本發(fā)明涉及經(jīng)工程改造以顯示pH敏感抗原結(jié)合的抗TNFa抗體。本發(fā)明優(yōu)選地涉及抗TNFa抗體阿達木單抗或其生物活性變體和片段，其中通過可變區(qū)內(nèi)氨基酸序列的修飾來工程改造原始的阿達木單抗抗體或其變體或片段。具體地，本發(fā)明涉及阿達木單抗或其生物活性變體或片段，其中CDR結(jié)構(gòu)域通過用組氨酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基來修飾。

所得修飾的抗TNFa抗體引起改善的藥代動力學(xué)性質(zhì)，其具有改善的抗原介導(dǎo)的IgG清除率和延長的總體血清半衰期。

發(fā)明背景

據(jù)信治療性抗體(mAb)至少為許多疾病如炎癥、自身免疫或腫瘤疾病提供重要的治療選擇。在2012年，美國市場上針對腫瘤學(xué)和抗炎癥疾病的各種靶標有40個FDA批準的mAb，在生物制劑市場中約占38.5％的份額。銷售額約246億美元表明治療性抗體作為所有生物制劑的最高收入類別的作用(Aggarwal，2009，Aggarwal，2014)。

對于治療性抗體，通過含有四類天然存在的相互作用配偶體(抗原、新生兒Fc-受體(FcRn)、Fc-受體(FcγR)和補體系統(tǒng)因子)的相互作用曲線測定不同的生物學(xué)結(jié)果(Chan和Carter，2010)。已經(jīng)報道了若干種策略以優(yōu)化旨在額外或改善的功能和特異性的抗體(Beck等人，2010)。在抗體內(nèi)，有兩個結(jié)構(gòu)特征可以用于工程改造。第一，介導(dǎo)與抗原相互作用的可變片段(Fv)，其次是參與抗體再循環(huán)或介導(dǎo)與免疫細胞相互作用的恒定片段(Fc)。

對于不同的抗原(例如細胞因子和生長因子)，存在多種作用機制，例如阻斷可溶性配體，從而阻止與其相應(yīng)受體的相互作用或阻斷受體本身(Chan和Carter，2010)。已經(jīng)投入了大量的努力來改善對Fv工程改造的功能，其通常通過增加對各抗原的特異性和/或結(jié)合親和力而被估價(Beck等人，2010)。提高抗體功效的一個策略是通過親和力成熟方法增強Fv-抗原相互作用。本文中，使用顯示技術(shù)篩選分子文庫允許分離表現(xiàn)出優(yōu)異親和力的變體。

恒定片段(Fc)及其連接的性質(zhì)可以用改變的免疫或抗體再循環(huán)的結(jié)果來調(diào)節(jié)。改變的Fc介導(dǎo)的免疫功能的突出實例是已經(jīng)被提出以增強抗體功效和減少劑量的增強的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。

已經(jīng)探索了其它策略，包括抗體的直接和間接裝備或多價抗體內(nèi)特異性的調(diào)節(jié)(Carter 2011)。

Fc功能的一個重要方面對應(yīng)于其在決定人免疫球蛋白1(IgG1)的長血清半衰期的抗體再循環(huán)中的關(guān)鍵作用。在通過流體相胞飲作用的細胞吸收后，IgG1的Fc部分以pH依賴性方式與新生兒Fc受體(FcRn)相互作用，導(dǎo)致酸化的內(nèi)體中的抗體捕獲(Kuo和Aveson，2011)。從那里，抗體被再循環(huán)回到循環(huán)中，并因此可以被保護免于細胞內(nèi)分解代謝。產(chǎn)生具有增強的FcRn結(jié)合親和力的不同的突變Fc-種類，并通過取代三種氨基酸來測試增加的再循環(huán)速率，其在食蟹猴研究中具有高達4倍延長的血清半衰期(Dall'Acqua等人，2006)。

雖然大多數(shù)抗體表現(xiàn)出高效的抗原阻斷，但是存在在治療性抗體的開發(fā)過程中沒有完全解決的缺點：

在許多治療性抗體中，抗體結(jié)合位點在抗體在血漿中的生存期間僅結(jié)合一個抗原分子(Igawa等人，2010)。

抗體注射的劑量和頻率取決于兩次注射之間的抗原合成速率，因為抗原通常在體內(nèi)連續(xù)產(chǎn)生(Igawa等人，2010)。

高生產(chǎn)成本和大量抗體的給藥：

Tocilicumab治療：8mg/kg/月，靜脈注射(Maini等人，2006)，

阿達木單抗治療：每隔一周40mg($19,272/每人/每年(Schabert等人，2013)。

當抗體結(jié)合可溶性靶時，可發(fā)生“抗體緩沖”效應(yīng)，其中抗原的降解在與抗體結(jié)合時被阻止。游離抗原庫建立自抗原-抗體復(fù)合物的可逆解離，并因此延長體內(nèi)持久性(O'Hear和Foote，2005)/Finkelman等人，1993)。

考慮到治療性抗體的這些缺點，需要在不存在高劑量和/或頻繁給藥的情況下產(chǎn)生治療響應(yīng)的更有效的分子(Chapparo-Riggers等人，2012)。

實現(xiàn)這些目標的一種可能性是對新的或良好建立和批準的抗體的可變區(qū)和任選的恒定區(qū)進行特異性工程改造。一種方法是開發(fā)表現(xiàn)出pH敏感抗原結(jié)合的抗體。已經(jīng)表明，組氨酸在抗體和其它蛋白質(zhì)的結(jié)合界面中的合理或組合摻入(Sarkar等人，2002，Chaparro-Riggers等人，2012，Ito等人，1992，Igawa等人，2010，Igawa等人，2013，Murtaugh等人，2011，Gera等人，2012)可以通常用于工程改造pH依賴性結(jié)合。pH敏感結(jié)合的基礎(chǔ)源于組氨酸對微環(huán)境中由于pH值降低而質(zhì)子化的敏感性。更詳細地，組氨酸需要在結(jié)合時經(jīng)歷pKa變化，以便在生理pH范圍內(nèi)質(zhì)子化(Murtaugh等人，2011)。結(jié)合界面中組氨酸側(cè)鏈的質(zhì)子化可改變靜電相互作用或可誘導(dǎo)導(dǎo)致結(jié)合親和力的pH依賴性差異的構(gòu)象變化(Gera等人，2012)。結(jié)合平衡的平衡的靜電和非靜電組分決定了結(jié)合的敏感性(Murtaugh等人，2011)。

將pH敏感性摻入抗原結(jié)合位點可以增加抗原結(jié)合循環(huán)的數(shù)目。本文中，pH依賴性抗體在血漿pH(pH 7.4)下以相似的高或降低的足夠的親和力與其抗原結(jié)合，并且在酸性pH(pH 6)下顯示減少的結(jié)合(Chaparro-Riggers等人，2012，Igawa等人，2010)，導(dǎo)致抗體從其在酸性內(nèi)體內(nèi)的抗原結(jié)合位點的更快和增加的解離，從而能夠再循環(huán)回到血漿并降低抗原介導(dǎo)的清除。

在結(jié)合可溶性靶的常規(guī)抗體的FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)(圖1a)期間，抗體-抗原復(fù)合物通過內(nèi)體運輸途徑再循環(huán)回到細胞外空間(Roopenian和Akilesh，2007)。相比之下，pH敏感抗體(圖1b)在內(nèi)體酸化期間(pH<6.5)從抗體-抗原復(fù)合物釋放其抗原(Roopenian和Akilesh，2007)。結(jié)果，游離抗體再循環(huán)到循環(huán)中，而抗原進入降解途徑(Chaparro-Riggers等人，2012，Igawa等人，2010)。

因此，pH敏感結(jié)合能夠使得抗體與另一抗原相互作用，并允許每個抗體分子的多個抗原分子的中和。PH-敏感性還可以增加抗體的半衰期，所述抗體針對膜相關(guān)靶并且例如在受體結(jié)合時內(nèi)化和降解。本文中，當抗體在內(nèi)體酸化期間釋放時，pH敏感性可以導(dǎo)致半衰期增加。

公開了若干種不同的策略，目的是工程改造蛋白質(zhì)中的pH轉(zhuǎn)換。以每個單個氨基酸殘基(例如在CDR區(qū)內(nèi))突變?yōu)镠is的組氨酸(His)掃描允許單取代變體的表征和有效突變的鑒定。通過組合這些取代產(chǎn)生新的變體可以導(dǎo)致增強的pH依賴性結(jié)合(Murtaugh等人，2011，Chaparro-Riggers等人，2012，Igawa等人，2010)。通過基于結(jié)構(gòu)的建模置換組氨酸時可能有助于pH敏感性的殘基的鑒定可以幫助盡可能減少在組氨酸掃描方法期間所需的努力和時間。需要晶體結(jié)構(gòu)以便具備對于結(jié)合和pH轉(zhuǎn)換的合理設(shè)計重要的殘基的精確概念(Sarkar等人，2002)。組合組氨酸掃描文庫方法需要體外篩選技術(shù)(例如噬菌體展示或酵母展示)，以從大分子文庫分離pH敏感變體。Murtaugh及其同事通過使用寡核苷酸定向誘變設(shè)計了美洲駝VHH抗體文庫，從而允許結(jié)合界面內(nèi)的每個殘基取樣親本VHH抗體的組氨酸殘基和野生型殘基兩者。對于M13-噬菌體展示文庫分離的變體的篩選顯示在pH 7.4下的在35-91nM之間的KD和在pH 5.4下結(jié)合親和力約10⁴倍減少(Murtaugh等人，2011)。

由于再循環(huán)的游離抗體能夠結(jié)合另一抗原，因此與其中單個抗體可以與抗原僅結(jié)合一次的常規(guī)方法相比，pH依賴性抗原結(jié)合將使單個抗體分子能夠重復(fù)結(jié)合多個抗原。

因此，通常需要制備關(guān)于其血漿和血清濃度更有效的可獲得的抗體，其可以通過對治療性抗體的不同細胞作用位點安裝pH敏感性來實現(xiàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了抗-TNFa抗體阿達木單抗的突變形式，其中所述突變由原始非突變的抗體阿達木單抗的氨基酸殘基被組氨酸殘基取代的一個或多個取代構(gòu)成，所述組氨酸殘基在所述抗體的重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的互補決定區(qū)(CDR)中。在阿達木單抗的一些CDR中的限定位置處引入組氨酸殘基，使得與非突變的抗體相比，原始抗體更加pH敏感或pH依賴。有趣的是，雖然組氨酸突變的抗體經(jīng)歷結(jié)合親和力的顯著喪失(高達10倍或更多的K_D)，但是與其親本非突變形式相比，本發(fā)明的突變的抗體治療上顯著更有效，導(dǎo)致減少抗體劑量或抗體給藥間隔，和由此顯著降低治療成本的可能性。

本發(fā)明已經(jīng)表明，根據(jù)本發(fā)明，通過置換阿達木單抗或其生物活性變體及其片段的CDR中的原始氨基酸殘基而成功引入組氨酸殘基，就關(guān)于pH敏感性和結(jié)合親和力的程度的期望結(jié)果而言，不遵守常規(guī)規(guī)則或心理考慮。

因此，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，阿達木單抗的組氨酸突變形式是特異性治療有效的，如果pH依賴性抗原結(jié)合導(dǎo)致抗原解離速率(K_dis)比pH6/pH7，其與非突變的阿達木單抗的各自K_dis速率比相比為5至20倍高，并且所述突變的阿達木單抗的結(jié)合親和力是所述非組氨酸突變的阿達木單抗的結(jié)合親和力的1-25％，優(yōu)選1-15％，更優(yōu)選2-12％。

因此，本發(fā)明提供了具有pH依賴性抗原結(jié)合的人抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含人抗體阿達木單抗或其具有相同或相似生物活性的變體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的至少一個CDR結(jié)構(gòu)域通過用組氨酸殘基置換所述CDR結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個氨基酸而突變，因此產(chǎn)生突變的阿達木單抗或阿達木單抗變體，引起pH依賴性抗原結(jié)合，其具有通過Bioayer Interferometrie(Octet Red)或其它相當?shù)姆椒y量的抗原解離速率(K_dis)比pH 6/pH 7，其與非突變的阿達木單抗的各自K_dis速率比相比為至少5、10、15或10倍高。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供各自的突變阿達木單抗，其中所述突變的抗體或其抗原結(jié)合片段具有減小的抗原結(jié)合親和力，其中優(yōu)選為非突變的阿達木單抗的結(jié)合親和力的1-15％，分別為1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

本發(fā)明提供衍生自阿達木單抗的人抗TNFa抗體，其中親本阿達木單抗的CDR內(nèi)的一個或多個原始氨基酸殘基用組氨酸殘基置換。有趣的是，阿達木單抗的最有效的組氨酸突變的形式包含在可變輕鏈內(nèi)，尤其是在輕鏈的CDR1和CDR3結(jié)構(gòu)域中的組氨酸突變。優(yōu)選的組氨酸突變的阿達木單抗形式進一步或獨立地包括組氨酸突變的CDR3重鏈。

因此本發(fā)明提供突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段，包含選自以下的CDR3重鏈序列：

或H，且X₄為S或H，和其中至少X₁或X₂或X₃或X₄為H。

本發(fā)明進一步提供突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段，包含選自以下的CDR3輕鏈序列：

其中X₁為Q或H，和X₂為T或H，

X₁X₂X₃X₄RAPYX₅(SEQ ID NO：41)，其中X₁為Q或H，X2為R或H，X3為Y或H，X4為N或H，和X₅為T或H，其中至少X₁或X₂或X₃或X₄或X₅為H。

本發(fā)明進一步提供突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段，包含選自以下的CDR1輕鏈序列：

RASQGIRNHLA(SEQ ID NO：15)，

RASQGIRNHHA(SEQ ID NO：16，

RASQGIRNX₁X₂A(SEQ ID NO：42)，

其中X₁為Y或H，X₂為L或H，其中至少X₁或X₂為H。

本發(fā)明進一步提供突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段，包含選自以下的CDR2輕鏈序列：

AAHTLQS(SEQID NO：32)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述組氨酸突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段包含如上文和在權(quán)利要求中所述的CDR3重鏈序列，和如上文和在權(quán)利要求中所述的CDR1輕鏈序列。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述組氨酸突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段包含如上文和權(quán)利要求中所述的CDR3重鏈序列和CDR3輕鏈序列。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述組氨酸突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段包含如上文和權(quán)利要求中所述的CDR3重鏈序列、CDR2輕鏈序列和CDR3輕鏈序列。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述組氨酸突變的阿達木單抗或其抗原結(jié)合片段包含如上文和權(quán)利要求中所述的CDR3重鏈序列、CDR1輕鏈序列和CDR3輕鏈序列。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，組氨酸突變的阿達木單抗的優(yōu)選形式包含以下輕鏈可變區(qū)之一：

(i)

(ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

(vii)

(viii)

(ix)

其中X₁為L或H，

(x)

其中X₁為Q或H，和X₂為T或H

(xi)

其中X₁為T或H；

(xii)

其中X₁為Q或H；

(xiii)

其中X1為L或H，和X₂為Q或H，和X₃為T或H；

(xiv)

其中X₁為Y或H，X₂為L或H，X₃為S或H，X₄為Q或H，X₅為R或H，X₆為Y或H，X₇為N或H，X₈為T或H，其中至少X₁或X₂或X₃或X₄或X₅或X₆或X₇或X₈為H。

本發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，組氨酸突變的阿達木單抗的優(yōu)選形式包含以下重鏈可變區(qū)之一：

(i)

(ii)

(iii)

(iv)

其中X₁為S或H，X₂為L或H，X₃為S或H，X₄為S或H，其中至少X₁或X₂或X₃或X₄為H。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的組氨酸突變的阿達木單抗包含如上所述的任何可變輕鏈和如上所述的任何一個可變重鏈結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明的第一優(yōu)選實施方案是組氨酸突變的阿達木單抗，其分別包含可變重鏈序列：

和

可變輕鏈序列：

本發(fā)明的第二優(yōu)選實施方案是組氨酸突變的阿達木單抗，其分別包含可變重鏈序列：

和

可變輕鏈序列：

本發(fā)明的第三優(yōu)選實施方案是組氨酸突變的阿達木單抗，其分別包含可變重鏈序列：

和

可變輕鏈序列：

組氨酸突變的阿達木單抗抗體或其變體或片段可以進一步包含人重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)。

在一個實施方案中，它們包含人IgG，優(yōu)選人IgG1(例如由SEQ ID NO：11指定)或IgG2重鏈恒定區(qū)。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，它們包含人κ輕鏈恒定區(qū)。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的組氨酸突變的阿達木單抗形式包含人重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選IgG1，其中Fc部分在一個或多個氨基酸位置突變，所述突變通過用其它介導(dǎo)(增加或減少)抗體與FcRn結(jié)合的天然氨基酸殘基來置換原始氨基酸殘基。

本發(fā)明的組氨酸突變的阿達木單抗抗體可以通過與其它多肽或蛋白質(zhì)例如細胞因子的重組融合，或通過與化學(xué)，優(yōu)選細胞毒性實體的化學(xué)連接，優(yōu)選通過連接分子形成抗體-藥物綴合物(ADC)綴合至其它分子。產(chǎn)生此類抗體融合蛋白或抗體藥物綴合物的技術(shù)和方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)得到很好地確認。

本發(fā)明還提供了適用于治療炎癥、自身免疫或癌癥疾病的藥物組合物，其包含組氨酸突變的抗TNFa抗體阿達木單抗或其變體或抗原結(jié)合片段，或各自的抗體-藥物綴合物或抗體細胞因子融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發(fā)明最后提供了此類組氨酸突變的阿達木單抗或其生物有效和活性變體或片段，或ADC或其融合蛋白在制備用于治療TNFa誘導(dǎo)的炎癥、自身免疫或癌癥疾病的藥物中的治療用途，詳細說明如下。

本發(fā)明的組氨酸突變的阿達木單抗形式顯示出以下有利的性質(zhì)和功能：

阿達木單抗結(jié)合位點在TNFα結(jié)合后的長時間內(nèi)不再被阻斷。

阿達木單抗顯示與靶抗原顯著改善的pH敏感結(jié)合。

在FcRn的再循環(huán)期間，通過在酸化的內(nèi)體中組氨酸突變的阿達木單抗可以更有效地釋放sTNFα。

在結(jié)合膜結(jié)合靶(mTNFα)時，可以避免或減少引發(fā)將導(dǎo)致抗體消除的mTNFα-阿達木單抗復(fù)合物的受體介導(dǎo)的內(nèi)化和溶酶體降解。

顯示pH依賴性靶結(jié)合的TNFα結(jié)合抗體的改善的藥代動力學(xué)。

pH敏感抗體變體通過改變抗體可變區(qū)內(nèi)的氨基酸序列而衍生自親本阿達木單抗序列。

將pH敏感性摻入阿達木單抗是通過用組氨酸取代重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸確立的。

阿達木單抗變體的pH敏感性對應(yīng)于在pH6/pH7.4下與親本阿達木單抗的比率相比動力學(xué)參數(shù)(KD，kdis)之間增加的比率。

在這方面，根據(jù)本發(fā)明的阿達木單抗抗體能夠中和抗原多次。

因此，治療效果可以延長，并且可以允許更低頻率的抗體的施用和/或以更低的劑量的施用。

發(fā)明詳述

腫瘤壞死因子α(TNFα)：

TNFα是在免疫應(yīng)答中通過引發(fā)對例如一些細菌感染的防御應(yīng)答而發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞因子。它在正常炎癥的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中起作用，并且還參與淋巴組織發(fā)育(Tracey等人，2008)。

許多不同的細胞產(chǎn)生TNFα，包括巨噬細胞、T細胞、肥大細胞和粒細胞，僅舉幾例。TNFα是通用術(shù)語，其包括可溶性(sTNFα)和跨膜TNFα(mTNFα)。在通過金屬蛋白酶TNF-α轉(zhuǎn)換酶(TACE)蛋白水解切割跨膜TNFα(26kDa單體的同三聚體)后，細胞釋放可溶性同三聚體(Wajant等人，2003)。兩種形式，sTNFα或mTNFα與兩種不同的受體，TNF受體1(TNFR1)和TNF受體2(TNFR2)相互作用。兩種受體在其細胞表達概覽和信號傳導(dǎo)機制方面不同。因為mTNFα本身可以用作兩種TNF受體的配體或受體，相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性增加(Wajant等人，2003)。

在疾病期間，TNFα的高表達觸發(fā)并介導(dǎo)下游機制，其可以導(dǎo)致受影響區(qū)室內(nèi)的慢性炎癥和發(fā)病機理(Tracey等人，2008)。TNFα活性在自身免疫病中的共同后果是免疫細胞募集、細胞增殖、細胞死亡和免疫調(diào)節(jié)的調(diào)整。其它效應(yīng)如基質(zhì)降解和破骨細胞形成更具疾病特異性，并且可能與受影響組織中的不同細胞類型相關(guān)(在Tracey等人，2008，Choy&Panayi，2001；Feldmann，2002；Schottelius等人，2004中綜述)。

TNFα在調(diào)節(jié)例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病和斑塊型銀屑病中的致病事件中具有特別重要的作用，并快速誘導(dǎo)其它細胞因子(例如IL-1β和IL-6)(Tracey等人，2008)。在若干種炎癥性自身免疫病中，通過治療性抗-TNFα抗體阻斷TNFα后的陽性臨床結(jié)果證實過量TNFα暴露與疾病病理學(xué)之間的聯(lián)系(Aggawal，2003；Tracey等人，2008)。

阿達木單抗：

阿達木單抗(也由其商標名已知)是最初通過使用噬菌體展示開發(fā)的針對TNFα的完全人148kDa IgG1 κ單克隆抗體(Abbott Laboratories，2014)。自2002年市場推出以來，阿達木單抗產(chǎn)生了巨大的銷售額，在2012年僅在美國市場就達到了46億美元(Aggarwal，2014)。阿達木單抗以高亞納摩爾親和力結(jié)合TNFα，從而阻斷TNFα與p55和p75細胞表面受體TNFR1或TNFR2之間的相互作用(Abbott Laboratories，2014)。

由于阿達木單抗還以高親和力結(jié)合mTNFα，因此進一步可能的作用模式包括在逆轉(zhuǎn)信號傳導(dǎo)機制和CDC或ADCC介導(dǎo)的細胞殺傷時的細胞凋亡或細胞因子抑制(在Tracey等人，2008和Horiuchi等人，2010中綜述)。

阿達木單抗(及其變體)的氨基酸序列及其藥理學(xué)和治療性質(zhì)公開于例如WO 97/029131中。

就本發(fā)明而言重要的序列在下面詳細列出：

阿達木單抗全輕鏈序列：

阿達木單抗輕鏈序列，可變區(qū)(VL)：

VL的阿達木單抗CDR1序列

RASQGIRNYLA(SEQ ID NO：3)

VL的阿達木單抗CDR2序列

AASTLQS(SEQ ID NO：4)

VL的阿達木單抗CDR3序列

QRYNRAPYT(SEQ ID NO：5)

阿達木單抗全重鏈序列：

阿達木單抗重鏈序列，可變區(qū)(VH)：

VH的阿達木單抗CDR1序列：

DYAMH(SEQ ID NO：8)

VH的阿達木單抗CDR2序列：

AITWNSGHIDYADSVEG(SEQ ID NO：9)

VH的阿達木單抗CDR3序列：

VSYLSTASSLDY(SEQ ID NO：10)

阿達木單抗人重鏈IgG1恒定區(qū)：

阿達木單抗在許多國家被批準用于一些治療性治療，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎和克羅恩病。

因此，根據(jù)本發(fā)明的組氨酸突變的阿達木單抗形式也適用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎和克羅恩病，而且可用于治療由TNFα誘導(dǎo)或觸發(fā)的其它疾病。這可以包括自身免疫病以及癌癥疾病。

抗體的選擇：

根據(jù)本發(fā)明的阿達木單抗及其片段的合適的抗TNFα抗體形式的選擇可以通過本領(lǐng)域良好建立的并已知的方法和技術(shù)來實現(xiàn)，例如通過經(jīng)由噬菌體展示文庫的組氨酸取代或通過酵母表面展示的組合組氨酸取代文庫。詳細內(nèi)容在實施例部分提供。

術(shù)語、定義、詳細內(nèi)容

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”在最廣泛的意義上使用，并且具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性。根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，完整抗體或全部抗體可以分為不同的類別。完整抗體有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的幾種可以進一步分為“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。

根據(jù)本發(fā)明的抗體的優(yōu)選主要類別是IgG，更詳細地是IgG1和IgG2，最優(yōu)選IgG1。

根據(jù)本發(fā)明的“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和Fc片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子；由抗體片段形成的雙特異性和多特異性抗體。

根據(jù)本發(fā)明的“整個或完全”抗體是包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3的抗體。

根據(jù)本發(fā)明的抗體的“Fc”區(qū)通常包含IgG1或IgG2抗體主要類別的CH2、CH3和鉸鏈區(qū)。所述鉸鏈區(qū)是一組約15個氨基酸殘基，其組合CH1區(qū)與CH2-CH3區(qū)。

“Fab”片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)，并且僅具有一個抗原結(jié)合位點。

“Fab'”片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基。

根據(jù)本發(fā)明的“F(ab’)2”抗體是作為Fab’片段對產(chǎn)生的，在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。

根據(jù)本發(fā)明的“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的V和V結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使得scFv能夠形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的抗體的“可變結(jié)構(gòu)域”包括構(gòu)架區(qū)(通常為FR1至FR4)以及被指定為“高變區(qū)”的CDR結(jié)構(gòu)域(通常為CDR1、CDR2和CDR3)。

當在本文中使用時，術(shù)語“高變區(qū)”或“CDR”是指負責抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。

如果沒有另外指出，根據(jù)本發(fā)明的抗體分子內(nèi)的氨基酸位置根據(jù)Kabat編號。

“構(gòu)架區(qū)”或“FR”殘基是除如本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。

根據(jù)本發(fā)明的“抗體變體”包括與親本抗體相比具有修飾的氨基酸序列但與靶向抗原具有相同或改變的結(jié)合親和力的抗體?？贵w變體與親本抗體的不同之處在于在抗體的可變結(jié)構(gòu)域(包括CDR結(jié)構(gòu)域)和/或恒定區(qū)內(nèi)的特定位置處置換或缺失或添加一個或多個氨基酸殘基，以便修飾抗體的某些性質(zhì)，例如結(jié)合親和力和/或受體功能，如ADCC、FcRn結(jié)合等。不經(jīng)進一步修飾的本發(fā)明的組氨酸突變的抗體不被稱為根據(jù)本發(fā)明的“抗體變體”。根據(jù)本發(fā)明的抗體變體與親本抗體相比顯示出80-99％的序列同源性，優(yōu)選90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同源性，取決于待置換、缺失或添加的氨基酸殘基的特定位置。阿達木單抗的抗體變體例如公開于

術(shù)語“融合蛋白”是指由一個或多個如上定義的生物分子組成的天然或合成分子，其中具有不同特異性的兩個或更多個基于肽或基于蛋白質(zhì)(包括糖蛋白)的分子任選地通過化學(xué)或氨基酸基接頭分子融合在一起。連接可以通過C-N融合或N-C融合(在5'→3'方向)，優(yōu)選C-N融合實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白是本發(fā)明的抗體或抗體變體與另一蛋白或多肽，優(yōu)選細胞因子融合的所述融合。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗體-藥物綴合物(ADC)”是指由根據(jù)本發(fā)明的抗體，優(yōu)選完全抗體和優(yōu)選化學(xué)細胞毒劑組成的免疫綴合物。組分通過特異性接頭彼此化學(xué)連接。本發(fā)明的抗體(優(yōu)選在其重鏈恒定區(qū)內(nèi))可以在一個或多個氨基酸位置處被修飾，以便產(chǎn)生與接頭和/或細胞毒性有效負載藥物的合適的連接。產(chǎn)生這種ADC的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“Fc受體”是指免疫球蛋白的Fc區(qū)的受體(FcR)，其將免疫系統(tǒng)內(nèi)的體液應(yīng)答與細胞活性相連。基于它們的功能，可以區(qū)分開FcR的兩個一般組：主要由觸發(fā)抗體效應(yīng)子功能的白細胞表達的那些和主要介導(dǎo)跨上皮或內(nèi)皮表面的免疫球蛋白轉(zhuǎn)運的那些。通過靶結(jié)合抗體(屬于IgG或IgA或IgE類別)與某些Fc受體(FcR)的相互作用觸發(fā)ADCC。涉及人IgG1的ADCC高度依賴于其Fc部分的糖基化概覽和Fcγ受體的多態(tài)性。術(shù)語“FcRn”是指特異性新生兒Fc受體，其在酸性pH(<6.5)下結(jié)合IgG，但不在中性或更高的pH下結(jié)合IgG。受體負責延長血清中IgG抗體的半衰期。

術(shù)語“細胞因子”是由一種細胞群體釋放的蛋白的通用術(shù)語，其作為細胞間介質(zhì)作用于另一種細胞。這樣的細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素，例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；整合素；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGFβ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGFα和TGFβ；紅細胞生成素(EPO)；干擾素如IFNα、IFNβ和IFNγ；集落刺激因子例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；和TNF-α或TNF-β。

術(shù)語“生物/功能有效”或“治療有效(量)”是指在體內(nèi)或體外引起生物功能或生物功能變化的藥物/分子，并且其在特定量下有效治療在哺乳動物中，優(yōu)選在人中的疾病或病癥。

術(shù)語“藥物治療”是指在步驟方面實施本發(fā)明的多種方式。例如，根據(jù)本發(fā)明的藥劑可以同時、按序或分別施用。此外，可以在施用之間的一個或多個時間間隔內(nèi)分別施用所述藥劑。本發(fā)明的治療組合物含有生理上可耐受的載體以及作為活性成分溶解或分散于其中的如本文所述的相關(guān)藥劑。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指組合物、載體、稀釋劑和試劑，其代表能夠施用于哺乳動物或在哺乳動物上施用，而不產(chǎn)生非期望的生理效應(yīng)，例如惡心、眩暈、胃部不適等的物質(zhì)。含有溶解或分散于其中的活性成分的藥物組合物的制備在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且不需要基于制劑進行限制。通常，將這樣的組合物作為液體溶液或懸浮液制備為可注射制劑，然而，也可以制備適于在使用前在液體中的溶液或懸浮液的固體形式。制劑也可以乳化?；钚猿煞挚梢耘c藥學(xué)上可接受的并且與所述活性成分相容的賦形劑混合，并且其量適合用于本文所述的治療方法。合適的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。此外，如果需要，所述組合物可以含有少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等，其可以增強所述活性成分的有效性。本發(fā)明的治療組合物可以包括在其中的組分的藥學(xué)上可接受的鹽。

根據(jù)本發(fā)明的組氨酸突變的阿達木單抗形式適合于治療與批準和市售的非組氨酸突變的阿達木單抗相同的病癥和疾病，其是類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和慢性斑塊型銀屑病，其中所述藥物優(yōu)選通過皮下注射施用。

與市售藥物一樣，根據(jù)本發(fā)明的組氨酸突變的阿達木單抗可以單獨使用或與支持該治療的其它藥物組合使用，例如甲氨蝶呤、DMARDS、糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥(NSAID)和/或鎮(zhèn)痛藥。

的標準劑量方案通常為每周40mg作為單劑量。如較早指出的，組氨酸突變的阿達木單抗形式顯示出比明顯更強的pH依賴性，因此可以以僅相當于的推薦劑量的10％-90％，具體為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的劑量施用，取決于所使用的組氨酸突變的阿達木單抗形式的各自K_dis值。

附圖簡述

圖1：a)常規(guī)和b)pH依賴性抗體對可溶性抗原結(jié)合之間的提議的差異(修改自：Igawa等人，2010)。

圖2：可變區(qū)的阿達木單抗氨基酸序列。互補決定區(qū)用紅色框突出顯示。a)重鏈的可變區(qū)(VH)。b)輕鏈的可變區(qū)(VL)。

圖3：七種獨特VH變體與親本VH的比對蛋白序列。在三輪篩選后，從重鏈文庫方法中分離出獨特的序列。親本VH序列顯示在頂部，并且對于每種變體突出顯示與親本VH不同的殘基。

圖4A：親本VL和在三輪篩選后從輕鏈文庫分離的38種獨特VL變體的蛋白序列比對(1-3個部分)的第一部分。親本VL序列顯示在頂部，并且對于每種變體突出顯示與親本VL不同的殘基。

圖4B：親本VL和在三輪篩選后從輕鏈文庫分離的38種獨特VL變體的蛋白序列比對(1-3個部分)的第二部分。親本VL序列顯示在頂部，并且對于每種變體突出顯示與親本VL不同的殘基。

圖4C：親本VL和在三輪篩選后從輕鏈文庫分離的38種獨特VL變體的蛋白序列比對(1-3個部分)的第三部分。親本VL序列顯示在頂部，并且對于每種變體突出顯示與親本VL不同的殘基。

圖5：阿達木單抗和具有pH依賴性結(jié)合rhTNFα的三種變體的Octet Red傳感圖。在pH 7.4下用范圍在0.26nM-2nM之間的rhTNFα濃度進行關(guān)聯(lián)，并在pH 7.4進行解離。使用Octet 8.0軟件通過全局擬合測定動力學(xué)結(jié)合常數(shù)。

圖6：阿達木單抗和具有pH依賴性結(jié)合的三種變體的Octet Red傳感圖。在pH 7.4下使用范圍在0.26nM-2nM之間的rhTNFα濃度進行關(guān)聯(lián)，并在pH 6下進行解離。通過使用Octet 8.0軟件進行局部部分擬合來測定PSV#1、PSV#2和PSV#3的解離速率。阿達木單抗的解離速率通過使用全局擬合產(chǎn)生。

圖7：阿達木單抗和具有pH依賴性結(jié)合的三種變體(PSV#1、PSV#2、PSV#3)的Octet Red傳感圖。阿達木單抗顯示rhTNFα的快速締合并且在pH6下的解離步驟期間保持緊密結(jié)合。相比之下，pH依賴性結(jié)合變體在pH6下的解離步驟過程中在rhTNFα快速釋放后在pH 7.4下顯示可逆的rhTNFα結(jié)合。測量與13nM的rhTNFα的締合200秒，和進行400秒解離。在兩個結(jié)合循環(huán)后，最后的解離步驟在pH 7.4下進行，顯示rhTNFα的緩慢釋放。

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實施例

實施例1：衍生自阿達木單抗的pH敏感抗TNFα抗體的選擇

通過酵母表面展示從組合組氨酸取代文庫中選擇抗TNFα抗體片段：基于阿達木單抗的重鏈和輕鏈，通過使用預(yù)先組裝的三核苷酸結(jié)構(gòu)單元由Geneart，Regensburg合成兩個抗體文庫。在合成期間，對親本或組氨酸殘基進行取樣，由此組氨酸的取樣受限于重鏈和輕鏈的互補決定區(qū)(CDR)。大多數(shù)阿達木單抗文庫成員攜帶分布在所有三個CDR上的三個組氨酸殘基(圖2)，但也合成攜帶更多或更少組氨酸取代(范圍在之間)的變體。理論多樣性：

通過EBY100酵母菌株中的間隙修復(fù)克隆將該兩個文庫分別亞克隆到質(zhì)粒載體中，所述EBY100酵母菌株允許抗體Fab片段的共價酵母表面展示(Boder和Wittrup，1997)。將相應(yīng)的親本鏈與重鏈或輕鏈文庫配對，和通過熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)分別篩選得到的兩個文庫。攜帶pH敏感阿達木單抗變體的細胞隨后通過應(yīng)用特異性染色和選擇策略(這里未解釋)在三輪篩選中富集。

一旦在pH6下在30分鐘內(nèi)釋放重組人TNFα(rhTNFα)之后，選擇在pH7.4下以可逆的高親和力(在亞納摩爾范圍內(nèi)的KD)與rhTNFα結(jié)合的Fab片段。在以pH依賴性方式結(jié)合rhTNFα的變體的三輪篩選后，分離的單個克隆的序列分析揭示了攜帶特異性組氨酸取代模式的變體(如圖3和4所示)。在重鏈序列數(shù)據(jù)集的CDR3區(qū)內(nèi)鑒定出一個突變熱點。在輕鏈序列數(shù)據(jù)集的CDR-L1和CDR-L3區(qū)內(nèi)鑒定出兩個突變熱點。僅選擇高豐度重鏈和輕鏈變體(在分析的序列組內(nèi)出現(xiàn)：N>1)用于進一步加工和表征，得到表1和表2中所示的8個輕鏈和3個重鏈候選物：

表1.在三輪篩選后的38個分離的單個克隆內(nèi)的三個高豐度(N>1)重鏈序列。

表2.在三輪篩選后的98個分離的單個克隆內(nèi)的八個高豐度(N>1)輕鏈序列。

將高豐度VH/VL變體以及親本阿達木單抗序列的可變區(qū)克隆到允許在哺乳動物細胞(HEK293和Expi293)中表達全長IgG1κ分子的載體中。重鏈和輕鏈變體的所有可能的組合在哺乳動物細胞中共表達。本文中表達24種重鏈和輕鏈變體組合以及11種衍生自重鏈或輕鏈變體與相應(yīng)親本鏈的組合的IgG種類。使用固定化抗體的初始Octet Red實驗評價在pH7.4下締合rhTNFα后，在pH6或pH7.4下的差異解離行為。根據(jù)它們在pH 7.4下的高親和力結(jié)合(pH 7.4下的締合/解離)和在pH 6下的抗原快速釋放(在pH 7.4下締合/在pH 6下解離)的結(jié)合特征選擇十個變體。為了進一步表征，通過蛋白A純化從粗制上清液中純化抗體，并且最后將緩沖液更換為PBS。進一步的Octet測定顯示在pH 7.4下的結(jié)合差異和在pH 6下的rhTNFα釋放差異。

隨后選擇三個變體(根據(jù)圖3-4的ID：VH#2+VL#9：PSV#1，VH#2+VL#16：PSV#2和VH#1+VL#14：PSV#3)用于Octet Red的最終表征。

在Octet Red實驗中分析幾種組氨酸突變的阿達木單抗變體的結(jié)合特征。在重鏈和輕鏈以及不同的重鏈和輕鏈變體組合中的不同組氨酸突變已經(jīng)顯示影響在pH 7.4下的結(jié)合親和力和在pH 6下的解離速率。

包括重鏈中的Leu98His和輕鏈中的Tyr32His、Leu33His的幾種突變的組合產(chǎn)生PSV#3。輕鏈突變Gln89His、Arg90His和Asn92His產(chǎn)生PSV#2的輕鏈。突變Arg90His、Asn92His和Thr97His產(chǎn)生PSV#1的輕鏈。對于PSV#1和PSV#2兩者，Ser100.bHis和Ser100.cHis的突變產(chǎn)生重鏈。

(根據(jù)kabat編號，將序列如圖3和4a-c所示編號。為此目的，通過使用Clustal W并且考慮到kabat編號規(guī)則應(yīng)用編號，將變體的序列與親本序列一起比對)。

Octet Red測量的代表性傳感圖示于圖5和6中，并且阿達木單抗、PSV#1、PSV#2和PSV#3的計算的動力學(xué)參數(shù)的相應(yīng)平均值(N＝3)顯示在表4中。

表3.阿達木單抗和pH依賴性結(jié)合變體在pH 7.4和pH 6下與rhTNFα的結(jié)合動力學(xué)。阿達木單抗、PSV#1、PSV#2和PSV#3在pH 7.4下的締合速率(kon)、解離速率(kdis)和結(jié)合親和力(KD)。也在pH6下測定解離速率。在25℃下進行實驗，并且對于每個實驗顯示三次重復(fù)測定的平均值(例外：以兩次重復(fù)測定在pH6下測量阿達木單抗)。對應(yīng)于數(shù)據(jù)的代表性傳感圖示于圖7和圖8中。

親本阿達木單抗在pH 7.4下以高親和力結(jié)合rhTNFα，這也在Kaymakcalan等人，2009中顯示。對于三種變體，增加的kdis值導(dǎo)致結(jié)合親和力降低(KD減少10-24倍)，然而，具有在三個數(shù)字范圍中的皮摩爾結(jié)合親和力的與TNFα的相互作用仍然表示非常緊密的結(jié)合(圖5和表3)。

還進行Octet Red測量以評估抗體的pH敏感性。在FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)的背景下改善的抗體功效需要在pH7.4下的循環(huán)中與TNFα緊密結(jié)合，和它在酸性內(nèi)體中的快速釋放。為了評價TNFα在酸性內(nèi)體中的釋放，在rhTNFα在pH 7.4下的締合后，在pH 6下測量解離(圖6和表3)。測定在pH6和pH7.4下的解離速率比，并且所有變體在pH6下顯示顯著增加的解離(在pH6下增加59-160倍的kdis，與kdis比(pH6/pH7.4)為6的阿達木單抗相比(表3)。

一個另外的實驗針對在pH6下解離后，PSV#1、PSV#2和PSV#3在pH 7.4下可逆地結(jié)合rhTNFα的能力。為了確保在pH 6的溫育不會不可逆地改變TNFα結(jié)合能力，進行結(jié)合(pH 7.4)和釋放(pH 6)兩個循環(huán)(圖7)。如圖8所示，在TNFα已在pH 6釋放后，PSV#1、PSV#2和PSV#3可以可逆地結(jié)合。與此相比，阿達木單抗在pH 6的溫育期間保持緊密結(jié)合。

實施例2：突變體的體內(nèi)表征

在雜合轉(zhuǎn)基因人FcRn小鼠(系176)以及純合系32小鼠中研究了親本IgG構(gòu)建體及其突變體對人TNFα的PK的影響。前一系更適合于研究施用的IgG構(gòu)建體之間的PK差異，而后一小鼠系提供更好的FcRn保護，導(dǎo)致更長的半衰期，更接近在人中所預(yù)期的結(jié)果。清除劑的這種更長的停留允許更好地評價抗體對TNFα清除的影響。

通過SC途徑以預(yù)定比施用人TNFα和清除劑。研究了總清除劑和總hTNFα的血漿濃度分布。預(yù)期pH依賴性hTNFα結(jié)合導(dǎo)致細胞因子的清除率增加和清除劑的清除率降低。

從小鼠收集所選擇的組織，以研究清除劑和靶細胞因子的分布。親本IgG用作本研究中的參考化合物。

體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)集用于建立下列之間的相關(guān)性：

物理化學(xué)性質(zhì)和體內(nèi)藥代動力學(xué)

FcRn親和力和體內(nèi)藥代動力學(xué)和組織分布

相關(guān)性用于構(gòu)建基于生理學(xué)的藥代動力學(xué)(PBPK)模型，其能夠表征和模擬血漿和組織藥代動力學(xué)。