本發(fā)明涉及在感測表面處評估分子結(jié)合相互作用的方法，并且更特別地涉及用于評估流體樣品中分析物和固定在生物傳感器的傳感器表面上的配體之間相互作用的方法，這不依賴于相互作用模型。

技術(shù)背景

能夠?qū)崟r(shí)地監(jiān)測分子(例如生物分子)間相互作用的分析傳感器系統(tǒng)，正獲得越來越多的關(guān)注。這些系統(tǒng)經(jīng)常基于光學(xué)生物傳感器，并且通常被稱為相互作用分析傳感器或生物特異性相互作用分析傳感器。代表性的這種生物傳感器系統(tǒng)是由GE Healthcare售出的儀器，其使用表面等離子共振(SPR)用于檢測樣品中分子和固定在感測表面上的分子結(jié)構(gòu)間的相互作用。當(dāng)樣品經(jīng)過該傳感器表面，結(jié)合的過程直接反映發(fā)生相互作用的速率。樣品注射跟隨緩沖液流，在其期間檢測器響應(yīng)反映出表面上的復(fù)合物的分離速率。來自系統(tǒng)的典型輸出是描述分子相互作用隨時(shí)間的進(jìn)展的圖表或曲線，包括聯(lián)合階段部分和分離階段部分。該結(jié)合曲線，其通常被顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，經(jīng)常被稱為結(jié)合曲線或“傳感圖”。

采用系統(tǒng)(和模擬傳感器系統(tǒng))，因此有可能在不使用標(biāo)記并且經(jīng)常不純化涉及的物質(zhì)的情況下實(shí)時(shí)地不僅確定樣品中的特定分子(分析物)的存在和濃度，還確定附加的相互作用參數(shù)，包括分子相互作用的結(jié)合(聯(lián)合)和分離的動力學(xué)速率常數(shù)，以及表面相互作用的親和性。聯(lián)合速率常數(shù)(k_a)和分離速率常數(shù)(k_d)可以通過使多個不同的樣品分析物濃度的得到的動力學(xué)數(shù)據(jù)適合以不同方程形式的相互作用模型的數(shù)學(xué)描述來獲得。親和性(表達(dá)為親和性常數(shù)KA或分離常數(shù)K_D)可以從聯(lián)合和分離速率常數(shù)計(jì)算得到。

為了將上述相互作用參數(shù)從記錄的結(jié)合曲線中推導(dǎo)出，已經(jīng)發(fā)展了一系列不同的試驗(yàn)和模型，其涉及或多或少的復(fù)雜計(jì)算，其已經(jīng)被證明給出多種類型的相互作用的非?？煽康慕Y(jié)果。然而，許多這些計(jì)算基于特定的相互作用模型，并且因此限制于落入該模型下的特定類型的相互作用，并且存在一系列相互作用，其不容易根據(jù)特定模型進(jìn)行分類。因此，并不總是有可能提供可靠的相互作用參數(shù)用于評估一些分析物配體相互作用。圖3公開了結(jié)合曲線的兩種示意示例，其中基于模型的評估(虛線)不能夠提供可靠的結(jié)果。

評估該類型相互作用的一個備選方法是依賴于結(jié)合曲線中的預(yù)定點(diǎn)處的報(bào)告點(diǎn)。但是在基于報(bào)告點(diǎn)的分析中，僅關(guān)于在特定報(bào)告點(diǎn)處的相互作用的信息被用于表征相互作用，反之結(jié)合曲線中的多數(shù)信息被丟棄。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供新的方法和生物傳感器系統(tǒng)用于評估流體樣品中分析物和固定在生物傳感器的傳感器表面上的配體之間的相互作用，所述方法和生物傳感器系統(tǒng)克服了現(xiàn)有技術(shù)的一種或多種缺陷。這通過如獨(dú)立權(quán)利要求中限定的方法和生物傳感器系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

使用本發(fā)明的方法和生物傳感器系統(tǒng)的一個優(yōu)點(diǎn)是其允許分析物配體相互作用的評估，其獨(dú)立于理論相互作用模型，同時(shí)仍然考慮所有記錄(register)數(shù)據(jù)點(diǎn)。另一個優(yōu)點(diǎn)是與現(xiàn)有技術(shù)的評估方法相比評估不太復(fù)雜，并且因此要求更少的計(jì)算能力。

本發(fā)明的更完全的理解，以及其進(jìn)一步的特征和優(yōu)點(diǎn)，將通過參考以下的詳細(xì)描述和附圖而獲得。

附圖說明

圖1是基于SPR的生物傳感器系統(tǒng)的示意側(cè)視圖。

圖2是代表性傳感圖，其中結(jié)合曲線具有可見的聯(lián)合和分離階段。

圖3示出兩種結(jié)合曲線的示例，兩種結(jié)合曲線難以適合理論模型。

圖4示出根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例的方法的示意框圖。

圖5-9圖示本發(fā)明的一個實(shí)施例。

圖10-17圖示示例1。

圖18-20圖示示例2。

圖21-22圖示示例3。

具體實(shí)施方式

如以上提到的，本發(fā)明涉及一種方法和生物傳感器系統(tǒng)，其用于評估流體樣品中的分析物和固定在生物傳感器的傳感器表面上的配體之間的相互作用。

通常，實(shí)驗(yàn)結(jié)合數(shù)據(jù)通過基于傳感器的技術(shù)獲得，其研究分子相互作用并且實(shí)時(shí)呈現(xiàn)結(jié)果作為相互作用進(jìn)展。然而在更詳細(xì)描述本發(fā)明之前，將描述意圖使用本發(fā)明的一般上下文。

除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與由相關(guān)于本發(fā)明的領(lǐng)域的技術(shù)人員普遍的理解的相同含義。而且，單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”意味著包括復(fù)數(shù)參考，除非其另有規(guī)定。

本文提到的所有出版物、專利申請、專利、和其他參考通過引用全部并入本文。

化學(xué)傳感器或生物傳感器通?；跓o標(biāo)記技術(shù)，檢測傳感器表面的性質(zhì)變化，例如固定層的質(zhì)量、折射率、或厚度，但是還存在依賴于某種類標(biāo)記的傳感器。典型的傳感器檢測技術(shù)包括，但是不限于，質(zhì)量檢測方法例如光學(xué)、熱-光和壓電或聲波方法(包括例如表面聲波(SAW)和石英晶體微天平(QCM)方法)，和電化學(xué)方法，例如測定電位、測定電導(dǎo)、測定電流和電容/阻抗方法。關(guān)于光學(xué)檢測方法，代表性的方法包括檢測質(zhì)量表面濃度的那些方法，例如反射-光學(xué)方法，包括外部和內(nèi)部反射方法，其為角度、波長、偏振或相位解析，例如倏逝波橢偏儀和倏逝波光譜(EWS，或內(nèi)反射譜)，其兩者可以包括經(jīng)由表面等離子共振(SPR)，布魯斯特角折射儀，臨界角測折射儀，受抑全反射(FTR)，散射全內(nèi)全反射(STIR)(其可以包括散射增強(qiáng)標(biāo)記)，光波導(dǎo)傳感器；外部反射成像，基于倏逝波成像例如臨界角解析成像，布魯斯特角解析成像，SPR角解析成像等的倏逝場增強(qiáng)。另外此外，測定光度測定和成像/顯微方法，“本身”或和與反射方法結(jié)合，基于例如表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)，表面增強(qiáng)共振拉曼光譜(SERRS)，倏逝波熒光(TIRF)和磷光可以被涉及提到，以及波導(dǎo)干涉儀(例如如由實(shí)現(xiàn)的Bio-Layer干涉法)，波導(dǎo)漏模光譜，反射干涉光譜(RIfS)，透射干涉法，全息光譜，和原子力顯微鏡(AFR)。

商業(yè)可用的生物傳感器包括前面提到的系統(tǒng)儀器，由GE Healthcare制造和出售，其基于表面等離子共振(SPR)并且準(zhǔn)許實(shí)時(shí)監(jiān)測結(jié)合的配體和感興趣的分析物之間的表面結(jié)合相互作用。在該上下文中，“配體”是一種分子，其對給定的分析物具有已知的或未知的親和性(affinity)，并且包括固定在表面上的任意俘獲或捕獲試劑，反之“分析物”包括任何與此相關(guān)的特定結(jié)合伴侶(partner)。

雖然在接下來的詳細(xì)描述和示例中，本發(fā)明在SPR光譜并且更特別的系統(tǒng)的上下文中圖示，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于這種檢測方法。而是，任何基于親和性的檢測方法，其中分析物結(jié)合到固定在傳感表面上的配體可以被使用，假設(shè)可以測量感測表面處的變化，其定量指示分析物與其上固定的配體的結(jié)合。

SPR現(xiàn)象是公知的，簡單的說當(dāng)光在某些條件下在具有不同折射率的兩種媒體之間的界面處反射時(shí)SPR出現(xiàn)，并且界面被金屬膜涂敷，通常為銀或金。在儀器，媒體是樣品和傳感器芯片的玻璃，其通過微流體流動系統(tǒng)與樣品接觸。金屬膜是芯片表面上的金的薄層。SPR引起了以反射特定角度的反射光強(qiáng)度的減少。該最小反射光強(qiáng)度的角度隨著鄰近與所述反射光相對側(cè)(在系統(tǒng)中是樣品側(cè))上的表面的折射率而變化。

系統(tǒng)的示意圖在圖1中顯示。傳感器芯片1具有金膜2，其支承捕獲分子(配體)3，例如抗體，通過流動通道5暴露于具有分析物4例如抗原的樣品流。來自光源7(LED)的單色p偏振光6被棱鏡8耦合到玻璃/金屬界面9，在此光被完全反射。反射光束10的強(qiáng)度被光檢測單元11(光電檢測器陣列)檢測。

儀器和SPR現(xiàn)象的技術(shù)方面的詳細(xì)討論可以在美國專利No.5313264中找到。關(guān)于生物傳感器感測表面的基涂層的更多詳細(xì)的信息在例如美國專利No.5242828和5436161中給出。另外，與儀器結(jié)合使用的生物傳感器芯片的技術(shù)方面的詳細(xì)討論可以在美國專利No.5492840中找到。

當(dāng)樣品中的分子結(jié)合到傳感器芯片表面上的捕獲分子時(shí)，濃度和因此的所述表面處折射率變化并且檢測到SPR響應(yīng)。在相互作用進(jìn)程期間標(biāo)繪響應(yīng)對時(shí)間，將提供該相互作用進(jìn)展的定量測量。這種標(biāo)繪圖、或動力學(xué)或曲線(結(jié)合等溫線)，通常被稱為結(jié)合曲線或傳感圖，有時(shí)在本領(lǐng)域也稱為“親和痕跡”或“親和圖(affinogram)”。在系統(tǒng)中，SPR響應(yīng)值被表達(dá)為共振單位(RU)。一個RU表示在最小反射光強(qiáng)度的角度的0.0001°變化，其對于多數(shù)蛋白質(zhì)和其他生物分子來說對應(yīng)于在傳感器表面上的大約1pg/mm²的濃度變化。當(dāng)含有分析物的樣品接觸所述傳感器表面時(shí)，結(jié)合到傳感器表面的捕獲分子(配體)在稱為“聯(lián)合”的步驟中與分析物相互作用。該步驟在結(jié)合曲線中通過當(dāng)樣品開始與傳感器表面接觸時(shí)RU的增加來指示。相反，通常當(dāng)樣品流被例如緩沖液流替代時(shí)發(fā)生“分離”。該步驟在結(jié)合曲線上通過當(dāng)分析物從表面結(jié)合配體分離時(shí)隨時(shí)間的RU的降低來指示。

圖2呈現(xiàn)在傳感器芯片表面處的可逆的相互作用的代表性結(jié)合曲線(傳感圖)，所述感測表面具有固定的捕獲分子，或配體，例如抗體，其因此與結(jié)合伴侶或例如樣品中的分析物相互作用。通過基于以上提到的其他檢測原理的生物傳感器系統(tǒng)產(chǎn)生的結(jié)合曲線將具有類似的外觀。垂直軸(y軸)指示響應(yīng)(這里是共振單位，RU)和水平軸(x軸)指示時(shí)間(這里是以秒為單位)。在水平軸下方，采集結(jié)合曲線的采集周期被示意性公開為分成不同的時(shí)間段，其中傳感器表面與不同流體接觸。開始，從t₁到t₂，緩沖液(B)通過所述感測表面，給出了結(jié)合曲線上的基線響應(yīng)I。接著從t₂到t₃期間，傳感器表面接觸含有濃度為C₁的分析物的樣品，因而由此觀察到由于分析物結(jié)合導(dǎo)致的信號增加。結(jié)合曲線的該部分II被通常稱為“聯(lián)合階段”。最終，在聯(lián)合階段的結(jié)束或接近結(jié)束時(shí)到達(dá)了穩(wěn)定狀態(tài)條件，其中在III處的共振信號穩(wěn)定時(shí)期(該狀態(tài)可以然而并不總是被獲得)。要注意本文中的術(shù)語“穩(wěn)定狀態(tài)”與術(shù)語“平衡”(在其他上下文中術(shù)語“平衡”可以保留以描述理想的相互作用模型，因?yàn)閷?shí)際上結(jié)合可以隨時(shí)間是恒定的，即使系統(tǒng)不處于平衡)同義使用。在聯(lián)合階段的結(jié)尾，在t₃，樣品經(jīng)常被緩沖液(B)的連續(xù)流代替，并且信號的減小反映了分析物從表面的分離或釋放。結(jié)合曲線的該部分IV通常稱為“分離階段”。分析可任選地通過再生步驟在t₄結(jié)束，其中能夠從表面去除結(jié)合分析物同時(shí)(理想地)保持配體的活性的溶液(R)，被注入傳感器表面上。這在傳感圖上的部分V中指示。在t₅緩沖液(B)的注入恢復(fù)到基線I，并且表面現(xiàn)在準(zhǔn)備新的分析。在一些情況下省略重生再生步驟V并且現(xiàn)在在沒有再生的情況下開始新的注射周期可以是方便的。這樣的類情況的示例包括相同分析物的濃度系列，采用足夠高的分離速率篩查分析物以允許基本完全的分離等。

分別從聯(lián)合和分離階段II和IV的輪廓，獲得關(guān)于結(jié)合和分離動力學(xué)的信息，并且結(jié)合曲線在III處的高度表示親和性(起因于相互作用的響應(yīng)與表面上質(zhì)量濃度的變化相關(guān))。

本發(fā)明

要理解，本發(fā)明不限于本發(fā)明上述的特定實(shí)施例，本發(fā)明的范圍將通過所附的權(quán)利要求限定。

如上所述，本發(fā)明涉及一種評估流體樣品中分析物和固定在生物傳感器的傳感器表面上的配體之間的相互作用的方法和生物傳感器系統(tǒng)。所述生物傳感器可以基于任意類型的親和性檢測方法，其中分析物結(jié)合到固定在感測表面上的配體，假設(shè)感測表面處的變化可以被檢測，其定量指示了分析物與在其上固定的配體的結(jié)合。根據(jù)示意性公開于圖4的一個實(shí)施例，所述方法包括以下步驟：

提供參考結(jié)合曲線10，表示預(yù)定采集周期的參考相互作用，

使用生物傳感器采集預(yù)定采集周期的分析物配體相互作用的樣品結(jié)合曲線20，

記錄樣品結(jié)合曲線和參考結(jié)合曲線的偏差40，以及

當(dāng)記錄的偏差小于預(yù)定的偏差標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將分析物配體相互作用50分類為等效于參考相互作用。

如圖4的虛線框指示的，所述方法可以任選地包括在偏差被記錄前，相對于參考結(jié)合曲線30將樣品結(jié)合曲線歸一化的步驟。這種歸一化可以被用于補(bǔ)償傳感器表面上的配體活性的變化。

遍及本公開，術(shù)語參考結(jié)合曲線指的是這樣的結(jié)合曲線，其表征參考相互作用，例如：

具體分析物-配體對之間的相互作用，

特定相互作用類型，其可為兩個或多個的分析物-配體對的組共用，

指示具體相互作用機(jī)制的特定相互作用行為，

等等。

參考結(jié)合曲線可以以基本上任何合適方式提供，并且它可以是如使用生物傳感器所采集的直接使用的特定相互作用的直接結(jié)合曲線，或它可以是精煉的結(jié)合曲線，其通過操控一種或多種結(jié)合曲線提供，如將被更詳細(xì)地公開。在一個實(shí)施例中，參考結(jié)合曲線通過在預(yù)定采集條件下，使用生物傳感器采集參考分析物配體相互作用的一種或多種結(jié)合曲線來提供。在一些實(shí)施例中，參考結(jié)合曲線可以是一種理論結(jié)合曲線，其不直接基于通過生物傳感器采集的結(jié)合曲線，而是基于理論或經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停缃Y(jié)合曲線，其特定設(shè)計(jì)成表征具體相互作用機(jī)制等。理論結(jié)合曲線可以例如使用理論模型和合適的動力學(xué)和親和性常數(shù)進(jìn)行模擬。

在本方法中，參考結(jié)合曲線表示預(yù)定采集周期的參考相互作用，并且待評估分析物配體相互作用的樣品結(jié)合曲線使用相同的預(yù)定采集周期采集，由此得到的結(jié)合曲線可以通過直接比較進(jìn)行評估，而不是將響應(yīng)適合理論模型等以提取用于評估的具體相互作用參數(shù)。

遍及本公開，術(shù)語預(yù)定采集周期包括收集步驟和生物傳感器設(shè)置以及一個或多個樣品流體中的分析物濃度，其對采用生物傳感器記錄的結(jié)合曲線的形狀有影響。根據(jù)一個實(shí)施例，預(yù)定采集周期包括至少一個聯(lián)合階段，其中傳感器表面與包含以預(yù)定濃度的分析物的流體樣品接觸。在一個實(shí)施例中，預(yù)定采集周期包括用于不同分析物濃度的至少兩個聯(lián)合階段，由此來自分析物配體相互作用的動力學(xué)特性的貢獻(xiàn)在得到的結(jié)合曲線中增大。預(yù)定采集周期可以包括至少一個分離階段，其中傳感器表面與無分析物的流體接觸。圖5示出預(yù)定采集周期的示例和參考曲線的示例，包括濃度為C₁到C₅的分析物的5個聯(lián)合階段，帶有中間的分離階段B，其中傳感器表面與不含無分析物的緩沖液接觸。在圖5中采集周期被在特定時(shí)間點(diǎn)t_n被分成不同段的過程時(shí)間軸圖示，在特定時(shí)間點(diǎn)t_n被分成不同段。如可以從聯(lián)合參考結(jié)合曲線看到的，C₁＜C₂＜C₃＜C₄＜C₅。然而，應(yīng)該注意的是，預(yù)定采集周期決不應(yīng)被限定到圖5的示例，并且預(yù)定采集周期可以以任何適合的方式設(shè)計(jì)成利于分析物配體的相互作用的評估和分類。預(yù)定采集周期可以例如包括：

具有分析物濃度C₁的一個單個聯(lián)合階段，

以相同的分析物濃度C₁的幾個聯(lián)合階段，

沒有中間分離階段的兩個或多個連續(xù)的聯(lián)合階段，

一個或多個再生相，

高分析物濃度之后是較低的分析物濃度，

將同樣的分析物通過兩個或多個具有在其上固定的不同配體的生物傳感器表面，例如傳遞到分析生物特異性和多特異性結(jié)合物，例如抗體等，

競爭型試驗(yàn)，

……

一些通過預(yù)定采集周期限定的參數(shù)可以與使用的生物傳感器的類型并且相同的設(shè)置相關(guān)。例如當(dāng)生物傳感器的傳感器表面提供在流動池中，然后預(yù)定采集周期也可以限定流體通過流動池的流動速率，因?yàn)樵谝恍l件下的聯(lián)合和分離速率取決于流動速率。可能相關(guān)的其他參數(shù)是生物傳感器處的溫度，配體活性的衰減等。

分析物濃度C₁到C₅可以離線制備，并且提供于單獨(dú)的樣品容器中或濃度通過能夠?qū)⒏邼舛葮悠吩号c緩沖液等混合為以預(yù)定濃度分析物的樣品流體的在線混合單元提供。

在圖5a中參考結(jié)合曲線被顯示為虛線曲線，其指示參考相互作用，分析物配體相互作用將相對于它進(jìn)行評估。根據(jù)一個實(shí)施方式，記錄樣品結(jié)合曲線和參考結(jié)合曲線的偏差的步驟40通過從參考結(jié)合曲線的偏差的直接計(jì)算來執(zhí)行，并且由此相對于偏差量的直接閾值可以為分類步驟50設(shè)置。根據(jù)其他實(shí)施例，更多特定閾值標(biāo)準(zhǔn)可以為分類步驟提供，例如通過相對于在預(yù)定采集周期中的它的一個或多個相或部分的偏差的權(quán)重等。

根據(jù)一個實(shí)施例，如圖5a示意性示出的，上限和/或下限的參考閾值曲線可以被提供為了限定相對于參考結(jié)合曲線的可接收閾值，并且其中偏差標(biāo)準(zhǔn)相對于一個或多個參考閾值曲線限定。在圖5a中上限和/或下限的參考閾值曲線被公開為細(xì)的實(shí)線并且它們各表示參考結(jié)合曲線沿著y軸分別在正向和負(fù)向上的線性位移，即：

上限閾值曲線＝參考結(jié)合曲線+預(yù)定上限閾值參數(shù)

下限閾值曲線＝參考結(jié)合曲線-預(yù)定下限閾值參數(shù)

圖5b是圖5a的采集周期和對應(yīng)參考曲線，其中樣品結(jié)合曲線被繪制為細(xì)虛線用于分類。圖5b中公開的樣品結(jié)合周期整體落入上限和下限的閾值曲線的邊界內(nèi)并且可以因此被分類為等效于預(yù)定閾值的參考相互作用。根據(jù)一個實(shí)施例，分類可以基于單個的上限或下限的閾值曲線，其中當(dāng)它滿足一個閾值曲線時(shí)樣品結(jié)合曲線被分類為等效于參考相互作用。如下面將詳細(xì)地和結(jié)合示例公開的，以上限和下限的閾值曲線形式的偏差標(biāo)準(zhǔn)可以基于從多個參考結(jié)合曲線的捕捉中計(jì)算的統(tǒng)計(jì)信息來提供。在這種方式中，用于分析物配體結(jié)合曲線的分類的閾值可以對于真實(shí)的相互作用偏差等更具代表性。根據(jù)一個實(shí)施例，用于分析物配體相互作用的分類的預(yù)定偏差標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)于預(yù)定采集周期的不同相或部分加權(quán)。

圖6到9示出建立統(tǒng)計(jì)限定的參考結(jié)合曲線以及上限和下限的閾值曲線的一種方式。為了提供統(tǒng)計(jì)相關(guān)的參考結(jié)合曲線，采集了兩個或多個結(jié)合曲線用于預(yù)定采集周期的參考分析物配體相互作用。在圖6中，5個參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線被示意性公開用于預(yù)定采集周期。由于生物傳感器響應(yīng)和樣品制備等的變化，在參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線間的一定量的偏差可以被預(yù)期，并且因此根據(jù)本方法的評估可以被布置為考慮這類偏差。根據(jù)一個實(shí)施例，參考結(jié)合曲線然后限定為所述兩個或多個結(jié)合曲線的平均或中間曲線并且在步驟40樣品結(jié)合曲線相對于平均或中間曲線的偏差被記錄。對于一些參考-分析物配體相互作用，記錄的結(jié)合曲線之間的偏差通過偏差/衰減類型模式被表征。在這類情況中，參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線可以在統(tǒng)計(jì)地限定的參考結(jié)合曲線的計(jì)算之前被歸一化。歸一化可以根據(jù)特定的偏差/衰減模式以任何合適的方式執(zhí)行，并且根據(jù)一個實(shí)施例，它可以通過在預(yù)定采集周期中選擇適合的歸一化的點(diǎn)t_N和在y方向上行將參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線重新標(biāo)度(這樣使得所有的曲線或在一系列曲線的情況下，使得所有曲線或曲線系列在所述點(diǎn)t_N具有相同值)來實(shí)施執(zhí)行。歸一化的點(diǎn)優(yōu)選地根據(jù)預(yù)定采集周期進(jìn)行選擇，并且在一個實(shí)施例中它被選為在聯(lián)合階段的結(jié)束之前具有最高響應(yīng)的短時(shí)幀的點(diǎn)。圖7示意性地公開了相對于歸一化的點(diǎn)t_N歸一化圖6的參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線。另一實(shí)施例是選擇兩個或多個歸一化點(diǎn)t_N，并且例如基于所述歸一化點(diǎn)t_N處的平均響應(yīng)來歸一化曲線。

在圖8中，參考結(jié)合曲線被示意性圖示為基于圖7的歸一化的參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線的平均曲線。備選地，參考結(jié)合曲線可以被提供為中間曲線或以任何其他適合的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，其將會提供表示預(yù)定采集周期的參考相互作用的參考結(jié)合曲線。通過使用用于限定參考結(jié)合曲線的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，還提供了關(guān)于與例如平均曲線的偏差的信息，并且這種信息可以被使用以提供參考閾值曲線，其例如允許相對于預(yù)定采集周期的一個或多個相或部分的更寬的閾值范圍，其中記錄的參考-分析物配體相互作用結(jié)合曲線示出更寬的偏差范圍。在一個實(shí)施例中上限和下限的參考閾值曲線分別被所述兩個或多個參考-分析物配體相互作用的最小和最大限定。在一個實(shí)施例中，上限和下限的參考閾值曲線通過從參考結(jié)合曲線等中選擇預(yù)定百分比的偏差來限定。在一個實(shí)施例中，上限和下限參考閾值曲線可以通過使用合適的動力學(xué)和親和性常數(shù)參考結(jié)合曲線等的理論模擬來限定。在一個實(shí)施例中，上限和下限的參考閾值曲線可以由用戶通過圖形用戶界面等來操控，用戶可以例如能夠進(jìn)行以下的一種或多種：

相對于參考曲線移動一個或多個閾值曲線。移動可以是自由的或限制的以保持對準(zhǔn)參考曲線。

使用繪制工具繪制自定義的閾值曲線。

使用繪制工具等修改現(xiàn)有的閾值曲線。

在一個實(shí)施例中，其被示意性地公開于圖8，并且將在示例中更詳細(xì)地公開，上限和下限參考閾值曲線被通過與平均曲線的預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)偏差限定。通過使用標(biāo)準(zhǔn)偏差的概念，評估的相關(guān)性可以建立到高等級的確定性。根據(jù)本發(fā)明的使用標(biāo)準(zhǔn)偏差限定評估的閾值的概念進(jìn)一步使得呈現(xiàn)以標(biāo)準(zhǔn)偏差圖的形式的評估結(jié)果，以清晰圖示樣品結(jié)合曲線與限定的參考閾值曲線的配合，如參考示例1的圖14所圖示的。根據(jù)一個實(shí)施例，所述方法包括以下步驟：

在圖形顯示器上顯示，用于視覺檢查，以下的一個或多個：

參考結(jié)合曲線，一個或多個樣品結(jié)合曲線和任選的上限閾值曲線，下限閾值曲線和控制結(jié)合曲線的重疊圖，

偏差圖，其中記錄的與參考記錄曲線的偏差被顯示用于一個或多個樣品結(jié)合曲線，以及

參考閾值曲線圖，其中一個或多個樣品結(jié)合曲線被顯示在參考閾值標(biāo)度上。

另外，如已經(jīng)提及的，一個或多個樣品結(jié)合曲線可以相對于參考結(jié)合曲線被歸一化，以便避免來自例如生物傳感器波動等的影響。而且，為了驗(yàn)證生物傳感器和涉及的分析物配體相互作用的功能是相關(guān)的，所述方法可以包括以下步驟：

與樣品結(jié)合曲線聯(lián)合采集控制-分析物配體相互作用的控制結(jié)合曲線，

記錄控制結(jié)合曲線與參考結(jié)合曲線的偏差，以及

當(dāng)控制結(jié)合曲線的偏差小于預(yù)定控制限定時(shí)驗(yàn)證樣品結(jié)合曲線的采集。

如以上的，控制結(jié)合曲線也可以相對于參考結(jié)合曲線被歸一化。在一個實(shí)施例中，預(yù)定的控制限定可以與參考閾值曲線相同?？刂?分析物配體相互作用可以方便地與參考相互作用相同。

根據(jù)一個實(shí)施例，將分析物配體相互作用分類的步驟包括計(jì)算樣品結(jié)合曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的百分比，數(shù)據(jù)點(diǎn)位于參考閾值曲線外部并且其中偏差標(biāo)準(zhǔn)是允許位于參考閾值曲線外部的數(shù)據(jù)點(diǎn)的最大百分比。根據(jù)一個實(shí)施例，將分析物配體相互作用分類的步驟包括計(jì)算閾值參考結(jié)合曲線和/或樣品結(jié)合曲線的平方和，其中參考曲線已經(jīng)首先被減去，并且其中偏差標(biāo)準(zhǔn)是允許的最大平方和。根據(jù)一個實(shí)施例，分類的步驟包括基于被識別的位于閾值曲線內(nèi)部的點(diǎn)的百分比和閾值曲線外部的計(jì)算的限定距離和樣品距離之間的比率平方和計(jì)算類似性分?jǐn)?shù)。因此類似性分?jǐn)?shù)等于內(nèi)部點(diǎn)的百分比加上外部點(diǎn)的百分比乘以SSQ(限定距離)除以SSQ(樣品距離)。在該實(shí)施例中內(nèi)部點(diǎn)被給出值100，并且外部點(diǎn)基于到參考曲線的距離被縮放。

在一個實(shí)施例中，示意性公開于圖9，本發(fā)明包括從記錄偏差的步驟和接下來的步驟中排除結(jié)合曲線的一個或多個段的步驟。從結(jié)合曲線中的一個或多個段的排除可以對排除包括干擾如尖峰等的區(qū)域是有用的。在一個實(shí)施例中，所述方法包括識別干擾以自動排除這類段的步驟。在一個實(shí)施例中，要被排除的段是基于分析物配體相互作用的現(xiàn)有技術(shù)和預(yù)定的采集條件確定的，并且在公開于圖9的實(shí)施例中，排除的段包括在如通過預(yù)定采集周期限定的聯(lián)合和分離階段之間的轉(zhuǎn)變。

所述方法由此可以被用于評估流體樣品中的分析物和固定在生物傳感器的傳感器表面上的配體之間的任何相互作用，其中有可能提供相關(guān)的參考結(jié)合曲線，表示參考相互作用，并且其中期望快速和可靠的相關(guān)評估。應(yīng)用領(lǐng)域的示例包括：

過程質(zhì)量控制，由此方法用來驗(yàn)證最終或中間過程結(jié)果，

篩選分析物/配體庫以識別某一類型的結(jié)合行為等，例如片段篩選，

解離率篩選，

熱力學(xué)篩選，

單相結(jié)合物的篩選，

與無校正濃度分析CFCA結(jié)合的效能測定，其中響應(yīng)曲線的評估確保靶標(biāo)/受體結(jié)合的相似性，其為效能分析的基礎(chǔ)。

根據(jù)一個實(shí)施例，配體和分析物中的至少一個被從以下組中選出：藥物靶標(biāo)和天然的它們的結(jié)合伴侶或用于表征藥物靶標(biāo)的試劑。

根據(jù)一個實(shí)施例，提供了生物傳感器，其布置成執(zhí)行根據(jù)以上的方法。所述生物傳感器系統(tǒng)，可以例如是基于SPR的系統(tǒng)，如系統(tǒng)或例如波導(dǎo)干涉儀如系統(tǒng)等。仍進(jìn)一步地，提供了計(jì)算機(jī)程序，其布置成當(dāng)在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，控制生物傳感器系統(tǒng)的操作以執(zhí)行根據(jù)以上的方法。

示例1

圖10-17示出根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例的評估流體樣品中的分析物和固定在生物傳感器的傳感器表面上的配體之間的相互作用的一個示例。在該示例中他(his)的標(biāo)記Fc受體，F(xiàn)cγRIIIaVal158被捕獲在抗組氨酸生物傳感器表面并且抗體，利妥昔單抗到生物傳感器表面的結(jié)合被記錄。圖示出對于以增加的抗體濃度的具有5個聯(lián)合階段的采集周期的相互作用收集的參考結(jié)合曲線的范圍，每個具有后續(xù)分離階段?？梢钥吹皆诓煌膮⒖冀Y(jié)合曲線之間的響應(yīng)具有大的變化。圖11公開了使用在最后聯(lián)合階段的結(jié)束前幾秒鐘的數(shù)據(jù)作為歸一化的基礎(chǔ)所歸一化參考結(jié)合曲線。

在圖12中，中間曲線表示圖11的歸一化的參考結(jié)合曲線的平均，并且上限和下限的曲線分別表示平均+/-三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖13示出平均參考結(jié)合曲線和上限和下限曲線之間的對應(yīng)不同點(diǎn)，其清楚地示出其中存在在記錄的參考結(jié)合曲線中的不確定性，反之圖14示出在標(biāo)準(zhǔn)偏差比例上重新繪制的記錄的參考結(jié)合曲線。

圖15示出平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差曲線，其中在聯(lián)合和分離階段之間的轉(zhuǎn)變的某些區(qū)段被排除，以減少在那些片段中不確定性的影響。圖16示出在圖15的參考結(jié)合曲線圖上繪制的樣品結(jié)合曲線，如可以看到的，不是所有數(shù)據(jù)都落入+/-三個標(biāo)準(zhǔn)偏差曲線內(nèi)。圖17示出在標(biāo)準(zhǔn)偏差比例上重新繪制的樣品結(jié)合曲線，并且可以看到樣品結(jié)合曲線在若干時(shí)間點(diǎn)處與參考結(jié)合曲線明顯地偏離多于三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。然而，對于相互作用所記錄的控制樣品被推斷如期望地表現(xiàn)，并且很好地處于與所有時(shí)間點(diǎn)處參考結(jié)合曲線的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。

示例2

圖18到20公開了示例，其中MabX-ECR試劑3154根據(jù)本發(fā)明被評估。在該示例中包括增加水平的加壓(stressed)MabX的MabX-ECR試劑3154被評估。圖18a示出對于具有一個聯(lián)合階段和后續(xù)分離階段的采集周期的野生型MabX-ECR試劑3154的相互作用所收集的參考結(jié)合曲線的范圍?？梢钥吹皆诓煌Y(jié)合曲線之間的響應(yīng)存在適度的變化。圖18b公開了歸一化的參考結(jié)合曲線并且圖18c示出了對應(yīng)的SD限定曲線。圖19到20示出增加水平的加壓MabX的評估，其中圖19公開了對于pH加壓刺狀MabX所獲得的結(jié)果并且圖20公開了對于氧化加壓MabX所獲得的結(jié)果。在圖19和20中，圖19a和20a示出已經(jīng)減去空白運(yùn)行后的記錄的響應(yīng)曲線，圖19b和20b示出跟隨歸一化的響應(yīng)曲線，19c和20c示出在SD圖中覆蓋的記錄的響應(yīng)曲線中的每個的標(biāo)準(zhǔn)偏差，并且19d和20d示出在SD圖中以時(shí)間連續(xù)的記錄的響應(yīng)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差。該示例給出由本發(fā)明提供的直觀評估的良好圖示。

示例3

類似于示例2，圖21和22公開了示例，其中根據(jù)本發(fā)明評估了MabX-ECR試劑2994。在該示例中包括增加水平的加壓MabX的MabX-ECR試劑2994被評估。圖21和22示出增加水平的加壓MabX的評估，其中圖21公開了對于pH加壓刺狀MabX所獲得的結(jié)果并且圖22公開了對于氧化加壓MabX所獲得的結(jié)果。在圖21和22中，圖21a和22a示出跟隨歸一化的響應(yīng)曲線，并且圖21b和22b示出在SD圖中一時(shí)間連續(xù)的記錄的響應(yīng)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差。