45)的氨基酸序列的fr2；包含選自giparfsgsgsgtdftltisrlepedfavyyc(seqidno：47)和gipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyyc(seqidno：48)的氨基酸序列的fr3；和包含氨基酸序列fgqgtkleik(seqidno：50)的fr4。這些鑒定的氨基酸序列可以具有一個(gè)或多個(gè)置換的氨基酸(例如，來自親和力成熟)或一個(gè)或兩個(gè)保守置換的氨基酸。本發(fā)明的抗-gitr抗體的可變區(qū)，在其全長(zhǎng)上，通常將具有與相應(yīng)的人種系可變區(qū)氨基酸序列至少約85％(例如，至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的總體可變區(qū)(例如，fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4)氨基酸序列同一性。例如，抗gitr抗體的重鏈可以與人種系可變區(qū)evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavirydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak-yfdywgqgtlvtvss(seqidno：89和91)(vh33-13/30+cdr3+jh4，連字符表示cdr3，其長(zhǎng)度是可變的)具有至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，seqidno：89中的最后一個(gè)氨基酸賴氨酸(k)，用精氨酸(r)置換?？?gitr抗體的輕鏈可以與人種系可變區(qū)eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsvssnlawyqqkpgqaprlliygastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyyc-ytfgqgtkleik(seqidnos：98和94)(vkiiil16/a27+cdr3+jk2；連字符表示cdr3，其長(zhǎng)度是可變的)具有至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，只添加、缺失或置換框架區(qū)內(nèi)的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，序列同一性比較排除cdr3。表1.本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體的實(shí)例可以通過本領(lǐng)域公知的編號(hào)系統(tǒng)，包括本文中所述的那些，來確定表1中所列抗體的cdr。表2列出了通過(1)使用kabat等(1991)，“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md(“kabat”編號(hào)方案)，nih出版號(hào)no.91-3242；和(2)chothia，參見al-lazikani等，(1997)“standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins”，j.mol.biol.273:927-948中描述的編號(hào)系統(tǒng)限定的cdr。表2：kabat和chothiacdr比較在一些實(shí)施方案中，結(jié)合gitr(例如，seqidno:1，細(xì)胞加工的seqidno:1)的本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段選自以下的任一個(gè)：i)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：重鏈cdr1包含seqidno:22，重鏈cdr2包含seqidno:23，重鏈cdr3包含seqidno:29，輕鏈cdr1包含seqidno:30，輕鏈cdr2包含seqidno:33和輕鏈cdr3包含seqidno:34；ii)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：重鏈cdr1包含seqidno:22，重鏈cdr2包含seqidno:24，重鏈cdr3包含seqidno:29，輕鏈cdr1包含seqidno:31，輕鏈cdr2包含seqidno:33和輕鏈cdr3包含seqidno:34；iii)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：重鏈cdr1包含seqidno:22，重鏈cdr2包含seqidno:25，重鏈cdr3包含seqidno:29，輕鏈cdr1包含seqidno:30，輕鏈cdr2包含seqidno:33和輕鏈cdr3包含seqidno:34；iv)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：重鏈cdr1包含seqidno:22，重鏈cdr2包含seqidno:26，重鏈cdr3包含seqidno:29，輕鏈cdr1包含seqidno:30，輕鏈cdr2包含seqidno:33和輕鏈cdr3包含seqidno:34；v)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：重鏈cdr1包含seqidno:22，重鏈cdr2包含seqidno:27，重鏈cdr3包含seqidno:29，輕鏈cdr1包含seqidno:30，輕鏈cdr2包含seqidno:33和輕鏈cdr3包含seqidno:34；和vi)抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其中：重鏈cdr1包含seqidno:22，重鏈cdr2包含seqidno:25，重鏈cdr3包含seqidno:109，輕鏈cdr1包含seqidno:30，輕鏈cdr2包含seqidno:33和輕鏈cdr3包含seqidno:34。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是人源化的。在特定的實(shí)施方案中，抗體或抗體片段包含人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段包含iggfc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是糖基化的。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段在修飾的細(xì)胞中修飾或表達(dá)，其中所述修飾導(dǎo)致抗體或抗體片段提高的fcr效應(yīng)子功能。在某些實(shí)施方案中，抗體或抗原片段在體內(nèi)誘導(dǎo)升高的teff:treg比率。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段在體內(nèi)誘導(dǎo)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段與第二抗體或抗體片段交聯(lián)時(shí)，其是seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:16的重鏈可變區(qū)具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，并包含與seqidno:17的輕鏈可變區(qū)具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:6的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno:7的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:8的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno:9的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:10的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno:7的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:12的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno:7的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:14的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈多肽，包含與seqidno:7的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno:99的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno：7的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno：105的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno：7的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與seqidno：61的重鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，包含與seqidno：59的輕鏈可變區(qū)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗-gitr抗體，在其全長(zhǎng)上，通常與人igg1/κ恒定區(qū)氨基酸序列具有至少約85％，例如，至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的整體恒定區(qū)(例如，igg1)氨基酸序列同一性。例如，抗-gitr抗體的重鏈可以與人igg1恒定區(qū)astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno：20).具有至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，粗體亮氨酸/亮氨酸殘基被丙氨酸/丙氨酸置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，最后一個(gè)氨基酸賴氨酸(k)被精氨酸(r)置換。抗-gitr抗體的輕鏈可以與人κ輕鏈恒定區(qū)rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno：21).具有至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，添加、刪除或置換恒定區(qū)內(nèi)的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，抗體是人或人源化抗體。vh、vl、全長(zhǎng)輕鏈和全長(zhǎng)重鏈序列(氨基酸序列和編碼氨基酸序列的核苷酸序列)可以“混合匹配”，以形成本發(fā)明的其他gitr-結(jié)合抗體。使用本領(lǐng)域已知的結(jié)合試驗(yàn)(例如，elisa，和實(shí)施例部分中描述的其他試驗(yàn))，可以測(cè)試這樣的“混合匹配的”gitr-結(jié)合抗體，以證實(shí)活性。鏈混合和匹配時(shí)，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上相似的vh序列替代來自特定的vh/vl對(duì)的vh序列。同樣，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上相似的全長(zhǎng)重鏈序列替代來自特定的全長(zhǎng)重鏈/全長(zhǎng)輕鏈對(duì)的全長(zhǎng)重鏈序列。同樣，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上相似的vl序列替代來自特定的vh/vl對(duì)的vl序列。同樣，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上相似的全長(zhǎng)輕鏈序列替代來自特定的全長(zhǎng)重鏈/全長(zhǎng)輕鏈對(duì)的全長(zhǎng)輕鏈序列。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或抗體片段，其具有：包含選自seqidno：6、8、10、12、14、99和105的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和包含選自seqidno：7和9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中抗體特異性地結(jié)合gitr。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗體片段包含與選自seqidno：65、seqidno：69、seqidno73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：100和seqidno：106之任一的重鏈序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重鏈多肽；并包含與seqidno：66或seqidno：70的輕鏈具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的輕鏈多肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗gitr-抗體或抗體片段包含選自seqidno：65、seqidno：69、seqidno73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：100和seqidno：106之任一的重鏈多肽；并包含seqidno：66或seqidno:70的輕鏈多肽。對(duì)于鑒定的低于20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列，可以容許一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸殘基置換，同時(shí)仍然保留期望的特定結(jié)合和/或激動(dòng)劑活性。本發(fā)明的抗-gitr抗體和抗體片段通常將結(jié)合gitr，包括同種型1(seqidno:1)、同種型2(seqidno:2)和同種型3(seqidno:3)，平衡解離常數(shù)(kd)值小于約10-8m或10-9m，例如，或小于約10-10m或10-11m，并且在一些實(shí)施方案中，小于約10-12m或10-13m。結(jié)合相同表位的抗體本發(fā)明提供抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，其結(jié)合人gitr的富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域1(“crd1”，seqidno:4：cgpgrlllgtgtdarccrvhttrccrdypgeeccsewdc)和富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域2(“cdr2”，seqidno:5：mcvqpefhcgdpccttcrhhpcppgqgvqsqgkfsfgfqc)中包含的表位，并且其中抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子是hgitr的激動(dòng)劑，并且其中抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子任選具有完整或提高的fcr效應(yīng)子功能。在一些實(shí)施方案中，抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子結(jié)合人gitr(包含seqidno:88)的表位。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:88中的殘基。在一些實(shí)施方案中，表位包含人gitr的殘基34-72和78中的氨基酸殘基，其中該抗體和抗體片段是hgitr的激動(dòng)劑。本發(fā)明還提供了與表1中所述的gitr-結(jié)合性抗體結(jié)合相同表位的抗體和抗體片段。因此，可以基于其在gitr結(jié)合試驗(yàn)中與本發(fā)明的其他抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)(例如，以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制其他抗體的結(jié)合)的能力來鑒定另外的抗體和抗體片段。試驗(yàn)抗體抑制本發(fā)明的抗體和抗體片段與gitr蛋白(例如，人gitr)結(jié)合的能力表明，試驗(yàn)抗體可以與所述抗體或抗體片段競(jìng)爭(zhēng)對(duì)hgitr的結(jié)合；根據(jù)非限制性理論，這樣的抗體可以與其競(jìng)爭(zhēng)性抗體或抗體片段結(jié)合gitr蛋白上相同或相關(guān)(例如，結(jié)構(gòu)上相似或空間上接近)的表位。在特定實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗體或抗體片段結(jié)合hgitr上相同表位的抗體是人或人源化單克隆抗體?？梢园凑毡疚闹兴龅闹苽浜头蛛x這樣的人或人源化單克隆抗體。工程化和修飾的抗體可以使用具有本文中(例如，表1)所示的一個(gè)或多個(gè)cdr和/或vh和/或vl序列的抗體作為起始材料，工程化構(gòu)建修飾的抗體或抗體片段，從而制備本發(fā)明的抗體或抗體片段，所述修飾抗體可以具有從起始抗體改變的特性?？梢酝ㄟ^修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即，vh和/或vl)內(nèi)(例如，一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)內(nèi))的殘基，來工程化構(gòu)建抗體或抗體片段。另外地或可替換地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來工程化構(gòu)建抗體或抗體片段，例如，以改變抗體的(一種或多種)效應(yīng)子功能?？梢赃M(jìn)行的一類可變區(qū)工程化是cdr移植?？贵w主要通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，cdr內(nèi)的氨基酸序列在抗體之間比cdr外的序列更多樣化。因?yàn)閏dr序列負(fù)責(zé)大部分的抗體-抗原相互作用，故通過構(gòu)建包括來自特定抗體的cdr序列(移植在來自具有不同特性的不同抗體的框架序列上)的表達(dá)載體，可以表達(dá)模擬該特定抗體的特性的重組抗體(參見，例如，riechmann,l.等，1998nature332:323-327；jones,p.等，1986nature321:522-525；queen,c.等，1989proc.natl.acad.,u.s.a.86:10029-10033；winter的美國(guó)專利no.5,225,539，以及queen等的美國(guó)專利nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括：包含具有選自seqidno:22、79和84的氨基酸序列的cdr1序列；具有選自seqidno:23、24、25、26、27、62和80的氨基酸序列的cdr2序列；具有選自seqidno:29、34和109的氨基酸序列的cdr3序列的重鏈可變區(qū)；和包含具有選自seqidno:30、31、63、81、85和86的氨基酸序列的cdr1序列；具有選自seqidno:33、64和82的氨基酸序列的cdr2序列；和選自seqidno:34和83的氨基酸序列的cdr3序列的輕鏈可變區(qū)。因此，這樣的抗體含有單克隆抗體的vh和vlcdr序列，還可以含有來自這些抗體的不同框架區(qū)。在某些實(shí)施方案中，分離的抗體或抗體片段包含與該段落中的相應(yīng)序列具有至少約85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。框架序列可以獲自包括種系抗體基因序列的公眾dna數(shù)據(jù)庫或公開的參考文獻(xiàn)。例如，可以在“vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(可在互聯(lián)網(wǎng)www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)，以及kabat,e.a.等，1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242；tomlinson,i.m.等，1992j.fol.biol.227:776-798；和cox,j.p.l.等，1994eur.jimmunol.24:827-836中，找到人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系dna序列。用于本發(fā)明抗體中的框架序列的實(shí)例是，與選定的本發(fā)明抗體使用的框架序列(例如，本發(fā)明的單克隆抗體使用的共有序列和/或框架序列)在結(jié)構(gòu)上相似的那些框架序列。vhcdr1、2和3序列，以及vlcdr1、2和3序列，可以移植至框架區(qū)上，所述框架區(qū)具有與該框架序列所源自的種系免疫球蛋白基因中的序列相同的序列；或cdr序列可以移植至與種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的框架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，突變框架區(qū)內(nèi)的殘基來維持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有益的(參見，例如，queen等的美國(guó)專利no.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。另一類可變區(qū)修飾是突變vh和/或vlcdr1、cdr2和/或cdr3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，由此提高目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如，親和力)，稱為“親和力成熟”?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或pcr介導(dǎo)的誘變來引入突變，并可以在本文中所述的和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)中和/或本領(lǐng)域已知的可替換或其他試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)對(duì)抗體結(jié)合或其他的目標(biāo)功能特性的影響?？梢砸氡Ｊ匦孕揎?。突變可以是氨基酸置換、添加或刪除。此外，通常改變cdr區(qū)內(nèi)的至多一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基。本發(fā)明的工程化抗體或抗體片段包括，已經(jīng)對(duì)vh和/或vl內(nèi)的框架殘基進(jìn)行了修飾的那些，例如，以提高抗體的特性。通常，進(jìn)行這樣的框架修飾，以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個(gè)或多個(gè)框架殘基“回復(fù)突變”至相應(yīng)種系序列。更特別地，已經(jīng)經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可以含有不同于抗體所源自的種系序列的框架殘基?？梢酝ㄟ^將抗體框架序列與抗體所來源的種系序列比較，鑒定這樣的殘基。為了將框架區(qū)序列返回至其種系構(gòu)造，可以通過例如定點(diǎn)誘變，將體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”至種系序列。這樣的“回復(fù)突變”抗體也旨在包括在本發(fā)明中。另一種類型的框架修飾涉及突變框架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基，或甚至一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)內(nèi)的殘基，以除去t細(xì)胞表位，由此降低抗體的潛在免疫原性。這種方法也稱為“去免疫化”并且更多詳細(xì)內(nèi)容描述于carr等的美國(guó)專利公開no.20030153043中。如果存在抗-gitr抗體或抗體片段的恒定區(qū)，則其可以根據(jù)情況是任何類型或亞型的，并可以選擇來自通過本發(fā)明的方法待治療的受試者的物種(例如，人、非人靈長(zhǎng)類或其他哺乳動(dòng)物，例如，農(nóng)業(yè)動(dòng)物(例如，馬、綿羊、牛、豬、駱駝)、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物(例如，犬、貓)或嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、兔子)。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體工程化，以產(chǎn)生人源化或抗體。在一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)同種型為igg，例如，igg1、igg2、igg3、igg4。在某些實(shí)施方案中，恒定區(qū)同種型為igg1。除了框架區(qū)或cdr區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾，或作為替代，可以工程化本發(fā)明的抗體或抗體片段，以在fc內(nèi)包括修飾，通常用來改變抗體的一個(gè)或多個(gè)功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明的抗體或抗體片段可以被化學(xué)修飾(例如，可以將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分連接至抗體)，或修飾以改變其糖基化，從而改變抗體或抗體片段的一個(gè)或多個(gè)功能特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾ch1的鉸鏈區(qū)，使得鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)量改變，例如，增加或減少。該方法進(jìn)一步描述于bodmer等的美國(guó)專利no.5,677,425中。例如，改變ch1的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)量來促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配或提高或降低抗體或抗體片段的穩(wěn)定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使抗體的fc鉸鏈區(qū)突變，以改變抗體的生物半衰期。更具體地，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變引入fc-鉸鏈片段的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)域中，使得抗體相對(duì)于天然fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域的spa結(jié)合具有受損的葡萄球菌蛋白a(spa)結(jié)合。這種方法進(jìn)一步詳細(xì)地描述于ward等的美國(guó)專利no.6,165,745中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)抗體進(jìn)行修飾以增加生物半衰期。各種方法都是可以的。例如，如ward的美國(guó)專利no.6,277,375所述，可以引入以下突變中的一個(gè)或多個(gè)：t252l、t254s、t256f?；蛘?，為增大生物半衰期，抗體可以在ch1或cl區(qū)內(nèi)改變，以包含取自igg的fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的挽救受體(salvagereceptor)結(jié)合表位，如presta等的美國(guó)專利no.5,869,046和6,121,022中所述。再在其他實(shí)施方案中，可以通過用不同的氨基酸殘基替代至少一個(gè)氨基酸殘基來改變fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)子功能。例如，可以將一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代為不同的氨基酸殘基，使得抗體對(duì)于效應(yīng)子配體具有改變的親和性，但保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。改變的親和性所針對(duì)的效應(yīng)子配體可以是例如，fc受體(fcr)或補(bǔ)體的c1組分。這種方法更詳細(xì)地描述于winter等的美國(guó)專利no.5,624,821和5,648,260中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用不同氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)選自氨基酸殘基的氨基酸，使得抗體具有改變的c1q結(jié)合和/或降低的或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)。這種方法更詳細(xì)地描述于idusogie等的美國(guó)專利no.6,194,551中。含有此類突變的抗體介導(dǎo)降低的抗體依賴性細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)，或無抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)。在一些實(shí)施方案中，igg1恒定區(qū)的氨基酸殘基l234和l235被置換成ala234和ala235。在一些實(shí)施方案中，igg1恒定區(qū)的氨基酸殘基n267被置換成ala267。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被改變，以由此改變抗體結(jié)合補(bǔ)體的能力。這種方法進(jìn)一步描述于bodmer等的pct公開wo94/19351中。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，通過修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾fc區(qū)，以提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)的能力和/或提高抗體對(duì)fcγ受體的親和力。這種方法進(jìn)一步描述于presta的pct公開wo00/42072中。此外，人igg1上針對(duì)fcγrl、fcγrii、fcγriii和fcrn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有提高的結(jié)合性的變體(參見，shields,r.l.等，2001j.biol.chen.276:6591-6604)。再在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化(aglycoslated)抗體(即，抗體缺少糖基化)。例如，可以改變糖基化，以提高抗體對(duì)“抗原”的親和性。這樣的碳水化合物修飾，例如，可以通過改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來完成。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)框架糖基化位點(diǎn)的消除，以由此消除該位點(diǎn)的糖基化。這樣的無糖基化可以提高抗體對(duì)抗原的親和性。這樣的方法更詳細(xì)地描述于co等的美國(guó)專利no.5,714,350和6,350,861中。另外地或替換地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，如具有降低含量的巖藻糖殘基的低巖藻糖化抗體，或具有增加的平分型(bisecting)glcnac結(jié)構(gòu)的抗體。已證實(shí)這種改變的糖基化模式可以提高抗體的adcc能力。這類糖修飾例如可以在具有改變的糖基化機(jī)器的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了具有改變的糖基化機(jī)器的細(xì)胞，并可被用作表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，hanai等的ep1,176,195描述了一種帶有功能上破壞的fut8基因(編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的細(xì)胞系，在這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體呈現(xiàn)出低巖藻糖基化。presta的pct公開wo03/035835描述了一種變體cho細(xì)胞系，lecl3細(xì)胞，該細(xì)胞系將巖藻糖附著至asn(297)連接的碳水化合物上的能力降低，這也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞系中表達(dá)的抗體的低巖藻糖化(還可參見shields，r.l.等，2002，j.biol.chem.277:26733-26740)。umana等的pct公開wo99/54342描述了經(jīng)過工程化以表達(dá)糖蛋白修飾性糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，β(l,4)-n-乙酰基葡糖胺轉(zhuǎn)移酶iii(gntiii))的細(xì)胞系，在這種工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體呈現(xiàn)增加的平分型glcnac結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗體的adcc活性提高(還可參見umana等，1999，nat.biotech.12:176-180)。將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域移植至替代性的框架或支架中可以使用各種抗體/免疫球蛋白框架或支架，只要所得到的多肽包括至少一個(gè)特異性結(jié)合gitr的結(jié)合區(qū)。這樣的框架或支架包括5種主要獨(dú)特型的人免疫球蛋白，或其片段，并且包括其他動(dòng)物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選具有人源化特征。在這個(gè)方面中，單重鏈抗體，如駝科動(dòng)物中鑒定的那些，是特別令人感興趣的。新的框架、支架和片段持續(xù)被本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)和研發(fā)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及，使用在其上可以移植本發(fā)明cdr的非免疫球蛋白支架，產(chǎn)生基于非免疫球蛋白的抗體。可以使用已知或?qū)淼姆敲庖咔虻鞍卓蚣芎椭Ъ?，只要它們包含?duì)于靶g(shù)itr蛋白(例如，人和/或獼猴gitr)具有特異性的結(jié)合區(qū)。已知的非免疫球蛋白框架或支架包括，但不限于，纖連蛋白(compoundtherapeutics,inc.，waltham,ma)、錨蛋白(molecularpartnersag，蘇黎世，瑞士)、結(jié)構(gòu)域抗體(domantis,ltd.，劍橋，ma和ablynxnv,zwijnaarde，比利時(shí))、脂籠蛋白(pierisproteolabag，freising，德國(guó))、小分子免疫藥物(trubionpharmaceuticalsinc.，seattle，wa)、maxybodies(avidia,inc.，mountainview，ca)、蛋白a(affibodyag，瑞典)和affilin(γ-晶狀體蛋白或泛素)(scilproteinsgmbh，halle，德國(guó))。纖連蛋白支架基于iii型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(例如，iii型纖連蛋白的第十個(gè)模塊(10fn3結(jié)構(gòu)域))。iii型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域具有7或8個(gè)β鏈，其分布在兩個(gè)β片之間，它們自身彼此擠靠形成蛋白質(zhì)的核心，并且進(jìn)一步含有環(huán)(與cdr類似)，這些環(huán)將β鏈彼此連接并且是溶劑暴露的。在β片夾層的每個(gè)邊緣存在至少三個(gè)這樣的環(huán)，其中所述邊緣是與β鏈的方向垂直的蛋白邊界(參見us6,818,418)。這些基于纖連蛋白的支架不是免疫球蛋白，但整體折疊與最小的功能性抗體片段(重鏈可變區(qū)，在駱駝和美洲鴕igg中其包含完整的抗原識(shí)別單位)密切相關(guān)。由于這個(gè)結(jié)構(gòu)，該非免疫球蛋白抗體可以模擬抗原結(jié)合特性，在性質(zhì)和親和性上與抗體的相似。這些支架可以用于體外環(huán)隨機(jī)化和改組策略中，該策略與體內(nèi)的抗體親和力成熟過程相似。這些基于纖連蛋白的分子可以用作支架，其中使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)，用本發(fā)明的cdr替代分子的環(huán)區(qū)域。錨蛋白技術(shù)基于使用具有錨蛋白衍生的重復(fù)模塊的蛋白作為支架用于攜帶可變區(qū)，所述可變區(qū)可以用于結(jié)合不同的靶標(biāo)。錨蛋白重復(fù)模塊是由兩個(gè)反平行的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角組成的33個(gè)氨基酸的多肽?？勺儏^(qū)的結(jié)合大多數(shù)可以通過使用核糖體展示來優(yōu)化。avimer源自含有天然a-結(jié)構(gòu)域的蛋白，如lrp-1。這些結(jié)構(gòu)域本質(zhì)上用于蛋白-蛋白相互作用，并且在人體中，超過250種蛋白在結(jié)構(gòu)上是基于a-結(jié)構(gòu)域的。avimer由多個(gè)不同“a-結(jié)構(gòu)域”單體(2-10個(gè))經(jīng)由氨基酸銜接物連接而成?？梢允褂美缑绹?guó)專利申請(qǐng)公開no.20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中所述的方法，形成可以結(jié)合靶抗原的avimer。affibody親和配體是小的簡(jiǎn)單蛋白，由基于蛋白a的一個(gè)igg-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的支架的三螺旋束組成。蛋白a是來自細(xì)菌金黃色葡萄球菌的表面蛋白。該支架結(jié)構(gòu)域由58個(gè)氨基酸組成，其中13個(gè)可以經(jīng)隨機(jī)化而產(chǎn)生具有大量配體變體的affibody文庫(參見，us5,831,012)。affibody分子模擬抗體，與150kda的抗體分子量相比，它們具有6kda的分子量。盡管其尺寸小，但affibody分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗體的相似。anticalin是由pierisproteolabag公司研發(fā)的產(chǎn)物。它們?cè)醋灾\蛋白(一組廣泛分布的、通常涉及化學(xué)敏感性或不溶性化合物的生理運(yùn)輸或存儲(chǔ)的、小而穩(wěn)健的蛋白質(zhì))。人組織或體液中存在幾種天然脂籠蛋白。該蛋白的構(gòu)造類似于免疫球蛋白的，在剛性框架頂部具有超變環(huán)。然而，與抗體或其重組片段不同，脂籠蛋白由具有160至180個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)多肽鏈組成，只略大于單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。構(gòu)成結(jié)合袋的四環(huán)組顯示出顯著的結(jié)構(gòu)可塑性并容許各種側(cè)鏈。該結(jié)合位點(diǎn)因此可以在專有方法中重塑，以高親和性和特異性識(shí)別規(guī)定的不同形狀的靶分子。通過誘變四環(huán)組，脂籠蛋白家族的一個(gè)蛋白，pierisbrassicae的后膽色素結(jié)合蛋白(bbp)，已經(jīng)用于研發(fā)anticalin。affilin分子是設(shè)計(jì)用來針對(duì)蛋白質(zhì)和小分子具有特異親和力的小的非免疫球蛋白蛋白質(zhì)。可從兩個(gè)文庫中非?？焖俚剡x擇新的affilin分子，每一所述文庫基于不同的人衍生支架蛋白。affilin分子與免疫球蛋白蛋白質(zhì)不顯示任何結(jié)構(gòu)同源性。目前，使用兩個(gè)affilin支架，其中一個(gè)是γ晶狀體蛋白——人結(jié)構(gòu)性眼晶狀體蛋白質(zhì)，另一個(gè)是“泛素”超家族蛋白質(zhì)。兩個(gè)人支架均非常小，顯示高的溫度穩(wěn)定性，并幾乎抵抗ph改變和變性劑。該高穩(wěn)定性主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的擴(kuò)展的β折疊結(jié)構(gòu)。γ晶狀體蛋白來源的蛋白質(zhì)的實(shí)例描述于wo2001004144中，并且“泛素樣”蛋白質(zhì)的實(shí)例描述于wo2004106368中。蛋白質(zhì)表位模擬物(pem)是中等大小的環(huán)狀、肽樣分子(mw1-2kda)，模擬蛋白質(zhì)β發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)(參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的主要二級(jí)結(jié)構(gòu))。人或人源化抗體本發(fā)明提供特異性結(jié)合gitr蛋白(例如，人gitr)的工程化人抗體。與嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化抗體相比，施用于人時(shí)，本發(fā)明的人gitr-結(jié)合抗體具有進(jìn)一步降低的抗原性。可以使用本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生人gitr-結(jié)合抗體。例如，技術(shù)平臺(tái)(kalobios，soutsanfrancisco，ca)用于將非人抗體轉(zhuǎn)化成工程化人抗體。美國(guó)專利公開no.20050008625描述了一種體內(nèi)方法，其中在抗體中以人可變區(qū)替換非人抗體可變區(qū)，同時(shí)相對(duì)于該非人抗體保持相同或提供更好的結(jié)合特征。所述方法依賴于表位引導(dǎo)的完全人抗體對(duì)非人參照抗體的可變區(qū)替換。所得到的人抗體通常在結(jié)構(gòu)上與參照非人抗體不相關(guān)，但與參照抗體結(jié)合相同抗原上的相同表位。本發(fā)明的抗-gitr抗體可以基于具有v-區(qū)序列的工程化人抗體，所述v-區(qū)序列與人種系v區(qū)序列具有實(shí)質(zhì)性的氨基酸序列同一性，同時(shí)保留參照抗體的特異性和親和性。參見，美國(guó)專利公開no.2005/0255552和美國(guó)專利公開no.2006/0134098，兩篇專利文獻(xiàn)都按引用并入本文中。該改進(jìn)的方法可以鑒定用于確定參照抗體可變區(qū)的抗原結(jié)合特異性所需要的最小序列信息，并將信息轉(zhuǎn)移至人部分v-區(qū)基因序列的文庫，以產(chǎn)生人抗體v區(qū)的表位聚焦文庫?；谖⑸锏姆置谙到y(tǒng)可以用于表達(dá)文庫成員為抗體fab片段，并且可以例如使用菌落轉(zhuǎn)移結(jié)合試驗(yàn)，針對(duì)抗原結(jié)合性fab篩選文庫。參見，例如，美國(guó)專利公開no.2007/0020685?？梢赃M(jìn)一步表征陽性克隆，鑒定具有最高親和性的克隆。所得到的工程化人fab保留親本參照抗-gitr抗體的結(jié)合特異性，與親本抗體相比，通常對(duì)抗原具有相等或更高的親和性，并且具有與人種系抗體v-區(qū)高度序列同一的v-區(qū)。產(chǎn)生表位聚焦文庫所需要的最小結(jié)合特異性決定簇(bsd)通常表現(xiàn)為重鏈cdr3內(nèi)的序列(“cdrh3”)和輕鏈cdr3內(nèi)的序列(“cdrl3”)。bsd可以包含cdr3的一部分或整個(gè)長(zhǎng)度。bsd可以由連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基組成。在一些情況中，表位聚焦文庫從人v-區(qū)段序列構(gòu)建，所述v-區(qū)段序列與含有bsd的參照抗體的獨(dú)特cdr3-fr4區(qū)及人種系j區(qū)段序列連接(參見，美國(guó)專利公開no.2005/0255552)?；蛘?，可以通過相繼盒替換來產(chǎn)生人v-區(qū)段文庫，其中最初僅有部分參照抗體v區(qū)段被人序列文庫替換。隨后，鑒定的在剩余的參照抗體氨基酸序列中支持結(jié)合的人“序列盒”，在第二文庫篩選中重組以產(chǎn)生完全人的v區(qū)段(參見，美國(guó)專利申請(qǐng)no.2006/0134098)。在每種情況中，含有來自參照抗體的特異性決定簇的、配對(duì)的重鏈和輕鏈cdr3區(qū)段、cdr3-fr4區(qū)段或j區(qū)段，用于約束該結(jié)合特異性，以使得獲自該文庫的抗原結(jié)合物保留參照抗體的表位特異性。在文庫構(gòu)建過程中，在每條鏈的cdr3區(qū)域中，都可以引入另外的成熟改變，以鑒定具有最佳結(jié)合動(dòng)力學(xué)的抗體。所得到的工程化人抗體具有源自人種系文庫的v-區(qū)段序列，保留來自cdr3區(qū)的短bsd序列，并具有人種系框架4(fr4)區(qū)。駱駝(camelid)抗體從駱駝和單峰駝(雙峰駝(camelusbactrianus)和calelusdromaderius)家族的成員，包括新世界成員，如駱馬物種(例如，lamapaccos、lamaglama和lamavicugna)中，獲得的抗體蛋白質(zhì)已經(jīng)在大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和對(duì)人受試者的抗原性方面進(jìn)行了表征。自然界中發(fā)現(xiàn)的來自該哺乳動(dòng)物家族的某些igg抗體缺少輕鏈，并因此在結(jié)構(gòu)上不同于來自其他動(dòng)物的抗體的兩條重鏈和兩條輕鏈的典型四鏈四級(jí)結(jié)構(gòu)。參見pct/ep93/02214(wo94/04678，1994年3月3日公開)?？赏ㄟ^遺傳改造獲得鑒定為vhh的駱駝抗體區(qū)域(小的單可變結(jié)構(gòu)域)，以產(chǎn)生對(duì)靶標(biāo)具有高親和力的小蛋白質(zhì)，得到低分子量的抗體來源蛋白質(zhì)，稱為“駱駝納米抗體”。參見1998年6月2日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,759,808；還可以參見stijlemans,b.等，2004jbiolchem279:1256-1261；dumoulin,m.等，2003nature424:783-788；pleschberger,m.等，2003bioconjugatechem14:440-448；cortez-retamozo,v.等，2002intjcancer89:456-62；和lauwereys,m.等，1998emboj17:3512-3520。例如從ablynx，ghent，belgium，通過商業(yè)途徑可以獲得工程化的駱駝抗體和抗體片段庫。如同非人來源的其他抗體一樣，可重組改變駱駝抗體的氨基酸序列，獲得與人序列更類似的序列，即，納米抗體可以進(jìn)行“人源化”。因此，駱駝抗體對(duì)人的天然低抗原性可進(jìn)一步降低。駱駝納米抗體的分子量是人igg分子的大概十分之一，并且所述蛋白質(zhì)的物理直徑僅幾納米。小尺寸的一種結(jié)果是駱駝納米抗體能夠結(jié)合更大抗體蛋白質(zhì)在功能上看不見的抗原位點(diǎn)，即駱駝納米抗體可用作使用經(jīng)典免疫技術(shù)檢測(cè)不到的抗原的檢測(cè)試劑，并可能用作治療劑。因此，小尺寸的另一結(jié)果是駱駝納米抗體由于結(jié)合靶蛋白質(zhì)的溝或窄縫中特異位點(diǎn)而因此可抑制靶蛋白，并因而可具有這樣的能力，其比經(jīng)典抗體具有更類似于經(jīng)典低分子量藥物的功能。低分子量和緊湊的尺寸還導(dǎo)致駱駝納米抗體極其熱穩(wěn)定，對(duì)極端ph和蛋白酶解消化穩(wěn)定，并且抗原性弱。另一結(jié)果是駱駝納米抗體容易從循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到組織，甚至穿過血腦屏障，可治療影響神經(jīng)組織的病癥。納米抗體可進(jìn)一步利于藥物運(yùn)輸穿過血腦屏障。參見2004年8月19日公開的美國(guó)專利申請(qǐng)20040161738。這些特征與對(duì)人的低抗原性結(jié)合表明巨大的治療潛能。另外，這些分子可在原核細(xì)胞，如大腸桿菌(e.coli)中表達(dá)，并用噬菌體表達(dá)為融合蛋白，且是有功能的。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是對(duì)gitr具有高親和力的駱駝抗體或納米抗體。在本文的某些實(shí)施方案中，所述駱駝抗體或納米抗體在駱駝動(dòng)物中天然產(chǎn)生，即，使用本文就其他抗體所描述的技術(shù)，用gitr或其肽片段免疫駱駝來產(chǎn)生。或者，可以工程化構(gòu)建，即如本文實(shí)施例中所述，使用gitr作為靶標(biāo)，通過淘選方法，從例如展示適當(dāng)誘變的駱駝納米抗體蛋白質(zhì)的噬菌體文庫中，選擇產(chǎn)生gitr結(jié)合性駱駝納米抗體。還可以通過遺傳工程化，定制工程化納米抗體，以在受體受試者中具有從45分鐘到兩周的半衰期。在特定實(shí)施方案中，如pct/ep93/02214所述，通過將本發(fā)明人抗體的重鏈或輕鏈的cdr序列移植到納米抗體或單域抗體框架序列中來獲得駱駝抗體或納米抗體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)以下所述的方法，本發(fā)明提供了多價(jià)駱駝抗體或納米抗體。多價(jià)抗體在另一個(gè)方面中，提供了包含本發(fā)明的gitr-結(jié)合抗體或其片段的多價(jià)抗體(單特異性、雙特異性或多特異性)。本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合區(qū)，可以衍生或連接另一個(gè)功能性分子，例如，另一個(gè)肽或蛋白(例如，另一個(gè)抗體或受體的配體)，以產(chǎn)生結(jié)合至少兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)(其可以是相同或不同靶位點(diǎn)或分子)的多價(jià)分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以被衍生或功能上連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)締合或其他)超過一個(gè)的其他功能性分子，以產(chǎn)生結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)(其可以是相同靶標(biāo)分子上的相同或不同的結(jié)合位點(diǎn))的多價(jià)分子。在某些實(shí)施方案中，多價(jià)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體被衍生或連接超過一個(gè)的其他功能性分子，以產(chǎn)生結(jié)合至少兩個(gè)靶標(biāo)分子上的兩個(gè)或更多個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的多特異性分子；如多特異性分子也旨在包括在本文中使用的術(shù)語“雙特異性分子”或“多特異”中。為了形成本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可以在功能上連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)結(jié)合或其他)一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合分子，如另一個(gè)抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物，以獲得多價(jià)分子。本發(fā)明包括雙特異性分子，其包含至少一個(gè)針對(duì)gitr的第一結(jié)合特異性和針對(duì)第二靶標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性。例如，第二靶表位是不同于第一個(gè)靶表位的另一個(gè)gitr表位。另外，對(duì)于分子是多特異性分子的本發(fā)明，在一些實(shí)施方案中，除了第一和第二靶表位以外，分子還可以包括第三結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個(gè)抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，包括，例如，fab、fab'、f(ab')2、fv或單鏈fv?？贵w也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段，如fv或單鏈構(gòu)建體，如ladner等的美國(guó)專利no.4,946,778中所述的。二抗體(diabody)是二價(jià)、雙特異性分子，其中vh和vl結(jié)構(gòu)域表達(dá)在單個(gè)多肽鏈上，通過太短以至于不允許同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)的銜接物連接。vh和vl結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，例如，holliger等，1993proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak等，1994structure2:1121-1123)。可以通過在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有結(jié)構(gòu)vha-vlb和vhb-vla(vh-vl構(gòu)型)、或vla-vhb和vlb-vha(vl-vh構(gòu)型)的兩個(gè)多肽鏈來產(chǎn)生二抗體。大部分的二抗體可以以可溶形式在細(xì)菌中表達(dá)。通過用大約15個(gè)氨基酸殘基的銜接物連接兩個(gè)二抗體形成性多肽鏈，可以產(chǎn)生單鏈二抗體(scdb)(參見holliger和winter，1997cancerimmunol.immunother.，45(3-4):128-30；wu等，1996immunotechnology，2(1):21-36)。scdb可以在細(xì)菌中以可溶、活性單體形式表達(dá)(參見，holliger和winter，1997cancerimmunol.immunother.，45(34):128-30；wu等，1996immunotechnology，2(1):21-36；pluckthun和pack，1997immunotechnology,3(2):83-105；ridgway等，1996proteineng.,9(7):617-21)。二抗體可以與fc融合，來產(chǎn)生“二-二抗體”(di-diabody)(參見，2004j.biol.chem.,279(4):2856-65)?？梢杂糜诒景l(fā)明雙特異性分子中的其他抗體是鼠、嵌合和人源化的單克隆抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，通過綴合結(jié)合特異性組成部分，制備本發(fā)明的雙特異性和/或多價(jià)分子。例如，可以分開產(chǎn)生雙特異性和/或多價(jià)分子的每個(gè)結(jié)合特異性，然后彼此綴合。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白或肽時(shí)，可以將各種偶聯(lián)或交聯(lián)劑用于共價(jià)綴合。交聯(lián)劑的實(shí)例包括蛋白a、碳二亞胺、n-琥珀酰亞胺-s-乙?；?硫代乙酸酯(sata)、5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、o-苯二馬來酰亞胺(opdm)、n-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)和磺基琥珀酰亞胺4-(n-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-smcc)(參見，例如，karpovsky等，1984j.exp.med.160:1686；liu,ma等，1985proc.natl.acad.sci.usa82:8648)。其他方法包括paulus,1985behringins.mitt.no.78,118-132；brennan等，1985science229:81-83和glennie等，1987j.immunol.139:2367-2375中所述的那些。綴合劑可以是sata和磺基-smcc，兩者都可獲自piercechemicalco.(rockford，il)。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(shí)，它們可以通過兩個(gè)重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)的巰基鍵合來綴合。在特定的實(shí)施方案中，在綴合前修飾鉸鏈區(qū)，以含有奇數(shù)個(gè)巰基殘基，例如，一個(gè)。或者，結(jié)合特異性可以在相同載體中編碼，并且在相同宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。在雙特異性和/或多價(jià)分子是mab×mab、mab×fab、fab×f(ab’)2或配體×fab融合蛋白的情況中，該方法特別有用。本發(fā)明的雙特異性和/或多價(jià)分子可以是包含一個(gè)單鏈抗體和結(jié)合決定簇的單鏈分子，或包含兩個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個(gè)單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法描述于例如美國(guó)專利號(hào)no.5,260,203；美國(guó)專利號(hào)no.5,455,030；美國(guó)專利號(hào)no.4,881,175；美國(guó)專利號(hào)no.5,132,405；美國(guó)專利號(hào)no.5,091,513；美國(guó)專利號(hào)no.5,476,786；美國(guó)專利號(hào)no.5,013,653；美國(guó)專利號(hào)no.5,258,498和美國(guó)專利號(hào)no.5,482,858中。雙特異性和/或多價(jià)分子與其特異性靶標(biāo)的結(jié)合，例如，可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)、放射性免疫試驗(yàn)(rea)、facs分析、生物試驗(yàn)(例如，生長(zhǎng)抑制)或western印跡試驗(yàn)，來證實(shí)。在這些試驗(yàn)的每一個(gè)中，通常使用對(duì)于目標(biāo)復(fù)合物特異的標(biāo)記試劑(例如，抗體)來檢測(cè)特別感興趣的蛋白-抗體復(fù)合物的存在。具有延長(zhǎng)半衰期的抗體本發(fā)明提供，具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的、特異性地結(jié)合gitr蛋白的抗體和抗體片段。許多因素可以影響蛋白的體內(nèi)半衰期。例如，腎過濾、肝臟中的代謝、蛋白水解酶(蛋白酶)的降解和免疫原性應(yīng)答(例如，被抗體蛋白中和以及被巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞攝取)。各種策略可以用于延長(zhǎng)本發(fā)明抗體的半衰期。例如，通過化學(xué)連接聚乙二醇(peg)、recodepeg、抗體支架、聚唾液酸(psa)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白-結(jié)合性配體和碳水化合物殼；通過與結(jié)合血清蛋白的蛋白(如白蛋白、igg、fcrn和轉(zhuǎn)鐵蛋白)進(jìn)行基因融合；通過與結(jié)合血清蛋白的其他結(jié)合性部分(如納米抗體、fab、darpins、avimers、affibodies和anticalins)(遺傳或化學(xué))偶聯(lián)；通過與rpeg、白蛋白、白蛋白的結(jié)構(gòu)域、白蛋白結(jié)合性蛋白和fc進(jìn)行基因融合；或通過摻入nancarriers、緩釋制劑或醫(yī)學(xué)裝置中。為了延長(zhǎng)抗體在體內(nèi)的血清循環(huán)，可以使用或不使用多官能接頭，通過peg與抗體的n-或c-端的位點(diǎn)特異性綴合、或經(jīng)由賴氨酸殘基上存在的ε-氨基基團(tuán)，將惰性聚合物分子(如高分子量peg)連接至抗體或其片段。為了使抗體peg化，通常可以在引起一個(gè)或多個(gè)peg基團(tuán)連接至抗體或抗體片段的條件下，使抗體或其片段與聚乙二醇(peg)，如peg的反應(yīng)性酯或醛衍生物反應(yīng)?？梢酝ㄟ^與反應(yīng)性peg分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)，來進(jìn)行peg化。如本文中使用的，術(shù)語“聚乙二醇”旨在包括已經(jīng)用于衍生其他蛋白的任何形式的peg，如單(c1-c10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，待peg化的抗體是無糖基化抗體。可以使用導(dǎo)致生物活性最小丟失的線性或分支聚合物衍生化?？梢酝ㄟ^sds-page和質(zhì)譜密切監(jiān)控綴合程度，以確保peg分子與抗體的正確綴合。未反應(yīng)的peg可以通過大小排阻或通過離子交換色譜與抗體-peg綴合物分離?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如，通過本文中所述的免疫試驗(yàn)，測(cè)定peg衍生抗體的結(jié)合活性以及體內(nèi)功效。用于將蛋白peg化的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，nishimura等的ep0154316和ishikawa等的ep0401384。其他改進(jìn)的peg化技術(shù)包括recodepeg(化學(xué)重構(gòu)正交定向工程化技術(shù)，reconstitutingchemicallyorthogonaldirectedengineeringtechnology)，其經(jīng)由包括trna合成酶和trna的重構(gòu)系統(tǒng)將化學(xué)上特定的側(cè)鏈并入生物合成的蛋白中。這種技術(shù)能夠在大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將超過30個(gè)的新氨基酸并入生物合成蛋白中。trna可以在放置琥珀密碼子的任何位置摻入非天然氨基酸，將琥珀密碼子從終止密碼子轉(zhuǎn)變成發(fā)出并入化學(xué)上特定氨基酸的信號(hào)的密碼子。重組peg化技術(shù)(rpeg)也可以用于血清半衰期延長(zhǎng)。這種技術(shù)涉及在遺傳上將300-600個(gè)氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白尾融合至已有的藥物蛋白上。因?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)蛋白鏈的表觀分子量比其實(shí)際的分子量大約15-倍，因此蛋白的血清半衰期得到很大程度的提高。與需要化學(xué)綴合和再純化的傳統(tǒng)peg化相反，生產(chǎn)過程得到了很大程度的簡(jiǎn)化并且產(chǎn)物是同質(zhì)的。聚唾液酸化是另一種技術(shù)，其使用天然聚合物聚唾液酸(psa)來延長(zhǎng)有效壽命并提高治療性肽和蛋白的穩(wěn)定性。psa是唾液酸的聚合物(糖)。用于蛋白和治療性肽藥物遞送時(shí)，聚唾液酸在綴合物上提供保護(hù)性微環(huán)境。這提高了治療蛋白在循環(huán)中的有效壽命并防止其被免疫系統(tǒng)識(shí)別。psa聚合物天然存在于人體中。其被某些細(xì)菌采用，所述細(xì)菌經(jīng)過數(shù)百萬年進(jìn)化，用psa聚合物覆蓋它們的壁。這些天然聚唾液酸化的細(xì)菌隨后能夠借助分子擬態(tài)來挫敗身體的防御系統(tǒng)。可以容易地從這樣的細(xì)菌大量產(chǎn)生具有預(yù)定的物理特征的psa(自然界的終極隱身技術(shù))。細(xì)菌psa因?yàn)槠湓诨瘜W(xué)上與人體內(nèi)的psa相同，而是完全非免疫原性的，即使與蛋白偶聯(lián)時(shí)也是如此。另一種技術(shù)包括利用與抗體連接的羥乙基淀粉(“hes”)。hes是源自蠟質(zhì)玉米淀粉的修飾的天然聚合物，可以被體內(nèi)的酶代謝。通?？梢允┯胔es溶液來替代不足的血液體積和提高血液的流變學(xué)特性?？贵w的hes化能夠通過提高分子的穩(wěn)定性以及通過降低腎清除來延長(zhǎng)循環(huán)半衰期，導(dǎo)致提高的生物活性。通過改變不同的參數(shù)，如hes的分子量，可以定制各種hes抗體綴合物。將一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(即，置換、插入或刪除)引入igg恒定結(jié)構(gòu)域或其fcrn結(jié)合片段(優(yōu)選fc或鉸鏈fc結(jié)構(gòu)域片段)中，也可以產(chǎn)生具有提高的體內(nèi)半衰期的抗體。參見，例如，國(guó)際公開no.wo98/23289；國(guó)際公開no.wo97/34631；和美國(guó)專利no.6,277,375。此外，抗體可以與白蛋白綴合，使得抗體或抗體片段在體內(nèi)更穩(wěn)定或具有更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，參見，例如，國(guó)際公開no.wo93/15199、wo93/15200和wo01/77137；和歐洲專利no.ep413,622。用于提高半衰期的策略在納米抗體、基于纖連蛋白的結(jié)合劑和需要提高體內(nèi)半衰期的其他抗體或蛋白中尤為有用?？贵w綴合物本發(fā)明提供，與異源蛋白或多肽(或其片段，優(yōu)選至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個(gè)氨基酸的多肽)重組融合或化學(xué)綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)以產(chǎn)生融合蛋白的、特異性結(jié)合gitr蛋白的抗體或其片段。特別地，本發(fā)明提供包含本文中所述抗體的抗原結(jié)合片段(例如，fab片段、fd片段、fv片段、f(ab)2片段、vh結(jié)構(gòu)域、vhcdr、vl結(jié)構(gòu)域或vlcdr)和異源蛋白、多肽或肽的融合蛋白。用于將蛋白、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或綴合的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，美國(guó)專利no.5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；歐洲專利no.ep307,434和ep367,166；國(guó)際公開wo96/04388和wo91/06570；ashkenazi等，1991,proc.natl.acad.sci.usa88:10535-10539；zheng等，1995,j.immunol.154:5590-5600；和vil等，1992,proc.natl.acad.sci.usa89:11337-11341。通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(總稱為“dna改組”)技術(shù)，可以產(chǎn)生其他融合蛋白。dna改組可以用于改變本發(fā)明的抗體或其片段的活性(例如，具有較高親和性和較低離解速率的抗體或其片段)。一般參見，美國(guó)專利no.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；patten等，1997,curr.opinionbiotechnol.8:724-33；harayama,1998,trendsbiotechnol.16(2):76-82；hansson等，1999,j.mol.biol.287:265-76；以及l(fā)orenzo和blasco,1998,biotechniques24(2):308-313(這些專利和出版物各自全部按引用并入)?？梢栽谥亟M前通過易錯(cuò)pcr、隨機(jī)核苷酸插入或其他方法進(jìn)行隨機(jī)誘變來改變抗體或其片段，或編碼的抗體或其片段。編碼特異性結(jié)合gitr蛋白的抗體或其片段的多核苷酸可以與一個(gè)或多個(gè)異源分子的一個(gè)或多個(gè)組分、基序、區(qū)段、部分、結(jié)構(gòu)域、片段等重組。此外，抗體或其片段可以與標(biāo)記序列融合，如促進(jìn)純化的肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是六組氨酸(hhhhhhseqidno:11)肽，如pqe載體中提供的標(biāo)簽(qiagen，inc.，9259etonavenue，chatsworth，ca，91311)，許多標(biāo)記氨基酸序列是商業(yè)上可購(gòu)得的。如gentz等，1989，proc.natl.acad.sci.usa86:821-824中所述的，例如，六組氨酸(seqidno:11)可以用于方便地純化融合蛋白。用于純化的其他肽標(biāo)簽包括，但不限于，血凝素(“ha”)標(biāo)簽——其對(duì)應(yīng)于從流感血凝素蛋白衍生的表位(wilson等，1984,cell37:767)和“flag”標(biāo)簽。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段與診斷劑或檢測(cè)劑綴合。這樣的抗體可用于監(jiān)控或預(yù)后疾病或病癥的發(fā)作、發(fā)展、進(jìn)展和/或嚴(yán)重性，作為臨床檢查程序的一部分，如確定特定治療的功效?？梢酝ㄟ^將抗體與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)來實(shí)現(xiàn)這樣的診斷和檢測(cè)，所述物質(zhì)包括，但不限于，各種酶，如，但不限于，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基，如，但不限于，鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；熒光材料如，但不限于，傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料，如，但不限于，魯米諾；生物發(fā)光材料，如但不限于，螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白(aequorin)；放射性材料，如，但不限于，碘(131i、125i、123i和121i)、碳(14c)、硫(35s)、氚(3h)、銦(115in、113in、112in和111in)、锝(99tc)、鉈(201ti)、鎵(68ga、67ga)、鈀(103pd)、鉬(99mo)、氙(133xe)、氟(18f)、153sm、177lu、159gd、149pm、140la、175yb、166ho、90y、47sc、186re、188re、142pr、105rh、97ru、68ge、57co、65zn、85sr、32p、153gd、169yb、51cr、54mn、75se、113sn和117tin；以及使用各種正電子發(fā)射斷層掃描的正電子發(fā)射金屬，和非放射性順磁性金屬離子。本發(fā)明進(jìn)一步包括與改變給定的生物作用或應(yīng)答的治療性部分或藥物部分綴合的抗體或其片段，以及與治療性部分綴合的抗體或其片段的用途。治療性部分或藥物部分不應(yīng)理解為限于傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白、肽或多肽。這樣的蛋白可以包括，例如，毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素a、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白，如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原激活劑、凋亡劑、抗血管生成劑；或，生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，例如，淋巴因子?？贵w或其片段可以與治療性部分綴合，如細(xì)胞毒素，例如，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或細(xì)胞殺傷劑、治療劑或放射性金屬離子，例如，α-發(fā)射體。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何物質(zhì)。例如，抗體可以與治療性部分綴合，所述治療性部分如放射性金屬離子，如α-發(fā)射體，如213bi，或用于將放射性金屬離子綴合至多肽的大環(huán)螯合劑，所述金屬離子包括但不限于，131in、131lu、131y、131ho、131sm。在某些實(shí)施方案中，大環(huán)螯合劑是1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-n,n’,n”,n”’-四乙酸(dota)，其可以經(jīng)由銜接物分子連接抗體。這樣的銜接物分子包括例如，甘氨酸銜接物，例如，ggggs(seqidno:15)，其可以任選是重復(fù)的，例如，ggggsggggsggggs(seqidno:18)，或其他銜接物是本領(lǐng)域通常已知的并且描述于denardo等，1998，clincancerres.4(10):2483-90；peterson等，1999，bioconjug.chem.10(4):553-7和zimmerman等，1999,nucl.med.biol.26(8):943-50，所述文獻(xiàn)均按引用全部并入。用于將治療性部分與抗體綴合的技術(shù)是公知的，參見，例如，arnon等，“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”，見monoclonalantibodiesandcancertherapy，reisfeld等(編輯)，pp.243-56(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等，“antibodiesfordrugdelivery”，見controlleddrugdelivery(第2版)，robinson等(編輯)，pp.623-53(marceldekker,inc.1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”，見monoclonalantibodies84:biologicalandclinicalapplications，pinchera等(編輯)，pp.475-506(1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”，見monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy，baldwin等(編輯)；pp.303-16(academicpress1985)；和thorpe等，1982,immunol.rev.62:119-58?？贵w也可以連接固體支持物，其對(duì)于靶抗原的免疫測(cè)定試驗(yàn)或純化特別有用。這樣的固體支持物包括，但不限于，玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。編碼激動(dòng)劑抗gitr抗體的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式，包括但不限于，重組表達(dá)、化學(xué)合成和抗體四聚體的酶消化，產(chǎn)生抗-gitr抗體、抗原結(jié)合分子及其片段，而全長(zhǎng)單克隆抗體可以通過例如雜交瘤或重組生產(chǎn)來獲得。重組表達(dá)可以來自本領(lǐng)域已知的任何合適的宿主細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、細(xì)菌宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞等。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本文中所述抗體的多核苷酸，例如，編碼重鏈或輕鏈可變區(qū)或包含本文中所述的互補(bǔ)決定區(qū)的區(qū)段的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈可變區(qū)的多核苷酸包含與選自seqidno:51、seqidno:53、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:101和seqidno:107的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈可變區(qū)的多核苷酸包含與選自seqidno:52、seqidno:54和seqidno:102的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:67的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:72的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:73的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:74的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:76的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:78的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:68的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:103的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:104的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:108的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:104的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與seqidno:60的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與seqidno:58的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。本發(fā)明的多核苷酸可以只編碼抗-gitr抗體的可變區(qū)序列。它們還可以編碼抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)。一些多核苷酸序列編碼包含示例的小鼠抗-gitr抗體之一的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的多肽。一些其他多核苷酸編碼分別與小鼠抗體之一的重鏈和輕鏈可變區(qū)基本上相同的兩個(gè)多肽區(qū)段。通過從頭固相dna合成或通過pcr誘變編碼抗-gitr抗體或其結(jié)合片段的現(xiàn)有序列(例如，本文中所述的序列)，可以產(chǎn)生多核苷酸序列。可以通過本領(lǐng)域已知的方法來完成核酸的直接化學(xué)合成，如narang等，meth.enzymol.68:90,1979的磷酸三酯方法；brown等，meth.enzymol.68:109,1979的磷酸二酯方法；beaucage等，tetra.lett.,22:1859,1981的二乙基亞磷酰胺方法；和美國(guó)專利no.4,458,066的固體支持物方法?？梢园凑绽鏿crtechnology:principlesandapplicationsfordnaamplification,h.a.erlich(編輯)，freemanpress,ny,ny,1992；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,innis等(編輯)，academicpress,sandiego,ca,1990；mattila等，nucleicacidsres.19:967,1991；和eckert等，pcrmethodsandapplications1:17,1991中所述的，通過pcr將突變引入多核苷酸序列中。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)上述抗-gitr抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。各種表達(dá)載體可以用于表達(dá)編碼抗-gitr抗體鏈、片段或結(jié)合片段的多核苷酸?；诓《镜暮头遣《镜谋磉_(dá)載體都可以用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生抗體。非病毒載體和系統(tǒng)包括質(zhì)粒、附加型載體，通常具有用于表達(dá)蛋白或rna的表達(dá)盒，以及人的人工染色體(參見，例如harrington等，natgenet15:345，1997)。例如，用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)細(xì)胞中表達(dá)抗-gitr多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pthiohisa、b&c，pcdna3.1/his，pebvhisa、b&c(invitrogen，sandiego，ca)，mpsv載體和各種本領(lǐng)域已知的用于表達(dá)其他蛋白的載體。有用的病毒載體包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒的載體，基于sv40、乳頭狀瘤病毒、hbpeb病毒的載體，痘苗病毒載體和semliki森林病毒(sfv)載體。參見，brent等，上引文；smith，annu.rev.microbiol.49:807，1995和rosenfeld等，cell68:143，1992。表達(dá)載體的選擇取決于打算在其中表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。通常，表達(dá)載體含有可操作地連接編碼抗-gitr抗體鏈或片段的多核苷酸的啟動(dòng)子和其他調(diào)控序列(例如，增強(qiáng)子)。在一些實(shí)施方案中，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來防止插入序列在誘導(dǎo)條件之外的條件下表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括，例如，阿拉伯糖、lacz、金屬硫蛋白啟動(dòng)子或熱休克啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化的生物體可以在非誘導(dǎo)條件下擴(kuò)大培養(yǎng)，不偏向編碼序列的表達(dá)產(chǎn)物被宿主細(xì)胞更耐受的群體。除了啟動(dòng)子，對(duì)于有效表達(dá)抗-gitr抗體鏈或片段，還可能需要或期望其他調(diào)控元件。這些元件通常包括atg起始密碼子和鄰近的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或其他序列。此外，可以通過包含適用于所使用的細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來增強(qiáng)表達(dá)效率(參見，例如，scharf等，resultsprobl.celldiffer.20:125,1994；和bittner等，meth.enzymol.,153:516,1987)。例如，sv40增強(qiáng)子或cmv增強(qiáng)子可以用于提高哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。表達(dá)載體還可以提供分泌信號(hào)序列位置，以與插入的抗-gitr抗體序列編碼的多肽形成融合蛋白。更常見的，包含在載體中之前，插入的抗-gitr抗體序列與信號(hào)序列連接。用于接收編碼抗-gitr抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的載體有時(shí)候也可以編碼恒定區(qū)或其部分。這樣的載體允許表達(dá)可變區(qū)與恒定區(qū)的融合蛋白，由此導(dǎo)致完整抗體或其片段的產(chǎn)生。通常，這樣的恒定區(qū)是人的。用于攜帶和表達(dá)抗-gitr抗體鏈的宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。大腸桿菌是用于克隆和表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的一種原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌，如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，如沙門氏菌屬(salmonella)、沙雷氏菌屬(serratia)和各種假單胞菌屬(pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以制備表達(dá)載體，其通常含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))。此外，可以存在任何數(shù)量的各種公知的啟動(dòng)子，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)、或來自噬菌體λ的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子通?？刂票磉_(dá)，任選具有操作子序列，并且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，用于啟動(dòng)和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。其他微生物，如酵母，也可以用于表達(dá)本發(fā)明的抗-gitr多肽。還可以使用昆蟲細(xì)胞結(jié)合桿狀病毒載體。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，將哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞用于表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的抗-gitr多肽。例如，它們可以是表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白基因的雜交瘤細(xì)胞系(例如，實(shí)施例中所述的骨髓瘤雜交瘤克隆)或攜帶外源表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如，以下示例的sp2/0骨髓瘤細(xì)胞)。這些包括任何正常的非永生化的或正?；虍惓５挠郎膭?dòng)物或人細(xì)胞。例如，已經(jīng)研發(fā)了各種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細(xì)胞系，包括cho細(xì)胞系、各種cos細(xì)胞系、hela細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的b-細(xì)胞和雜交瘤。使用哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物來表達(dá)多肽，一般性地討論于例如winnacker，fromgenestoclones，vchpublishers，n.y.，n.y.，1987。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(參見，例如，queen等，immunol.rev.89:49-68，1986)，和必需的加工信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。這些表達(dá)載體通常含有源自哺乳動(dòng)物基因或哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子可以是組成型的、細(xì)胞類型特異性的、階段特異性的和/或可調(diào)節(jié)或可調(diào)控的。有用的啟動(dòng)子包括，但不限于，金屬硫蛋白啟動(dòng)子、組成型腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、地塞米松-誘導(dǎo)型mmtv啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、mrppoliii啟動(dòng)子、組成型mpsv啟動(dòng)子、四環(huán)素誘導(dǎo)型cmv啟動(dòng)子(如人立即早期cmv啟動(dòng)子)、組成型cmv啟動(dòng)子和本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合。用于引入含有目標(biāo)多核苷酸序列的表達(dá)載體的方法可以根據(jù)細(xì)胞宿主的類型而改變。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可以用于其他細(xì)胞宿主(總地參見sambrook等，上引文)。其他方法包括，例如，電穿孔、磷酸鈣處理、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、注射和微注射、生物導(dǎo)彈法、病毒顆粒、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子:核酸綴合物、裸dna、人工病毒粒子、與皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白vp22融合(elliotando'hare，cell88:223，1997)、試劑增強(qiáng)的dna吸收和離體轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于長(zhǎng)期、高產(chǎn)量的重組蛋白生產(chǎn)，常常將需要穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源性表達(dá)元件和選擇標(biāo)記基因的本發(fā)明表達(dá)載體，制備穩(wěn)定表達(dá)抗-gitr抗體鏈或結(jié)合片段的細(xì)胞系。引入載體后，可以在轉(zhuǎn)換至選擇培養(yǎng)基之前，允許細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天。選擇標(biāo)記的目的是賦予對(duì)選擇的抗性，其存在允許成功表達(dá)引入的序列的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。使用適于細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)，可以使抗性、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖。鑒定激動(dòng)劑抗-gitr抗體的試驗(yàn)用于鑒定激動(dòng)劑抗-gitr抗體的試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的并且描述于本文中。激動(dòng)劑抗-gitr抗體結(jié)合gitr并促進(jìn)、誘導(dǎo)、刺激通過gitr的胞內(nèi)信號(hào)傳輸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定抗-gitr抗體與gitr的結(jié)合。例如，可以使用已知技術(shù)，包括但不限于elisa、western印跡、表面等離子體共振(例如，biacore)和流式細(xì)胞術(shù)，測(cè)定與gitr的結(jié)合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來測(cè)量通過gitr的胞內(nèi)信號(hào)傳輸。例如，通過gitr的激活促進(jìn)nfκb和mapk信號(hào)傳輸。用于測(cè)量nfκb和mapk激活的方法是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的(例如，使用報(bào)告基因試驗(yàn)、nfκb蛋白的核易位、mapk蛋白的磷酸化狀態(tài))。通過gitr的激活是共刺激信號(hào)，其在通過t-細(xì)胞受體的激活存在下(例如，在主要或靶抗原的存在下)促進(jìn)激活的cd4+和cd8+t細(xì)胞增殖。用于測(cè)量細(xì)胞增殖的方法是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的(例如，3h-胸苷摻入試驗(yàn)、cfse標(biāo)記)。在存在通過t-細(xì)胞受體的激活的情況下，通過gitr的信號(hào)傳輸也共刺激激活的cd4+和cd8+t細(xì)胞，以產(chǎn)生細(xì)胞因子。通過gitr的信號(hào)傳輸還共刺激激活的nk細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子。細(xì)胞因子可以是th1-型細(xì)胞因子(例如，干擾素-γ、il-2和tnf)和th2-型細(xì)胞因子(例如，il-4、il-5、il-10和il-13)中的一者或兩者。用于測(cè)量細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法是本領(lǐng)域公知的(例如，elisa試驗(yàn)、elispot試驗(yàn))。通過gitr的激活還可以誘導(dǎo)凋亡。用于測(cè)量細(xì)胞凋亡的方法是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的(例如，膜聯(lián)蛋白v染色)。在進(jìn)行體外試驗(yàn)時(shí)，可以將接觸激動(dòng)劑抗-gitr抗體的試驗(yàn)細(xì)胞或來自試驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，與沒有接觸過激動(dòng)劑抗-gitr抗體的對(duì)照細(xì)胞或來自對(duì)照細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，進(jìn)行比較。還可以在體內(nèi)測(cè)量本發(fā)明抗體的gitr激動(dòng)劑功能。優(yōu)選的激動(dòng)劑抗-gitr抗體具有激活和擴(kuò)增cd4+和cd8+t細(xì)胞的能力?？梢砸允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，例如，通過流式細(xì)胞術(shù)，來測(cè)量cd4+和cd8+t細(xì)胞的體內(nèi)激活和擴(kuò)增。優(yōu)選的激動(dòng)劑抗-gitr抗體可以在治療上用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或促進(jìn)腫瘤縮小?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法(例如，視覺觀察、卡尺、重量、成像技術(shù)，包括mri)來測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)，或其抑制。優(yōu)選的激動(dòng)劑抗-gitr抗體可以在治療上用于預(yù)防、降低、抑制或消除感染性疾病的致病因素，例如細(xì)菌、真菌、病毒或寄生物感染?？梢酝ㄟ^將治療有效量的抗體施用于受試者并比較施用抗體前后的受試者來確定激動(dòng)劑抗-gitr抗體在提升t-細(xì)胞應(yīng)答或降低疾病嚴(yán)重性中的功效。還可以通過將治療有效量的抗體施用于試驗(yàn)受試者并將試驗(yàn)受試者與沒有施用抗體的對(duì)照受試者比較來確定激動(dòng)劑抗-gitr抗體在提升t-細(xì)胞應(yīng)答或降低疾病嚴(yán)重性中的功效。包含激動(dòng)劑抗-gitr抗體的組合物本發(fā)明提供包含與藥物學(xué)上可接受的載體配制在一起的本發(fā)明抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子的藥物組合物。任選，藥物組合物另外含有適用于治療或預(yù)防給定疾病的一種或多種其他治療劑。藥物學(xué)上可接受的載體增強(qiáng)或穩(wěn)定組合物，或促進(jìn)組合物的制備。藥物學(xué)上可接受的載體包括生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法來施用。施用途徑和/或方式可以根據(jù)所需結(jié)果來改變。優(yōu)選施用是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，或接近靶位點(diǎn)施用。藥物學(xué)上可接受的載體應(yīng)當(dāng)適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、鼻內(nèi)、吸入、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，活性化合物，例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段或多價(jià)分子(例如，單特異性、雙特異性或多特異性分子)，可以包裹在材料中，以保護(hù)化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然條件的作用?？贵w或其片段，單獨(dú)或結(jié)合其他合適的組分，可以制成氣溶膠制劑(即，它們可以被“噴霧”)，以通過吸入施用。氣溶膠制劑可以放入加壓的可接受推進(jìn)劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾?。在一些?shí)施方案中，組合物是無菌的且是流體。例如，通過使用包衣，如卵磷脂，在分散體的情況中通過維持所需的顆粒大小、或通過使用表面活性劑，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況中，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如，糖，多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇，以及氯化鈉。可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁或明膠，來實(shí)現(xiàn)可注射組合物的長(zhǎng)期吸收。在某些實(shí)施方案中，可以使用合適的賦形劑(例如，蔗糖)，將組合物制成凍干形式用于儲(chǔ)存。可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的和常規(guī)實(shí)踐的方法，制備本發(fā)明的藥物組合物。藥物學(xué)上可接受的載體部分決定于所施用的特定組合物以及用于施用組合物的特定方法。因此，存在各種合適的本發(fā)明的藥物組合物的制劑。適用于配制抗體以及確定合適的劑量和時(shí)間表的方法可以見于，例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，universityofthesciencesinphiladelphia，編輯，lippincottwilliams&wilkins(2005)；和martindale:thecompletedrugreference,sweetman,2005,london:pharmaceuticalpress；以及martindale,martindale:theextrapharmacopoeia，第31版，1996，amerpharmaceuticalassn；以及sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson編輯，marceldekker,inc.,newyork,1978，將每篇文獻(xiàn)按引用并入本文中。藥物組合物優(yōu)選在gmp條件下制造。通常，在本發(fā)明的藥物組合物中使用治療有效劑量或有效劑量的抗-gitr抗體。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將抗-gitr抗體配制成藥物學(xué)上可接受的劑型。調(diào)節(jié)劑量方案，以提供所需的應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。在確定治療或預(yù)防有效劑量中，可以施用低劑量，然后逐漸遞增，直至獲得所需應(yīng)答和最小或沒有不合需要的副作用。例如，可以施用單個(gè)大丸劑(bolus)，可以在一段時(shí)間內(nèi)施用幾個(gè)分劑量，或可以按照治療情況的緊急性所指示的，按比例地降低或增加劑量。尤為有利的是，為了易于施用和劑量的均一性，配制單位劑型的腸胃外組合物。本文中所用的單位劑型是指，適宜作為單元?jiǎng)┝坑糜诖委熓茉囌叩奈锢砩戏珠_的單位；每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算可以產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性化合物和所需的藥物載體。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變，以獲得對(duì)于特定患者、組合物和施用方式而言可以有效實(shí)現(xiàn)所需治療應(yīng)答的活性成分量，而對(duì)患者沒有毒性。選定的劑量水平取決于各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑，施用時(shí)間，待使用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與所用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)，待治療患者的年齡、性別、重量、狀況、整體健康和之前的醫(yī)療史，以及類似因素。與第二藥劑的共配制在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與第二藥劑的混合物。與本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗原結(jié)合分子一起包括在混合物中的示例性第二藥劑包括但不限于，主要或靶抗原、提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性的藥劑、抑制或遏制共抑制信號(hào)的藥劑。本發(fā)明的抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與主要或靶抗原共同配制(即，作為混合物來提供或制備在混合物中)。靶抗原，或疫苗，將取決于待治療的疾病狀況。例如，靶抗原可以來自腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌、病毒或寄生物。根據(jù)情況，靶抗原可以是肽、多肽、細(xì)胞或多核苷酸的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶抗原來自病毒，例如，選自：甲肝、乙肝、丙肝、流感、水痘、腺病毒、i型單純皰疹病毒(hsvi)、ii型單純皰疹(hsvii)、牛痘病毒、鼻病毒、埃可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、巨細(xì)胞病毒、echinovirus、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、i型人免疫缺陷病毒(hivi)和ii型人免疫缺陷病毒(hivii)、任何小核糖核酸病毒科病毒、腸病毒、杯狀病毒科、諾沃克病毒組中的任何一種病毒、披膜病毒，如甲病毒、黃病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒、馬爾堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亞病毒(bunyavirus)、沙粒病毒、呼腸弧病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病毒、i型人t細(xì)胞白血病病毒、ii型人t細(xì)胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、細(xì)小病毒、eb病毒、人皰疹病毒6、猿猴皰疹病毒1(b病毒)和痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶抗原來自細(xì)菌，例如，選自：奈瑟氏菌屬(neisseriaspp)、鏈球菌屬(streptococcusspp)、變形鏈球菌(s.mutans)、嗜血桿菌屬(haemophilusspp.)、莫拉氏菌屬(moraxellaspp)、博德特氏菌屬(bordetellaspp)、分枝桿菌屬(mycobacteriumspp)、軍團(tuán)菌屬(legionellaspp)、埃希氏菌屬(escherichiaspp)、弧菌屬(vibriospp)、耶爾森氏菌屬(yersiniaspp)、彎曲菌屬(campylobacterspp)、沙門氏菌屬(salmonellaspp)、李斯特氏菌屬(listeriaspp.)、螺桿菌屬(helicobacterspp)、假單胞菌屬(pseudomonasspp)、葡萄球菌屬(staphylococcusspp.)、腸球菌屬(enterococcusspp)、梭菌屬(clostridiumspp.)、芽孢桿菌屬(bacillusspp)、棒狀桿菌屬(corynebacteriumspp.)、疏螺旋體屬(borreliaspp.)、埃里希氏體屬(ehrlichiaspp)、立克次氏體屬(rickettsiaspp)、衣原體屬(chlamydiaspp.)、鉤端螺旋體屬(leptospiraspp.)、密螺旋體屬(treponemaspp)。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與腫瘤相關(guān)抗原(taa)共同配制在混合物中。taa可以是分離的多肽或肽，可以是完整細(xì)胞的一部分或腫瘤細(xì)胞裂解物的一部分。taa可以是多核苷酸，例如，包含編碼一個(gè)或多個(gè)taa的多核苷酸的裸露質(zhì)?；虿《据d體。已知的taa實(shí)例包括，不限于，黑素瘤相關(guān)抗原(mage-1、mage-3、trp-2、黑素瘤膜糖蛋白gp100、gp75以及與黑素瘤相關(guān)的muc-1(粘液素-1))；cea(癌胚抗原)，其可以例如與卵巢、黑素瘤或結(jié)腸癌相關(guān)；由卵巢癌表達(dá)的葉酸受體α；由許多不同腫瘤，包括但不限于骨髓瘤，表達(dá)的游離人絨毛膜促性腺激素β(hcgβ)亞基；與乳腺癌相關(guān)的her-2/neu；與小細(xì)胞肺癌相關(guān)的腦脊髓炎抗原h(huán)ud；與神經(jīng)母細(xì)胞瘤相關(guān)的酪氨酸羥化酶；與前列腺癌相關(guān)的前列腺特異性抗原(psa)；與卵巢癌相關(guān)的ca125；并且b細(xì)胞淋巴瘤的獨(dú)特型決定簇可以產(chǎn)生腫瘤特異性免疫性(歸因于獨(dú)特型-特異性體液免疫應(yīng)答)。此外，人1型t細(xì)胞白血病病毒的抗原已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)對(duì)抗病毒誘導(dǎo)的人成年t細(xì)胞白血病(atl)的特異性ctl應(yīng)答和抗腫瘤免疫性。參見，例如，haupt等，experimentalbiologyandmedicine(2002)227:227-237；ohashi等，journalofvirology(2000)74(20):9610-9616。其他taa是已知的并且可以用于與抗-gitr抗體共同配制。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子，與來自患者的自體腫瘤細(xì)胞或來自另一位患者的相同組織類型的同種異體腫瘤細(xì)胞，共同配制。腫瘤細(xì)胞可以是完整細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物、凋亡的腫瘤細(xì)胞或腫瘤總mrna的形式?？梢赞D(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，以表達(dá)增強(qiáng)或提高腫瘤細(xì)胞在患者中的免疫原性的多肽，例如，轉(zhuǎn)染以表達(dá)粒細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)。腫瘤細(xì)胞可以來自任何癌組織，包括不限于，上皮癌或癌瘤，以及肉瘤和淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、卵巢癌、腎癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌(nsclc))、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、纖維肉瘤、血液癌癥、或頭頸鱗狀細(xì)胞癌(hnscc)。參見，例如，pardee等，immunotherapy(2009)1(2):249-264，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞來自例如胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔或咽喉的癌癥、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、和血液組織的癌癥。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與細(xì)胞毒性劑共同配制。例如，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與結(jié)合并減少或耗盡cd4+cd25+調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)的激動(dòng)劑抗體或抗原結(jié)合分子共同配制。示例性treg細(xì)胞耗竭性抗體或抗原結(jié)合分子結(jié)合cd25或ccr4。參見expertopintherpatents(2007)17(5):567-575，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與共抑制信號(hào)的抑制劑共同配制。示例性抑制劑包括ctla-4的抑制劑和pd-1/pd-l1(例如，b7-b1)相互作用的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制ctla-4的抗體共同配制。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制tim3的抗體共同配制。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制lag3的抗體共同配制。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制pd-1的抗體共同配制。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制b7-h1的抗體共同配制。參見，例如，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575；和melero等，clincancerres(2009)15(5):1507-1509，和其中討論的參考文獻(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，制劑包含包括抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子和共抑制信號(hào)的抑制劑的雙特異性分子。在一些實(shí)施方案中，制劑包含包括抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子和ctla4的抑制劑的雙特異性分子。在一些實(shí)施方案中，制劑包含包括抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子和tim3的抑制劑的雙特異性分子。在一些實(shí)施方案中，制劑包含包括抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子和lag3的抑制劑的雙特異性分子。在一些實(shí)施方案中，制劑包含包括抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子和pd-1/pd-l1的抑制劑的雙特異性分子。在一些實(shí)施方案中，制劑包含包括抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子和抑制劑b7h1的雙特異性分子。pd-1抑制劑在一些實(shí)施方案中，將gitr激動(dòng)劑與pd-1抑制劑組合使用，例如，如wo2015/026684中描述的pd-1抑制劑。在一些實(shí)施方案中，pd-1抑制劑是選自nivolumab、pembrolizumab或pidilizumab的抗pd-1抗體。在一些實(shí)施方案中，抗pd-1抗體是nivolumab。nivolumab的替代名包括mdx-1106、mdx-1106-04、ono-4538或bms-936558。在一些實(shí)施方案中，抗pd-1抗體是nivolumab(cas注冊(cè)號(hào)：946414-94-4)。nivolumab是完全人igg4單克隆抗體，其特異性阻斷pd1。nivolumab(克隆5c4)和特異性結(jié)合pd1的其他人單克隆抗體公開于us8,008,449和wo2006/121168。在一個(gè)實(shí)施方案中，pd-1的抑制劑是nivolumab，并且具有其中公開的序列(或與該具體序列基本上相同或相似的序列，例如，至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。在一些實(shí)施方案中，抗pd-1抗體是pembrolizumab。pembrolizumab(也稱為lambrolizumab、mk-3475、mk03475、sch-900475或merck)是結(jié)合pd-1的人源化igg4單克隆抗體。pembrolizumab和其他人源化抗pd-1抗體公開于hamid，o.等，(2013)newenglandjournalofmedicine369(2):134–44，us8,354,509和wo2009/114335。在一個(gè)實(shí)施方案中，pd-1的抑制劑是公開于例如us8,354,509和wo2009/114335中的pembrolizumab，并具有其中公開的序列(或與其基本上相同或相似的序列，例如，與該指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。在一些實(shí)施方案中，抗pd-1抗體是pidilizumab。pidilizumab(ct-011；curetech)是結(jié)合pd1的人源化igg1k單克隆抗體。pidilizumab和其他人源化抗pd-1單克隆抗體公開于wo2009/101611。其他抗pd1抗體包括amp514(amplimmune)，以及例如，us8,609,089、us2010028330和/或us20120114649中公開的抗pd1抗體。在一些實(shí)施方案中，pd-1抑制劑是免疫粘附素(例如，包含與恒定區(qū)(例如，免疫球蛋白序列的fc區(qū))融合的pd-l1或pd-l2的胞外或pd-1結(jié)合部分的免疫粘附素)。在一些實(shí)施方案中，pd-1抑制劑是amp-224(b7-dcig；amplimmune；例如，公開于wo2010/027827和wo2011/066342中)，其是阻斷pd-1和b7-h1之間的相互作用的pd-l2fc融合可溶性受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合包括抗-gitr抗體分子，例如，本文中所述的，和抗pd-1抗體，例如wo2015/112900中公開的并且具有其中公開的序列(或與其基本上相同或相似的序列，例如，與指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)的抗pd-1抗體。pd-l1或pd-l2抑制劑在一些實(shí)施方案中，pd-l1抑制劑是抗體分子。在一些實(shí)施方案中，抗pd-l1抑制劑選自yw243.55.s70、mpdl3280a、medi-4736、msb-0010718c或mdx-1105。在一些實(shí)施方案中，抗pd-l1抗體是msb0010718c。msb0010718c(也稱為a09-246-2；merckserono)是結(jié)合pd-l1的單克隆抗體。pembrolizumab和其他人源化抗pd-l1抗體公開于wo2013/079174，并且具有其中公開的序列(或與其基本上相同或相似的序列，例如，與指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pd-l1抑制劑是yw243.55.s70。yw243.55.s70抗體是wo2010/077634中公開的抗pd-l1(重鏈和輕鏈可變區(qū)分別顯示在seqidno.20和21中)，并且具有其中公開的序列(或與其基本上相同或相似的序列，例如，與指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。在一些實(shí)施方案中，pd-l1抑制劑是mdx-1105。mdx-1105，也稱為bms-936559，是wo2007/005874中描述的抗pd-l1抗體，并且具有其中公開的序列(或與其基本上相同或相似的序列，例如，與指定的序列至少85％、90％、95％相同或更高同一性的序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pd-l1抑制劑是mdpl3280a(genentech/roche)。mdpl3280a是結(jié)合pd-l1的人fc優(yōu)化的igg1單克隆抗體。mdpl3280a和其他的人單克隆pd-l1抗體公開于美國(guó)專利no.:7,943,743和美國(guó)公開no.:20120039906中。在其他實(shí)施方案中，pd-l2抑制劑是amp-224。amp-224是阻斷pd1和b7-h1之間的相互作用的pd-l2fc融合可溶性受體(b7-dcig；amplimmune；例如，公開于wo2010/027827和wo2011/066342)。lag-3抑制劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中所述的組合包括lag-3抑制劑。在一些實(shí)施方案中，將組合用于治療癌癥，例如，本文中所述的癌癥，例如，實(shí)體腫瘤或血液學(xué)惡性疾病。在一些實(shí)施方案中，抗lag-3抗體是bms-986016。bms-986016(也稱為bms986016；bristol-myerssquibb)是結(jié)合lag-3的單克隆抗體。bms-986016和其他人源化抗lag-3抗體公開于us2011/0150892、wo2010/019570和wo2014/008218。在一些實(shí)施方案中，抗lag-3抗體是wo2015/138920中公開的人源化抗lag3抗體。tim-3抑制劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中所述的組合包括tim-3抑制劑。在一些實(shí)施方案中，將組合用于治療癌癥，例如，本文中所述的癌癥，例如，實(shí)體腫瘤或血液學(xué)惡性疾病。示例性抗tim-3抗體公開于美國(guó)專利no.:8,552,156、wo2011/155607、ep2581113和u.s公開no.:2014/044728中。在一些實(shí)施方案中，抗-tim3是wo2015/117002中公開的人源化abtim3mab。ctla-4抑制劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中描述的組合包括ctla-4抑制劑。在一些實(shí)施方案中，將組合用于治療癌癥，例如，本文中所述的癌癥，例如，實(shí)體腫瘤或血液學(xué)惡性疾病。示例性抗-ctla4抗體包括tremelimumab(獲自pfizer的igg2單克隆抗體，之前稱為ticilimumab，cp-675,206)；和ipilimumab(ctla-4抗體，也稱為mdx-010，casno.477202-00-9)。其他示例性抗ctla-4抗體公開于例如美國(guó)專利no.5,811,097?？?gitr抗體或抗原結(jié)合分子也可以與一種或多種免疫刺激劑共同配制。例如，在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與免疫刺激性細(xì)胞因子共同配制，例如，il-7、il-12或il-15。或者，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與第二免疫刺激性抗體共同配制。例如，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子也可以與另一腫瘤壞死因子受體超家族成員的激動(dòng)劑抗體或抗原結(jié)合分子共同配制。示例性的第二免疫刺激性靶包括不限于tnfrsf4腫瘤壞死因子受體超家族成員4(也稱為ox40)或腫瘤壞死因子受體超家族成員9(也稱為tnfrsf9、4-1bb或cd137)。參見，例如，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575；pardee等，immunotherapy(2009)1(2):249-264；和melero等，clincancerres(2009)15(5):1507-1509，和其中討論的參考文獻(xiàn)?？?gitr抗體或抗原結(jié)合分子也可以與化療劑共同配制。選擇的藥劑將取決于待治療的病癥，例如，癌癥或感染性疾病，如細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生物感染?？?gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于治療待治療病癥的化學(xué)治療劑共同配制?；瘜W(xué)治療劑，如，用于治療癌癥和感染性疾病的化學(xué)治療劑，是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如goodmanandgilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics，第11版，brunton,lazo和dparker編輯，mcgraw-hill(2006)；2010physicians’deskreference(pdr)，第64版，thomsonpdr。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與抗腫瘤劑共同配制。可以用于與抗-gitr抗體混合在組合物中的示例性抗腫瘤劑包括烷化劑(例如，氮芥、乙撐亞胺和甲基蜜胺、甲肼衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯(triazene)和鉑配位復(fù)合物)；抗代謝物(例如，葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物)；天然產(chǎn)物(例如，長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷、表鬼臼毒素、喜樹堿、抗生素和蒽二酮)。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與抗代謝物抗腫瘤劑共同配制，例如，葉酸類似物(例如，氨甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、曲美沙特(trimetrexate))、嘧啶類似物(例如，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、阿胞糖苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine))、嘌呤類似物(例如，巰基嘌呤(mercaptopurine)、噴司他丁(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、氟達(dá)拉濱(fludarabine))，或其混合物。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與烷化劑抗腫瘤劑共同配制，例如，氮芥(nitrogenmustards)(例如，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙撐亞胺(ethyleneimines)(例如，六甲蜜胺(altretamine))和甲基蜜胺(methylmelamines)(例如，噻替派(thiotepa))、甲肼衍生物(methylhydrazinederivatives)(例如，甲基芐肼(procarbazine))、烷基磺酸鹽(例如，白消安(busulfan))、亞硝基脲(例如，卡氮芥(carmustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin))、三氮烯(例如，達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide))和鉑配位復(fù)合物(例如，順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin))。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與抗病毒劑共同配制。示例性抗病毒劑包括不限于抗皰疹病毒劑(例如，無環(huán)鳥苷(acyclovir)、西多福韋(cidofovir)、泛昔洛韋(famciclovir)、佛斯卡耐特(foscarnet)、thiovir、福米韋生(fomivirsen)、更昔洛韋(ganciclovir)、idoxuridine、噴昔洛韋(penciclovir)、三氟胸苷(trifluridine)、伐昔洛韋(valacyclovir)、valgenciclovir、瑞喹莫德(resiquimod))；抗流感劑(例如，金剛烷胺(amantadine)、奧司他韋(oseltamivir)、金剛乙胺(rimantadine)、扎那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、e-118958)；抗肝炎劑(例如，阿德福韋酯(adeforvirdipivoxil)、干擾素-α、拉米夫定(lamivudine)、恩替卡韋(entecavir)、克萊夫定(clevudine)、恩曲他濱(emtricitabine)、替比夫定(telbivudine)、替諾福韋(tenofovir)、塔利韋林(viramidine)、biln2061、nm283)，和其他抗病毒劑(例如，病毒唑、咪喹莫特、馬立巴韋、sicam-1、pleconaril)?？共《緞┛梢允强鼓孓D(zhuǎn)錄病毒劑。示例性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑包括不限于齊多夫定(zidovudine)、去羥肌苷(didanosine)、司他夫定(stavudine)、扎西他濱(zalcitabine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韋(abacavir)、tenofavir、恩去他濱(emtricitabine)、奈韋拉平(nevirapine)、依法韋侖(efavirenz)、地拉夫定(delavirdine)、沙奎那韋(saquinavir)、茚地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)、那非那韋(nelfinavir)、安潑那韋(amprenavir)、洛匹那韋(lopinavir)、阿扎那韋(atazanavir)、福沙那韋(fosamprenavir)和恩夫韋地(enfuvirtide)。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與抗細(xì)菌劑共同配制。示例性抗細(xì)菌劑包括不限于磺酰胺類(例如，氨苯磺胺(sulfanilamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲基異唑(sulfamethoxazole)、磺胺異唑(sulfisoxazole)、磺胺醋酰(sulfacetamide))、三甲氧芐二氨嘧啶(trimethoprim)、喹諾酮(quinolones)(例如，萘啶酮酸(nalidixicacid)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、perloxacin、左氧氟沙星(levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)和吉米沙星(gemifloxacin))、六亞甲基四胺(methenamine)、硝基呋喃妥英(nitrofurantoin)、青霉素類(penicillins)(例如，青霉素g、青霉素v、甲氧西林(methicilin)、苯唑西林(oxacillin)、鄰氯青霉素(cloxacillin)、雙氯青霉素(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcilin)、氨芐青霉素(ampicillin)、羥氨芐青霉素(amoxicillin)、羧芐青霉素(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)和哌拉西林(piperacillin))、頭孢菌素類(cephalosporins)(例如，頭孢唑林(cefazolin)、頭孢氨芐(cephalexin)、頭孢羥氨芐(cefadroxil)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羅奇(cefprozil)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢呋辛酯(cefuroximeacetil)、洛拉卡比(loracarbef)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢雷特(ceforanide)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟酯(cefpodoximeproxetil)、頭孢布烯(cefibuten)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢妥侖匹酯(cefditorenpivorxil)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢三嗪(ceftriaxone)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻甲羧肟(ceftazidime)和頭孢吡肟(cefepine))、碳青霉烯類(carbapenems)(例如，亞胺培南(imipenem)、噻肟單胺菌素(aztreonam))，和氨基糖苷類(例如，新霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、toramycin、奈替米星(netilmicin)和阿米卡星(amikacin))。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與抗寄生物劑共同配制。示例性抗寄生物劑包括不限于抗瘧疾劑(例如，喹啉類，包括氯喹(chloroquine)、甲氟喹(mefloquine)、奎寧(quinine)、奎尼丁(quinidine)和伯氨喹(primaquine)；二氨基嘧啶類，包括乙胺嘧啶(pyrimethamine)、磺胺多辛(sulfadoxine)，四環(huán)素類(tetracyclines)、阿托伐醌(atovaquone)和氯胍(proguanil))；抗原生動(dòng)物劑，包括兩性霉素(amphotericin)、氯喹(chloroquine)、依氟鳥氨酸(eflornithine)、依米丁(emetine)、煙曲霉素(fumagillin)、8-羥基喹啉類(8-hydroxyquinolines)、硫腫蜜胺(melarsoprol)、滅滴靈(metronidazole)、米特福辛(miltefosine)、硝呋莫司(nifurtimox)、硝唑尼特(nitazoxanide)、巴龍霉素(paromomycin)、噴他脒(pentamidine)、葡萄糖酸銻鈉(sodiumstibogluconate)和蘇拉明(suramin)。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子可以與抗真菌劑共同配制。示例性抗真菌劑包括不限于多烯類(polyenes)(例如，游霉素(natamycin)、龜裂霉素(rimocidin)、菲律賓菌素(filipin)、制霉菌素(nystatin)、兩性霉素b(amphotericinb)、坎底辛(candicin)和哈霉素(hamycin))、咪唑類(例如，咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、聯(lián)苯芐唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、異康唑(isoconazole)、奧昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole))、三唑類(例如，氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、里氟康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特康唑(terconazole))、噻唑類(例如，阿巴芬凈(abafungin))、烯丙胺類(allylamines)(例如，特比萘芬(terbinafine)、阿莫羅芬(amorolfine)、萘替芬(naftifine)、布替萘芬(butenafine))、棘白菌素類(echinocandins)(例如，阿尼芬凈(anidulafungin)、卡泊芬凈(caspofungin)、米卡芬凈(micafungin))、苯甲酸(benzoicacid)、環(huán)匹羅司(ciclopirox)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸(undecylenicacid)、氟胞嘧啶(flucytosine)或5-氟胞嘧啶、灰黃霉素(griseofulvin)、和鹵丙炔氧苯(haloprogin)。藥盒本發(fā)明的抗-gitr組合物可以提供于藥盒中?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子通常在小瓶或容器中。根據(jù)情況，抗體可以是液體或干燥(例如，凍干)形式。如本文中所述的，藥盒可以包含本發(fā)明的抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，并且任選還可以含有第二或第三藥劑。在一些實(shí)施方案中，藥盒含有本發(fā)明的抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子和藥物學(xué)上可接受的稀釋劑?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子可以與第二或第三藥劑在相同或分開制劑中(例如，作為混合物或在分開的容器中)提供于藥盒中。藥盒可以含有等份的抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子，以提供一個(gè)或多個(gè)劑量。如果提供用于多次施用的等份，劑量可以是均一的或不同的。根據(jù)情況，不同的劑量施用方案可以遞增或遞減?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的劑量和第二藥劑可以獨(dú)立地是均一或不同的。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有靶抗原。靶抗原，或疫苗，將取決于待治療的病況。例如，靶抗原可以來自腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌、寄生物或病毒。根據(jù)情況，靶抗原可以是肽、多肽、細(xì)胞、多核苷酸(例如，裸露的質(zhì)?；虿《据d體)的形式。在一些實(shí)施方案中，靶抗原是腫瘤相關(guān)抗原。本文中討論了示例性靶抗原；也可以使用本領(lǐng)域中已知的其他靶抗原。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有細(xì)胞毒性劑。例如，藥盒可以含有結(jié)合并減少或耗盡cd4+cd25+調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)的激動(dòng)劑抗體或抗原結(jié)合分子。示例性treg細(xì)胞耗竭性抗體或抗原結(jié)合分子結(jié)合cd25或ccr4。參見，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有共抑制信號(hào)的抑制劑。示例性抑制劑包括ctla-4、lag3、tim3的抑制劑，和/或pd-1/pd-l1(例如，b7-h1)相互作用的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有結(jié)合并抑制ctla-4的抗體。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有結(jié)合并抑制lag3的抗體。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有結(jié)合并抑制tim3的抗體。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有結(jié)合并抑制pd-1的抗體。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有結(jié)合并抑制b7-h1的抗體。參見，例如，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575；andmelero,etal.,clincancerres(2009)15(5):1507-1509，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有一種或多種免疫刺激劑。例如，在一些實(shí)施方案中，藥盒含有免疫刺激性細(xì)胞因子，例如，il-7、il-12或il-15?；蛘?，藥盒可以含有第二免疫刺激性抗體。例如，藥盒可以含有另一腫瘤壞死因子受體超家族成員的激動(dòng)劑抗體或抗原結(jié)合分子。示例性第二免疫刺激靶包括不限于tnfrsf4腫瘤壞死因子受體超家族成員4(也稱為ox40)或腫瘤壞死因子受體超家族成員9(也稱為tnfrsf9，4-1bb或cd137)。參見，例如，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575；pardee,etal,immunotherapy(2009)1(2):249-264；和melero等，clincancerres(2009)15(5):1507-1509，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，藥盒進(jìn)一步含有化學(xué)治療劑。選定的藥劑將取決于待治療的病癥，例如，癌癥或感染性疾病，如細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生物感染。示例性化學(xué)治療劑包括本領(lǐng)域已知和本文中描述的任何抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌、抗寄生物和抗真菌劑。增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答的方法接受治療或預(yù)防的病癥本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體和抗體片段可以用于在有需要的患者中提高cd4+t輔助細(xì)胞應(yīng)答和cd8+細(xì)胞溶解性t細(xì)胞應(yīng)答。因此，抗體可以用于增強(qiáng)或提高患者的t細(xì)胞應(yīng)答，例如，以實(shí)現(xiàn)對(duì)可通過增強(qiáng)或提升免疫應(yīng)答而抵抗的疾病的減輕、逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了在有需要的個(gè)體中增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段施用于個(gè)體。在一個(gè)方面中，本發(fā)明還提供了用于增強(qiáng)個(gè)體中的t細(xì)胞應(yīng)答的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含這樣的抗體或抗體片段的組合物，用于增強(qiáng)個(gè)體中的t細(xì)胞應(yīng)答。接受治療的病癥包括癌癥和感染性疾病。對(duì)于治療目的，患者可以患有癌癥或腫瘤或感染性疾病，例如，細(xì)菌、病毒、真菌或寄生物感染。對(duì)于預(yù)防目的，患者可以處于癌癥緩解中或可能預(yù)期會(huì)暴露于細(xì)菌、病毒、真菌或寄生物感染?？贵w還可以用作佐劑來增強(qiáng)或促進(jìn)或加強(qiáng)對(duì)抗主要抗原或靶抗原(例如，疫苗)的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，患者患有癌癥、懷疑患有癌癥或處于癌癥緩解中。如本文中所述的，接受用抗-gitr抗體治療的癌癥通常表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(taa)。接受治療的癌癥包括，不限于，上皮癌或癌瘤，以及肉瘤和淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、卵巢癌、腎癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌(nsclc))、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、纖維肉瘤。參見，例如，pardee等，immunotherapy(2009)1(2):249-264，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，腫瘤類型選自：胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔或咽喉的癌癥、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織的癌癥、和頭頸鱗狀細(xì)胞癌(hnscc)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療有需要的個(gè)體中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段施用于個(gè)體，如本文中所述的。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段，用于治療個(gè)體中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的抗體或抗體片段的組合物，用于減輕、抑制或預(yù)防個(gè)體中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的腫瘤生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，用于促進(jìn)個(gè)體中的癌癥的診斷或預(yù)后的方法，包括使用本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體或抗體片段，用于檢測(cè)個(gè)體中腫瘤中或周圍的gitr的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，患者患有感染性疾病，例如，細(xì)菌、病毒、真菌或寄生物感染?？?gitr激動(dòng)劑抗體可以用于減少、抑制和/或預(yù)防寄生物例如絲蟲病和利什曼病。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr激動(dòng)劑抗體可以用于治療病毒感染，所述病毒感染包括不限于肝炎病毒感染，例如，慢性丙肝(hcv)感染、單純皰疹病毒(hsv)感染或人免疫缺陷病毒(hiv)感染。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr激動(dòng)劑抗體可以用于治療病毒感染，所述病毒感染選自：甲肝、乙肝、丙肝、流感、水痘、腺病毒、i型單純皰疹病毒(hsvi)、ii型單純皰疹(hsvii)、牛痘、鼻病毒、?？刹《?、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、巨細(xì)胞病毒、echinovirus、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、i型人免疫缺陷病毒(hivi)和ii型人免疫缺陷病毒(hivii)、任何小核糖核酸病毒科病毒、腸病毒、諾沃克病毒組中的任何一種病毒、披膜病毒，如甲病毒、黃病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒、馬爾堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸弧病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病毒、i型人t細(xì)胞白血病病毒、ii型人t細(xì)胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、細(xì)小病毒、eb病毒、人皰疹病毒6、猿猴皰疹病毒1(b病毒)和痘病毒。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr激動(dòng)劑抗體可以用于治療細(xì)菌感染，包括但不限于如下細(xì)菌感染：奈瑟氏菌屬(neisseriaspp)、鏈球菌屬(streptococcusspp)、變形鏈球菌(s.mutans)、嗜血桿菌屬(haemophilusspp.)、莫拉氏菌屬(moraxellaspp)、博德特氏菌屬(bordetellaspp)、分枝桿菌屬(mycobacteriumspp)、軍團(tuán)菌屬(legionellaspp)、埃希氏菌屬(escherichiaspp)、弧菌屬(vibriospp)、耶爾森氏菌屬(yersiniaspp)、彎曲菌屬(campylobacterspp)、沙門氏菌屬(salmonellaspp)、李斯特氏菌屬(listeriaspp.)、螺桿菌屬(helicobacterspp)、假單胞菌屬(pseudomonasspp)、葡萄球菌屬(staphylococcusspp.)、腸球菌屬(enterococcusspp)、梭菌屬(clostridiumspp.)、芽孢桿菌屬(bacillusspp)、棒狀桿菌屬(corynebacteriumspp.)、疏螺旋體屬(borreliaspp.)、埃里希氏體屬(ehrlichiaspp)、立克次氏體屬(rickettsiaspp)、衣原體屬(chlamydiaspp.)、鉤端螺旋體屬(leptospiraspp.)、密螺旋體屬(treponemaspp)。抗-gitr抗體的施用醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于實(shí)現(xiàn)所需治療效果所要求的水平施用藥物組合物中的本發(fā)明抗體或抗體片段的開始劑量，并且逐漸提高劑量，直至實(shí)現(xiàn)所需效果。通常，本發(fā)明組合物的有效劑量根據(jù)許多不同因素而改變，所述因素包括待治療的特定疾病或病癥、施用方式、靶位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、患者是人或動(dòng)物、施用的其他藥物、和治療是預(yù)防性的或是治療性的。治療劑量需要滴定，以優(yōu)化安全性和功效。對(duì)于抗體施用，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg宿主體重，并且更常見地為0.01至5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg范圍內(nèi)。按照需要或期望的，劑量施用可以以每天、每周、每?jī)芍堋⒚吭?、或更高或更低的頻率進(jìn)行。一個(gè)示例性治療方案需要每周一次、每?jī)芍芤淮位蛎吭乱淮巍⒒蛎?至6個(gè)月一次施用。在一些實(shí)施方案中，施用編碼本發(fā)明的抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的多核苷酸。在藥劑是核酸的實(shí)施方案中，典型的劑量范圍可以為約0.1mg/kg體重至高達(dá)并包括約100mg/kg體重，例如，約1mg/kg體重至約50mg/kg體重。在一些實(shí)施方案中，約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg/kg體重?？贵w或抗體片段可以單劑或分劑量施用?？贵w或抗體片段通常多次施用。按照需要或期望的，單次劑量之間的間隔可以為每周、每?jī)芍?、每月或每年。如通過測(cè)量患者的抗-gitr抗體或抗體片段的血液水平所指示的，間隔也可以是不規(guī)律的。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量來實(shí)現(xiàn)1-1000μg/ml的血漿抗體或抗體片段濃度，并且在一些方法中，為25-300μg/ml。或者，抗體或抗體片段可以作為持續(xù)釋放制劑來施用，在該情況中，需要較少頻率的施用。劑量和頻率可以根據(jù)抗體或抗體片段在患者中的半衰期來改變。通常，人源化抗體顯示出比嵌合抗體和非人抗體長(zhǎng)的半衰期。劑量和施用頻率可以根據(jù)治療是預(yù)防性的或是治療性的來改變。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間段中，以相對(duì)不太頻繁的間隔，施用相對(duì)低的劑量。一些患者在剩余的生命中持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)短的間隔施用相對(duì)高的劑量，直至疾病進(jìn)展得到減慢或終止，并且優(yōu)選直至患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善。此后，可以給予患者預(yù)防性方案。與第二藥劑的共施用在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與第二或第三藥劑共施用?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子和第二或第三藥劑可以作為混合物或在分開的制劑中施用?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子和第二或第三藥劑可以同時(shí)或相繼施用。根據(jù)需要，抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子和第二或第三藥劑可以經(jīng)由相同的施用途徑或經(jīng)由不同的施用途徑來施用。用于與本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子共施用的示例性第二藥劑和第三藥劑包括，不限于，主要或靶抗原、提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性的藥劑、抑制或遏制共抑制信號(hào)的藥劑?？?gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子也可以與能用于治療待治療疾病狀況的化學(xué)治療劑共施用，例如，以增強(qiáng)化學(xué)治療劑的功效或進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)抗靶抗原的免疫應(yīng)答?？?gitr激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子還可以，與已建立的用于治療該指定的疾病狀況的療法例如放療或手術(shù)，組合用于治療中。本發(fā)明的抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子可以與主要或靶抗原共施用。靶原抗或疫苗將取決于待治療的疾病狀況。例如，靶抗原可以來自腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌、病毒或寄生物。根據(jù)需要，靶抗原可以是肽、多肽、細(xì)胞或多核苷酸的形式。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與來自病毒的靶抗原共施用，所述病毒例如選自：甲肝、乙肝、丙肝、流感、水痘、腺病毒、i型單純皰疹病毒(hsvi)、ii型單純皰疹病毒(hsvii)、牛痘、鼻病毒、?？刹《?、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、巨細(xì)胞病毒、echinovirus、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、i型人免疫缺陷病毒(hivi)和ii型人免疫缺陷病毒(hivii)、任何小核糖核酸病毒科病毒、腸病毒、杯狀病毒科、諾沃克病毒組中的任何一種病毒、披膜病毒，如甲病毒、黃病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒、馬爾堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸弧病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病毒、i型人t細(xì)胞白血病病毒、ii型人t細(xì)胞白血病病毒、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、細(xì)小病毒、eb病毒、人皰疹病毒6、猿猴皰疹病毒1(b病毒)和痘病毒。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與來自細(xì)菌的靶抗原共施用，所述細(xì)菌例如選自：奈瑟氏菌屬(neisseriaspp)、鏈球菌屬(streptococcusspp)、變形鏈球菌(s.mutans)、嗜血桿菌屬(haemophilusspp.)、莫拉氏菌屬(moraxellaspp)、博德特氏菌屬(bordetellaspp)、分枝桿菌屬(mycobacteriumspp)、軍團(tuán)菌屬(legionellaspp)、埃希氏菌屬(escherichiaspp)、弧菌屬(vibriospp)、耶爾森氏菌屬(yersiniaspp)、彎曲菌屬(campylobacterspp)、沙門氏菌屬(salmonellaspp)、李斯特氏菌屬(listeriaspp.)、螺桿菌屬(helicobacterspp)、假單胞菌屬(pseudomonasspp)、葡萄球菌屬(staphylococcusspp.)、腸球菌屬(enterococcusspp)、梭菌屬(clostridiumspp.)、芽孢桿菌屬(bacillusspp)、棒狀桿菌屬(corynebacteriumspp.)、疏螺旋體屬(borreliaspp.)、埃里希氏體屬(ehrlichiaspp)、立克次氏體屬(rickettsiaspp)、衣原體屬(chlamydiaspp.)、鉤端螺旋體屬(leptospiraspp.)、密螺旋體屬(treponemaspp)。在一些實(shí)施方案中，抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與腫瘤相關(guān)抗原(taa)共施用。taa可以是分離的多肽或肽，可以是完整細(xì)胞的一部分或腫瘤細(xì)胞裂解物的一部分。示例性taa如以上所討論的；也可以使用本領(lǐng)域已知的其他taa。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與來自患者的自體腫瘤細(xì)胞、或與來自另一位患者的相同組織類型的同種異體腫瘤細(xì)胞，共施用。腫瘤細(xì)胞可以是完整細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物、凋亡的腫瘤細(xì)胞或腫瘤總mrna的形式?？梢赞D(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞以表達(dá)增強(qiáng)或提高腫瘤細(xì)胞在患者中的免疫原性的多肽，例如，轉(zhuǎn)染以表達(dá)粒細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)。腫瘤細(xì)胞可以來自任何癌組織，包括不限于，上皮癌或癌瘤，以及肉瘤和淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、卵巢癌、腎癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌(nsclc))、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或纖維肉瘤。參見，例如，pardee等，immunotherapy(2009)1(2):249-264，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞來自例如胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔或咽喉的癌癥、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織的癌癥、和頭頸鱗狀細(xì)胞癌(hnscc)。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與細(xì)胞毒性劑共施用。例如，將抗-gitr抗體或抗原結(jié)合分子與結(jié)合并減少或耗竭cd4+cd25+調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)的激動(dòng)劑抗體或抗原結(jié)合分子共施用。示例性treg細(xì)胞耗竭性抗體或抗原結(jié)合分子結(jié)合cd25或ccr4。參見expertopintherpatents(2007)17(5):567-575，以及其中討論的參考文獻(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子與共抑制信號(hào)的抑制劑共施用。示例性抑制劑包括ctla-4、lag3、tim3的抑制劑和/或pd-1/pd-l1(例如，b7-h1)相互作用的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制ctla-4的抗體共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制tim3的抗體共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制lag3的抗體共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制pd-1的抗體共施用。在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體與結(jié)合并抑制b7-h1的抗體共施用。參見，例如，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575；和melero等，clincancerres(2009)15(5):1507-1509，和其中討論的參考文獻(xiàn)?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子還可以與一種或多種免疫刺激劑共施用。例如，在一些實(shí)施方案中，將抗-gitr抗體或抗體片段與免疫刺激性細(xì)胞因子共施用，例如il-7、il-12或il-15?；蛘?，抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子可以與第二免疫刺激性抗體共施用。例如，抗-gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子也可以與另一腫瘤壞死因子受體超家族成員的激動(dòng)劑抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子共施用。示例性的第二免疫刺激靶包括不限于tnfrsf4腫瘤壞死因子受體超家族成員4(也稱為ox40)或腫瘤壞死因子受體超家族成員9(也稱為tnfrsf9、4-1bb或cd137)。參見，例如，expertopintherpatents(2007)17(5):567-575；pardee等，immunotherapy(2009)1(2):249-264；和melero等，clincancerres(2009)15(5):1507-1509，和其中討論的參考文獻(xiàn)?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子還可以與化學(xué)治療劑共施用。選擇的藥劑將取決于待治療的病癥，例如，癌癥或感染性疾病，如細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生物感染?？?gitr抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于治療待治療病癥的化學(xué)治療劑共施用。示例性化學(xué)治療劑在上面進(jìn)行了討論；也可以使用本領(lǐng)域已知的其他化學(xué)治療劑。附圖簡(jiǎn)述圖1a-d舉例說明，本發(fā)明的gitrmab的表位作圖。圖1a描繪了，使用fc-gitr融合物(上面和中間的跡線)和his-gitr(下面的跡線)融合蛋白和mab1親本ab，氫/氘交換偶聯(lián)質(zhì)譜(hdxms)的結(jié)果。編號(hào)反映天然gitr信號(hào)肽(aa1-26)序列的去除。圖1b描繪，使用人gitr的胞外結(jié)構(gòu)域(hgitrecd)制備的n-末端缺失構(gòu)建體的示意圖。圖1c描繪，mab4和mab5與hgitrecd構(gòu)建體結(jié)合的結(jié)果。來自人gitr(hgitr)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)的富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域1(crd1)的n-端缺失，可以消除mab4和mab5與hgitr的結(jié)合。對(duì)于mab7，獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。圖1d描繪了丙氨酸掃描誘變的結(jié)果。除了gitr突變體e78a外，mab7結(jié)合所有其它突變蛋白。進(jìn)行了fortebiotm結(jié)合分析，并且結(jié)果也證實(shí)了mab7喪失與hgitre78a突變蛋白的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果說明，gitr中包括crd1和包括e78的ecd的區(qū)域(seqidno:88：rptggpgcgpgrllgtgtdarccrvhttrccrdypgeeccsewdcmcvqpefhcgd)是涉及結(jié)合mab1和mab7(親本mab)的區(qū)域和潛在表位。圖2a-2e描繪了抗-gitrmab抗體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2a和2b說明了，如通過elisa試驗(yàn)測(cè)定的，mab4和mab5與來自人和獼猴(2a)的gitr特異性結(jié)合，但不與來自嚙齒動(dòng)物(2b)的gitr結(jié)合。圖2c說明，通過elisa試驗(yàn)，mab7具有結(jié)合人和獼猴gitr但不結(jié)合小鼠gitr的相似結(jié)合譜。圖2d說明，通過facs競(jìng)爭(zhēng)分析測(cè)定，mab7競(jìng)爭(zhēng)gitr-配體結(jié)合。圖2e說明了elisa試驗(yàn)的結(jié)果，顯示出本發(fā)明的抗-gitr抗體(例如，mab4、mab5)不結(jié)合tnf受體超家族(tnfrsf)的其他成員。protagentm芯片試驗(yàn)還證實(shí)了這些抗體不結(jié)合其他脫靶蛋白(未顯示)。圖3a-3d描繪了經(jīng)工程化表達(dá)gitr的293細(xì)胞中的胞內(nèi)信號(hào)傳輸。圖3a說明，重組人gitr配體(gitr-l)激活經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而超表達(dá)人gitr的293細(xì)胞中的胞內(nèi)信號(hào)傳輸。圖3b說明，抗體交聯(lián)時(shí)，單克隆抗體mab4和mab5激活經(jīng)轉(zhuǎn)染而超表達(dá)人gitr的293細(xì)胞中的胞內(nèi)信號(hào)傳輸，激活程度與gitr-l相當(dāng)(gitrl的ec50為約65nm，相對(duì)地在交聯(lián)劑存在下激動(dòng)劑抗體的ec50為約2.5nm)。圖3c說明，交聯(lián)的mab抗體激活細(xì)胞中的胞內(nèi)信號(hào)傳輸，因?yàn)閙ab7和mab8也以相似于交聯(lián)mab4的方式促進(jìn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人gitr和nfκb-螢光素酶報(bào)告基因的293細(xì)胞中的nfκb激活。圖3d說明，交聯(lián)的mab4和mab5促進(jìn)已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了獼猴gitr和nfκb-螢光素酶報(bào)告基因的293細(xì)胞中的nfκb激活。用交聯(lián)的mab7看到了相似的激活(數(shù)據(jù)未顯示)。圖4a-4c描繪了mab7對(duì)t細(xì)胞的體外共刺激活性依賴于t細(xì)胞的激活。將抗-cd3(okt3)、抗-cd28(cd28.2)和抗-gitrmab在珠子上交聯(lián)(以1:1:3的比例)，隨后與pbmc孵育。圖4a說明，mab7是cd4+t細(xì)胞的共激活劑，并刺激cd4+t細(xì)胞中的t細(xì)胞增殖。圖4b說明，mab7是cd8+t細(xì)胞的共激活劑，并且刺激cd8+t細(xì)胞中的t細(xì)胞增殖。圖4c說明細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如，與mab7協(xié)同，tcr結(jié)合后ifnγ的產(chǎn)生被提高。對(duì)于mab4和5，看到了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5a-d說明，在以不同水平表達(dá)gitr的細(xì)胞中mab7的體外adcc活性。圖5a、圖5b、圖5c和圖5d各自描繪了在不同gitr表達(dá)水平下使用對(duì)照或mab7抗體的adcc活性結(jié)果。mab7能夠誘導(dǎo)通過fcgriiia的信號(hào)傳輸，在gitr信號(hào)傳輸水平提高時(shí)活性提高。圖6a-6d說明，gitr在hgitr-hgitrl敲入(knock-in)小鼠中是功能性的。從hgitr-hgitrl敲入小鼠分離脾細(xì)胞并在未刺激或用acd3和acd8抗體刺激下培養(yǎng)48小時(shí)，然后用不同濃度的對(duì)照或mab7脈沖30分鐘，然后固定并用熒光團(tuán)綴合的抗體染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖6a描繪的結(jié)果顯示,hgitr的表達(dá)在受刺激的cd8+t細(xì)胞上被上調(diào)。圖6b描繪了通過hfc染色獲得的抗hgitr抗體結(jié)合t細(xì)胞的結(jié)果，表明mab7可以結(jié)合小鼠cd8+t細(xì)胞上表達(dá)的hgitr。圖6c和6d描繪了，如通過胞內(nèi)pikk染色(6c)和t細(xì)胞激活(6d)所示的，mab7和受刺激的cd8+t細(xì)胞的結(jié)合與提高的t細(xì)胞激活相關(guān)。＊p<0.05，＊p<0.005。圖7a-7c說明，mab7在體內(nèi)是功能性的。用單劑運(yùn)載體(vehicle)(n＝8/時(shí)間點(diǎn))或mab7(n＝10/時(shí)間點(diǎn))抗體，處理帶有建立的colon26腫瘤的hgitr-hgitrl雙敲入小鼠。圖7a描繪每周兩次的腫瘤測(cè)量結(jié)果和使用公式(lxw2)/2計(jì)算的腫瘤體積。所示的數(shù)據(jù)來自十五(15)日時(shí)間點(diǎn)組。圖7b和7c描繪了來自全血的結(jié)果，而圖7c和7d描繪了，在施用后3天，針對(duì)免疫細(xì)胞上細(xì)胞表面的hgitr表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)收集和分析的來自腫瘤的結(jié)果。(＊p<0.05，＊＊＊＊p<0.00005)。圖8a-8e說明，mab7在體內(nèi)引發(fā)對(duì)colon26腫瘤的抗腫瘤免疫應(yīng)答。用單劑量的運(yùn)載體(n＝8/時(shí)間點(diǎn))或mab7(n＝10/時(shí)間點(diǎn))處理帶有建立的colon26腫瘤的hgitr-hgitrl雙敲入小鼠。圖8a描繪了施用后3天t調(diào)節(jié)細(xì)胞的結(jié)果。圖8b-8c描繪，施用后15天，在腫瘤中給予治療水平后，腫瘤部位中存在的淋巴細(xì)胞(8b)和激活的cd8+t細(xì)胞(8c)的結(jié)果。細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量相對(duì)于腫瘤大小進(jìn)行標(biāo)化，以說明運(yùn)載體和mab7處理組之間在腫瘤大小上的顯著差異。圖8d描繪，如通過腫瘤內(nèi)總的激活cd8+t細(xì)胞與cd4+foxp3+tregs相比而產(chǎn)生teff/treg比例來確定的，在處理動(dòng)物中獲得的teff/treg比例。圖8e描繪離體脾細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果，其中將純化的cd8+t細(xì)胞與colon26腫瘤細(xì)胞離體孵育，并使用ifngelispot試驗(yàn)測(cè)量ctl。(＊p<0.05，＊＊＊p<0.0005)。圖9a-9c說明，用小鼠替代物gitr抗體dta-1處理后，在colon26腫瘤以及脾中在cd8+t細(xì)胞上pd-1表達(dá)上調(diào)。2劑dta-1后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析整個(gè)腫瘤或整個(gè)脾的單細(xì)胞懸浮液。圖9a描繪了pd-1陽性細(xì)胞的結(jié)果，評(píng)價(jià)為總的cd19-cd3+cd8+t細(xì)胞的百分比。圖9b通過每mm3體積腫瘤的pd-1+cd19-cd3+cd8+t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，描繪了相對(duì)于腫瘤大小進(jìn)行標(biāo)化后的pd-1陽性細(xì)胞結(jié)果。圖9c描繪，用dta-1處理后，在帶有colon26腫瘤的小鼠脾中cd8+t細(xì)胞上pd-1表達(dá)上調(diào)的結(jié)果。以總的cd19-cd3+cd8+t細(xì)胞的百分比來評(píng)價(jià)pd-1陽性細(xì)胞。(＊p<0.05，＊＊＊＊p<0.00005)。圖10說明了與同種型對(duì)照相比，抗-gitr和抗pd-1組合賦予存活優(yōu)勢(shì)。描繪了與同種型對(duì)照相比，用抗gitr(igg2a-dta-1)和抗pd-1(rmpi-14)單獨(dú)或組合處理的colon26小鼠模型中的結(jié)果。圖11說明了，與同種型對(duì)照ab處理相比，在帶有建立的colon26腫瘤的小鼠中，用抗-gitr、抗pd-1和抗-gitr/抗pd-1組合處理后，lag3(第一欄)、tim3(中間欄)和pd1(右欄)的表達(dá)。描繪了與同種型對(duì)照相比，用抗-gitr(igg2a-dta-1)和抗pd-1(rmp1-14)單獨(dú)或組合處理的colon26小鼠模型中的結(jié)果。上排顯示了腫瘤樣品中的結(jié)果，而下排描繪了脾樣品中的結(jié)果。用a-gitr和a-pd1處理后，colon26腫瘤中cd8+t細(xì)胞上的lag3、tim3和pd1表達(dá)上調(diào)。用抗-gitr/抗pd-1組合處理后，colon26腫瘤中cd8+t細(xì)胞上的pd-1表達(dá)上調(diào)。實(shí)施例gitr激動(dòng)劑抗體mab2、mab3、mab4、mab5、mab6、mab7和mab8的形成通過工程化小鼠單克隆gitr激動(dòng)劑抗體mab1，以與人種系抗體具有更高的序列同源性，產(chǎn)生了人抗體mab2、mab3、mab4、mab5、mab6、mab7和mab8。mab2、mab3、mab4、mab5、mab6、mab7和mab8保留了親本小鼠抗體mab1的表位特異性、親和性和獼猴gitr交叉反應(yīng)性。與初始的小鼠抗體相比，mab2、mab3、mab4、mab5、mab6、mab7和mab8與人種系序列的同源性高得多，并且因此應(yīng)當(dāng)被人免疫系統(tǒng)更好地耐受。使用通過kalobios(southsanfrancisco,ca(在萬維網(wǎng)kalobios.com上))可獲得的技術(shù)平臺(tái)，將小鼠單克隆mab1工程化，使其蛋白質(zhì)序列更接近于人種系序列并降低其免疫原性?？贵w非常接近于具有v-區(qū)序列的人抗體，其與人種系序列具有高同源性，同時(shí)仍然保留了親本或參照抗體的特異性和親和性(美國(guó)專利公開2005/0255552和2006/0134098)。該方法首先鑒定參照fab的重鏈和輕鏈可變區(qū)中的最小抗原結(jié)合特異性決定簇(bsd)(通常是重鏈cdr3和輕鏈cdr3內(nèi)的序列)。因?yàn)檫@些重鏈和輕鏈bsd被保留在該過程中構(gòu)建的所有文庫中，因此每個(gè)文庫都是表位聚焦的，并且所得到的抗體保留初始小鼠抗體的表位特異性。接著，產(chǎn)生全鏈文庫(其中用人序列文庫替代完整的輕鏈或重鏈可變區(qū))和/或盒文庫(其中用人序列文庫替代小鼠fab的重鏈或輕鏈可變區(qū)的一部分)。細(xì)菌分泌系統(tǒng)用于將文庫成員表達(dá)為抗體fab片段，并且使用菌落轉(zhuǎn)移結(jié)合試驗(yàn)(colonyliftbindingassay,clba)，針對(duì)結(jié)合抗原的fab來篩選文庫。進(jìn)一步表征陽性克隆來鑒定具有最高親和性的那些。鑒定的在剩余小鼠序列中支持結(jié)合的人盒，在最終文庫篩選中組合以產(chǎn)生完全的人v-區(qū)。所得到的抗體fab具有源自人文庫的v-區(qū)段序列，保留了cdr3區(qū)域內(nèi)鑒定的短bsd序列，并且具有人種系框架4區(qū)域。通過將重鏈和輕鏈的可變區(qū)克隆至igg表達(dá)載體中，將這些fab轉(zhuǎn)化成完整igg。在此方法中產(chǎn)生的抗體保留了親本小鼠抗體的結(jié)合特異性，通常對(duì)抗原具有與親本抗體相等或更高的親和性，并且具有在蛋白水平上與人種系抗體基因相比具有高度序列同一性的v-區(qū)。方法小鼠抗gitrmabmab1的產(chǎn)生使用稱作多位點(diǎn)重復(fù)免疫(rimms)(mcintyregd.hybridoma1997)的程序，用人gitr的n-端區(qū)(aa26-161)免疫bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠(c57bl/6-tgn(bc1-2)22wehi株)，接著從高滴定小鼠產(chǎn)生雜交瘤。使用抗hgitr的夾心elisa鑒定和選擇分泌mab1的雜交瘤，并使用nkκb報(bào)告基因試驗(yàn)以證實(shí)hgitr結(jié)合和激動(dòng)劑活性。小鼠v-區(qū)的克隆使用標(biāo)準(zhǔn)方法，從獲自雜交瘤細(xì)胞系的rna，通過rt-pcr擴(kuò)增小鼠單克隆mab1的可變區(qū)dna。使用hv3(5’-gggtctagacaccatggctgtcttggggctgctcttc-3’(seqidno:95))和hc恒定(5’-gcgtctagaayctccacacacaggrrccagtggatagac-3’(seqidno:96))，從mab1cdna擴(kuò)增重鏈可變區(qū)。使用lv3(5’-gggtctagacaccatggagwcacakwctcaggtctttrta-3’(seqidno:97))和lc恒定(5’-gcgtctagaactggatggtgggaagatgg-3’(seqidno:19))，從相同cdna擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)。將可變重鏈和輕鏈產(chǎn)物插入pcdna3.1載體中，并驗(yàn)證序列。將重鏈和輕鏈載體用作pcr的模板，將用于克隆的限制酶位點(diǎn)并入kalobios載體中：在ncoi(5’)和nhei(3’)將vh克隆至kb1292-his中(kb1292修飾形式，編碼在ch1上具有氨基酸序列aagashhhhhh(seqidno:13)的c-末端柔性銜接物和6-his標(biāo)簽(seqidno:11))；在ncoi(5’)和bsiwi(3’)將vk克隆至kb1296中。隨后通過用bsshii和clai限制消化并連接，將這些分開的重鏈和輕鏈載體組合至單個(gè)雙順反子kalobiosfab表達(dá)載體中。在大腸桿菌中從這個(gè)載體表達(dá)fab片段。針對(duì)hgitr-抗原結(jié)合，測(cè)試了該fab，并且稱為mab1rfab。fab純化使用kalobios表達(dá)載體，通過從大腸桿菌分泌，表達(dá)fab片段。將細(xì)胞生長(zhǎng)于2×yt培養(yǎng)基中，至～0.6的od500。通過添加iptg至100μm來誘導(dǎo)表達(dá)并在33℃振蕩4小時(shí)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過滲透壓裂解，從周質(zhì)級(jí)分獲得裝配的fab，并使用ni-nta柱(histraphp柱；gehealthcare目錄號(hào)#17-5247-01)，通過親和性色譜純化。將fab在含有500mm咪唑的緩沖液中洗脫并相對(duì)不含鈣和鎂的pbsph7.4徹底透析。文庫構(gòu)建為了限制復(fù)雜性以鑒定在人gitr結(jié)合中支持bsd-fr4的互補(bǔ)人cdr，采取了盒文庫方法，其中只有部分親本小鼠v-區(qū)段由人序列文庫替代。初始小鼠mab1vk最接近人種系vkiii，因此在制備vk盒文庫中使用了含有vkiii種系的兩個(gè)kalobios文庫(kb1423和kb1424)的混合物。將含有vh3種系的kalobios文庫(kb1413，kb1414)用于構(gòu)建vh盒文庫。通過重疊pcr構(gòu)建了兩個(gè)類型的盒：在fr1、cdr1和fr2中含有人序列的前端盒(8c1vk3fe-01和mab1vh3fe-01)，和在fr3中含有人序列的fr3盒(mab1vk3fr3-01和mab1vh3fr3-01)，使用上述種系限制的kalobios文庫，進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)vh盒文庫在ncoi(5’)和kpni(3’)處克隆至載體kb1292-his中；每個(gè)vk盒文庫在ncoi(5’)和hindiii(3’)處克隆至載體kb1296-b(kalobios載體kb1296的修飾形式，其具有在fr4中添加的沉默hindiii位點(diǎn))。然后通過用bsshii和clai消化并隨后連接以形成表達(dá)完整fab的雙順反子載體文庫，將得到的vh或vk質(zhì)粒文庫與來自優(yōu)化的參照fab的互補(bǔ)鏈組合(mab1opvk或mab1opvh(例如，將vh前端文庫與優(yōu)化的參照vk載體組合))。沒有以高親和性結(jié)合人gitr的vh3前端克隆，因此，構(gòu)建了第二個(gè)vh3前端文庫(mab1vh3fe-02)。文庫在fr1和fr2中含有人序列，并含有在全部位置編碼親本小鼠殘基或選定的人種系殘基的一系列cdr2。該文庫的fr3區(qū)序列來自選自vh3fr3文庫(mab1vh3fr3-01)的六個(gè)克隆。通過組合來自vk前端文庫和vkfr3盒文庫的克隆與在全部位置編碼親本小鼠殘基或選定的人種系殘基的突變vkcdr2，構(gòu)建了最終的vk全長(zhǎng)鏈文庫(mab1vk3fcl-01)。將得到的vk全長(zhǎng)鏈文庫在ncoi和hindiii位點(diǎn)克隆至kb1296b中。將此vk全長(zhǎng)鏈文庫與選定的多個(gè)vh3fr3文庫克隆配對(duì)，以允許clbs表達(dá)并分泌功能性fab。通過人gitr特異性elisa，證實(shí)了抗原特異性克隆，并通過抗原親和性滴定elisa來排序。使用來自第二個(gè)vh3前端文庫(mab1vh3fe-02)的選定克隆，產(chǎn)生了vh3全長(zhǎng)鏈文庫(mab1vh3fcl-01)，所述前端文庫具有在所有位置含有親本小鼠殘基或人殘基的一系列cdr2序列。將此vh全長(zhǎng)鏈文庫在ncoi和kpni位點(diǎn)克隆至kb1292-his中。為了產(chǎn)生最終完整鏈人fab表達(dá)文庫，將選定的vk全長(zhǎng)鏈克隆在bsshii和clai位點(diǎn)與vh全長(zhǎng)鏈文庫組合。通用elisa將重組人gitr和人fc融合蛋白(hgitr-hfc)用于全部的elisa試驗(yàn)。通常，通過在4℃下過夜孵育，將pbsph7.4中稀釋的hgitr-hfc抗原以200ng/孔結(jié)合至96-孔微滴定平板。用pbst沖洗三次后，用pbs中的1％bsa溶液在37℃下封閉平板一小時(shí)，并隨后用pbst沖洗一次。然后將含有fab的細(xì)胞培養(yǎng)基、或稀釋的純化的fab(50μl)加入各孔中。在37℃下孵育一小時(shí)或在4℃下過夜孵育后，用pbst沖洗平板三次。將pbst(50μl)中1:5000稀釋的抗人κ鏈hrp綴合物(sigma#a7164)加入各孔中，并且將平板在室溫下孵育45min。用pbst將平板洗滌三次，然后將100μlsurebluetmb底物(kpl#52-00-03)加入各孔中，并將平板在室溫下孵育約10min。在分光光度計(jì)中在650nm下讀取平板。親和性滴定elisa為了評(píng)價(jià)選定的fab產(chǎn)生性克隆的抗原結(jié)合，開發(fā)了親和性滴定elisa。此試驗(yàn)結(jié)合了兩個(gè)連續(xù)的elisa步驟：第一個(gè)，使用山羊抗人fab(jacksonimmunoresearchlab#109-005-097)捕獲和山羊抗人κ(sigma#a7164)檢測(cè)，測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中的fab濃度，以標(biāo)準(zhǔn)化第二個(gè)抗原滴定elisa中使用的fab的量；第二個(gè)elisa(正常的抗原特異性elisa)，使用相同量的起始fab，產(chǎn)生抗原結(jié)合稀釋曲線。通過比較不同克隆的稀釋曲線，鑒定高親和性克隆。菌落轉(zhuǎn)移結(jié)合elisa(clba)基本上按照所述的(美國(guó)專利公開2005/0255552和2006/0134098)，使用pbsph7.4中以2.0μg/ml的hgitr-hfc包被的硝基纖維素濾膜，進(jìn)行了fab片段的抗體文庫篩選。使用pbst中1:5000稀釋的山羊抗人κ鏈hrp綴合物(sigma#a7164)，檢測(cè)了與抗原包被的濾膜結(jié)合的fab，并且用eclpluswestern印跡檢測(cè)系統(tǒng)(gehealthcare#rpn2132)來產(chǎn)生印跡。mab4中的糖化位點(diǎn)的去除通過用精氨酸替代賴氨酸，或通過用精氨酸替代賴氨酸并用天冬酰胺替代組氨酸，去除了mab4重鏈的fr3與cdr3連接中的糖化位點(diǎn)“kh”。使用p50h質(zhì)粒作為dna模板，通過基于pcr的誘變，完成kh至rh和kh至rn的轉(zhuǎn)換。反向引物(tctggcgcagtaatacacggcc，seqidno:110)并入精氨酸以替代賴氨酸；正向引物(nnkgcctatggccatgatggcg，seqidno:111)在組氨酸位點(diǎn)具有簡(jiǎn)并nnk三核苷酸。50μl反應(yīng)體積中以100ng模板、每種引物各0.2μm、200μmdntp和2.5upfuultraiidna聚合酶(strategene)，進(jìn)行pcr反應(yīng)。pcr條件為94℃，3分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃15秒，52℃20秒，以及65℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)；最終，72℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)。將dpni(2u)加入pcr反應(yīng)中，并在37℃下孵育30分鐘，以除去模板p50h。通過1％sybr凝膠分離擴(kuò)增的mab4重鏈變體，并使用qiagen凝膠純化試劑盒純化。用t4dna多核苷酸激酶處理凝膠純化的pcr產(chǎn)物，連接并轉(zhuǎn)化至dh5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen)中，置于氨芐青霉素選擇下。按照gotaqclear實(shí)驗(yàn)方案(promega)，使用正向引物(gcctttctctccacagg，seqidno:112)和反向引物(ggcaaacaacagatggctgg，seqidno:113)，通過菌落pcr，選擇了帶有mab7和mab8重鏈的克隆。pcr條件為94℃3分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃10秒，55℃30秒，72℃45秒，25次；以及最后，72℃5分鐘，一個(gè)循環(huán)。通過用核酸外切酶i和蝦堿性磷酸酶將樣品在37℃孵育30分鐘和80℃孵育15分鐘，來清理pcr反應(yīng)，用于測(cè)序。將pcr樣品測(cè)序并使用clonemanager軟件分析結(jié)果。抗體生產(chǎn)和純化使用293fectin轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen#51-0031)，根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案，將如下載體共同轉(zhuǎn)染至293freestyle細(xì)胞中，生產(chǎn)了抗體mab2、mab3、mab4、mab5、mab6、mab7和mab8(igg1κ)。mab2–p35h+p35κmab3–p38h+p38κmab4–p50h+p35κmab5–p51h+p35κmab6–p56h+p35κmab7–pmab7h+p35κmab8–pmab8h+p35κ使用5-mlhitrap蛋白ahp柱(gehealthcare#17-0403-03)，從293freestyle細(xì)胞上清液純化抗體。使用igg洗脫緩沖液(pierce#21004)洗脫抗體，并通過透析將緩沖液交換為pbs。在akta-fplc液相色譜系統(tǒng)(gehealthcare)上進(jìn)行了蛋白a親和性色譜。特異性elisa為了進(jìn)行特異性elisa，從表達(dá)tnfrsf家族成員的細(xì)菌制得粗制細(xì)胞裂解物。為了防止與平板的非特異性結(jié)合，每ml細(xì)菌裂解物加入50μl5％bsa。以每孔100μl裂解產(chǎn)物/bsa，用含有tnfrsf的細(xì)菌裂解物包被hisgrab鎳96-孔板(pierce#15142)，并在室溫下孵育1小時(shí)。然后用pbst沖洗平板三次，然后將mab在pbs中的10％fbs中稀釋至0.5μg/ml，并將100μl加入每個(gè)孔中。將平板在室溫下孵育1小時(shí)，并隨后用pbst沖洗三次。將綴合hrp的抗人κ抗體(sigma#a7164)在pbs中的1:1pbst:10％fbs中1:5000稀釋，并將100μl加入每個(gè)孔中。將平板在室溫下孵育1小時(shí)，并隨后用pbst洗滌三次。將100μlsurebluetmb底物加入每個(gè)孔中，并將平板在室溫下孵育約10min，接著用100μl/孔的2nh2so4停止反應(yīng)。在分光光度計(jì)中在450nm下讀取平板。elisa(gitr結(jié)合、物種交叉反應(yīng)性、丙氨酸掃描)用大鼠、小鼠、人或獼猴gitr胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)以每孔50ng包被384-孔平板，并在4℃孵育過夜；使用該平板評(píng)價(jià)mab與來自不同物種、各種丙氨酸突變構(gòu)建體的gitr或與gitr胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。用pbs中的1％bsa溶液在室溫下封閉平板一小時(shí)，并隨后用pbst沖洗三次。然后將mab在pbs中稀釋至0.5μg/ml或1μg/ml，并將20μl加入每個(gè)孔中。將平板在室溫下孵育1小時(shí)，并隨后用pbst洗滌三次。將綴合hrp的抗人κ抗體(sigma#a7164)、抗人γ抗體(jacksonimmunoresearch109-036-098)、山羊抗小鼠抗體(jacksonimmunoresearch115-035-071)在封閉緩沖液(25μl)中1:5000稀釋，并加入每個(gè)孔中，或加入在封閉緩沖液中1:1000稀釋的hrp綴合的his抗體(qiagen1014992)。將平板在室溫下孵育1小時(shí)，然后用pbst洗滌六次。將25μlsurebluetmb(kpl52-00-02)底物加入每個(gè)孔中，并將平板在室溫下孵育約10min。在分光光度計(jì)中在650nm下讀取平板。細(xì)胞系，細(xì)胞細(xì)胞系為了產(chǎn)生293-hgitr-nfκb報(bào)告基因細(xì)胞系，用nfκb-螢光素酶報(bào)告基因和人gitr(或獼猴gitr)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。通過與gitr-l或激動(dòng)劑抗體孵育24小時(shí)后測(cè)量細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的螢光素酶的水平，測(cè)定了這些細(xì)胞中g(shù)itr信號(hào)傳輸途徑的激活。為了評(píng)價(jià)交聯(lián)ab的作用，在用于報(bào)告基因試驗(yàn)前，將其與過量的f(ab’)2山羊抗-人fcγ片段特異性抗體或蛋白a一起孵育。產(chǎn)生了表達(dá)在人免疫細(xì)胞上所見水平的gitr的clonaldaudi細(xì)胞系。制備了獼猴pbmc，并使用mab測(cè)定了gitr結(jié)合。簡(jiǎn)而言之，將獼猴血液轉(zhuǎn)移至50ml錐形管(falcon，#352098)中，然后在pbs中1:2稀釋(hyclone，#sh30256.01)并混合。將稀釋的血液小心地層放在18ml90％ficollpaqueplus(pbs中稀釋的gehealthcare#17-1440-03)的頂部，并且將試管在臺(tái)式離心機(jī)中在室溫下在2,000×g下離心30分鐘，不帶剎車。小心移出血漿層，不擾動(dòng)ficoll頂部的彌散pbmc層。然后小心收集pbmc，并將pbs加入分離的pbmc中，直至錐形管中的體積為45ml，混合，并隨后在臺(tái)式離心機(jī)中在室溫下在300×g下離心15分鐘。小心吸出上清液，加入4ml1×bd裂解溶液(bd#555899)，將樣品溫和地渦旋。在黑暗中在室溫下孵育3分鐘后，將40mlpbs加入每個(gè)樣品中，并且在臺(tái)式離心機(jī)中在室溫下在200×g下離心10分鐘。小心吸出上清液，在臺(tái)式離心機(jī)中在室溫下在200×g離心10分鐘，之后在45mlpbs中洗滌沉淀兩次。將得到的沉淀物過濾，并以1×106細(xì)胞/ml重懸浮于補(bǔ)充了青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺(hyclone#sv30082.01)的ctl試驗(yàn)培養(yǎng)基中(ctlt-005)。將100μl純化的獼猴pbmc放入96孔圓底平板(corning，#3799)中。為了激活pbmc，將100μl綴合sp34-2/cd28.2抗體的m-280對(duì)甲苯磺酰基激活的dynabeads(lifetechnologies#142.04)加入每個(gè)孔中。使用3:1比例的cd3/cd28珠子與pbmc，并在37℃的組織培養(yǎng)箱中孵育平板48小時(shí)。對(duì)于第0天染色，將200μlpbmc放入96孔圓底平板中(corning，#3799)。對(duì)于刺激48小時(shí)的樣品，小心取出100μl上清液，并將孔的剩余內(nèi)含物小心重懸浮，并將200μl轉(zhuǎn)移至facs染色平板中。facs用200μl冷pbs中重懸浮的細(xì)胞來準(zhǔn)備平板。在50μldmso中重構(gòu)live/dead固定染色(lifetechnologies#l23105)，每ml冷pbs添加1μl重構(gòu)染料，將細(xì)胞沉淀物立即重懸浮于100μllive/deadpbs溶液中，在冰上避光孵育30分鐘，然后洗滌，之后重懸浮于100μl含有2μg/mlmab7或同種型人igg1對(duì)照抗體的冷facs緩沖液中，將平板在冰上避光孵育30分鐘。接著洗滌并重懸浮在100μl抗體混合物中(facs緩沖液(jacksonimmuno#109-116-098)中percpcy5.5抗人cd3(bd#552852)、alexafluor700抗人cd4(bd#560836)、v450抗人cd8(bd#561426)、pe-cy7抗人cd25(bd#561405)和pe抗人)，隨后將平板在冰上避光孵育30分鐘，然后在臺(tái)式離心機(jī)中3,200rpm在4℃離心1分鐘。將細(xì)胞在facs緩沖液中洗滌，隨后懸浮于100μlbdcytofix(bd#554655)中，并將平板在室溫下避光孵育15分鐘，隨后洗滌兩次，并重懸浮于100μlfacs緩沖液中。以箔覆蓋平板(beckmancoulter，#538619)并儲(chǔ)存于4℃，直至準(zhǔn)備讀取。在facs讀取當(dāng)天，將平板在臺(tái)式離心機(jī)中在3,200rpm離心1分鐘，并將50μlcml乳膠珠子(lifetechnologies#c37259)(facs緩沖液中4×105/ml)加入每個(gè)孔中。在bdfortessa流式細(xì)胞儀上讀取平板，并使用flowjo分析數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)基因小鼠通過用人gitrcdna序列置換小鼠gitr的完整編碼序列(外顯子和內(nèi)含子)，產(chǎn)生了hgitr敲入小鼠。起始密碼子上游和終止密碼子下游的非翻譯序列來自小鼠基因組。使用帶有balb/c衍生的同源臂的靶向載體，在balb/ces細(xì)胞中，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行了基因打靶。通過pcr鑒定了幾個(gè)es細(xì)胞克隆，并通過southern印跡證實(shí)含有確切的人cdna敲入。按照標(biāo)準(zhǔn)小鼠胚胎學(xué)技術(shù)，將陽性es細(xì)胞克隆注入胚泡中，將其轉(zhuǎn)移至假孕受體代孕母體中，以產(chǎn)生嵌合后代。將雄性嵌合小鼠與在其生殖系中表達(dá)cre重組酶的balb/c雌性雜交，以切除側(cè)接loxp的新霉素抗性盒。一個(gè)克隆形成了白色后代，表明靶es細(xì)胞的種系傳遞。通過pcr基因型分型，證實(shí)切除了側(cè)接loxp的盒。隨后通過與balb/cwt小鼠的育種步驟，除去cre重組酶。通過用后接牛生長(zhǎng)激素poly-a信號(hào)的人gitrlcdna序列置換小鼠的外顯子1的編碼部分，產(chǎn)生了hgitrl敲入小鼠。所有es細(xì)胞工作以及小鼠胚胎學(xué)按與上述程序相似的方式進(jìn)行。通過將兩個(gè)建立者(founder)系雜交2代來產(chǎn)生純合的雙敲入小鼠，從而產(chǎn)生了hgitr-hgitrl雙敲入小鼠。功能試驗(yàn)針對(duì)激動(dòng)劑活性，在nfκb報(bào)告基因試驗(yàn)中測(cè)定了mab的功能活性。將mab在pbs中稀釋至6μg/ml，并在3倍過量的f(ab’)2片段山羊抗-人fcγ特異性交聯(lián)劑的存在/不存在下，在室溫下孵育30分鐘?；蛘撸瑢ab在pbs中稀釋至6μg/ml，并在2倍過量的蛋白a的存在/不存在下，在室溫下孵育30分鐘。然后將10μl孵育的mab加入384孔白色透明圓底試驗(yàn)平板中。將用hgitr和nfκb報(bào)告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hek-293細(xì)胞系稀釋至5×105細(xì)胞/ml并將20μl細(xì)胞上清液加入每個(gè)孔中。將平板在37℃組織培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。將30μlcellbrightglo加入每個(gè)孔中，并在acquest上讀取平板的發(fā)光。使用hek-293nfκb報(bào)告親本細(xì)胞評(píng)價(jià)了mab阻斷配體結(jié)合的能力，并將hgitr穩(wěn)定細(xì)胞用于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)和facs分析中。簡(jiǎn)而言之，將收集的細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml和100μl/孔接種于96孔圓底facs平板(corning)中，然后重懸浮于每孔200μl冷facs緩沖液(1xpbs+1％fbs-hi+0.1％疊氮化鈉)中。以100μl/孔，在facs緩沖液中，準(zhǔn)備人gitr配體滴定(從270nm至1.52pm)。將平板在冰上避光孵育1小時(shí)，洗滌細(xì)胞，然后制備4nm同種型對(duì)照或制備mab溶液，并以100μl/孔加入合適的孔中，平板在冰上避光孵育1小時(shí)，洗滌細(xì)胞，以100μl/孔加入在facs緩沖液中以1:100稀釋制備的pe綴合的山羊抗人檢測(cè)抗體(jacksonimmunoresearch)，將平板在冰上避光孵育30分鐘。在facs緩沖液中洗滌細(xì)胞，隨后用100μl/孔的bdcytofix(bdbiosciences)固定細(xì)胞，并在冰上避光再孵育15分鐘。將固定的細(xì)胞洗滌兩次，以150μl/孔facs緩沖液的終體積重懸浮，并在1周內(nèi)在bdfortessa流式細(xì)胞計(jì)(bdbioscience)上分析樣品。在表達(dá)內(nèi)源性水平的gitr的主要t細(xì)胞上，通過主要t細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，也可以看到mab的激動(dòng)劑活性。按照制造商的說明，將mab綴合在m-280甲苯磺?；せ畹闹樽?invitrogen#142.04)上。在一些實(shí)驗(yàn)中，將激動(dòng)劑cd3(okt3)和cd28(cd28.2)抗體也綴合在珠子上。將1×105個(gè)新鮮純化的cfse-標(biāo)記的人pbmc接種于96孔圓底組織培養(yǎng)平板的10ulctl試驗(yàn)培養(yǎng)基(ctl#ctlw-010)中。然后以1個(gè)t細(xì)胞:1個(gè)珠子的比例，添加100ulmab綴合的珠子。然后將平板在37℃組織培養(yǎng)箱中孵育3天。根據(jù)制造商的說明，使用msd多重試驗(yàn)，測(cè)量了培養(yǎng)基中分泌的細(xì)胞因子的水平。用抗-cd4、-cd8a、-cd25、-gitr抗體和live/dead染色將細(xì)胞染色，染色后，將細(xì)胞固定，并在流式細(xì)胞儀上閱讀。通過cfse染色評(píng)價(jià)cd4和cd8細(xì)胞的增殖，并且在facs閱讀前添加計(jì)數(shù)珠子，以允許樣品的標(biāo)準(zhǔn)化。還使用elispot方法檢測(cè)ifng，測(cè)量了t細(xì)胞上的mab的共刺激活性。簡(jiǎn)而言之，用70％乙醇包被elispot板2分鐘，接著pbs洗滌，并用pbs中的50ugifng單克隆抗體(mabtech3321-3)孵育過夜，準(zhǔn)備elispot板(milliporemsips4510)。給藥后15天，從運(yùn)載體或mab7處理的小鼠的脾分離純化的cd8+t細(xì)胞。在ctl培養(yǎng)基(ctl試驗(yàn)培養(yǎng)基(ctlctlt-005)、1mmhepes(mediatechmt25-060-cl)、2mml-谷氨酰胺(mediatechmt25-005-cl)、1mm丙酮酸鈉(mediatechmt25-000-cl)、100ummem非必需氨基酸(mediatechmt25-025-cl)、66um2-巰基乙醇(gibco21985-023)、100u/mlpten/strep(gibco10378016))中，將t細(xì)胞以0.25×106細(xì)胞接種在包被的elispot平板中。用10％conasup(bdbiosciences354115)在37℃下處理colon26細(xì)胞48小時(shí)，以上調(diào)ii類mhc表達(dá)，用ctl培養(yǎng)基洗滌后添加至t-細(xì)胞。將colon26腫瘤細(xì)胞(200,000/孔)加入ctl中，并在37℃下孵育24-48小時(shí)。然后用0.05％tween-20/pbs洗滌平板并將10ug生物素化抗-ifngmab(mabtechr4-6a2-生物素)加入每個(gè)孔中，并在37℃下孵育2小時(shí)。然后用0.05％tween-20/pbs洗滌平板，并將vectastainabc溶液(vectorlabspk6100)加入每個(gè)孔中，并且室溫下孵育1小時(shí)。然后用0.05％tween-20/pbs洗滌細(xì)胞，并將根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案(sigmaa6926)制備的aec底物加入每個(gè)孔中，并在室溫下孵育4分鐘。然后用自來水沖洗平板、干燥并在讀數(shù)前在黑暗中儲(chǔ)存24小時(shí)。使用報(bào)告試驗(yàn)來測(cè)量mab誘導(dǎo)adcc的能力。在96孔白色平板(perkinelmerf6178)中，以1個(gè)daudi細(xì)胞比20個(gè)jurkat細(xì)胞的比率，在50ulrpmi+10％fbs中孵育2×103個(gè)hgitr-daudi細(xì)胞和4×104個(gè)jurkat-v158細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)人fcgriiia的v158變體和nfat報(bào)告基因)。將等體積的mab加入孔中，并將平板在37℃組織培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)。孵育后，將60ulbright-glo加入每個(gè)孔中，并在光度計(jì)上讀取平板。使用從小鼠分離的脾進(jìn)行了體外脾細(xì)胞試驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，在gentlemacsocto離解器(miltenyibiotech130-095-937)上，使用gentlemacsc試管(miltenyibiotech130-096-334)，在5ml含有5％bsa(miltenyibiotech130-091-376)的automacs漂洗溶液(miltenyibiotech130-091-222)中，通過自動(dòng)化均質(zhì)，解離來自小鼠的脾。勻漿物通過0.70um孔徑細(xì)胞濾過器(fisherscientific22363548)過濾，并用10mlautomacs緩沖液洗滌。將脾細(xì)胞重懸浮并以100,000細(xì)胞/孔接種在96孔組織培養(yǎng)平板(costar3799)中的rpmi(hyclonesh30027.02)+10％人血清(cellgro35-060.c1)+1×pen/strep/l-glut(gibco15140-112)中。對(duì)于t-細(xì)胞刺激，將0.4ug/ml的抗-小鼠cd3(ebioscience16-0031-86)和0.8ug/ml的抗小鼠cd28(ebioscience13-0281-86)抗體添加至合適的孔中。48小時(shí)后，立即分析細(xì)胞，或用對(duì)照或治療性抗體脈沖30分鐘至96小時(shí)，用綴合熒光團(tuán)的抗體染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)：對(duì)于表面標(biāo)志物，用抗-cd19(bdbiosciences562291)、抗-cd8(biolegend100725)、抗-cd4(ebioscience25-0041)、抗-cd69(bdbiosciences561238)、抗-hgitr(miltenyibiotech130-092-895)和抗-higg(lifesciencesa-10631)抗體，將細(xì)胞在4℃下染色30分鐘。對(duì)于胞內(nèi)染色，與細(xì)胞表面抗體孵育后，洗滌細(xì)胞，根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案，固定并用foxp3fix/perm緩沖液(biolegend421403)透化，與抗-磷酸-ikka/b抗體(cellsignaling2697)或抗-foxp3抗體(ebioscience50-4774-42)在4℃下孵育30分鐘。使用bdfacsdiva軟件(bdbiosciences)在bdlsrfortessa細(xì)胞計(jì)數(shù)器上讀取細(xì)胞，并使用flowjo軟件(treestarinc.)分析了流動(dòng)數(shù)據(jù)。從腫瘤和脾產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液，染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。例如，使用以下抗體來評(píng)價(jià)細(xì)胞標(biāo)志物：a-cd8-buv395(克隆53-6.7，bdbiosciences563786)、a-cd19-apc-cy7(克隆6d5，biolegend115530)、a-cd3-percp(克隆145-2c11，bdbioscience553067)、a-pd-1-pe-cy7(克隆rmp1-30，biolegend109110)。使用bdfacsdiva軟件(bdbiosciences)，在bdlsrfortessa細(xì)胞計(jì)數(shù)器上，實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)。使用flowjo軟件(flowjollc)，分析了流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。產(chǎn)生了圖表，并使用prism軟件(graphpadsoftware)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。使用95％置信區(qū)間，使用雙側(cè)student’st-檢驗(yàn)，進(jìn)行了組比較。對(duì)于所有統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)，顯著性水平設(shè)定為p<0.05。除非另外指出，報(bào)道與運(yùn)載體對(duì)照組相比的顯著性。體內(nèi)腫瘤模型。colon26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系獲自國(guó)立癌癥研究所(nationalcancerinstitute)的癌癥治療和診斷部(divisionofcancertreatmentanddiagnosis)(小瓶：0507238)。將小鼠colon26癌細(xì)胞在補(bǔ)充了10％fbs(gibco10099-141)、10mmhepes(gibco15630-080)和1mm丙酮酸鈉(gibco11360-070)的rpmi1640培養(yǎng)基(hyclonesh30027.02)中培養(yǎng)。給8-10周齡的雌性hgitr-hgitrl敲入小鼠在脅腹皮下注射100ulrpmi中的0.5×106個(gè)colon26細(xì)胞。使用數(shù)字卡尺測(cè)量了腫瘤，使用公式(lxw2)/2計(jì)算了腫瘤體積。當(dāng)腫瘤達(dá)到180mm3的平均大小時(shí)，將小鼠隨機(jī)化分組，單次腹膜內(nèi)注射200ulpbs中的運(yùn)載體(pbs)或治療性抗體(15mg/kg)。給予治療抗體后7天，處死小鼠，收集腫瘤，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在aaalac認(rèn)證機(jī)構(gòu)進(jìn)行，使用iacuc批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案。使用雙側(cè)95％置信區(qū)間的student’st-檢驗(yàn)，或使用單向anova和turkey校正，在prism軟件中進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。替代物小鼠gitrcolon26模型試驗(yàn)。將charlesriverlabs雌性6-8周齡balb/c小鼠用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。為了植入，將細(xì)胞重懸浮于hank’s1×平衡鹽溶液(hyclonecat#sh30030.02)中，并使用28g針(100ml注射體積)通過皮下注射在右下肋腹植入。植入后，根據(jù)腫瘤體積，將小鼠隨機(jī)化分組。通過皮下注射，給予小鼠5mg/kgigg2a-dta-1或小鼠igg2a同種型對(duì)照。通過將dta-1可變區(qū)序列與小鼠igg2afc區(qū)融合以形成igg2a-dta-1，從而修飾克隆dta-1(大鼠抗小鼠gitr抗體(s.sakaguchi，京都大學(xué)，日本京都))以形成小鼠嵌合igg2a。聯(lián)合治療。為了評(píng)價(jià)替代物抗-gitr抗體(小鼠igg2a-dta-1)組合替代物抗pd-1抗體(大鼠，igg2armpi-14，biolegend)的體內(nèi)活性，在來自jacksonlaboratories(barharbor，maine)的雌性6-8周齡balb/c小鼠的右腋上區(qū)中皮下植入100ul體積中的5×105colon26細(xì)胞。為了植入，將colon26細(xì)胞懸浮于來自lonza的無鈣和鎂的dulbecco’spbs(17-512f)中。植入后十天，具有115mm3±7的平均±sem腫瘤體積的小鼠入選該研究。隨機(jī)指定至4組中的一組后(n＝10-16/組)，按照表6中所述的，同時(shí)給予小鼠同種型(組1)、rmp1-14(10mg/kg，組2)、igg2a-dta-1(5mg/kg，組3)或rmp1-14和igg2a-dta的組合(分別為10mg/kg和5mg/kg，組4)，每周一次，持續(xù)2周。將第0天定為隨機(jī)化分組日。同種型對(duì)照組含有5mg/kg的migg2a(biolegend)和10mg/kg的大鼠igg2a(biolegend)。經(jīng)由皮下注射給予5mg/kg的igg2a-dta及其同種型對(duì)照(migg2a)。經(jīng)由腹膜內(nèi)注射給予rmp1-14及其同種型對(duì)照(rigg2a)。對(duì)于所有處理，劑量體積為10mg/ml。每周收集體重和腫瘤體積兩到三次。當(dāng)腫瘤體積等于或超過1200mm3時(shí)，動(dòng)物個(gè)體評(píng)為達(dá)到終點(diǎn)。通過kaplan-meier存活分析評(píng)價(jià)，基于到終點(diǎn)的中值時(shí)間(tte)的變化，報(bào)道抗腫瘤活性。聯(lián)合治療。為了評(píng)價(jià)施用抗-gitr或抗-gitr聯(lián)合抗pd-1后共刺激分子的表達(dá)，在1劑gitr(克隆igg2a-dta-1)或抗-pd1(克隆rmp1-14)或抗-gitr+pd1組合后，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定整個(gè)腫瘤和脾的單細(xì)胞懸浮液。將migg2a用作對(duì)照。作為腫瘤和脾中總的cd3+cd8+t細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，評(píng)價(jià)lag3、tim3和pd-1陽性細(xì)胞。使用t-檢驗(yàn)計(jì)算了p值。＊p<0.05和＊＊p<0.005。結(jié)果小鼠和參照v-區(qū)氨基酸序列將來自表達(dá)mab1的雜交瘤細(xì)胞的rt-pcr產(chǎn)物測(cè)序，并使用thermoelectronltq-orbitrap質(zhì)譜儀在蛋白質(zhì)水平大范圍地(95％或更高)驗(yàn)證了這個(gè)序列。然后mab1的重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆在kalobios載體中，以形成參照fabmab1rfab。mab1中的第一個(gè)氨基酸必須從天冬酰胺(n)變成谷氨酸(e)殘基，以便能夠克隆至kalobios載體中，用于產(chǎn)生參照fab；因此，mab1rfab在第一個(gè)vk位置具有谷氨酸。fabmab1rfab具有與人恒定區(qū)融合的來自mab1的完整小鼠v-區(qū)。除了mab1rfab，構(gòu)建了優(yōu)化的fab，mab1opfab。在mab1opfab中，mab1rfab中的幾個(gè)框架氨基酸殘基被改變成人種系殘基。參照和優(yōu)化的參照fab的親和性分析并入優(yōu)化參照mab1opfab的fr1和fr3中的人種系殘基，由用于擴(kuò)增人v-區(qū)段庫的pcr引物規(guī)定，并且因此存在于抗體v-區(qū)文庫的所有成員中。構(gòu)建優(yōu)化的參照fab，以評(píng)價(jià)任何向人種系的改變是否改變fab結(jié)合的特性。使用fortebiooctedqk系統(tǒng)和包被了生物素化的hgitr-hfc的鏈霉親和素高結(jié)合性生物傳感器，測(cè)試了mab1rfab、mab1opfab的親和性常數(shù)(ka(1/ms)、kd(1/s)和kd(m))。與mab1rfab相比，mab1opfab具有非常相似的kd，但ka提高五倍，表明mab1rfabz中的氨基酸變化被耐受?？贵wfab的文庫構(gòu)建和選擇通過clba產(chǎn)生并篩選了重鏈和輕鏈前端和fr3盒文庫，種系家族限制于vh3和vkiii。對(duì)于vk，從vk前端(mab1vk3fe-01)和fr3(mab1vk3fr3-01)盒文庫鑒定出支持人gitr結(jié)合的克隆。對(duì)于vh，從fr3盒文庫(mab1vh3fr3-01)鑒定出支持人gitr結(jié)合的克隆，但從vh3前端文庫(mab1vk3fe-01)未鑒定出這樣的克隆。由于vk前端和fr3盒文庫中的大部分成員在clba中是陽性的，通過重疊pcr，使用在所有位置編碼親本小鼠殘基或選定的人種系(vkiiil-16)殘基的突變vkcdr2，將這兩個(gè)文庫的全部成員用于構(gòu)建vk全長(zhǎng)鏈文庫(mab1vk3fcl-01)。通過clba從vh3fr3文庫(mab1vh3fr3-01)鑒定出許多hgitr陽性克隆，并通過人gitr特異性elisa證實(shí)。將其中六個(gè)用于與vk全長(zhǎng)鏈文庫(mab1vk3fcl-01)配對(duì)，使得能夠進(jìn)行功能性fab表達(dá)和該文庫的篩選。由于從vh前端文庫(mab1vh3fe-01)沒有鑒定出以高親和性結(jié)合hgitr的克隆，隨后，構(gòu)建了第二個(gè)vh3前端文庫(mab1vh3fe-02)。該文庫具有來自六個(gè)選定的vhfr3克隆的fr3序列并在cdr1的每個(gè)位置具有親本小鼠或人種系(vh33-30)殘基。從vk全長(zhǎng)鏈文庫(mab1vk3fcl-01)和第二個(gè)vh前端文庫(mab1vh3fe-02)鑒定出許多hgitr結(jié)合劑。通過對(duì)含fab的細(xì)胞上清液進(jìn)行人gitr特異性elisa試驗(yàn)，證實(shí)了這些克隆，并通過hgitr親和性滴定elisa進(jìn)行等級(jí)排序?；趆gitr親和性滴定elisa，從vk全長(zhǎng)鏈文庫(mab1vk3fcl01)選擇了四個(gè)vk全長(zhǎng)鏈克隆，并且從mab1vh3fe-02文庫選擇了六個(gè)克隆。將六個(gè)vh克隆用作主鏈，構(gòu)建在cdr2中的每個(gè)位置具有mab1小鼠殘基或最接近的人種系(vh33-30)殘基的vh全長(zhǎng)鏈文庫。將該vh全長(zhǎng)鏈庫與四個(gè)vk全長(zhǎng)鏈克隆配對(duì)，形成最終的人全長(zhǎng)鏈fab文庫。clba鑒定出許多hgitr結(jié)合克隆，使用相應(yīng)的培養(yǎng)物上清液作為fab來源，通過elisa證實(shí)了這些克隆?；赿na序列分析和hgitr親和性滴定elisa結(jié)果，選擇了五個(gè)人全長(zhǎng)鏈fab克隆(mab2、mab3、mab4、mab5和mab6)。使用fortebiooctet分析測(cè)定抗體fab對(duì)gitr抗原的親和性表達(dá)并純化五個(gè)人全長(zhǎng)鏈fab(mab2、mab3、mab4、mab5和mab6)。然后使用fortebiooctet系統(tǒng)，比較了這些人fab的結(jié)合動(dòng)力學(xué)與優(yōu)化的參照fab(mab1opfab)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)總結(jié)于表3中)。表3.fab對(duì)人gitr的親和性fabkd[m]mab1opfab(a)*1.25e-8mab2(a)6.84e-9mab3(a)2.98e-9mab1opfab(b)*6.59e-9mab4(b)2.43e-9mab5(b)3.74e-9mab1opfab(c)*1.47e-8mab6(c)5.94e-9＊a、b、c表示三個(gè)分開的forte實(shí)驗(yàn)。結(jié)果是兩個(gè)樣品重復(fù)的全局?jǐn)M合。抗體mab2、mab3、mab4、mab5和mab6的氨基酸序列以及與人種系序列百分比同一性表1中顯示了五個(gè)fab(mab2、mab3、mab4、mab5和mab6)的可變區(qū)氨基酸序列。通過與單個(gè)種系序列(分別為vkiiil16/a27和vh33-30；表4)比對(duì)vh和vk氨基酸序列，確定五個(gè)fab與人種系序列的百分比同一性。對(duì)于每條鏈，在計(jì)算中省略了cdrh3和cdrl3中的殘基。表4.五個(gè)fab與人種系序列的百分比同一性fabvkiiil15/a27vh33-30fvmab295％86％90％mab398％85％91％mab495％85％89％mab595％83％89％mab695％82％88％mab795％85％89％mab895％85％89％人gitr抗原表位的保留通過間接競(jìng)爭(zhēng)elisa，評(píng)價(jià)了抗原表位保留。所有五個(gè)fab都阻斷了親本小鼠抗體mab1與人gitr的結(jié)合，表明這些人fab保留了初始小鼠抗體的表位特異性。通過elisa分析mab4和mab5的抗原特異性為了測(cè)定在這些igg(mab2、mab3、mab4和mab5)中是否保留了親本小鼠抗體mab1的抗原特異性，在elisa試驗(yàn)中測(cè)定了抗體與一組人tnfr的結(jié)合。使用mab4和mab5(圖2c)的一個(gè)這樣的試驗(yàn)的結(jié)果表明，mab4和mab5保留了對(duì)gitr的高特異性，與小鼠抗體mab1相似。使用mab2、mab3和mab6獲得了相似的結(jié)果。抗體在elisa中結(jié)合人和獼猴gitr蛋白，但不結(jié)合嚙齒動(dòng)物gitr蛋白親本小鼠抗體mab1結(jié)合人和獼猴gitr蛋白，但不結(jié)合嚙齒動(dòng)物gitr蛋白。圖2a-b顯示出，與mab1相似，抗體mab4和mab5能夠以相似方式結(jié)合人和獼猴gitr，但不結(jié)合嚙齒動(dòng)物gitr。用mab6、7和8發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果。通過biacore分析測(cè)定了gitr激動(dòng)劑抗體mab4和mab5對(duì)人(hgitr)和獼猴(cgitr)gitr的結(jié)合親和性。參見表5。單克隆抗體mab4和mab5以亞納米摩爾的結(jié)合親和性(kd)結(jié)合人gitr?？贵wmab4和mab5以納米摩爾的結(jié)合親和性結(jié)合獼猴gitr，比對(duì)人gitr的結(jié)合親和性低了約2-3倍。本發(fā)明的抗-gitr激動(dòng)劑抗體在各種生物化學(xué)試驗(yàn)(包括流式細(xì)胞術(shù)、elisa、biacore和protagentm芯片試驗(yàn))中選擇性地結(jié)合人和獼猴gitr。表5.mab對(duì)人-和獼猴-gitr的結(jié)合親和性抗原mabkd(nm)hgitrmab40.684(±0.331)hgitrmab50.973(±0.167)hgitrmab74.29(±0.14)cgitrmab41.78(±0.543)cgitrmab51.87(±0.520)cgitrmab73.67(±0.09)單克隆抗體mab7結(jié)合人以及獼猴cd4+t細(xì)胞。分離的獼猴或人pbmc的facs分析證明，mab7結(jié)合分離的cd4+t細(xì)胞。另外，facs實(shí)驗(yàn)證明，在pbmc(cd4+t細(xì)胞)的cd3/cd28激活后gitr(通過結(jié)合mab7)和cd25上調(diào)。(數(shù)據(jù)未顯示)報(bào)告基因試驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)中的抗體功能活性在報(bào)告基因試驗(yàn)中測(cè)定了抗體的功能活性(圖3)。mab4、mab5、mab7和mab8igg之每一個(gè)，在交聯(lián)時(shí)，以與gitr配體(gitr-l)相似的水平誘導(dǎo)nfκb活性。參見圖3a-d。用mab2、mab3和mab6獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。mab7與人gitr配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合表達(dá)人gitr的穩(wěn)定細(xì)胞系。競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)一式三份重復(fù)進(jìn)行，facs競(jìng)爭(zhēng)分析證明配體結(jié)合的抑制。參見圖2d。為了證實(shí)在獼猴gitr上的功能活性，將抗體與珠子綴合，與純化的cfse標(biāo)記的人pbmc孵育。與同種型對(duì)照抗體相比，mab7誘導(dǎo)了cd4+t細(xì)胞(圖4a)和cd8+t細(xì)胞(圖4b)的增殖增加。這種增殖的提高還伴隨著幾種細(xì)胞因子分泌的增加，所述細(xì)胞因子包括ifnγ(圖4c)、tnfα、il-10和il-13(未顯示)。用mab4、mab5發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果(未顯示)。我們能夠證實(shí)，由mab7誘導(dǎo)的增殖和ifnγ產(chǎn)生的增加依賴于珠子上抗-cd3和抗-cd28激動(dòng)劑抗體的存在。如果省略這些共刺激抗體，mab對(duì)cd4+或cd8+t細(xì)胞都沒有激動(dòng)劑作用。用mab2、mab3、mab4；mab5和mab6獲得了相似結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)，存在高水平的gitr時(shí)，mab7表現(xiàn)出能夠在體外試驗(yàn)中誘導(dǎo)fcgriiia信號(hào)傳輸(顯示出與adcc活性相關(guān))。daudi-hgitr細(xì)胞與mab7或?qū)φ誥b及jurkat-v158細(xì)胞系的孵育，顯示出mab7能夠在體外試驗(yàn)中誘導(dǎo)fcgriiia信號(hào)傳輸，并且mab7誘導(dǎo)fcgriiia信號(hào)傳輸?shù)哪芰εcdaudi細(xì)胞表面上表達(dá)的受體水平相關(guān)(即，越高的受體水平等于越高的fcgriiia信號(hào)傳輸誘導(dǎo))。參見圖5.hgitr在t-細(xì)胞上表達(dá)，并且在hgitr-hgitrl敲入小鼠中是功能性的。從野生型或hgitr-hgitrl敲入小鼠分離脾細(xì)胞，并在沒有刺激或用a-cd3和a-cd28抗體刺激的情況下培養(yǎng)24、48、72或96小時(shí)。然后用熒光團(tuán)綴合的抗體染色細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析，證明人gitr表達(dá)，并且共刺激導(dǎo)致野生型或轉(zhuǎn)基因小鼠中提高的gitr表達(dá)譜。從hgitr-hgitrl敲入小鼠分離的脾細(xì)胞證明，在培養(yǎng)物中應(yīng)答共同刺激而誘導(dǎo)了gitr表達(dá)(圖6a)。mab7有效結(jié)合cd8+細(xì)胞上表達(dá)的hgitr(圖6b)；mab7和受刺激的t細(xì)胞的結(jié)合與提高的t細(xì)胞激活相關(guān)，如通過pikk染色(圖6c)和t細(xì)胞激活標(biāo)志物cd25+(圖6d)所測(cè)量的。mab7在體內(nèi)是功能性的。如上所述，用單劑運(yùn)載體(n＝8/時(shí)間點(diǎn))或mab7(n＝10/時(shí)間點(diǎn))抗體處理具有建立的colon26腫瘤的hgitr-hgitrl雙敲入小鼠。每周測(cè)量腫瘤兩次，并使用公式(lxw2)/2計(jì)算腫瘤體積。mab處理的動(dòng)物表現(xiàn)出colon26腫瘤的延遲生長(zhǎng)。處理后三天時(shí)，收集全血(圖7b-7c)和腫瘤(圖7d-7e)，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞上細(xì)胞表面的hgitr表達(dá)。結(jié)果表明，對(duì)于血液和腫瘤中的t調(diào)節(jié)細(xì)胞和t輔助細(xì)胞，hgitr占據(jù)和脫落導(dǎo)致處理組的hgitr降低(＊p<0.05，＊＊＊＊p<0.00005)。mab7在體內(nèi)引發(fā)對(duì)colon26腫瘤的抗腫瘤免疫應(yīng)答。用單劑運(yùn)載體(n＝8/時(shí)間點(diǎn))或mab7(n＝10/時(shí)間點(diǎn))抗體處理具有建立的colon26腫瘤的hgitr-hgitrl雙敲入小鼠。圖8a描繪了施用后3天的結(jié)果，證明了treg在處理過的動(dòng)物中降低。圖8b-8c描繪了施用后15天的結(jié)果，證明了處理后腫瘤部位存在增加的淋巴細(xì)胞(8b)和增加的激活的cd8+t細(xì)胞(8c)。細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量相對(duì)于腫瘤大小進(jìn)行了標(biāo)化，以說明運(yùn)載體和mab7處理組之間在腫瘤大小上的顯著差異。mab7結(jié)果表明，將總的腫瘤內(nèi)激活的cd8+t細(xì)胞與cd4+foxp3+treg相比，處理導(dǎo)致在處理的動(dòng)物中提高的teff/treg比率。參見圖8d。另外，來自脾細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果(其中純化cd8+t細(xì)胞與colon26腫瘤細(xì)胞離體孵育，并使用ifngelispot試驗(yàn)測(cè)量ctl應(yīng)答)，表明來自mab7處理的動(dòng)物的cd8+t細(xì)胞中提高的腫瘤特異性ifng應(yīng)答。(＊p<0.05,＊＊＊p<0.0005)。參見圖8e。用抗-mgitrab處理小鼠可以上調(diào)腫瘤和脾中的pd-1表達(dá)。用兩劑的對(duì)照或小鼠抗mgitr抗體處理帶有建立的colon26腫瘤的小鼠。圖9a9c描繪的結(jié)果表明，用替代物gitr抗體igg2a-dta-1處理后，在colon26腫瘤以及脾中在cd8+t細(xì)胞上pd-1表達(dá)上調(diào)。gitr和pd-1組合，與同種型對(duì)照相比，賦予存活優(yōu)勢(shì)。在帶有建立的colon26腫瘤的小鼠中，單獨(dú)和組合地施用抗-gitr(dta-1)和抗pd-1(rmp1-14)。參見圖10。與同種型對(duì)照相比，組合施用顯示出明顯的存活優(yōu)勢(shì)(＊＊＊p<0.0005配對(duì)比較，使用gehan-breslow-wilcoxon檢驗(yàn))。與同種型對(duì)照相比，抗-mgitr(igg2a-dta-1)單藥劑顯示出明顯的存活優(yōu)勢(shì)(＊p<0.05配對(duì)比較，使用gehan-breslow-wilcoxon檢驗(yàn))。數(shù)據(jù)表明，igg2a-dta-1和rmp1-14的組合相對(duì)于同種型對(duì)照處理，賦予統(tǒng)計(jì)上顯著的存活優(yōu)勢(shì)，中值tte大于42天(未達(dá)中值tte)而同種型處理組為22天(p<0.0005)。尤其是，3/10動(dòng)物獲得了完全消退(cr)，2/10動(dòng)物獲得了疾病的穩(wěn)定(sd)。igg2a-dta-1單一治療導(dǎo)致了30.5天的中值tte(p<0.05)，3/10動(dòng)物獲得了疾病的穩(wěn)定(sd)。rmp1-14處理組的中值存活為24天，其與同種型對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。產(chǎn)生了kaplanmeier圖并使用prism軟件(graphpadsoftware)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用gehan-breslow-wilcoxon檢驗(yàn)，以配對(duì)比較進(jìn)行了組比較。對(duì)于所有統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)，將顯著性水平設(shè)定在p<0.05。報(bào)道與運(yùn)載體對(duì)照組比較的顯著性。疾病的穩(wěn)定被定義為，在3次連續(xù)腫瘤體積測(cè)量中，腫瘤體積具有10％或更小的變化?？?gitr或抗-gitr組合抗pd-1施用后，評(píng)價(jià)了腫瘤中共刺激分子的表達(dá)。參見圖11。1劑抗-gitr或抗-pd1或抗-gitr+pd1組合后，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了整個(gè)腫瘤和脾的單細(xì)胞懸浮液，結(jié)果表明，用gitr、pd-1和組合處理后，colon26腫瘤中cd8+t細(xì)胞上提高的lag3、tim3和pd-1表達(dá)。單劑組合顯示出，在脾cd8+細(xì)胞中pd-1表達(dá)的上調(diào)。按引用并入本文中所有提及的出版物、專利和登錄號(hào)全部按引用并入，如同單獨(dú)地特意指明每篇出版物或?qū)＠匆貌⑷?。等同物盡管已經(jīng)討論了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但以上的說明書是舉例說明性的，而非限制性的。在閱讀說明書和以下權(quán)利要求時(shí)，本發(fā)明的許多變化將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然易見的。本發(fā)明的完整范圍應(yīng)當(dāng)參照權(quán)利要求連同其等同物的完整范圍以及說明書連同這些變化，予以確定。當(dāng)前第1頁12