本發(fā)明涉及高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種pH敏感嵌段聚合物、FRET復(fù)合物模型及其制備方法。

背景技術(shù)：

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一種將熒光光譜與共振能量轉(zhuǎn)移相結(jié)合的高靈敏，高空間分辨率，無損傷的均相檢測技術(shù)。FRET是指熒光供受體在1-10nm距離內(nèi)，當(dāng)供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定重疊時(shí)，由于偶極-偶極相互作用，供體激發(fā)態(tài)能量以非輻射的形式傳遞給受體。能量轉(zhuǎn)移效率與供受體之間距離R的六次方成反比，因此，F(xiàn)RET被稱為1.0-10.0nm范圍內(nèi)有效的光學(xué)“分子尺”，并已在生物分析中具有廣泛的應(yīng)用。其應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域已有40多年，該技術(shù)在自身不斷完善的同時(shí)，極大地促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)分析的發(fā)展^[3]。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫等異相檢測體系相比，F(xiàn)RET是均相分析，省去了很多分離步驟，極大地簡化了分析過程，使自動(dòng)化、高通量分析成為可能，并可克服固相載體非特異性吸附的影響。

利用FRET的原理，設(shè)計(jì)一種空間可變構(gòu)的兩親性自組裝聚合物，能夠通過變構(gòu)實(shí)現(xiàn)頭尾兩端的親近與疏遠(yuǎn)，以此完成FRET。如果使用常見的PCL-PEG-PCL聚合物，能夠?qū)崿F(xiàn)聚合物鏈段的自我折疊，完成自組裝或溫度敏感的凝膠化^[4]。盡管如此，經(jīng)尾靜脈注射的此聚合物膠束，無pH敏感性，且鏈段上無可用于熒光標(biāo)記的化學(xué)位點(diǎn)，無法在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)診療一體化。另一方面，已有專利中，聚組氨酸-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PLH-PEG-PCL)作為一種pH敏感的聚合物載藥體系，體內(nèi)注射后所載藥物或熒光標(biāo)記的聚合物后會(huì)被體內(nèi)多種組織攝取，無法在低背景條件下實(shí)現(xiàn)腫瘤的成像。

因此有必要設(shè)計(jì)一種能夠在酸性條件下實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性的成像、降低體內(nèi)其他組織代謝后的熒光干擾的FRET模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤酸性微環(huán)境調(diào)節(jié)的pH敏感嵌段聚合物。

具體的技術(shù)方案如下：

一種pH敏感嵌段聚合物，該聚合物的結(jié)構(gòu)為聚組氨酸-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-硫辛酸，其中聚乙二醇的分子量為2000-5000，所述聚己內(nèi)酯的分子量為2000-10000，聚組氨酸鏈段長度由10-30個(gè)組氨酸組成。

在其中一些實(shí)施例中，聚己內(nèi)酯與聚乙二醇的鏈長比為1-5。

在其中一些實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量為2000、4000或5000。

本發(fā)明的另一目的是提供上述pH敏感嵌段聚合物的制備方法。

具體的技術(shù)方案如下：

上述pH敏感嵌段聚合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將0.5-5g異雙官能團(tuán)聚乙二醇溶解于30-120ml 10wt％的Na₂CO₃溶液中，冷卻至-4-0℃，將0.6-10g芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺溶解于5-50ml二氧六環(huán)中并緩慢滴入聚乙二醇溶液中，-4-0℃攪拌25-35min，然后置于室溫繼續(xù)攪拌6-12h，經(jīng)乙醚沉淀、過濾，再在去離子水體系下透析40-50h，得Fmoc-NH-PEG-OH；

(2)將1-5g組氨酸單體溶解于10ml無水四氫呋喃，然后加入0.8-5ml亞硫酰氯，室溫反應(yīng)1-3h，經(jīng)過量乙醚沉淀、過濾、重結(jié)晶得組氨酸酸酐；

(3)以辛酸亞錫為催化劑，將0.5-2gFmoc-NH-PEG-OH與1-10g己內(nèi)酯在130-170℃條件下開環(huán)聚合制備Fmoc-NH-PEG-PCL-OH，所述辛酸亞錫的投料量為己內(nèi)酯用量的0.4-0.6wt％；

(4)將Fmoc-NH-PEG-PCL-OH與硫辛酸按摩爾比為1：1.2-1.5的比例分別溶于二甲亞砜中，F(xiàn)moc-NH-PEG-PCL-OH與二甲亞砜的比例為1mol：(20-40)ml；然后加入二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、吡啶，23-28℃攪拌40-50h，其中二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶的添加量分別為Fmoc-NH-PEG-PCL-OH摩爾量的1.2-1.5倍，三乙胺和吡啶的添加量分別為二甲亞砜體積的0.5-1.5％，過濾，再在去離子水體系下透析40-50h并凍干得Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

(5)將步驟(4)得到的0.2-2g Fmoc-NH-PEG-PCL-LA粉末溶于10-30mL20wt％哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，23-28℃攪拌10-20min，使用無水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

(6)將80mg NH-PEG-PCL-LA與20-50mg組氨酸酸酐溶于25-35mL二甲基甲酰胺中，23-28℃攪拌20-30h；然后加入巰基乙醇，巰基乙醇的添加量二甲基甲酰胺體積的0.5-1.5％，繼續(xù)攪拌1-1.5h，經(jīng)乙醚沉淀，即得所述pH敏感嵌段聚合物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種FRET復(fù)合物。

具體的技術(shù)方案如下：

一種由上述pH敏感嵌段聚合物制備得到的FRET復(fù)合物。

本發(fā)明的另一目的是提供上述FRET復(fù)合物的制備方法。

具體的技術(shù)方案如下：

上述FRET復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)采用熒光染料標(biāo)記所述pH敏感嵌段聚合物的氨基末端；

(2)將10mg-200mg金納米顆粒加入10mL濃度為5mg/mL的步驟(1)得到的產(chǎn)物的二甲亞砜溶液中，然后在PBS體系下透析6-7h，即得所述FRET復(fù)合物。

在其中一些實(shí)施例中，所述金納米顆粒選自膠體金或金納米棒。

在其中一些實(shí)施例中，所述熒光染料選自Cy5或Cy7。

在其中一些實(shí)施例中，所述PBS體系的pH值為7.2-7.4。

本發(fā)明的原理及優(yōu)點(diǎn)如下：

大量的腫瘤診療一體化方案被用來設(shè)計(jì)和構(gòu)建藥物、探針共載體系，但是眾多載體中，設(shè)計(jì)大多圍繞二硫鍵(-S-S)、pH敏感斷裂(如腙鍵-NH-NH等)實(shí)現(xiàn)載體藥物釋放，同時(shí)利用Gd、Fe₃O4或者ICG等實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像。當(dāng)這些復(fù)合體系經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)靶組織后，能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)想的成像與治療。但是肝臟、腎臟以及其他如腸道代謝中被動(dòng)攝取的這些復(fù)合物同樣能夠發(fā)射熒光信號，干擾腫瘤部位的熒光信號分析，不利于實(shí)現(xiàn)腫瘤低背景的成像。我們利用Cy系列探針為熒光分子，發(fā)射的熒光信號可以在FRET條件下被金納米棒吸收，完成熒光的淬滅或強(qiáng)度降低，實(shí)現(xiàn)FRET對熒光的開關(guān)。控制FRET模型中的分子間距離，可以實(shí)現(xiàn)這一概念。因?yàn)槲覀儾捎脤δ[瘤微環(huán)境敏感的聚組氨酸鏈段作為相應(yīng)分子，設(shè)計(jì)了Cy7-PLH-PEG-PCL-LA/Au復(fù)合模型(如圖1所示)，完成腫瘤診療一體化的應(yīng)用目的。當(dāng)該模型納米聚合物復(fù)合體系進(jìn)入堿性或中性生理環(huán)境時(shí)，熒光因?yàn)镕RET效應(yīng)而被關(guān)閉；當(dāng)復(fù)合物體系進(jìn)入腫瘤部位時(shí)，實(shí)現(xiàn)聚合物的pH敏感變構(gòu)，打破FRET的實(shí)現(xiàn)條件，完成熒光的一個(gè)恢復(fù)。

本發(fā)明以功能化的嵌段聚合物聚組氨酸-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-硫辛酸(PLH-PEG-PCL-LA)設(shè)計(jì)與合成為核心內(nèi)容，構(gòu)建基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理、可針對腫瘤酸性微環(huán)境特異近紅外成像并參與治療的診療一體化模型。利用聚組氨酸在不同pH條件下的親疏水性質(zhì)變化，PLH-PEG-PCL-LA具有堿性條件下“折疊”、酸性條件下“伸展”兩種納米構(gòu)象。通過對聚己內(nèi)酯末端的硫辛酸修飾引入二硫鍵(-S-S)，熒光分子標(biāo)記后的聚合物能夠與金顆粒組裝成近紅外成像的FRET模型?？刂坪铣煞磻?yīng)，得到不同聚己內(nèi)酯(PCL)/聚乙二醇(PEG)/聚組氨酸(PLH)鏈段長度的聚合物分子，由pH敏感變構(gòu)作用調(diào)節(jié)作為供體的熒光分子(如花青染料Cy5、Cy7)與作為受體的金納米顆粒的納米構(gòu)象距離，從而借助FRET控制近紅外探針分子的熒光開與關(guān)，完成對實(shí)體腫瘤內(nèi)酸性微環(huán)境的特異近紅外成像(如圖2所示)。同時(shí)，設(shè)計(jì)通過含聚乙二醇聚合物的包覆，提高金納米顆粒的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，增加治療性金顆粒在腫瘤的富集，更好的實(shí)現(xiàn)金顆粒對腫瘤的光熱治療。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，是當(dāng)供體與受體熒光光譜匹配、且距離小于10nm的情況下，供體的發(fā)射光譜作為受體的激發(fā)光譜，觸發(fā)受體熒光激發(fā)或淬滅供體熒光的一種物理現(xiàn)象。利用這一物理現(xiàn)象，結(jié)合聚合物親疏水性質(zhì)改變導(dǎo)致的聚合物納米粒構(gòu)象變化這一結(jié)果，開發(fā)了一種潛在的藥物遞送體系。利用金棒特異的淬滅近紅外熒光這一能力，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度的腫瘤診療一體化模型，該模型既能標(biāo)記腫瘤的酸性微環(huán)境，實(shí)時(shí)熒光成像；也能夠遞送金棒這種光敏顆粒，實(shí)現(xiàn)腫瘤的光熱治療。

1.利用金納米棒作為近紅外熒光分子的熒光淬滅劑，巧妙的匹配熒光分子，將發(fā)生FRET所需條件自然的整合在該發(fā)明中，構(gòu)建了一種針對腫瘤酸性微環(huán)境特異性發(fā)揮作用的FRET體系模型。

2.利用pH敏感觸發(fā)的聚合物納米粒結(jié)構(gòu)改變這一物理特性，控制供體(熒光基團(tuán))與與受體(金納米粒)的距離，達(dá)到調(diào)節(jié)FRET的目的。

附圖說明

圖1為FRET復(fù)合物及其作用示意圖；

圖2為FRET復(fù)合物在腫瘤診療一體化應(yīng)用的示意圖；

圖3為pH敏感嵌段聚合物的制備流程圖；

圖4為Cy7-PLH-PEG-PCL-LA聚合物自組裝納米粒電鏡照片；

圖5為Cy7-PLH-PEG-PCL-LA/Au(FRET復(fù)合物)電鏡照片(左側(cè)為明場，右側(cè)為暗場)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所使用的原料如下：

異雙官能團(tuán)聚乙二醇(NH2-PEG-OH，分子量為2000Da、4000Da和5000Da)購自上海炎怡生物公司；

己內(nèi)酯(ε-CL)購自sigma公司；

組氨酸單體分子(Nα-CBZ-Nim-DNP-L-histidine)購自上海吉爾生化有限公司；

芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)購自sigma公司；

膠體金購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

其余試劑均為市售購得。

金納米棒的制備方法如下：

合成金種：5mL 0.2mol/L的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)與5mL 0.5mmol/L的氯金酸相混合，再攪拌的過程中加入0.6mL 0℃保存的0.01mol/L的硼氫化鈉，強(qiáng)烈攪拌5min，室溫靜置2h，作為種子金納米粒使用；

CTAB模板法合成短的金納米棒：取7個(gè)25mL的樣品瓶(分別標(biāo)記為GNP-A1、GNP-A2、GNP-A3、GNP-A4、GNP-A5、GNP-A6、GNP-A7)，分別加入5mL 0.2mol/L的CTAB水溶液，對應(yīng)編號加入不同量4mmol/L的AgNO₃水溶液(0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.40mL)，再分別加入5mL 1mmol/L的氯金酸水溶液，此時(shí)溶液顏色變成金黃色，接著分別加入70μL 0.0788mol/L的抗壞血酸，瞬間溶液變成無色。最后分別加入12μL的種子金納米粒分散液，在27～30℃下靜置反應(yīng)2h，即得。

以下通過實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例一種pH敏感嵌段聚合物的制備方法(制備流程如圖3所示)如下：

使用2kDa的Fmoc-NH-PEG-OH 1g，1.2g己內(nèi)酯，130℃真空、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)6小時(shí)，合成Fmoc-NH-PEG-PCL(2000-2000的聚合物)經(jīng)無水乙醚沉淀、透析并凍干；

稱取0.3mmolFmoc-NH-PEG-PCL、0.45mmol硫辛酸、0.45mmol二環(huán)己基碳二亞胺、0.45mmol 4-二甲氨基吡啶、0.3mL三乙胺和0.3mL吡啶加入30mL二甲亞砜中，反應(yīng)48小時(shí)，制備Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液脫去氨基末端的保護(hù)基，即25℃攪拌10分鐘，使用無水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

隨后暴露的氨基用于開環(huán)組氨酸酸酐，即使用NH-PEG-PCL-LA開環(huán)聚合的方式，制備FRET模型中的聚合物：首先將上述制得的80mgNH-PEG-PCL-LA與20mg組氨酸酸酐溶于30mL二甲基甲酰胺溶液中，25℃攪拌24小時(shí)，隨后加入0.3mL巰基乙醇，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，經(jīng)乙醚沉淀，即得所述一端氨基、一端二硫鍵的pH敏感嵌段聚合物(NH₂)PLH-PEG-PCL-LA(-S-S)。

本實(shí)施例一種FRET復(fù)合物的制備方法：

經(jīng)Cy7標(biāo)記聚組氨酸末端，形成的聚合物均能夠在DMSO中溶解，經(jīng)透析法制備聚合物納米粒。結(jié)果如圖4所示。金納米顆粒能夠與二硫鍵(-S-S)發(fā)生特異性結(jié)合，在溶液狀態(tài)下，將10mg金納米棒加入10mL(濃度5mg/mL)Cy7-NH-PLH-PEG-PCL-LA的二甲亞砜溶液中，在使用截留分子量為1000的透析袋在5L的PBS(pH7.2-7.4)體系下透析6小時(shí)制得聚合物膠束/金納米棒復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的溶液。經(jīng)過Cy7標(biāo)記以及與金納米粒復(fù)合，可以形成具有FRET效應(yīng)的復(fù)合物。

實(shí)施例2

本實(shí)施例一種pH敏感嵌段聚合物的制備方法如下：

使用5kDa的Fmoc-NH-PEG-OH，開環(huán)己內(nèi)酯至疏水鏈段長10000Da，合成NH₂-PEG-PCL(為5000-10000的聚合物)；

5kDa的Fmoc-NH-PEG-OH 1g，3g己內(nèi)酯，170℃真空、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)6小時(shí)，合成Fmoc-NH-PEG-PCL，經(jīng)無水乙醚沉淀、透析并凍干；

稱取0.3mmolFmoc-NH-PEG-PCL、0.45mmol硫辛酸、0.45mmol二環(huán)己基碳二亞胺、0.45mmol 4-二甲氨基吡啶、0.3mL三乙胺和0.3mL吡啶加入30mL二甲亞砜溶液中，反應(yīng)48小時(shí)，制備Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液脫去氨基末端的保護(hù)基，即25℃攪拌20分鐘，使用無水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

隨后暴露的氨基用于開環(huán)組氨酸酸酐，即使用NH-PEG-PCL-LA開環(huán)聚合的方式，制備FRET模型中的聚合物：首先將上述制得的80mgNH-PEG-PCL-LA與50mg組氨酸酸酐溶于30mL二甲基甲酰胺溶液中，25℃攪拌24小時(shí)，隨后加入0.3mL巰基乙醇，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，經(jīng)乙醚沉淀，即得所述一端氨基、一端二硫鍵的pH敏感嵌段聚合物(NH₂)PLH-PEG-PCL-LA(-S-S)。

本實(shí)施例一種FRET復(fù)合物的制備方法如下：

經(jīng)Cy7標(biāo)記聚組氨酸末端，形成的聚合物均能夠在DMSO中溶解，經(jīng)透析法制備聚合物納米粒。在溶液狀態(tài)下，將200mg金納米棒加入10mL(濃度5mg/mL)Cy7-NH-PLH-PEG-PCL-LA的二甲亞砜溶液中，在使用截留分子量為7000的透析袋在5L的PBS(pH7.2-7.4)體系下透析6小時(shí)制得聚合物膠束/金納米棒復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的溶液。經(jīng)過Cy7標(biāo)記以及與金納米粒復(fù)合，可以形成具有FRET效應(yīng)的復(fù)合物?？梢孕纬蒄RET模型(圖5所示)，熒光強(qiáng)度在堿性條件緩沖液中減弱，而在偏酸緩沖液略有恢復(fù)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例一種pH敏感嵌段聚合物的制備方法如下：

使用4kDa的Fmoc-NH-PEG-OH，開環(huán)己內(nèi)酯至鏈段長4000Da，合成NH₂-PEG-PCL(4000-4000的聚合物)；

4kDa的Fmoc-NH-PEG-OH 1g，1.2g己內(nèi)酯，140℃真空、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)6小時(shí)，合成Fmoc-NH-PEG-PCL(4000-4000的聚合物)經(jīng)無水乙醚沉淀、透析并凍干；

稱取0.3mmolFmoc-NH-PEG-PCL、0.45mmol硫辛酸、0.45mmol二環(huán)己基碳二亞胺、0.45mmol 4-二甲氨基吡啶、0.3mL三乙胺和0.3mL吡啶加入30mL二甲亞砜溶液中，反應(yīng)48小時(shí)，制備Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液脫去氨基末端的保護(hù)基，即25℃攪拌15分鐘，使用無水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

隨后暴露的氨基用于開環(huán)組氨酸酸酐，即使用NH-PEG-PCL-LA開環(huán)聚合的方式，制備FRET模型中的聚合物：首先將上述制得的80mgNH-PEG-PCL-LA與30mg組氨酸酸酐溶于30mL二甲基甲酰胺溶液中，25℃攪拌24小時(shí)，隨后加入0.3mL巰基乙醇，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，經(jīng)乙醚沉淀，即得所述一端氨基、一端二硫鍵的pH敏感嵌段聚合物(NH₂)PLH-PEG-PCL-LA(-S-S)。

本實(shí)施例一種FRET復(fù)合物的制備方法如下：

經(jīng)Cy7標(biāo)記聚組氨酸末端，形成的聚合物均能夠在DMSO中溶解，經(jīng)透析法制備聚合物納米粒。在溶液狀態(tài)下，將100mg金納米棒加入10mL(濃度5mg/mL)Cy7-NH-PLH-PEG-PCL-LA的二甲亞砜溶液中，在使用截留分子量為3500的透析袋在5L的PBS(pH7.2-7.4)體系下透析6小時(shí)制得聚合物膠束/金納米棒復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的溶液。經(jīng)過Cy7標(biāo)記以及與金納米粒復(fù)合，可以形成具有FRET效應(yīng)的復(fù)合物。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。