背景技術(shù)：
：新生兒Fc-受體(FcRn)對于IgG類抗體在體內(nèi)的代謝命運(yùn)是重要的。FcRn起從溶酶體降解途徑中挽救IgG的作用，導(dǎo)致降低的清除率和延長的半衰期。它是由兩個多肽：50kDaI類主要組織相容性復(fù)合物樣蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)組成的異源二聚體蛋白。FcRn以高親和力結(jié)合IgG類抗體的Fc區(qū)的CH2-CH3部分。IgG類抗體和FcRn之間的相互作用是pH依賴性的并且以1:2化學(xué)計(jì)量發(fā)生，即一個IgG抗體分子可以通過其兩個重鏈Fc區(qū)多肽與兩個FcRn分子相互作用(參見，例如Huber,A.H.,等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。Houde,D等人報(bào)道了通過氫/氘交換質(zhì)譜法(Anal.Chem.81(2009)2644-2651)表征IgG1構(gòu)象和構(gòu)象動力學(xué)。Suzuki,T.等人報(bào)道了新生兒FcR在調(diào)節(jié)含有人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域的治療性蛋白的血清半衰期中的重要性：單克隆抗體和Fc融合蛋白對人新生兒FcR的親和力的比較研究(J.Immunol.184(2010)1968-1976)。Wang，W.等人報(bào)道了具有相同F(xiàn)c序列的單克隆抗體可以差異地以藥物動力學(xué)結(jié)果結(jié)合FcRn(DrugMetabol.Dispos.39(2011)1469-1477)。Schlothauer，T.等人報(bào)道了用于功能表征單克隆抗體的分析性FcRn親和色譜法(mAbs5(2013)576-586)。Houde，D.等人報(bào)道了翻譯后修飾差異地影響IgG1構(gòu)象和受體結(jié)合(Mol.CellProteom.9(2010)1716-1728)。在EP14165987.0中報(bào)道了體內(nèi)半衰期的體外預(yù)測。在EP2233500中報(bào)道了優(yōu)化的Fc變體。在US2012/028304中報(bào)道了具有修飾的等電點(diǎn)的抗體。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單克隆全長抗體的包含重鏈中殘基1-23、145-174、180-197的區(qū)域以及包含輕鏈中殘基55-83的區(qū)域(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU索引(恒定區(qū))編號))參與全長抗體與人新生兒Fc受體(FcRn)的相互作用。因此，本文報(bào)道的一個方面是用于選擇全長抗體的方法，其包括以下步驟：a)通過隨機(jī)化一個或多個氨基酸殘基從親本全長抗體產(chǎn)生多種全長抗體變體，所述一個或多個氨基酸殘基選自以下氨基酸殘基的組：重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的殘基(根據(jù)EU索引編號)，b)測定來自多種抗體的每種全長抗體對人新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合強(qiáng)度，以及c)從多種全長抗體變體中選擇與親本全長抗體具有不同的FcRn結(jié)合強(qiáng)度的全長抗體。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-73的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，氨基酸殘基選自包含重鏈中氨基酸殘基6、162、164、165、191、194、195和196，以及輕鏈中氨基酸殘基57和60(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU索引(恒定區(qū))編號)的氨基酸殘基的組。在一個實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置6的氨基酸殘基被隨機(jī)化為Q。在一個實(shí)施方案中，重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一處或多處的氨基酸殘基彼此獨(dú)立地被隨機(jī)化為酸性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置57和60中的一處或多處的氨基酸殘基彼此獨(dú)立地被隨機(jī)化為堿性氨基酸殘基。在如本文報(bào)道的所有方面的一個實(shí)施方案中，在不存在抗體的相應(yīng)抗原的情況下測定來自多種抗體的全長抗體的每種與人新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合強(qiáng)度。在如本文報(bào)道的所有方面的一個實(shí)施方案中，對游離的，即非抗原復(fù)合的抗體測定來自多種抗體的全長抗體的每種與人新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合強(qiáng)度。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG1抗體。全長抗體包含四條抗體鏈，兩條輕鏈(第一輕鏈和第二輕鏈)和兩條重鏈(第一重鏈和第二重鏈)。第一和第二重鏈以及其獨(dú)立地，第一和第二輕鏈在其氨基酸序列方面可以相同或不同。在一個實(shí)施方案中，抗體是單臂抗體。單臂抗體包含i)一條全長輕鏈，ii)與全長輕鏈配對的一條全長重鏈，和iii)一條縮短重鏈，其包含至少一部分鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，其與全長重鏈配對。在一個實(shí)施方案中，抗體是雙特異性抗體。在一個實(shí)施方案中，通過用中性氨基酸殘基取代帶電荷的氨基酸殘基或通過用帶電荷的氨基酸殘基取代中性氨基酸殘基，彼此獨(dú)立地改變一個或多個下列氨基酸位置(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)：重鏈位置6、16、19、57、66、83、162、164、165、191、194、195、196、輕鏈位置57、60。在一個實(shí)施方案中，通過用中性氨基酸殘基取代帶電荷的氨基酸殘基或通過用帶電荷的氨基酸殘基取代中性氨基酸殘基，彼此獨(dú)立地改變一個或多個下列氨基酸位置(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)：重鏈位置6、16、19、162、164、165、191、194、195、196、輕鏈位置57、60。在一個實(shí)施方案中，彼此獨(dú)立地引入一個或多個以下氨基酸突變(隨機(jī)化)(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)-重鏈E6Q，和/或-重鏈A162D，和/或-重鏈A162E，和/或-重鏈T164D，和/或-重鏈T164E，和/或-重鏈S165D，和/或-重鏈S165E，和/或-重鏈S191D，和/或-重鏈S191E，和/或-重鏈G194D，和/或-重鏈G194E，和/或-重鏈T195D，和/或-重鏈T195E，和/或-重鏈Q(jìng)196D，和/或-重鏈Q(jìng)196E，和/或-輕鏈G57K，和/或-輕鏈G57R，和/或-輕鏈S60K，和/或-輕鏈S60R。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈E6Q。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈T164E。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈A162D和S165D。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈G194E。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈S191D和Q196D。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)輕鏈G57R。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)輕鏈G57K和S60K。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈T164E，和ii)重鏈A162D和S165D，和iii)重鏈G194E，和iv)重鏈S191D和Q196D。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈E6Q，和ii)重鏈T164E，和iii)重鏈A162D和S165D，和iv)重鏈G194E，S191D和Q196D，和V)輕鏈G57K和S60K。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)重鏈E6Q，和/或ii)重鏈T164E，和/或iii)重鏈A162D和S165D，和/或iv)重鏈G194E，和/或v)重鏈T164E，A162D和S165D，和/或vi)重鏈G194E，S191D和Q196D，和/或vii)輕鏈G57R，和/或viii)輕鏈G57K和S60K。在一個實(shí)施方案中，引入以下氨基酸突變(分別根據(jù)Kabat可變結(jié)構(gòu)域編號和KabatEU索引編號方案編號)i)第一和/或第二重鏈中的E6Q，和/或ii)a)第一重鏈中的T164E，和b)第二重鏈中的A162D和S165D，和/或iii)a)第一重鏈中的G194E，和b)第二重鏈中的S191D和Q196D，和/或iv)a)第一重鏈中的T164E，A162D和S165D，和b)第二重鏈中的G194Q，S191D和Q196D，和/或v)a)第一和/或第二重鏈中的E6Q，b)第一重鏈中的T164E，A162D和S165D，c)第二重鏈中的G194E，S191D和Q196D，和d)第一和/或第二輕鏈中的G57K和S60K。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自相同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自不同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，將1至15個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至10個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至5個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有增加的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有降低的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是KD值。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是具有正線性pH梯度洗脫的FcRn親和色譜法柱上的保留時間。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是體內(nèi)半衰期。如本文報(bào)道的一個方面是通過隨機(jī)化一個或多個氨基酸殘基從單一親本全長抗體產(chǎn)生的多種全長抗體變體，所述一個或多個氨基酸殘基選自包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置1-23(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置55-83(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置145-174(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置180-197(根據(jù)EU索引編號)的氨基酸殘基的組。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-73的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，氨基酸殘基選自包含重鏈中的氨基酸殘基6、162、164、165、191、194、195和196，以及輕鏈中的氨基酸殘基57和60(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU索引(恒定區(qū))編號)的氨基酸殘基的組。在一個實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置6的氨基酸殘基被隨機(jī)化為Q。在一個實(shí)施方案中，重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一處或多處的氨基酸殘基被隨機(jī)化為酸性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置57和60中的一處或多處的氨基酸殘基被隨機(jī)化為堿性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，一個或多個以下氨基酸隨機(jī)化彼此獨(dú)立地被引入-重鏈E6Q，和/或-重鏈A162D，和/或-重鏈A162E，和/或-重鏈T164D，和/或-重鏈T164E，和/或-重鏈S165D，和/或-重鏈S165E，和/或-重鏈S191D，和/或-重鏈S191E，和/或-重鏈G194D，和/或-重鏈G194E，和/或-重鏈T195D，和/或-重鏈T195E，和/或-重鏈Q(jìng)196D，和/或-重鏈Q(jìng)196E，和/或-輕鏈G57K，和/或-輕鏈G57R，和/或-輕鏈S60K，和/或-輕鏈S60R。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG1抗體。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自相同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自不同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，將1至15個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至10個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至5個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有增加的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有降低的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是KD值。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是具有正線性pH梯度洗脫的FcRn親和色譜法柱上的保留時間。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是體內(nèi)半衰期。如本文報(bào)道的另一方面是選自下述位置的一個或多個氨基酸突變用于改變?nèi)L抗體的體內(nèi)半衰期的用途，所述位置包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置1-23(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域中的位置55-83(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置145-174(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置180-197(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-73的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，氨基酸殘基選自包含重鏈中的氨基酸殘基6、162、164、165、191、194、195和196，以及輕鏈中的氨基酸殘基57和60(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU索引(恒定區(qū))編號)的氨基酸殘基的組。在一個實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置6的氨基酸殘基被隨機(jī)化為Q。在一個實(shí)施方案中，重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一處或多處的氨基酸殘基被彼此獨(dú)立地突變?yōu)樗嵝园被釟埢Ｔ谝粋€實(shí)施方案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置57和60中的一處或多處的氨基酸殘基被彼此獨(dú)立地突變?yōu)閴A性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，一個或多個以下氨基酸突變彼此獨(dú)立地被引入-重鏈E6Q，和/或-重鏈A162D，和/或-重鏈A162E，和/或-重鏈T164D，和/或-重鏈T164E，和/或-重鏈S165D，和/或-重鏈S165E，和/或-重鏈S191D，和/或-重鏈S191E，和/或-重鏈G194D，和/或-重鏈G194E，和/或-重鏈T195D，和/或-重鏈T195E，和/或-重鏈Q(jìng)196D，和/或-重鏈Q(jìng)196E，和/或-輕鏈G57K，和/或-輕鏈G57R，和/或-輕鏈S60K，和/或-輕鏈S60R。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG1抗體。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自相同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自不同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，將1至15個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至10個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至5個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有增加的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有降低的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是KD值。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是具有正線性pH梯度洗脫的FcRn親和色譜法柱上的保留時間。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是體內(nèi)半衰期。如本文報(bào)道的另一方面是包含兩條輕鏈多肽和兩條重鏈多肽的全長抗體變體，其中變體抗體通過在一個或多個選自以下的位置引入氨基酸突變而衍生自親本全長抗體：所述位置包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置1-23(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域中的位置55-83(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置145-174(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置180-197(根據(jù)EU索引編號)，并且其中變體抗體對于人新生兒Fc受體具有與親本全長抗體不同的親和力。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-73的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)。在一個實(shí)施方案中，氨基酸殘基選自包含重鏈中的氨基酸殘基6、162、164、165、191、194、195和196，以及輕鏈中的氨基酸殘基57和60(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU索引(恒定區(qū))編號)的氨基酸殘基的組。在一個實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置6的氨基酸殘基被突變?yōu)镼。在一個實(shí)施方案中，重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一處或多處的氨基酸殘基被彼此獨(dú)立地突變?yōu)樗嵝园被釟埢?。在一個實(shí)施方案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置57和60中的一處或多處的氨基酸殘基被彼此獨(dú)立地突變?yōu)閴A性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，一個或多個以下氨基酸突變彼此獨(dú)立地被引入-重鏈E6Q，和/或-重鏈A162D，和/或-重鏈A162E，和/或-重鏈T164D，和/或-重鏈T164E，和/或-重鏈S165D，和/或-重鏈S165E，和/或-重鏈S191D，和/或-重鏈S191E，和/或-重鏈G194D，和/或-重鏈G194E，和/或-重鏈T195D，和/或-重鏈T195E，和/或-重鏈Q(jìng)196D，和/或-重鏈Q(jìng)196E，和/或-輕鏈G57K，和/或-輕鏈G57R，和/或-輕鏈S60K，和/或-輕鏈S60R。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG1抗體。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自相同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，隨機(jī)化是通過將氨基酸殘基突變成來自不同氨基酸殘基組的不同氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，將1至15個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至10個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，將1至5個氨基酸殘基隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有增加的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，全長抗體選自與FcRn具有降低的結(jié)合強(qiáng)度的多種全長抗體。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是KD值。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是具有正線性pH梯度洗脫的FcRn親和色譜法柱上的保留時間。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合強(qiáng)度是體內(nèi)半衰期。如本文報(bào)道的一個方面是相對于其親本抗體在一個或多個以下氨基酸殘基處具有突變的變體抗體：-重鏈中的殘基6、162、164、165、191、194、195和196，-輕鏈中的殘基57和60，(分別根據(jù)Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU指數(shù)(恒定區(qū))編號)。在一個實(shí)施方案中，變體抗體相對于其親本抗體在一個或多個以下氨基酸殘基處具有突變-重鏈中的殘基162、164、165、191、194、195和196，-輕鏈中的殘基57和60，(分別根據(jù)Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU指數(shù)(恒定區(qū))編號)。在一個實(shí)施方案中，變體抗體相對于其親本抗體在一個或多個以下氨基酸殘基處具有突變-重鏈中的殘基162、164、165、191、194、195和196，(分別根據(jù)Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU指數(shù)(恒定區(qū))編號)。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG1抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是雙特異性抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中具有氨基酸突變E6Q。在一個實(shí)施方案中，抗體在重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一處或多處具有酸性氨基酸。在一個實(shí)施方案中，酸性氨基酸是D或E。在一個實(shí)施方案中，抗體在重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的兩處或更多處具有酸性氨基酸殘基，其中酸性氨基酸殘基彼此獨(dú)立地選擇。在一個實(shí)施方案中，抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置57和60中的一處或兩處具有堿性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基是K或R。在一個實(shí)施方案中，抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置57和60兩處都具有堿性氨基酸殘基，其中堿性氨基酸殘基彼此獨(dú)立地選擇。在一個實(shí)施方案中，所述抗體具有彼此獨(dú)立的一個或多個以下氨基酸突變-重鏈E6Q，和/或-重鏈A162D，和/或-重鏈A162E，和/或-重鏈T164D，和/或-重鏈T164E，和/或-重鏈S165D，和/或-重鏈S165E，和/或-重鏈S191D，和/或-重鏈S191E，和/或-重鏈G194D，和/或-重鏈G194E，和/或-重鏈T195D，和/或-重鏈T195E，和/或-重鏈Q(jìng)196D，和/或-重鏈Q(jìng)196E，和/或-輕鏈G57K，和/或-輕鏈G57R，和/或-輕鏈S60K，和/或-輕鏈S60R。發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于如下發(fā)現(xiàn)：單克隆抗體在Fc區(qū)和Fab片段中的幾個區(qū)域在結(jié)合FcRn時顯示氘?dāng)z取的減少(參見圖1和圖2)。這些區(qū)域包括重鏈中的殘基1-23、145-174(氨基酸序列GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL，SEQIDNO：11)、180-197(氨基酸序列YSLSSVVTVPSSSLGTQT，SEQIDNO：13)以及輕鏈中的殘基55-83(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU指數(shù)(恒定區(qū))編號)。I.定義如本文所用，重鏈和輕鏈的所有恒定區(qū)和結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置根據(jù)Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat編號系統(tǒng)編號，在本文中稱為“根據(jù)Kabat編號”。具體地，Kabat等人的SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat編號系統(tǒng)(參見第647-660頁)用于κ和λ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域CL，KabatEU指數(shù)編號系統(tǒng)(參見第661-723頁)用于恒定重鏈結(jié)構(gòu)域(CH1，鉸鏈，CH2和CH3)。術(shù)語“約”表示其后數(shù)值的+/-20％的范圍。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“約”表示其后數(shù)值的+/-10％的范圍。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“約”表示其后數(shù)值的+/-5％的范圍。用于本文目的的“受體人框架”是包含來源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下文所定義。來源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的改變。在一些實(shí)施方案中，氨基酸改變的數(shù)目為10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些實(shí)施方案中，VL受體人框架在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同?！坝H和力成熟的”抗體是指與不具有這種改變的親本抗體相比，在一個或多個高變區(qū)(HVR)中具有一個或多個改變的抗體，這種改變導(dǎo)致抗體對抗原親和力的改善。術(shù)語“改變”表示親本抗體或融合多肽(例如，至少包含F(xiàn)c區(qū)的FcRn結(jié)合部分的融合多肽)中一個或多個氨基酸殘基的突變(取代)、插入(添加)或缺失，以獲得修飾的抗體或融合多肽。術(shù)語“突變”表示指定的氨基酸殘基取代為不同的氨基酸殘基。例如，突變L234A表示抗體Fc區(qū)(多肽)中位置234處的氨基酸殘基賴氨酸被氨基酸殘基丙氨酸取代(用丙氨酸取代賴氨酸)(根據(jù)KabatEU索引編號系統(tǒng)編號)?！疤烊淮嬖诘陌被釟埢北硎緛碜员彼?三字母代碼：Ala，單字母代碼：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、賴氨酸(Lys，K)、蛋氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、脯氨酸(Pro，P)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr，Y)和纈氨酸(Val，V)。術(shù)語“氨基酸突變”表示至少一個存在的氨基酸殘基被另一不同的氨基酸殘基(＝取代氨基酸殘基)取代。取代氨基酸殘基可以是“天然存在的氨基酸殘基”，并且選自丙氨酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(glu，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys,K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F(xiàn))、脯氨酸(pro，P)、絲氨酸(ser，S)、蘇氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。取代氨基酸殘基可以是“非天然存在的氨基酸殘基”。參見例如US6,586,207,WO98/48032,WO03/073238,US2004/0214988,WO2005/35727,WO2005/74524,Chin,J.W.,等人,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.andSchultz,P.G.,ChemBioChem11(2002)1135-1137；Chin,J.W.,等人,PICASUnitedStatesofAmerica99(2002)11020-11024；and,Wang,L.andSchultz,P.G.,Chem.(2002)1-10(全部通過引用全部并入本文)。術(shù)語“氨基酸插入”表示在氨基酸序列中的預(yù)定位置(添加)摻入至少一個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，插入將是插入一個或兩個氨基酸殘基。插入的氨基酸殘基可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基。術(shù)語“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中的預(yù)定位置去除至少一個氨基酸殘基。本文中的術(shù)語“抗體”以最廣泛的含義使用，并且包括各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體，三特異性抗體)和抗體片段，只要它們展示所需的抗原和/或蛋白A和/或FcRn結(jié)合活性。術(shù)語“異源二聚體Fc區(qū)”表示由兩條在相應(yīng)位置具有不同氨基酸殘基的多肽鏈組成的Fc區(qū)，其中根據(jù)KabatEU指數(shù)編號系統(tǒng)確定位置，其中不同的位置影響異源二聚體的形成。這樣的差異的實(shí)例是所謂的“杵臼(knobsintoholes)”取代(參見例如US7,695,936和US2003/0078385)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在亞型IgG1的IgG抗體Fc區(qū)的單個多肽鏈中的以下杵和臼取代增加異源二聚體形成：1)一條鏈中的Y407T和另一條鏈中的T366Y；2)一條鏈中的Y407A和另一條鏈中的T366W；3)一條鏈中的F405A和另一條鏈中的T394W；4)一條鏈中的F405W和另一條鏈中的T394S；5)一條鏈中的Y407T和另一條鏈中的T366Y；6)一條鏈中的T366Y和F405A，另一條鏈中的T394W和Y407T；7)一條鏈中的T366W和F405W，另一條鏈中的T394S和Y407A；8)一條鏈中的F405W和Y407A，另一條鏈中的T366W和T394S；和9)一條鏈中的T366W和另一條鏈中的T366S、L368A和Y407V，其中最后列出的特別適合。此外，在兩個Fc區(qū)多肽鏈之間產(chǎn)生新的二硫橋的改變促進(jìn)異源二聚體形成(參見例如US2003/0078385)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以下取代導(dǎo)致用于形成IgG1亞型的IgG抗體Fc區(qū)的各個多肽鏈中新的鏈內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基適當(dāng)間隔開，增加異源二聚體形成：一條鏈中的Y349C和另一條鏈中的S354C；一條鏈中的Y349C和另一條鏈中的E356C；一條鏈中的Y349C和另一條鏈中的E357C；一條鏈中的L351C和另一條鏈中的S354C；一條鏈中的T394C和另一條鏈中的E397C；或一條鏈中的D399C和另一條鏈中的K392C。異源二聚化促進(jìn)的氨基酸改變的其它實(shí)例是所謂的“電荷對取代(chargepairsubstitutions)”(參見例如WO2009/089004)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IgG1亞型的IgG抗體Fc區(qū)的單個多肽鏈中的以下電荷對取代增加異源二聚體形成：1)一條鏈中的K409D或K409E，和另一條鏈中的D399K或D399R；2)一條鏈中的K392D或K392E，和另一條鏈中的D399K或D399R；3)一條鏈中的K439D或K439E，和另一條鏈中的E356K或E356R；4)一條鏈中的K370D或K370E，和另一條鏈中的E357K或E357R；5)一條鏈中的K409D和K360D，和另一條鏈中的D399K和E356K；6)一條鏈中的K409D和K370D，和另一條鏈中的D399K和E357K；7)一條鏈中的K409D和K392D，和另一條鏈中的D399K、E356K和E357K；8)一條鏈中的K409D和K392D，和另一條鏈中的D399K；9)一條鏈中的K409D和K392D，和另一條鏈中的D399K和E356K；10)一條鏈中的K409D和K392D，和另一條鏈中的D399K和D357K；11)一條鏈中的K409D和K370D，和另一條鏈中的D399K和D357K；12)一條鏈中的D399K和另一條鏈中的K409D和K360D；和13)一條鏈中的K409D和K439D，和另一條鏈中的D399K和E356K。術(shù)語“嵌合”抗體指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分來源于特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分來源于不同的來源或物種?？贵w的“類型”是指其重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。有五種主要類型的抗體：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且這些中的幾種可以進(jìn)一步分為亞型(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。對應(yīng)于免疫球蛋白的不同類型的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。術(shù)語“可比較的長度”表示兩個多肽包含相同數(shù)目的氨基酸殘基或可以在長度上相差一個或多個且至多10個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，(Fc區(qū))多肽包含相同數(shù)目的氨基酸殘基或相差1至10個氨基酸殘基的數(shù)目。在一個實(shí)施方案中，(Fc區(qū))多肽包含相同數(shù)目的氨基酸殘基或相差1至5個氨基酸殘基的數(shù)目。在一個實(shí)施方案中，(Fc區(qū))多肽包含相同數(shù)目的氨基酸殘基或相差1至3個氨基酸殘基的數(shù)目?！靶?yīng)子功能”是指歸因于抗體Fc區(qū)的那些生物活性，其隨抗體類型而變化?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括：C1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)；和B細(xì)胞活化。試劑(例如藥物制劑)的“有效量”是指在必需的時間段內(nèi)在劑量上有效實(shí)現(xiàn)所需治療或預(yù)防結(jié)果的量。術(shù)語“人源Fc區(qū)”表示含有鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分的人源免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)。在一個實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)具有SEQIDNO：02的氨基酸序列。然而，F(xiàn)c區(qū)的C末端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。術(shù)語“FcRn”表示人新生兒Fc-受體。FcRn發(fā)揮從溶酶體降解途徑中挽救IgG的作用，導(dǎo)致清除率降低和半衰期延長。FcRn是由兩個多肽：50kDaI類主要組織相容性復(fù)合物樣蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)組成的異源二聚體蛋白。FcRn以高親和力結(jié)合IgGFc區(qū)的CH2-CH3部分。IgG和FcRn之間的相互作用是嚴(yán)格的pH依賴性的，并且以1:2的化學(xué)計(jì)量發(fā)生，其中一個IgG通過其兩條重鏈與兩個FcRn分子結(jié)合(Huber，AH，等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn結(jié)合發(fā)生在酸性pH(pH<6.5)下的胞內(nèi)體中，并且IgG在中性細(xì)胞表面(pH約7.4)釋放。相互作用的pH敏感的性質(zhì)促進(jìn)FcRn介導(dǎo)，通過在核內(nèi)體的酸性環(huán)境中結(jié)合受體，保護(hù)吞飲入細(xì)胞的IgG免受細(xì)胞內(nèi)降解。然后FcRn促進(jìn)IgG向細(xì)胞表面的再循環(huán)并且隨后在FcRn-IgG復(fù)合物暴露于細(xì)胞外的中性pH環(huán)境時釋放到血流中。術(shù)語“Fc區(qū)的FcRn結(jié)合部分”表示抗體重鏈多肽的部分，其大致從EU位置243延伸至EU位置261，和大致從EU位置275延伸至EU位置293，和大致從EU位置302延伸至EU位置319，和大致從EU位置336延伸至EU位置348，和大致從EU位置367延伸至EU位置393和EU位置408，和大致從EU位置424延伸至EU位置440。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)KabatEU編號的一個或多個以下氨基酸殘基被改變：F243，P244，P245P,K246,P247,K248,D249,T250,L251,M252,I253,S254,R255,T256,P257,E258,V259,T260,C261,F275,N276，W277,Y278,V279,D280,V282，E283,V284，H285，N286，A287，K288，T289,K290,P291，R292，E293，V302，V303，S304，V305,L306，T307，V308,L309,H310，Q311，D312，W313，L314，N315，G316，K317,E318,Y319,I336，S337,K338,A339,K340,G341，Q342,P343,R344，E345，P346，Q347,V348,C367,V369，F(xiàn)372,Y373,P374,S375，D376,I377,A378，V379，E380，W381，E382，S383，N384，G385，Q386,P387,E388,N389,Y391，T393，S408，S424，C425，S426，V427，M428，H429，E430，A431，L432，H433，N434，H435，Y436，T437，Q438，K439,和S440(EU編號)。“框架”或“FR”是指除高變區(qū)(HVR)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。可變結(jié)構(gòu)域的FR通常由四個FR結(jié)構(gòu)域組成：FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以如下序列出現(xiàn)在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。術(shù)語“全長抗體”表示具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本上相似的結(jié)構(gòu)的抗體，所述天然抗體結(jié)構(gòu)包含四個多肽或具有含有本文定義的Fc區(qū)的重鏈。全長抗體可以包含另外的結(jié)構(gòu)域，如與全長抗體的一條或多條鏈綴合的scFv或scFab。這些綴合物也包括在術(shù)語全長抗體中。術(shù)語“二聚多肽”表示包含至少兩個共價結(jié)合的多肽的復(fù)合物。復(fù)合物可以包含也與其它多肽共價或非共價結(jié)合的其它多肽。在一個實(shí)施方案中，二聚多肽包含兩個或四個多肽。術(shù)語“異源二聚體”或“異源二聚體的”表示包含兩個多肽(例如具有可比較的長度)的分子，其中兩個多肽具有在相應(yīng)位置上具有至少一個不同氨基酸殘基的氨基酸序列，其中相應(yīng)位置根據(jù)KabatEU索引編號系統(tǒng)確定。術(shù)語“同源二聚體”和“同源二聚體的”表示包含兩個可比較長度的多肽的分子，其中兩個多肽具有在相應(yīng)位置上相同的氨基酸序列，其中相應(yīng)位置根據(jù)KabatEU索引編號系統(tǒng)確定。術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且是指已經(jīng)引入外源核酸的細(xì)胞，包括這些細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”，其包括原代轉(zhuǎn)化細(xì)胞和由其衍生的后代，而不考慮傳代次數(shù)。后代在核酸含量上可能不與親本細(xì)胞完全相同，但可能含有突變。在本文中包括具有與針對原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞所篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變后代?！叭丝贵w”是具有氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體、或衍生自利用人抗體組成成分(repertoire)或其它人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的這種定義特異性排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇中最常見的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變結(jié)構(gòu)域序列的亞組。通常，序列亞組是如Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,BethesdaMD(1991),NIHPublication91-3242,Vols.1-3中的亞組。在一個實(shí)施方案中，對于VL，亞組是Kabat等人，同上中的亞組κI。在一個實(shí)施方案中，對于VH，亞組是Kabat等人，同上中的亞組III。術(shù)語“衍生自”表示通過在至少一個位置引入改變而使氨基酸序列衍生自親本氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列在至少一個相應(yīng)位置(根據(jù)針對抗體Fc區(qū)的KabatEU索引編號)不同于相應(yīng)的親本氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，衍生自親本氨基酸序列的氨基酸序列在相應(yīng)位置上有1-15個氨基酸殘基的不同。在一個實(shí)施方案中，衍生自親本氨基酸序列的氨基酸序列在相應(yīng)位置上有1-10個氨基酸殘基的不同。在一個實(shí)施方案中，衍生自親本氨基酸序列的氨基酸序列在相應(yīng)位置上有1-6個氨基酸殘基的不同。同樣，衍生的氨基酸序列與其親本氨基酸序列具有高的氨基酸序列同一性。在一個實(shí)施方案中，衍生自親本氨基酸序列的氨基酸序列具有80％或更高的氨基酸序列同一性。在一個實(shí)施方案中，衍生自親本氨基酸序列的氨基酸序列具有90％或更高的氨基酸序列同一性。在一個實(shí)施方案中，衍生自親本氨基酸序列的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性。術(shù)語“人Fc區(qū)多肽”表示與“天然”或“野生型”人Fc區(qū)多肽相同的氨基酸序列。術(shù)語“變體(人)Fc區(qū)多肽”表示由于至少一個“氨基酸改變”衍生自“天然”或“野生型”人Fc區(qū)多肽的氨基酸序列?！叭薋c區(qū)”由兩個人Fc區(qū)多肽組成?！白凅w(人)Fc區(qū)”由兩個Fc區(qū)多肽組成，其中兩者可以都是變體(人)Fc區(qū)多肽，或一個是人Fc區(qū)多肽，另一個是變體(人)Fc區(qū)域多肽。“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)對應(yīng)于非人抗體的那些，并且全部或基本上全部的FR對應(yīng)于人抗體的那些。人源化抗體任選地可以包含衍生自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？贵w(例如非人抗體)的“人源化形式”是指經(jīng)過人源化的抗體。如本文所用的術(shù)語“高變區(qū)”或“HVR”是指序列是高度可變的抗體可變結(jié)構(gòu)域的每個區(qū)域(“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”)，其形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)(“高變環(huán)”)，和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸”)。通常，抗體包含6個HVR；三個在VH(H1，H2，H3)，三個在VL(L1，L2，L3)。本文所指的HVR包括(a)存在于氨基酸殘基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)的高變環(huán)(Chothia,C.andLesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)存在于氨基酸殘基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242)。(c)存在于氨基酸殘基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接觸(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)，(b)和/或(c)的組合，包括HVR氨基酸殘基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3)和94-102(H3)。除非另有說明，本文根據(jù)KabatEU索引編號系統(tǒng)(Kabat等人，同上)對HVR殘基和可變結(jié)構(gòu)域中的其它殘基(例如FR殘基)進(jìn)行編號。“分離的”抗體是已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中分離的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體純化至大于95％或99％的純度，如通過例如電泳(例如SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細(xì)管電泳)或色譜法(例如尺寸排阻色譜法，離子交換或反相HPLC)測定的。關(guān)于評價抗體純度的方法的綜述，參見例如Flatman,S.等人,J.Chrom.B848(2007)79-87。“分離的”核酸是指已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中分離的核酸分子。分離的核酸包括包含在通常含有核酸分子的細(xì)胞中的核酸分子，但是該核酸分子存在于染色體外或存在于與其天然染色體位置不同的染色體位置。如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即群包含的各單個抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了可能的變體抗體，例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制劑的生產(chǎn)期間產(chǎn)生的，這樣的變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。因此，修飾語“單克隆”表示從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過多種技術(shù)制備，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，這樣的方法和用于制備單克隆抗體的其它示例性方法在本文描述。“天然抗體”是指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，其由二硫鍵結(jié)合的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。從N至C末端，每條重鏈具有可變區(qū)(VH)，也稱為可變重鏈結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其后是三個恒定結(jié)構(gòu)域(CH1，CH2和CH3)。類似地，從N至C末端，每條輕鏈具有可變區(qū)(VL)，也稱為可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其后是恒定輕鏈(CL)結(jié)構(gòu)域。基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，抗體的輕鏈可以歸類于兩種類型之一，稱為kappa(κ)和lambda(λ)。相對于參考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為在比對序列以及如果需要，引入間隙以獲得最大百分比序列同一性之后，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分。用于測定百分比氨基酸序列同一性的比對可以以本領(lǐng)域中的各種方式實(shí)現(xiàn)，例如使用可公開獲得的計(jì)算機(jī)軟件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對序列的適當(dāng)參數(shù)，包括在比較序列的全長上實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任何算法。然而，為了本文的目的，使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech，Inc.撰寫，并且源代碼已經(jīng)與用戶文檔在美國版權(quán)局，WashingtonD.C.，20559提交，其中它在美國版權(quán)注冊號TXU510087下注冊。ALIGN-2程序可從Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公開獲得，或者可從源代碼編譯。ALIGN-2程序應(yīng)該編譯在UNIX操作系統(tǒng)上使用，包括數(shù)字UNIXV4.0D。全部序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)置并且不變。在ALIGN-2用于氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列A對、與或針對給定氨基酸序列B(其可以替代地表示為給定氨基酸序列A具有或包含對、與或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)的％氨基酸序列同一性計(jì)算如下：100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是通過序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B的比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，和其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時，A對B的％氨基酸序列同一性將不等于B對A的％氨基酸序列同一性。除非另有說明，否則本文使用的全部％氨基酸序列同一性值是使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序如在前面的段落中所描述的獲得的。本文所用的術(shù)語“重組抗體”表示通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的全部抗體(嵌合的、人源化的和人)。這包括從宿主細(xì)胞例如NS0或CHO細(xì)胞分離的抗體，或來自人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)，或使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。這樣的重組抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。可以對重組抗體進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞超突變(somatichypermutation)。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列：雖然衍生自人種系VH和VL序列并與之相關(guān)，但可能并不是天然存在于體內(nèi)的人抗體種系組成成分。本申請中使用的術(shù)語“價”表示在(抗體)分子中存在特定數(shù)量的結(jié)合位點(diǎn)。因此，術(shù)語“二價”、“四價”和“六價”分別表示在(抗體)分子中存在兩個結(jié)合位點(diǎn)、四個結(jié)合位點(diǎn)和六個結(jié)合位點(diǎn)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文報(bào)道的雙特異性抗體是“二價的”。術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指參與抗體與其抗原結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別為VH和VL)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)域包含四個框架區(qū)(FR)和三個高變區(qū)(HVR)(參見例如Kindt,T.J.等人KubyImmunology,第六版,W.H.FreemanandCo.,N.Y.(2007),，第91頁)。單個VH或VL結(jié)構(gòu)域可足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以使用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域分離結(jié)合特定抗原的抗體，以分別篩選互補(bǔ)VL或VH結(jié)構(gòu)域的文庫(參見例如Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628)。如本文所使用的術(shù)語“載體”是指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)的載體以及整合入其已被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)其有效連接的核酸的表達(dá)。這樣的載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。II.本發(fā)明新生兒Fc-受體(FcRn)對于IgG類抗體在體內(nèi)的代謝命運(yùn)是重要的。FcRn發(fā)揮從溶酶體降解途徑拯救野生型IgG的作用，導(dǎo)致清除率降低和半衰期延長。它是由兩個多肽：50kDaI類主要組織相容性復(fù)合物樣蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)組成的異源二聚體蛋白。FcRn以高親和力結(jié)合IgG類抗體Fc區(qū)的CH2-CH3部分。IgG類抗體和FcRn之間的相互作用是pH依賴性的，并且以1∶2的化學(xué)計(jì)量發(fā)生，即一個IgG抗體分子可以通過其兩個重鏈Fc區(qū)多肽與兩個FcRn分子相互作用(參見例如Huber，A.H.,等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。因此，IgG體外FcRn結(jié)合性質(zhì)/特征是其在血液循環(huán)中的體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì)的指征。重鏈CH2-和CH3-結(jié)構(gòu)域的不同氨基酸殘基參與FcRn和IgG類抗體的Fc區(qū)之間的相互作用。與FcRn相互作用的氨基酸殘基大致位于EU位置243和EU位置261之間，大致位于EU位置275和EU位置293之間，大致位于EU位置302和EU位置319之間，大致位于EU位置336和EU位置348之間，大致位于EU位置367和EU位置393之間，位于EU位置408，和大致位于EU位置424和EU位置440之間。更具體地，根據(jù)KabatEU編號的以下氨基酸殘基參與Fc區(qū)和FcRn的相互作用：F243，P244，P245P，K246，P247，K248，D249，T250，L251，M252，I253，S254，R255，T256，P257，E258，V259，T260，C261,F275,N276,W277,Y278,V279,D280,V282,E283,V284，H285,N286，A287，K288,T289,K290,P291，R292,E293,V302，V303，S304，V305,L306,T307,V308,L309,H310,Q311，D312，W313，L314，N315,G316，K317，E318，Y319，I336，S337，K338，A339，K340，G341，Q342，P343，R344，E345，P346，Q347,V348，C367，V369,F372，Y373，P374，S375，D376，I377，A378，V379，E380,W381，E382，S383，N384，G385，Q386，P387，E388，N389，Y391，T393，S408,S424，C425，S426，V427，M428，H429，E430，A431，L432，H433，N434，H435，Y436，T437，Q438，K439，和S440。定點(diǎn)誘變研究已經(jīng)證明IgG的Fc區(qū)中針對FcRn的重要結(jié)合位點(diǎn)是組氨酸310、組氨酸435和異亮氨酸253，以及在較小程度上是組氨酸433和酪氨酸436(參見例如Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825；Raghavan，M.，等人，Biochem.34(1995)14649-14657；Medesan，C.，等人，JImmunol.158(1997)2211-2217)。通過在多種氨基酸殘基處突變IgG來進(jìn)行增加IgG與FcRn的結(jié)合的方法：蘇氨酸250、蛋氨酸252、絲氨酸254、蘇氨酸256、蘇氨酸307、谷氨酸380、蛋氨酸428、組氨酸433和天冬酰胺434(參見Kuo，T.T.,等人,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。在一些情況下，期望在血液循環(huán)中具有降低的半衰期的抗體。例如，用于玻璃體內(nèi)應(yīng)用的藥物應(yīng)當(dāng)在眼睛中具有長的半衰期，而在患者的血液循環(huán)中具有短的半衰期。這樣的抗體還具有增加暴露于疾病部位的優(yōu)點(diǎn)，例如在眼睛。影響FcRn結(jié)合以及由此影響血液循環(huán)中半衰期的不同突變是已知的。已經(jīng)通過定點(diǎn)誘變鑒定了對小鼠Fc區(qū)-小鼠FcRn相互作用是關(guān)鍵的Fc區(qū)殘基(參見例如Dall’Acqua,W.F.,等人J.Immunol169(2002)5171-5180)。殘基I253，H310，H433，N434和H435(根據(jù)Kabat的EU編號)參與相互作用(Medesan,C.,等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan，M.，等人，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.24(1994)542-548)。發(fā)現(xiàn)殘基I253，H310和H435對于人Fc與鼠FcRn的相互作用是至關(guān)重要的(Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2855)。Dall′Acqua等人通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究描述了殘基M252Y、S254T、T256E改善FcRn結(jié)合(Dall'Acqua,W.F.,等人J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc-人FcRn復(fù)合物的研究已經(jīng)顯示殘基I253、S254、H435和Y436對于相互作用是至關(guān)重要的(Firan,M.,等人,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields,R.L.,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.,等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已報(bào)道和檢測了殘基248至259和301至317和376至382和424至437的各種突變體。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體在Fab片段中的幾個區(qū)域顯示在結(jié)合FcRn時氘?dāng)z取的減少(參見圖1和圖2)。這些區(qū)域包括重鏈中的殘基1-23、145-174、180-197以及輕鏈中的殘基55-83(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域和EU索引(恒定區(qū))編號))。因此，不僅Fc區(qū)氨基酸殘基、而且位于CH1結(jié)構(gòu)域和VH/VL結(jié)構(gòu)域中的殘基也有助于抗體-FcRn相互作用的強(qiáng)度和與此的緊密性。基于這一發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在可以提供新的氨基酸突變和氨基酸突變的組合來定制抗體的體內(nèi)半衰期。HDX-MS用于繪制參與結(jié)合人FcRn的全長IgG1抗體的位點(diǎn)。FcRn與抗洋地黃毒苷抗體的HDX-MS的有效序列覆蓋率對于HC和LC都為82％，并報(bào)道了89種肽的氘?dāng)z取(參見圖1)?？贵w在Fc和Fab結(jié)構(gòu)域中的幾個區(qū)域顯示在結(jié)合FcRn時氘?dāng)z取減少(參見圖1和2)。這些區(qū)域包括重鏈中的殘基1-23、145-174、180-197以及輕鏈中的殘基55-83(分別為Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU索引(恒定區(qū))編號)。在區(qū)域1-23中，5-18、5-22和5-23的重疊肽中的HDX分析顯示對于延伸肽的C-末端沒有觀察到額外的保護(hù)(19-23)。沒有進(jìn)行肽1-18與其它肽(4-18，5-18)的比較，因?yàn)橥耆瘶悠返幕厮萁粨Q(back-exchange)的差異大于15％。因此，考慮到在HDX-MS實(shí)驗(yàn)中，在肽的前兩個N-末端殘基上的氘在MS檢測前丟失，通過FcRn結(jié)合而降低的氘?dāng)z取可以定位于殘基3-18。抗體CH1結(jié)構(gòu)域的區(qū)域145-174中重疊肽(145-174、146-174、156-174、159-174)中的HDX比較、以及考慮到在HDX-MS實(shí)驗(yàn)中在肽的前兩個N-末端殘基上的氘在MS檢測前丟失，表明通過FcRn結(jié)合的HDX保護(hù)可定位于殘基161-174。對于區(qū)域180-197，當(dāng)FcRn結(jié)合時重疊肽186-197顯示僅約肽180-197的一半的氘?dāng)z取減少。因此，考慮到在HDX-MS實(shí)驗(yàn)中在肽的前兩個N-末端殘基上的氘在MS檢測前丟失，通過FcRn的HDX保護(hù)可定位于殘基182-197。在LC中，框架區(qū)3中的區(qū)域55-83中的幾種肽顯示在FcRn結(jié)合時氘?dāng)z取降低。通過重疊肽(55-71、55-73、55-83、71-82、71-83)分析，以及考慮到在HDX-MS實(shí)驗(yàn)中在肽的前兩個N-末端殘基上的氘在MS檢測前丟失，結(jié)合相互作用主要定位于殘基57-71。在FcRn結(jié)合時遠(yuǎn)離Fc區(qū)的這些區(qū)域的降低的HD交換表明這些區(qū)域包含參與抗體-FcRn相互作用的氨基酸殘基。本文報(bào)道的一個方面是用于選擇全長抗體的方法，其包括以下步驟：a)通過隨機(jī)化一個或多個氨基酸殘基，從親本全長抗體產(chǎn)生多種全長抗體，所述一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)，b)測定來自多種抗體的每種全長抗體與人新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合強(qiáng)度，以及c)從多種全長抗體中選擇與親本全長抗體具有不同的FcRn結(jié)合強(qiáng)度的全長抗體。不受該理論的束縛，設(shè)想在抗體的Fc區(qū)和FcRn之間的第一相互作用已經(jīng)建立之后，抗體的Fab部分和FcRn之間形成第二相互作用。該第二相互作用改變第一相互作用的強(qiáng)度，如本文提供的數(shù)據(jù)所示。在本文提供的HD交換數(shù)據(jù)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在基于可變結(jié)構(gòu)域中相對低量的正電荷的Fab與FcRn的直接相互作用。此外，如本文中報(bào)道的，額外的正電荷已經(jīng)在Fab區(qū)的某些區(qū)域中應(yīng)用于烏司奴單抗(Ustekinumab)，導(dǎo)致顯著改善的FcRn相互作用強(qiáng)度。已發(fā)現(xiàn)由于在FcRn親和柱的pH梯度中較晚的洗脫，這種相互作用的增加不遵循pH依賴性結(jié)合行為。在許多FcRn柱保留時間分析中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)全部IgG顯示獨(dú)自的保留時間曲線，取決于其Fab序列和由此其獨(dú)自的Fab電荷模式?？梢酝ㄟ^向運(yùn)行緩沖液施加高鹽含量分解額外的電荷依賴性相互作用，來改變該觀察。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過靶向相應(yīng)抗體的預(yù)孵育來屏蔽Fab的影響。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并且在本文中提出，每個抗體在Fab區(qū)中具有可以影響該抗體與FcRn結(jié)合的獨(dú)自的電荷模式。如果抗體已經(jīng)對FcRn具有非常強(qiáng)的或甚至太強(qiáng)的結(jié)合(示例為，例如，F(xiàn)cRn親和柱上的洗脫pH值接近或甚至高于pH7.4，或盡管有強(qiáng)的FcRn結(jié)合但有意想不到的縮短的體內(nèi)半衰期)，可以通過減少抗體Fab區(qū)中的電荷數(shù)來修飾抗體-FcRn相互作用。例如，在本專利申請的實(shí)施例中報(bào)道的FcRn親和色譜法中，具有7.4或更高的洗脫pH的抗體是具有太強(qiáng)的FcRn相互作用的抗體。通過減少Fab區(qū)中的電荷數(shù)(如果Fab區(qū)工程化不足，最終與Fc區(qū)工程化一起)，也可以降低保留時間，實(shí)現(xiàn)小于pH7.4的洗脫pH。這樣的抗體通過增加體內(nèi)保留時間而受益于FcRn相互作用。如果抗體對FcRn具有弱的結(jié)合(示例為，例如FcRn親和柱上的洗脫pH值遠(yuǎn)低于pH7.4)，可以通過增加抗體Fab區(qū)中的電荷數(shù)來修飾抗體-FcRn相互作用。例如，在本專利申請的實(shí)施例中報(bào)道的FcRn親和色譜法中，具有6.5的洗脫pH的抗體是具有弱FcRn相互作用的抗體。通過增加Fab區(qū)中的電荷數(shù)(如果Fab區(qū)工程化不足，最終與Fc區(qū)工程化一起)，也可以增加保留時間，實(shí)現(xiàn)接近pH7.4的洗脫pH。這樣的抗體通過增加體內(nèi)保留時間而受益于FcRn相互作用。通常，F(xiàn)ab區(qū)中改變的電荷影響整個正電荷，即，正電荷的數(shù)量減少或增加，或者負(fù)電荷的數(shù)量增加或減少。由于不是Fab區(qū)的全部區(qū)域都能與結(jié)合到相應(yīng)抗體Fc區(qū)的FcRn相互作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過修飾本文概述的區(qū)域中的殘基，可以修飾抗體-FcRn相互作用，所述殘基即跨越重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23區(qū)域中的殘基(根據(jù)Kabat編號)，跨越輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83區(qū)域中的位置(根據(jù)Kabat編號)，跨越第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174區(qū)域中的位置(根據(jù)EU索引編號)，和跨越第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197區(qū)域中的位置(根據(jù)EU索引編號)。此外，在雙特異性抗體的情況下，每個Fab區(qū)可以被單獨(dú)地工程化，因?yàn)橐粋€抗體Fc區(qū)可以與兩個FcRn分子相互作用，產(chǎn)生更多的潛在相互作用和修飾位點(diǎn)。因此，在本文報(bào)道的方法中，在本文定義的區(qū)域中引入的突變引入、去除或修飾正電荷片(patch)。這樣的突變是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如(以一個字母的氨基酸代碼)例如，E至Q(引入正電荷)、T至E(還原正電荷)、A至D(還原正電荷)、S至D(還原正電荷)、G至E(還原正電荷)、G至R(導(dǎo)入正電荷)或S至K(導(dǎo)入正電荷)。在生理pH值下，氨基酸殘基精氨酸(R)、賴氨酸(K)和組氨酸(H)主要被質(zhì)子化并因此帶正電荷，而氨基酸殘基天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)主要被去質(zhì)子化(即帶負(fù)電)。本發(fā)明在下文中用抗洋地黃毒苷抗體舉例說明。以下突變已經(jīng)被引入抗洋地黃毒苷抗體：-HC-E6Q(變體1)，-HC-T164E(變體2)，-HC-A162D和HC-S165D(變體3)，-HC-G194E(變體4)，-HC-S191D和HC-Q196D(變體5)，-LC-G57R(變體6)，-LC-G57R和LC-S60K(變體7)，-HC164E，HC-A162D，HC-S165D，HC-G194E，HC-S191D和HC-Q196D(變體8)，-HC-E6Q，HC-A162D，HC-T164E，HC-S165D，HC-S191D，HC-G194E，HC-Q196D，LC-G57K和LC-S60K(變體9)。這些突變體在FcRn親和柱和基于SPR的結(jié)合測定法中的性質(zhì)顯示在下表中(對抗體-FcRn相互作用的影響)：樣本相對FcRn保留時間相對SPR結(jié)合參照抗洋地黃毒苷抗體100％(40分鐘)100％變體1增加107％變體2減少94％變體3增加178％變體4減少96％變體5增加167％變體6增加126％變體7增加161％變體8減少69％變體9增加120％因此，從上面給出的數(shù)據(jù)可以看出，通過改變可變結(jié)構(gòu)域和/或第一恒定結(jié)構(gòu)域(VH1和CL)中的電荷模式，可以實(shí)現(xiàn)FcRn結(jié)合的改變。如本文報(bào)道的一個方面是通過隨機(jī)化選自以下氨基酸殘基的一個或多個氨基酸殘基從單一親本全長抗體產(chǎn)生多種全長抗體變體：重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置1-23的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置55-83的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置145-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置180-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。如本文報(bào)道的另一方面是在選自下組位置上的一個或多個氨基酸突變用于改變?nèi)L抗體體內(nèi)半衰期的用途，所述位置包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置1-23(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置55-83(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置145-174(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置180-197(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。本文報(bào)道的另一方面是包含兩條輕鏈多肽和兩條重鏈多肽的全長抗體變體，其中變體抗體通過在選自下組位置的一個或多個位置引入氨基酸突變而衍生自親本全長抗體：所述位置包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置1-23(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置55-83(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置145-174(根據(jù)Kabat編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的位置180-197(根據(jù)EU索引編號)，其中變體抗體具有與親本全長抗體不同的人新生兒Fc受體親和力。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置3-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-71的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置161-174的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置182-197的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。在一個實(shí)施方案中，一個或多個氨基酸殘基選自重鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置5-18的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中位置57-70的氨基酸殘基(根據(jù)Kabat編號)和第一重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中位置181-196的氨基酸殘基(根據(jù)EU索引編號)。本文報(bào)道的一個方面是在以下氨基酸殘基中的一處或多處具有突變的抗體：-重鏈中的殘基6、162、164、165、191、194、195和196，-輕鏈中的殘基57和60。(分別根據(jù)Kabat(可變結(jié)構(gòu)域)和EU指數(shù)(恒定區(qū))編號)。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是全長IgG1抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是雙特異性抗體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以修飾包含氨基酸殘基3至18的重鏈肽段以擴(kuò)大可與FcRn上的其負(fù)對應(yīng)物相互作用的現(xiàn)有表面正電荷片。只有E6Q突變應(yīng)該被積極的耐受。在一個實(shí)施方案中，抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中具有氨基酸突變E6Q。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含氨基酸殘基159至174的重鏈肽段打破與CH2結(jié)構(gòu)域上的正片相對的兩個相鄰的負(fù)電荷片。因此，增加的CH1-CH2相互作用可使Fab更接近FcRn，這繼而可能有利于FcRn結(jié)合。該片最好與包含氨基酸殘基182-197的重鏈肽段一起修飾，因?yàn)閮烧叨荚谙嗤珻H2結(jié)構(gòu)域片的附近。因此，位置162和/或164和/或165和/或191和/或194和/或195和/或196的一個或多個氨基酸殘基應(yīng)被修飾為酸性殘基，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾為D或E，以加強(qiáng)抗體-FcRn結(jié)合/相互作用。在一個實(shí)施方案中，抗體在重鏈第一恒定域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一處或多處具有酸性氨基酸。在一個實(shí)施方案中，酸性氨基酸是D或E。在一個實(shí)施方案中，抗體在重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196的兩處或更多處具有酸性氨基酸殘基，其中酸性氨基酸殘基彼此獨(dú)立地選擇。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基57至71的肽段形成與FcRn上的負(fù)片相對的弱陽性片。將該段中的正殘基突變?yōu)樨?fù)殘基，即堿性殘基，可以加強(qiáng)抗體-FcRn相互作用。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置57和/或60的氨基酸殘基彼此獨(dú)立地是堿性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基選自K和R。在一個實(shí)施方案中，抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置57和60的一處或兩處具有堿性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，堿性氨基酸殘基是K或R。在一個實(shí)施方案中，抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置57和60都具有堿性氨基酸殘基，其中堿性氨基酸殘基彼此獨(dú)立地選擇。在一個實(shí)施方案中，抗體具有一個或多個以下氨基酸突變-重鏈E6Q，和/或-重鏈A162D，和/或-重鏈A162E，和/或-重鏈T164D，和/或-重鏈T164E，和/或-重鏈S165D，和/或-重鏈S165E和/或-重鏈S191D，和/或-重鏈S191E，和/或-重鏈G194D，和/或-重鏈G194E，和/或-重鏈T195D，和/或-重鏈T195E，和/或-重鏈Q(jìng)196D和/或-重鏈Q(jìng)196E，和/或-輕鏈G57K，和/或-輕鏈G57R，和/或-輕鏈S60K，和/或-輕鏈S60R。在本文報(bào)道的一個方面，可以通過篩選隨機(jī)文庫中具有所需抗體-FcRn相互作用的抗體來選擇抗體。例如，本領(lǐng)域已知多種方法用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫以及篩選這樣的文庫中具有所需結(jié)合特性的抗體。這樣的方法綜述在，例如，Hoogenboom,H.R.等人,MethodsinMolecularBiology178(2001)1-37，以及還描述在，例如McCafferty,J.等人,Nature348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,MethodsinMolecularBiology248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods284(2004)119-132。在某些噬菌體展示方法中，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別克隆VH和VL基因的組成成分，并隨機(jī)重組在噬菌體文庫中，然后可以如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455所述篩選抗原結(jié)合噬菌體。噬菌體通常展示抗體片段，或作為單鏈Fv(scFv)片段或作為Fab片段。描述人抗體噬菌體文庫的專利出版物包括，例如：US5,750,373和US2005/0079574,US2005/0119455,US2005/0266000,US2007/0117126,US2007/0160598,US2007/0237764,US2007/0292936和US2009/0002360。從人抗體文庫分離的抗體或抗體片段被認(rèn)為是本文的人抗體或人抗體片段。在US2002/0123057中報(bào)道了基于哺乳動物細(xì)胞中牛痘病毒介導(dǎo)的完整抗體表達(dá)的篩選系統(tǒng)。另一種篩選系統(tǒng)基于哺乳動物細(xì)胞中抗體的細(xì)胞表面表達(dá)(Ho,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)9637-9642)。細(xì)胞展示描述于Higuchi等人，在COS細(xì)胞中(J.Immunol.Meth.202(1997)193-204)。Beerli等人報(bào)道了從BHK細(xì)胞中的抗原特異性B細(xì)胞產(chǎn)生的基于辛德畢斯(Sindbis)病毒的scFv細(xì)胞表面展示文庫(Proc.Natl.Acad.Sci.USA105(2008)14336–14341)。Ho和Pastan報(bào)道了使用HEK293細(xì)胞(scFv)的方法(MethodsMol.Biol.562(2009)99-113)。Alonso-Camino等人(PLoSOne.4(2009)e7174)報(bào)道了淋巴細(xì)胞展示。Zhou等人報(bào)道了使用HEK293細(xì)胞的方法(ActaBiochim.Biophys.Sin.42(2010)575–584)。Zhou等人報(bào)道了Flp-In系統(tǒng)(Mabs.2(2010)508-518)。Taube,R.等人報(bào)道了(PLOSOne3(2008)e3181)在人細(xì)胞表面和慢病毒顆粒上穩(wěn)定表達(dá)人抗體。在WO2007/047578中報(bào)道了抗體文庫的細(xì)胞展示。真核細(xì)胞上抗體的展示和/或分泌是分離抗體的另一種方法。這些抗體通過將抗體編碼核酸克隆到慢病毒載體中產(chǎn)生，所述載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以使得能夠在這些細(xì)胞的表面上表達(dá)抗體。所使用的載體攜帶抗體輕鏈、抗體重鏈、可選擇地剪接的膜錨或標(biāo)簽或熒光標(biāo)記蛋白。Sasaki-Haraguchi,N.等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.423(2012)289-294)報(bào)道了關(guān)于人超短內(nèi)含子的人前mRNA剪接的機(jī)理性見解：潛在的不尋常機(jī)制鑒定富含G的內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中，如WO2013/092720中報(bào)道的使用慢病毒表達(dá)文庫與慢病毒表達(dá)載體組合的方法/展示系統(tǒng)用于本文報(bào)道的方法中，所述慢病毒表達(dá)載體包含EV71-IRES連接的雙順反子表達(dá)盒，用于以可溶性以及膜結(jié)合形式表達(dá)全長抗體輕鏈和全長抗體重鏈。使用的慢病毒載體包括病毒長的末端重復(fù)序列3’LTR和5’LTR、抗體輕鏈、EV71IRES、抗體重鏈。在一個實(shí)施方案中，使用如在EP13178581.8中報(bào)道的方法/展示系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點(diǎn)/抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于，具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(dá)(參見Milstein,C和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540,WO93/08829,和Traunecker,A.等人,EMBOJ.10(1991)3655-3659)和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(參見例如US5,731,168)。多特異性抗體也可以通過用于制備抗體Fc-異源二聚體分子的工程化靜電轉(zhuǎn)向效應(yīng)來制備(WO2009/089004)；交聯(lián)兩個或更多個抗體或片段(參見例如US4,676,980和Brennan,M.等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體(參見例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用用于制備雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(shù)(參見例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；和使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和如，例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述制備三特異性抗體。本文還包括具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化抗體，包括“章魚抗體”(參見，例如US2006/0025576)。本文的抗體還包括“雙重作用Fab”或“DAF”(例如，參見US2008/0069820)。本文的抗體還包括在WO2009/080251,WO2009/080252,WO2009/080253,WO2009/080254,WO2010/112193,WO2010/115589,WO2010/136172,WO2010/145792和WO2010/145793中描述的多特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了具有一個或多個氨基酸突變的抗體變體/突變體。保守突變顯示在下表中“優(yōu)選突變”的標(biāo)題下。在下表中“示例性突變”的標(biāo)題下提供了更多的實(shí)質(zhì)性改變，如下文關(guān)于氨基酸側(cè)鏈類別的進(jìn)一步描述?？蓪被嵬蛔円敫信d趣抗體中，并篩選所需FcRn結(jié)合的產(chǎn)物。表氨基酸可以根據(jù)常見的側(cè)鏈特性分組：(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性親水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；(3)酸性：Asp，Glu；(4)堿性：His，Lys，Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly，Pro；(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。非保守突變需要將這些類別之一的成員交換為另一類別。一種類型的突變變體包括突變親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步研究的所得變體將相對于親本抗體具有FcRn結(jié)合特性的修飾(例如，改善)，并將基本上保留親本抗體的其它生物學(xué)特性。在一些實(shí)施方案中，通過多種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中的任意將突變引入編碼核酸。然后創(chuàng)建一個文庫。然后篩選文庫以鑒定具有所需FcRn親和力的任何抗體變體。引入多樣性的另一種方法包括位置定向方法，其中幾個氨基酸殘基(例如，每次4-6個殘基)被隨機(jī)化。在一個實(shí)施方案中，突變導(dǎo)致突變的氨基酸殘基變?yōu)橥唤M的不同殘基。在一個實(shí)施方案中，突變導(dǎo)致突變的氨基酸殘基變?yōu)椴煌M的不同殘基。在某些實(shí)施方案中，可以將一個或多個氨基酸修飾引入本文提供的抗體的Fc區(qū)，從而產(chǎn)生Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包含在一個或多個氨基酸位置上包含氨基酸修飾(例如取代)的人Fc區(qū)序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋具有一些但不是全部效應(yīng)子功能的抗體變體，這使其成為抗體體內(nèi)半衰期是重要的、但是某些效應(yīng)子功能(例如補(bǔ)體和ADCC)是不必要的或有害的應(yīng)用中令人滿意的候選?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定法以證實(shí)CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測定法以確保抗體缺少FcγR結(jié)合(因此可能缺乏ADCC活性)、但保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細(xì)胞上FcR表達(dá)總結(jié)在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492中第464頁的表3中。評估感興趣分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性實(shí)例描述于US5,500,362(參見，例如Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)1499-1502)；US5,821,337(參見Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)?？蛇x擇地，可以使用非放射性測定方法(參見，例如，用于流式細(xì)胞儀的ACTITM非放射性細(xì)胞毒性測定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性細(xì)胞毒性測定法(Promega，MadisonWI)。用于這種測定法的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。可選擇地，或另外，可以在體內(nèi)評估感興趣分子的ADCC活性，例如，在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656公開的動物模型中。也可以進(jìn)行C1q結(jié)合測定法以證實(shí)抗體不能結(jié)合C1q，因此缺乏CDC活性。參見，例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c結(jié)合ELISA。為了評估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測定法(參見，例如Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood101(2003)1045-1052；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103(2004)2738-2743)。FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定也可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行(參見例如Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769))。具有降低的效應(yīng)子功能的抗體包括具有Fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個取代的那些(US6,737,056)。這樣的Fc突變體包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的兩處或更多處具有取代的Fc突變體，包括具有殘基265和297被丙氨酸取代的所謂的“DANA”Fc突變體(US7,332,581)。描述了具有改善或減弱的FcR結(jié)合的某些抗體變體(參見，例如US6,737,056；WO2004/056312,和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在某些實(shí)施方案中，抗體變體包含具有一個或多個氨基酸取代的Fc區(qū)，所述一個或多個氨基酸取代改善ADCC，例如Fc區(qū)的位置298、333和/或334(殘基的EU編號)的取代。在一些實(shí)施方案中，在Fc區(qū)中進(jìn)行改變，其導(dǎo)致改變的(即，改善或降低的)C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，例如，如US6,194,551，WO99/51642和E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184所述。具有增加的半衰期和改善的與新生兒Fc受體(FcRn)結(jié)合的抗體描述于US2005/0014934中，所述新生兒Fc受體負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593,和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗體包含其中具有一個或多個取代的Fc區(qū)，所述一個或多個取代改善Fc區(qū)與FcRn的結(jié)合。這樣的Fc變體包括在Fc區(qū)殘基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一處或多處具有取代的那些，例如Fc區(qū)殘基434的取代(US7,371,826)。關(guān)于Fc區(qū)變體的其它實(shí)例，還參見Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821和WO94/29351。本發(fā)明的教導(dǎo)本文中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗體VL/CH1結(jié)構(gòu)域內(nèi)某些殘基的修飾可以用于影響抗體-FcRn相互作用。重組方法可以使用例如，如US4,816,567中所述的重組方法和組合物產(chǎn)生抗體。在一個實(shí)施方案中，提供了編碼如本文所述的抗體的分離核酸。這樣的核酸可以編碼包含抗體VL的氨基酸序列和/或包含抗體VH的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個實(shí)施方案中，提供了包含這樣的核酸的一個或多個載體(例如，表達(dá)載體)。在另一個實(shí)施方案中，提供了包含這樣的核酸的宿主細(xì)胞。在一個這樣的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含(例如，已經(jīng)轉(zhuǎn)化有)：(1)包含核酸的載體，所述核酸編碼包含抗體VL的氨基酸序列和包含抗體VH的氨基酸序列，或(2)包含編碼包含抗體VL的氨基酸序列的核酸的第一載體，和包含編碼包含抗體VH的氨基酸序列的核酸的第二載體。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核的，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如，Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個實(shí)施方案中，提供了生產(chǎn)如本文報(bào)道的抗體的方法，其中所述方法包括在適于表達(dá)所述抗體的條件下培養(yǎng)包含如上所提供的編碼抗體的核酸的宿主細(xì)胞，并任選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收抗體。對于重組生產(chǎn)抗體，分離例如如上所述的編碼抗體的核酸，并插入一個或多個載體中用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)?？梢允褂贸Ｒ?guī)程序(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離和測序此類核酸。用于克隆或表達(dá)抗體編碼載體的合適宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌中產(chǎn)生抗體，特別是當(dāng)不需要糖基化和Fc效應(yīng)子功能時。對于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見例如US5,648,237,US5,789,199和US5,840,523。(還參見Charlton,K.A.,In:MethodsinMolecularBiology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254,描述了在大腸桿菌中表達(dá)抗體片段)。表達(dá)后，可以從細(xì)菌細(xì)胞糊中以可溶性級分分離抗體，并可以進(jìn)一步純化。除了原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母對于抗體編碼載體是合適的克隆或表達(dá)宿主，包括其糖基化途徑已被“人源化”的真菌和酵母菌株，導(dǎo)致生成具有部分或全部人糖基化模式的抗體。參見Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。用于表達(dá)糖基化抗體的合適的宿主細(xì)胞也衍生自多細(xì)胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多可以與昆蟲細(xì)胞一起使用的桿狀病毒毒株，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞。植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。參見例如US5,959,177，US6,040,498，US6,420,548，US7,125,978和US6,417,429(描述了用于在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)抗體的PLANTIBODIESTM技術(shù))。脊椎動物細(xì)胞也可以用作宿主。例如，適于在懸浮液中生長的哺乳動物細(xì)胞系可能是有用的。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的其它實(shí)例是由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7)；人胚腎細(xì)胞系(例如，如Graham,F.L.等人,J.GenVirol.36(1977)59-74中所述的293或293細(xì)胞)；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)；小鼠支持細(xì)胞(TM4細(xì)胞，如，例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞(MDCK；布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(HepG2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT060562)；TRI細(xì)胞，如，例如Mather,J.P.等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的；MRC5細(xì)胞；和FS4細(xì)胞。其它有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR-CHO細(xì)胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤細(xì)胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。對于適合于抗體生產(chǎn)的某些哺乳動物宿主細(xì)胞系的綜述，參見例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,MethodsinMolecularBiology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。附圖說明圖1，抗洋地黃毒苷抗體的HDX-MS肽圖。對于HC(A)和LC(B)可以獲得HDX數(shù)據(jù)的胃酶解肽(pepticpeptide)顯示為白色條。開放大框表示當(dāng)FcRn結(jié)合時具有降低的氘含量的肽。實(shí)心框表示當(dāng)FcRn與各個位點(diǎn)結(jié)合時的靶向區(qū)域，其中氘化的胃酶解肽的ETD用于解析差異氘標(biāo)記。用星號表示與大鼠Fc-FcRn和人FcRn-Fc-YTE的晶體結(jié)構(gòu)中的FcRn結(jié)合有關(guān)的抗體殘基(參見Martin,W.L.,等人,Mol.Cell.7(2001)867-877,Oganesyan,V.,等人,J.Biol.Chem.289(2014)7812-7824)。圖2，在存在和不存在人FcRn的情況下抗洋地黃毒苷抗體區(qū)域的HDX圖譜。顯示了輕鏈肽55-71和重鏈肽1-18、57-79、159-174和180-197的HDX圖。上曲線顯示抗體單獨(dú)的HDX，下曲線分別顯示在FcRn存在時HC和LC肽的HDX。對于FcRn和HC57-79，顯示為虛線黑色曲線。在1分鐘、1小時、2.5小時和5小時，一式三份監(jiān)測氘摻入。在對照實(shí)驗(yàn)(90％D2O)中在5小時的時間點(diǎn)上測量的完全氘水平以黑色顯示。圖3，抗洋地黃毒苷抗體、布雷奴單抗(Briakinumab)和烏司奴單抗的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比對。對于全部三種抗體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的防止HDX的氨基酸殘基段在框內(nèi)。圖4，抗洋地黃毒苷抗體、布雷奴單抗和烏司奴單抗的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比對。對于全部三種抗體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的防止HDX的氨基酸殘基段在框內(nèi)。提供以下實(shí)施例、序列和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求中闡述。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以在所闡述的步驟中進(jìn)行修飾。實(shí)施例材料和方法重組DNA技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA，如Sambrook,J.等人,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中所述。根據(jù)制造商的說明使用分子生物學(xué)試劑?；蚝凸押塑账岷铣赏ㄟ^在GeneartGmbH(Regensburg，Germany)的化學(xué)合成制備所需的基因區(qū)段。將合成的基因片段克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中用于繁殖/擴(kuò)增。通過DNA測序驗(yàn)證亞克隆的基因片段的DNA序列?；蛘?，通過退火化學(xué)合成的寡核苷酸或通過PCR組裝短的合成DNA片段。各寡核苷酸由metabionGmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制備。試劑如果沒有另外說明，根據(jù)制造商提供的方案使用全部商業(yè)化學(xué)品、抗體和試劑盒。實(shí)施例1抗洋地黃毒苷抗體的重組表達(dá)載體的生成用于表達(dá)抗洋地黃毒苷抗體重鏈的載體的生成通過融合編碼各抗洋地黃毒苷抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域的DNA片段與編碼人IgG1恒定區(qū)的序列元件，組裝包含人IgG1恒定區(qū)(CH1，鉸鏈，CH2，CH3)和抗洋地黃毒苷抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域的重鏈編碼融合基因?？寡蟮攸S毒苷抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO:01)。人IgG1恒定區(qū)具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO:02)。表達(dá)載體還包含來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，以及包含β-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。抗體重鏈的轉(zhuǎn)錄單位在5'至3'方向包含以下功能元件：-來自包括內(nèi)含子A的人巨細(xì)胞病毒(P-CMV)的立即早期增強(qiáng)子和啟動子，-人重鏈免疫球蛋白5'-非翻譯區(qū)(5'UTR)，-鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，-重鏈可變(VH)結(jié)構(gòu)域編碼核酸，-人IgG1恒定區(qū)編碼核酸，和-牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGHpA)。用于表達(dá)抗洋地黃毒苷抗體輕鏈的載體的生成通過融合編碼各抗洋地黃毒苷抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的DNA片段與編碼人Ig-κ恒定區(qū)的序列元件，組裝包含人Ig-κ恒定區(qū)(CL-κ)和κ同種型的抗洋地黃毒苷抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的κ輕鏈編碼融合基因?？寡蟮攸S毒苷抗體輕鏈可變域具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO：03)。人Ig-κ恒定區(qū)具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO：04)。表達(dá)載體還包含來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和包含β-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性?？贵wκ輕鏈的轉(zhuǎn)錄單元在5'至3'方向包含以下功能元件：-來自包括內(nèi)含子A的人巨細(xì)胞病毒(P-CMV)的立即早期增強(qiáng)子和啟動子，-人重鏈免疫球蛋白5'-非翻譯區(qū)(5'UTR)，-鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，-輕鏈可變(VL)結(jié)構(gòu)域編碼核酸，-人Ig-κ恒定區(qū)編碼核酸，和-牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGHpA)。實(shí)施例2抗洋地黃毒苷抗體的重組生成抗體在F17培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)中培養(yǎng)的瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞(衍生自人胚腎細(xì)胞系293)中產(chǎn)生。對于如實(shí)施例1中所述的各個載體的轉(zhuǎn)染，使用“293-Free”轉(zhuǎn)染試劑(Novagen)。從各個表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)抗體。如制造商的說明所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染3至7天后收獲含有重組抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將上清液在降低的溫度(例如-80℃)下儲存直至純化。關(guān)于人免疫球蛋白在，例如HEK293細(xì)胞中重組表達(dá)的一般信息在Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中給出。實(shí)施例3重組抗洋地黃毒苷抗體的純化過濾含抗體的培養(yǎng)上清液，并通過兩個色譜法步驟純化。使用PBS(1mMKH2PO4，10mMNa2HPO4，137mMNaCl，2.7mMKCl)，pH7.4平衡的HiTrapMabSelectSuRe(GEHealthcare)、通過親和色譜法捕獲抗體。通過用平衡緩沖液洗滌除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，并用25mM檸檬酸鹽緩沖液，pH3.1回收抗體，洗脫后用1MTris-堿，pH9.0將其立即調(diào)節(jié)至pH6.0。Superdex200TM(GEHealthcare)上的尺寸排阻色譜法用作第二純化步驟。尺寸排阻色譜在20mM組氨酸緩沖液、0.14MNaCl，pH6.0中進(jìn)行。將含有抗體的溶液用配備有Biomax-SK膜的Ultrafree-CL離心過濾器單元(Millipore，Billerica，MA，USA)濃縮并儲存在-80℃。實(shí)施例4用于烏司奴單抗和布雷奴單抗的重組表達(dá)載體的生成烏司奴單抗：CNTO1275，StelaraTM，CAS登記號815610-63-0布雷奴單抗：ABT874，J695，OzespaTM，SEQIDNO：36，WO2001/014162為了表達(dá)上述抗體，使用基于具有或不具有CMV-內(nèi)含子A啟動子的cDNA結(jié)構(gòu)或基于具有CMV啟動子的基因組結(jié)構(gòu)的瞬時表達(dá)(例如在HEK293-F中)的表達(dá)質(zhì)粒。除了抗體表達(dá)盒之外，質(zhì)粒包含：-允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，-在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因，和-來自小鼠的二氫葉酸還原酶基因，作為真核細(xì)胞中的選擇性標(biāo)記物?？贵w基因的轉(zhuǎn)錄單元由以下元件組成：-在5'端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)-來自人巨細(xì)胞病毒的立即早期增強(qiáng)子和啟動子，-在cDNA結(jié)構(gòu)的情況下隨后是內(nèi)含子A序列，-人抗體基因的5'-非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白重鏈信號序列，-作為cDNA或基因組結(jié)構(gòu)的人抗體鏈，具有免疫球蛋白外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)-具有聚腺苷酸化信號序列的3'非翻譯區(qū)，和-在3'末端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。通過PCR和/或基因合成、并通過已知的重組方法和技術(shù)通過連接相應(yīng)的核酸區(qū)段組裝(例如使用各質(zhì)粒中獨(dú)特的限制性位點(diǎn))，產(chǎn)生包含抗體鏈的融合基因。通過DNA測序驗(yàn)證亞克隆的核酸序列。對于瞬時轉(zhuǎn)染，通過從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物制備質(zhì)粒來制備更大量的質(zhì)粒(NucleobondAX，Macherey-Nagel)。實(shí)施例5烏司奴單抗和布雷奴單抗的重組生產(chǎn)如CurrentProtocolsinCellBiology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.andYamada,K.M.(eds.),JohnWiley&Sons,Inc中所述使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。通過使用HEK293-F系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明用各質(zhì)粒(例如編碼重鏈，以及相應(yīng)的輕鏈)瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抗體。簡言之，在搖瓶中或在攪拌發(fā)酵罐中、在無血清FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中懸浮生長的HEK293-F細(xì)胞(Invitrogen)用各表達(dá)質(zhì)粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物轉(zhuǎn)染。對于2L搖瓶(Corning)，將HEK293-F細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/mL的密度接種在600mL中，并在120rpm，8％CO2孵育。第二天細(xì)胞以ca.1.5×106個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染ca.42mL的A)20mLOpti-MEM(Invitrogen)，含有600μg編碼各重鏈和等摩爾比的相應(yīng)輕鏈的總質(zhì)粒DNA(1μg/mL)和B)20mlOpti-MEM+1.2mL293fectin或fectin(2μL/mL)的混合物。根據(jù)葡萄糖消耗，在發(fā)酵過程中加入葡萄糖溶液。5-10天后收獲含有分泌的抗體的上清液，從上清液中直接純化抗體或冷凍并保存上清液。實(shí)施例6重組烏司奴單抗和布雷奴單抗的純化通過使用MabSelectSure-SepharoseTM(GEHealthcare，Sweden)的親和色譜法、使用butyl-Sepharose(GEHealthcare,Sweden)的疏水相互作用色譜法和Superdex200尺寸排阻(GEHealthcare，Sweden)色譜法，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化抗體。簡言之，在用PBS緩沖液(10mMNa2HPO4，1mMKH2PO4，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4)平衡的MabSelectSuRe樹脂上捕獲無菌過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用平衡緩沖液洗滌，用25mM檸檬酸鈉pH3.0洗脫。合并洗脫的抗體級分，并用2MTris(pH9.0)中和。通過添加1.6M硫酸銨溶液至0.8M硫酸銨的終濃度、并使用乙酸將pH調(diào)節(jié)至pH5.0來制備用于疏水相互作用色譜法的抗體池。用35mM乙酸鈉、0.8M硫酸銨，pH5.0平衡butyl-Sepharose樹脂后，將抗體加到樹脂上，用平衡緩沖液洗滌，用線性梯度洗脫至35mM乙酸鈉pH5.0。合并含有抗體的級分，并通過使用20mM組氨酸、140mMNaCl，pH6.0平衡的Superdex20026/60GL(GEHealthcare，Sweden)柱的尺寸排阻色譜法進(jìn)一步純化。合并含有抗體的級分，使用Vivaspin超濾裝置(SartoriusStedimBiotechS.A.，F(xiàn)rance)濃縮至所需濃度并儲存于-80℃。表：抗體的產(chǎn)率在每個純化步驟后，使用微流體Labchip技術(shù)(CaliperLifeScience，USA)通過CE-SDS分析純度和抗體完整性。使用HTProteinExpressReagent試劑盒根據(jù)制造商的說明制備5μl蛋白質(zhì)溶液用于CE-SDS分析，并使用HTProteinExpressChip在LabChipGXII系統(tǒng)上分析。使用LabChipGX軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例7FcRn在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)通過用包含F(xiàn)cRn的編碼序列(SEQIDNO：09)和β-2-微球蛋白的編碼序列(SEQIDNO：10)的兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，瞬時表達(dá)FcRn。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在搖瓶中在36.5℃、120rpm(振蕩器振幅5cm)、80％濕度和7％CO2下培養(yǎng)。將細(xì)胞每2-3天稀釋至3至4×105個細(xì)胞/ml的密度。為了瞬時表達(dá)，用8L培養(yǎng)體積在36.5℃，pH7.0±0.2，pO235％(用N2和空氣充氣，總氣流200mlmin-1)下、以14L不銹鋼生物反應(yīng)器開始，攪拌器速度為100-400rpm。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到20×105個細(xì)胞/ml時，在400mlOpti-MEM(Invitrogen)中稀釋10mg質(zhì)粒DNA(等摩爾量的兩種質(zhì)粒)。將20ml293fectin(Invitrogen)加入到該混合物中，然后將其在室溫下孵育15分鐘，隨后轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中。從第二天起，以連續(xù)模式向細(xì)胞補(bǔ)充營養(yǎng)物：以每天500ml的速率加入進(jìn)料溶液，并根據(jù)需要使葡萄糖保持高于2g/l的水平。在轉(zhuǎn)染后7天使用具有1L桶的擺式離心機(jī)收獲上清液：4000rpm持續(xù)90分鐘。通過SartobranP過濾器(0.45μm+0.2μm，Sartorius)過濾上清液(13μL)，并從中純化FcRnβ-2-微球蛋白復(fù)合物。實(shí)施例8通過MS表征單克隆抗體和FcRn對使用0.5MTCEP(Perbio，Bonn，Germany)在4M鹽酸胍溶液中在37℃下持續(xù)30分鐘還原和變性的50μg單克隆抗體或FcRn進(jìn)行還原的完整質(zhì)譜分析。樣品通過尺寸排阻色譜法(SephadexG-25，用含2％甲酸(v/v)的40％乙腈等度洗脫)脫鹽。在裝備有TriversaNanoMate(Advion，Ithaca，USA)的Q-TOF儀器(MaXis，Bruker，Germany)上記錄ESI質(zhì)譜。對于數(shù)據(jù)評估，使用內(nèi)部開發(fā)的軟件。通過加入0.4MTris，8M鹽酸胍，pH8和0.24MDTT、在37℃下持續(xù)1小時使化合物變性，并通過加入0.6M碘乙酸水溶液、在室溫下在黑暗中持續(xù)15分鐘烷基化，來進(jìn)行單克隆抗體和FcRn(250μg)的肽圖繪制。使用NAP5SephadexG-25DNA級柱(GEHealthcare，Munich，Germany)將樣品緩沖交換為50mMTris/HCl，pH7.5。用胰蛋白酶(Promega，Mannheim，Germany)在37℃消化5小時(酶與底物的比率為1:37)。注射獲得的肽混合物并使用反相U-HPLC(NanoAcquity，WatersGmbH，Eschborn，Germany)分離而無需預(yù)處理。來自Waters的AcquityUPLCBEHC18柱(1×150mm，1.7μm粒徑，孔徑)用于分離。溶劑是在水(A)和乙腈(B)(SigmaAldrich，Munich，Germany)中的0.1％(v/v)甲酸。60μl/min、1至40％B的線性梯度在50℃運(yùn)行120分鐘。通過UPLC系統(tǒng)結(jié)合LTQOrbitrapXL串聯(lián)質(zhì)譜儀(ThermoFisherScientific，Dreieich，Germany)、通過TriversaNanoMate界面(Advion，Ithaca，USA)以正離子模式操作進(jìn)行質(zhì)量分析。實(shí)施例9氫/氘交換質(zhì)譜法(HDX-MS)使用以下樣品設(shè)置進(jìn)行HDX-MS實(shí)驗(yàn)：將具有和不具有FcRn(112pmol/μl)的單克隆抗體(73pmol/μl)混合并稀釋在含有50mM磷酸鈉、50mMNaCl，pH6.5的D2O(99.9原子％氘)中至最終氘含量90％，抗體濃度為1.2pmol/μl，F(xiàn)cRn為8.96pmol/μl(84％抗體結(jié)合，1：2的IgG1：FcRn結(jié)合比)。理論計(jì)算基于IgG1-FcRn相互作用的KD為0.6μM，用D2O稀釋后的最終體積為25μl。15分鐘后，預(yù)孵育樣品，在室溫下開始氘標(biāo)記不同的時間間隔：0分鐘、1分鐘、1小時、2.5小時和5小時。在每個時間間隔，從標(biāo)記混合物中移除30pmol靶蛋白的等分試樣(25μl)，并在25μl50mM磷酸鈉、50mMNaCl，pH6.5和50μl0.5MTCEP、6M鹽酸胍的磷酸溶液(pH2.3)的冰冷混合物中淬滅至最終pH為2.5，并冷凍至-80℃，直到LC-MS分析。通過在6M氘化的鹽酸胍(最終氘含量為90原子％)中過夜孵育來制備完全氘化的樣品。將猝滅的氘化蛋白(30pmol)加載到結(jié)合混合Q-TOFSynaptG2質(zhì)譜儀(Waters，Milford，USA)的冷的HDX-UPLC系統(tǒng)上。UPLC系統(tǒng)在0℃操作并配備有帶有60μl內(nèi)部體積的內(nèi)部包裝的胃蛋白酶柱(IDEX，OakHarbor，USA)，其包含固定在瓊脂糖上的胃蛋白酶(ThermoScientificPierce，Rockford，USA)、捕獲C18柱(ACQUITYUPLCBEHC181.7μmVanGuard柱(Waters,Milford,USA))和分析C18柱(ACQUITYUPLCBEHC181.7μm,1x100mm柱(Waters,Milford,USA))。蛋白質(zhì)在20℃的溫度下順序消化，并在捕獲柱上以200μl流動相A(0.23％FA)的流速脫鹽。胃酶解肽從捕獲柱洗脫，并以40μl/分鐘的流速、以8％到40％流動相B的7分鐘梯度(ACN，0.23％FA)通過分析柱，進(jìn)入質(zhì)譜儀用于質(zhì)量分析。ESI源以正離子模式操作，儀器能夠用于離子遷移率分析。獲得的Glu-Fibrinopeptide(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)的lock-spray參考信號用于內(nèi)部校準(zhǔn)。通過MSe、HDMSe和DDAMS/MS的組合進(jìn)行肽的鑒定。通過在PLGS版本2.5中的數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行肽鑒定，HDX-MS數(shù)據(jù)在DynamX版本2.2.1中處理。如果完全氘化抗體肽的回交相似(低于7％)，則重疊肽的HDX-MS數(shù)據(jù)僅用于將氘?dāng)z取定位到較小的片段(Sheff,J.,等人,J.Am.Soc.MassSpectrom.24(2013)1006-1015)。實(shí)施例10氫/氘交換質(zhì)譜與ETD通過與前述實(shí)施例相同的步驟制備氘化樣品，除了將注射量調(diào)節(jié)至100pmol抗體，并且使用在D2O緩沖液中的5倍稀釋(至最終80原子％氘)，導(dǎo)致在標(biāo)記期間抗體濃度為4pmol/μl和FcRn濃度為14pmol/μl和85％的結(jié)合抗體。以靶向方式對選擇的抗體肽片段進(jìn)行HDX-ETD，所述片段在FcRn結(jié)合和未結(jié)合狀態(tài)之間具有差異氘?dāng)z取。ESI源和源T波在針對最小H/D加擾而優(yōu)化的設(shè)置下操作，如Rand,K.D.,等人(J.Am.Soc.MassSpectrom.22(2011)1784-1793)所述，具有以下參數(shù)：毛細(xì)管電壓2.8kV，去溶劑化氣體流量800L/h，錐形氣體流量0L/h，源溫度90℃，去溶劑化氣體溫度300℃，取樣錐20V，萃取錐2V，T波捕獲波速度300m/s，波高0.2V。在捕獲T波中使用1,4-二氰基苯(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)作為ETD試劑進(jìn)行ETD。儲存在密封容器中的試劑晶體上使用20ml/min的氮?dú)庋a(bǔ)充流將1,4-二氰基苯引入到陰離子源中。通過輝光放電以40μA的電流產(chǎn)生自由基陰離子，并補(bǔ)充20ml/min的氣流。通過測定c型和z型ETD片段離子的平均質(zhì)量來分析ETD數(shù)據(jù)。通過從氘化樣品的氘含量中減去未標(biāo)記的產(chǎn)物離子的氘含量計(jì)算氘含量。通過監(jiān)測記錄的來自完全氘化抗體樣品的胃酶解肽ETD光譜中從帶電還原物質(zhì)損失的氨，證實(shí)不存在H/D加擾，如Rand,K.D.,等人(Anal.Chem.82(2010)9755-9762)所述。當(dāng)前第1頁1 2 3