本發(fā)明涉及一種在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中區(qū)別間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法。本發(fā)明還涉及一種在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中提高M(jìn)SC群體的純度的方法。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離在發(fā)炎環(huán)境中較具反應(yīng)性的MSC群體的方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞(MSC)是屬于胚胎中胚層來源的多能性細(xì)胞，其具有類纖維母細(xì)胞的形態(tài)。所述細(xì)胞視刺激及培養(yǎng)條件可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)系細(xì)胞及肌細(xì)胞與其它細(xì)胞類型。盡管hMSC的可塑性及其在組織修復(fù)與再生上的角色已廣泛地被研究，近來得到最多的關(guān)注者是其免疫調(diào)控性質(zhì)[50-51]。人類間充質(zhì)干細(xì)胞已自各種組織分離出。最常用的MSC來源為骨髓(bone marrow,BM)。然而，其分離程序為極具侵入性的。為避免侵入性的分離程序，諸如人類臍帶及胎盤的組織由于通常在生產(chǎn)后被丟棄而被視為良好的候選物。先前研究已證實hMSC可自臍帶或胎盤有效率的分離[49]。

MSC為包含在間充質(zhì)組織中的更復(fù)雜的基質(zhì)細(xì)胞組成的子群體。由于間充質(zhì)干細(xì)胞的異質(zhì)性及對其具特異性的已知生物標(biāo)志的缺乏，定義MSC表型及特征是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)[52-54]。負(fù)責(zé)MSC功能的分子組份(特別是在細(xì)胞膜上者)大多數(shù)仍屬未知。此外，特異性細(xì)胞表面標(biāo)志的缺乏使得細(xì)胞培養(yǎng)處于可能為其它細(xì)胞類型污染的風(fēng)險中，特別是諸如纖維母細(xì)胞的成熟基質(zhì)細(xì)胞，其相對地大量存在于間充質(zhì)組織中[52-54]。在自胎盤源組織分離MSC的過程中，非MSC(包括纖維母細(xì)胞、胎盤源上皮細(xì)胞及胎盤源網(wǎng)狀細(xì)胞)常常在體外培養(yǎng)中與MSC共存。纖維母細(xì)胞尤其是污染的主要來源。

纖維母細(xì)胞被視為成熟間充質(zhì)細(xì)胞，尤其大量存在于結(jié)締組織中。因此，該細(xì)胞為許多細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中最常存在的污染細(xì)胞表型。不僅成功地自培養(yǎng)物去除纖維母細(xì)胞的技術(shù)困難，在相同培養(yǎng)物中區(qū)別MSC與纖維母細(xì)胞也尤為復(fù)雜。纖維母細(xì)胞及MSC具有極相似的形態(tài)外觀；二者均可良好地增生并具有許多相同的細(xì)胞表面標(biāo)志[55,56]。國際細(xì)胞治療研討會(International Society of Cellular Therapy,ISCT)目前定義MSC為表達(dá)CD73、CD90及CD105的具塑料貼附性的多能性類纖維母細(xì)胞的細(xì)胞，且不表達(dá)造血標(biāo)志CD14、CD34及CD45。然而，纖維母細(xì)胞也具有所述性質(zhì)及標(biāo)志。因此，目前由ISCT建議的定義無法區(qū)別MSC與一般纖維母細(xì)胞。至今，區(qū)別MSC與纖維母細(xì)胞的最佳方式是基于此兩種細(xì)胞的功能特性的分析；MSC保留多能性干細(xì)胞性及免疫調(diào)控能力，而纖維母細(xì)胞在此二功能特性中都顯得較為受限。

自Friedenstein在辨別MSC上的開創(chuàng)性成果以來[48]，在尋求穩(wěn)定且明確地區(qū)別離體培養(yǎng)擴(kuò)增的MSC與纖維母細(xì)胞方面，培養(yǎng)衍生方法學(xué)、形態(tài)學(xué)及基因表達(dá)特征并無明顯的差異[57-60]。目前，對于分離MSC與纖維母細(xì)胞不存在公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)或單一細(xì)胞表面標(biāo)志。由于纖維母細(xì)胞為常見于源自胎盤的MSC培養(yǎng)物中的污染細(xì)胞群體的事實，作為生物標(biāo)志以區(qū)別MSC與纖維母細(xì)胞的新穎表面蛋白對于確保胎盤源MSC的初代培養(yǎng)的均一性極為重要。

人類促紅血球生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞(Eph)受體為組成受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)跨膜蛋白質(zhì)的最大家族。Eph受體最早發(fā)現(xiàn)的功能是其在軸突導(dǎo)向的復(fù)雜且精密的機(jī)制中的角色[4]。目前已知Eph受體可調(diào)控胚胎發(fā)育期間的細(xì)胞定位及組織模式形成以及諸如癌癥及血管并發(fā)癥的病理癥狀中所涉及的廣泛范圍的細(xì)胞-細(xì)胞間通訊事件[1-5]。此外，所述受體為特化細(xì)胞功能的重要調(diào)控子，參與在突觸可塑性、胰島素分泌、骨重塑、上皮衡定以及發(fā)炎與免疫反應(yīng)中[1,2,6]。其表達(dá)于多種細(xì)胞類型，諸如：神經(jīng)元、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞及包括癌癥干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞[7-10]。

EphA2基因?qū)儆诘鞍踪|(zhì)－酪氨酸激酶家族的Eph受體亞族。先前研究已指出EphA2在介導(dǎo)發(fā)育事件(尤其在神經(jīng)系統(tǒng)中)的功能[4]。在發(fā)育期間，EphA2作用于模式形成的特定方面與其后的數(shù)種胎兒組織的發(fā)育，包括：血管新生、神經(jīng)管發(fā)育、軸中胚層生成、早期后腦發(fā)育、神經(jīng)分化、細(xì)胞遷移調(diào)控、經(jīng)由蝕骨細(xì)胞生成及成骨細(xì)胞生成調(diào)控的骨重塑及在乳腺發(fā)育期間乳腺上皮細(xì)胞增生及分枝形態(tài)形成[11]。尤其，EphA2在神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育中的角色[12]，包括神經(jīng)元送出軸突以到達(dá)正確目標(biāo)的過程，已被明確定義。

Eph受體在干細(xì)胞生物學(xué)中于胚胎發(fā)育期間與成人干細(xì)胞棲位(niche)中的角色僅于最近才被指出。Eph受體在大多數(shù)成人干細(xì)胞棲位中表達(dá)。干細(xì)胞位于特化的微環(huán)境－棲位中，其定義為細(xì)胞及微環(huán)境決定因素的組合，其在特化組織位置內(nèi)精細(xì)安排干細(xì)胞群體(pool)的自我更新及分化。Eph受體及ephrin配體在胚胎形成及組織衡定期間的表達(dá)與其在發(fā)育期間的干細(xì)胞調(diào)控及在成人組織衡定中所涉入者一致[13,15]。Eph/ephrin系統(tǒng)在干細(xì)胞靜止、自我更新與分化之間的平衡中進(jìn)行空間－時間調(diào)控的功能已被提出[14]。然而，Eph在干細(xì)胞棲位維持中的機(jī)制及其在干細(xì)胞調(diào)控中的角色尚未完全被了解。EphA2大量表達(dá)于胚胎干細(xì)胞[16]。然而，大多數(shù)EphA2在干細(xì)胞中的功能研究專注于神經(jīng)系統(tǒng)上。EphA2在CNS(包括神經(jīng)系及膠系前驅(qū)細(xì)胞)中大量表達(dá)[12,15]。最近的研究證據(jù)顯示ephrin-A1可促進(jìn)EphA2-陽性心臟干細(xì)胞的活動性，進(jìn)而增強(qiáng)心肌梗塞后的再生及心臟功能[17]。除這些發(fā)現(xiàn)外，干細(xì)胞科學(xué)中EphA2的表現(xiàn)檔案及功能尚未完全確定。

Eph受體及ephrin配體可調(diào)控干細(xì)胞/先驅(qū)細(xì)胞的自我更新與腫瘤的演化[14]。未轉(zhuǎn)化干細(xì)胞/先驅(qū)細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的高相似度也是公認(rèn)的。近年來，已描述各種癌癥藏有“癌癥干細(xì)胞”區(qū)(在癌細(xì)胞群體組成中高達(dá)25％)的概念[14]。所述細(xì)胞被定義為腫瘤增殖細(xì)胞(tumor-propagating cells,TPC)，因其可誘發(fā)動物宿主中的腫瘤、自我更新并使擴(kuò)增的腫瘤細(xì)胞體中生成進(jìn)一部分化的細(xì)胞[14]。最近，Eph/ephrin信號被連結(jié)至癌細(xì)胞去分化與類干細(xì)胞性質(zhì)的調(diào)控[9,18,19]。然而，應(yīng)注意癌癥干細(xì)胞實際上并非如相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中通常所指的(多能性)“干細(xì)胞”。

Ephs的過度表達(dá)連帶特異ephrin配體的調(diào)降已在數(shù)種癌癥中被報告，并與腫瘤侵略性及較高的級數(shù)(grade)相連結(jié)[19-22]。EphA2的表達(dá)在乳癌、卵巢癌與肺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤與黑色素瘤中升高，且高量的EphA2與低病患存活率相關(guān)[20,23-29]。然而，Eph受體在癌細(xì)胞中的角色及其表達(dá)是絕對情境相依的。已在某些腫瘤(包括乳癌、大腸直腸癌及急性淋巴性白血病)中觀察到相反的表達(dá)模式，其中經(jīng)由表觀遺傳基因靜默或突變造成的低Eph受體表達(dá)與不佳預(yù)后相關(guān)[30]。在人類腎上腺皮質(zhì)癌、腺瘤與健康腎上腺皮質(zhì)組織的陣列轉(zhuǎn)錄剖析研究中，EphA2在人類腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織中的表達(dá)與健康腎上腺皮質(zhì)組織相比較是調(diào)降的[31]。因此，盡管某些Ephs及ephrins的表達(dá)模式在許多腫瘤形成病例中可作為預(yù)后標(biāo)志，相反現(xiàn)象也在大量研究報告中被觀察到。Eph/ephrins的表達(dá)是極度細(xì)胞/腫瘤情境特異性且情境相依的。

最近在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)上的研究顯示藏有大型TPC子群體的腫瘤具有上升的EphA2及EphA3表達(dá)。EphA2受體在人類神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌癥干細(xì)胞(glioblastoma cancer stem cells,CSC)中過度表達(dá)，且在此特異性腫瘤類型中EphA2的表達(dá)與CSC的大小與腫瘤引發(fā)能力具正相關(guān)性[9]。所述Eph受體調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，而其失調(diào)的表達(dá)及體細(xì)胞突變與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的生長，演化及轉(zhuǎn)移相關(guān)[32-36]。

另一方面，在GBM、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌及皮膚癌中，配體依賴性的EphA信號活化具有腫瘤抑制作用[27,38-43]也曾被報導(dǎo)。在大量的GBM研究中，根據(jù)報導(dǎo)通過ephrinA1活化EphA2激酶具有抗增生作用，其可能經(jīng)由調(diào)降EphA2及FAK活性[27,38,44]。EphA2剔除小鼠顯示提高的腫瘤細(xì)胞增生及ERK磷酸化[45]。EphA2的配體刺激還減弱EGF媒介的ERK磷酸化，其與減少的細(xì)胞增生及遷移相關(guān)[46,47]。總言的，有趣的是，所述發(fā)現(xiàn)支持EphA2/ephrinA1信號傳遞為抑制腫瘤生長及侵入。ephrin–Eph相互作用的結(jié)果在不同情境下顯著分歧。

2012年Vescovi團(tuán)隊發(fā)表的研究論文[9]顯示(1)在hGBM中的類干細(xì)胞腫瘤增殖細(xì)胞(tumor-propagating cells,TPC)高度表達(dá)EphA2受體，(2)高EphA2表達(dá)支持TPC的未分化狀態(tài)及自我更新，(3)TPC含量及致腫瘤性在EphA2^[High]hGBM細(xì)胞中較EphA2^[Low]hGBM細(xì)胞為高。雖有以上提出的所觀察事實，EphA2^[Low]hGBM仍具有明顯的腫瘤引發(fā)能力。即使在hGBM中，EphA2是否可代表一真實的TPC標(biāo)志仍有爭論，更不用說在不同腫瘤或不同類型的細(xì)胞中。換言之，本領(lǐng)域技術(shù)人員將不會認(rèn)識到EphA2為一對TPC具特異性且通用的標(biāo)志，更談不上一對多能性干細(xì)胞具特異性且通用的標(biāo)志。相同團(tuán)隊還提出專利申請主張使用EphA2作為用于識別與分離干細(xì)胞(優(yōu)選地為哺乳類干細(xì)胞，更佳地為人類或小鼠干細(xì)胞)的細(xì)胞表面標(biāo)志[37,EP 2733206A1]。然而，由于Vescovi的研究完全并僅專注于人類神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(hGBM)，以及EphA2^[Low]hGBM仍具有顯著腫瘤引發(fā)能力的事實，本領(lǐng)域技術(shù)人員將無法認(rèn)識到EphA2作為識別多能性干細(xì)胞的特異性標(biāo)志。此外，Vescovi也未提及如何在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中區(qū)別多能性干細(xì)胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為非預(yù)期性地發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可基于其特異性表面標(biāo)志EphA2的表達(dá)量在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中被區(qū)別出來。

因此，在一方面，本發(fā)明提供一種在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中區(qū)別MSC的方法，其包含通過一EphA2表面標(biāo)志分選細(xì)胞。

另一方面，本發(fā)明提供一種在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中提高M(jìn)SC群體純度的方法，其包含通過一EphA2表面標(biāo)志分選細(xì)胞。

又一方面，本發(fā)明提供一種分離在發(fā)炎環(huán)境中較具反應(yīng)性的MSC群體的方法，該方法包含通過一EphA2表面標(biāo)志分選細(xì)胞。

本發(fā)明的方法可用于區(qū)別MSC與選自纖維母細(xì)胞、胎盤源上皮細(xì)胞、胎盤源網(wǎng)狀細(xì)胞及其組合的細(xì)胞群體。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，該方法用于區(qū)別MSC與纖維母細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，胎盤相關(guān)組織可選自羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶。

根據(jù)本發(fā)明，分選步驟可使用本領(lǐng)域已知或待開發(fā)的技術(shù)進(jìn)行，例如一基于抗體或一基于核苷酸分離的方法。

在本發(fā)明的部分實施例中，源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞培養(yǎng)于一用于MSC的培養(yǎng)基。

根據(jù)部分實施例，經(jīng)分離的MSC群體對TNF-α信號傳遞或TNF-α-依賴的信號傳遞較具反應(yīng)性。

應(yīng)了解先前的一般描述及以下的詳述兩者都僅為示例性及解釋性且并不限制本發(fā)明。

附圖說明

本發(fā)明先前的概述以及以下詳述在配合隨附圖式閱讀時得以更佳地被了解。為說明本發(fā)明，在圖式中顯示目前優(yōu)選的實施例。

在所述圖式中：

圖1顯示EphA2轉(zhuǎn)錄物的即時聚合酶連鎖反應(yīng)定量。在胎盤源MSC中EphA2的轉(zhuǎn)錄物量是通過與纖維母細(xì)胞中EphA2的表達(dá)相比較的富集倍數(shù)來評估，即通過將MSC中的EphA2mRNA量相對于纖維母細(xì)胞中的EphA2量作比較(MSC/纖維母細(xì)胞)。MSC中EphA2的轉(zhuǎn)錄物量可見于來自捐贈者#12、#17、#21及#28的樣本。結(jié)果顯示在體外，相比于纖維母細(xì)胞，EphA2是高度富集于MSC中。D＝捐贈者。AM＝羊膜；CD＝絨毛膜盤；CM＝絨毛膜；及UC＝臍帶。BS＝胎牛血清。P1＝第一代。P3＝第三代。

圖2顯示MSC及纖維母細(xì)胞的混合群體的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析的結(jié)果。源自捐贈者#23的臍帶(UC)的MSC以不同比例與纖維母細(xì)胞混合。結(jié)果顯示由流動式細(xì)胞測量術(shù)偵測到的EphA2⁺群體的百分比相應(yīng)于增加的纖維母細(xì)胞群體而成比例減少。FB＝纖維母細(xì)胞。

圖3顯示通過qPCR評估的EphA2RNA量。不同個別細(xì)胞群體中的總RNA表達(dá)量通過內(nèi)生GAPDH表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?！半S意序列(Scramble)”表示shRNA剔除實驗中隨意序列的對照組。通過與正常野生型UC源MSC中的EphA2轉(zhuǎn)錄物表達(dá)量比較，qRT-PCR結(jié)果確認(rèn)了sh-EphA2的剔除效率。D＝捐贈者。UC＝臍帶。

圖4A及圖4B顯示跨室(trans-well)遷移測定及細(xì)胞存活率偵測的結(jié)果。在圖4A中，活遷移細(xì)胞由發(fā)光信號強(qiáng)度呈現(xiàn)。在圖4B中，活遷移細(xì)胞由與在0.2％FBS中野生型MSC對照組相比較的相對比例呈現(xiàn)。

具體實施方式

本發(fā)明基于經(jīng)由表面標(biāo)志EphA2的細(xì)胞分選，可在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中區(qū)別間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)此未預(yù)期的發(fā)現(xiàn)。

一方面，本發(fā)明提供一種在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中區(qū)別MSC的方法，其包含通過一EphA2表面標(biāo)志分選細(xì)胞。

另一方面，本發(fā)明特色為一種在源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中提高M(jìn)SC群體純度的方法，其包含通過一EphA2表面標(biāo)志分選細(xì)胞。

還證實經(jīng)EphA2分選的MSC相比于未分選的MSC或類MSC細(xì)胞在發(fā)炎環(huán)境中展現(xiàn)卓越反應(yīng)性。因此，在又一方面，本發(fā)明提供一種分離在發(fā)炎環(huán)境中較具反應(yīng)性的MSC群體的方法，其包含通過一EphA2表面標(biāo)志分選細(xì)胞。在本發(fā)明的一具體實施例中，經(jīng)分離的MSC群體對TNF-α信號傳遞或TNF-α依賴的信號傳遞較具反應(yīng)性。

MSC具有經(jīng)各種細(xì)胞激素活化后抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞反應(yīng)的免疫抑制功能。其還可經(jīng)TNF-α與IFN-γ的作用誘導(dǎo)以在急性發(fā)炎環(huán)境的存在下發(fā)揮促發(fā)炎效應(yīng)。在發(fā)炎關(guān)節(jié)疾病(例如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)中，骨髓中的MSC通過TNF-α依賴的機(jī)制遷移至關(guān)節(jié)并可能對疾病進(jìn)程負(fù)部分責(zé)任。MSC還被證實在骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)周圍組織中數(shù)量增加，其可能反映關(guān)節(jié)修復(fù)或再生的企圖[6]。已提出在發(fā)炎環(huán)境中釋放的TNF-α通過結(jié)合至MSC的TNF-R1并活化MSC中的NF-κB路徑而賦予MSC免疫抑制性質(zhì)，從而使MSC可發(fā)揮免疫調(diào)控中的角色[62]。

根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞根據(jù)本領(lǐng)域中已知的實驗操作程序，例如，F(xiàn)ukuchi等人，新鮮地得自、獲得自或收集自胎盤相關(guān)組織的實驗操作程序。在部分優(yōu)選具體實施例中，源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞接著培養(yǎng)于一用于MSC的培養(yǎng)基。用于MSC的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基包含伊格爾氏最低必須培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium Eagle)(具不同修改版本)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)及堿性纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF)[49,64-68]。

根據(jù)本發(fā)明，該方法可用于區(qū)別MSC與選自纖維母細(xì)胞、胎盤源上皮細(xì)胞、胎盤源網(wǎng)狀細(xì)胞及其組合的細(xì)胞群體。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于自源于胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)中的纖維母細(xì)胞中區(qū)別MSC。

胎盤相關(guān)組織可選自羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶。

在本發(fā)明方法的實行中，使一源自胎盤相關(guān)組織的細(xì)胞的初代培養(yǎng)的培養(yǎng)物接受EphA2的細(xì)胞分選。該細(xì)胞分選可經(jīng)由本領(lǐng)域已知或待開發(fā)的技術(shù)進(jìn)行，例如：一基于抗體或一基于核苷酸的分離方法。優(yōu)選地，該細(xì)胞分選通過一基于抗體的磁性細(xì)胞分選進(jìn)行。例如，MACS法Technology,Miltenyi Biotec)。此外，該細(xì)胞分選可經(jīng)由一流式細(xì)胞分析方法進(jìn)行，例如：一基于抗體或一基于核苷酸的流式細(xì)胞分析。

如本文所用，術(shù)語“較具反應(yīng)性(more responsive)”意指回應(yīng)于發(fā)炎相關(guān)信號傳遞路徑的MSC細(xì)胞的行為(例如：活動性)，該信號傳遞路徑包括但不限于一TNF-α信號傳遞或一TNF-α-依賴的信號傳遞。

本發(fā)明通過以下實例進(jìn)一步說明，其提供作為示例的用而非限制本發(fā)明。

實例

實例1：胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及纖維母細(xì)胞的免疫表型特性分析

在獲得捐贈者簽署的受試者同意書后，收集足月胎盤(n＝8)。MSC得自羊膜(AM)、絨毛膜盤(CD)、絨毛膜(CM)及臍帶(UC)。得自胎盤的細(xì)胞在37℃、飽和濕度及5％CO₂下經(jīng)培養(yǎng)、擴(kuò)增并保存在具有FBS及bFGF的α-MEM中，且當(dāng)細(xì)胞達(dá)80％滿度時繼代培養(yǎng)所述細(xì)胞，接著以流動式細(xì)胞測量術(shù)分析其表型特征。在接受流式細(xì)胞分析的免疫染色過程中，細(xì)胞依照廠商指示與抗體共同培養(yǎng)。對應(yīng)類別的非特異性IgG用作陰性對照組。細(xì)胞懸浮液經(jīng)流式細(xì)胞分析儀(BD Biosciences FACSCanto II)和Flowjo 7.6.1軟件分析。

我們評估CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR及EphA2的表達(dá)。所有分離自胎盤各個位置的MSC的流動式細(xì)胞測量術(shù)的分析結(jié)果為CD73、CD90、CD105、EphA2呈陽性，且CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性。纖維母細(xì)胞(人類包皮纖維母細(xì)胞，新生兒，PC501A-HFF，SBI)的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析CD73、CD90、CD105呈陽性，對CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性，且EphA2呈陰性或低表達(dá)。胎盤源MSC與纖維母細(xì)胞之間的EphA2被注意到具有不同模式：MSC顯示高百分比的EphA2陽性細(xì)胞，而纖維母細(xì)胞則顯示為相反。結(jié)果顯示于下表1。

表1：胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞與纖維母細(xì)胞的免疫表型分析(在流動式細(xì)胞測量術(shù)中陽性細(xì)胞的百分比)

AM＝羊膜；CD＝絨毛膜盤；CM＝絨毛膜；及UC＝臍帶。陰性混合液包括抗CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR的抗體(人類MSC分析套組，BD Stemflow^TM，目錄編號562245)。胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型可見于捐贈者#12與捐贈者#17于P0的樣本。流動式細(xì)胞測量術(shù)分析顯示MSC群體在P0為99.3～99.7％CD73陽性，77.8～99.8％CD90陽性，75.9～98.0％CD 105陽性及45.0～80.7％EphA2陽性。相對地，造血細(xì)胞系特異性標(biāo)志(諸如：CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR)未表達(dá)在MSC中。纖維母細(xì)胞的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析顯示該群體是99.3％CD73陽性，97.7％CD90陽性，75.6％CD105陽性，及18.6％EphA2陽性；造血細(xì)胞系特異性標(biāo)志(諸如：CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR)未表達(dá)在纖維母細(xì)胞中。

實例2：以EphA2分選的胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的免疫表型特性分析

a.通過磁性活化細(xì)胞分選(magnetic-activated cell sorting,MACS)分選的EphA2-富集的MSC的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析

MACS方法Technology,Miltenyi Biotec)允許細(xì)胞通過與涂布有抗EphA2表面抗原的抗體的磁性奈米粒子培育來分離。源自胎盤的MSC的初代培養(yǎng)是根據(jù)廠商指示與抗EphA2的熒光接合抗體培育并以R-藻紅蛋白(PE)磁性粒子分選。流動式細(xì)胞測量術(shù)分析顯示MACS分選的P0MSC細(xì)胞群體為均質(zhì)的：在于其100％CD73陽性、97.2～99.5％CD90陽性、96.0～99.9％CD 105陽性以及96.6～100％EphA2陽性的表達(dá)上(參見下表2)，證實經(jīng)由抗體接合磁珠的EphA2分選可大幅地提升MSC在P0的純度。富集的EphA2-陽性MSC群體可在體外擴(kuò)增中良好地維持于其后的繼代(參見下表3)。

表2：P0的EphA2-分選胎盤源MSC的免疫表型特性分析

EphA2-分選MSC的免疫表型特性分析可見于捐贈者#17的P0的絨毛膜盤(CD)的MSC。結(jié)果顯示EphA2-陽性細(xì)胞也為CD73陽性、CD90陽性及CD105陽性。D＝捐贈者。P＝代數(shù)。

表3：在體外擴(kuò)增期間的EphA2-MACS-富集群體的免疫表型特性分析(流動式細(xì)胞測量術(shù)的陽性細(xì)胞百分比)

在之后擴(kuò)增的EphA2-分選MSC的免疫表型特性分析。免疫表型可見于源自捐贈者#17的絨毛膜盤(CD)的MSC。MSC于P0通過EphA2-抗體接合磁珠分選，且在體外擴(kuò)增期間在其后的繼代中于經(jīng)優(yōu)化的MSC培養(yǎng)條件中保存。結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)志EphA2的表達(dá)在經(jīng)優(yōu)化MSC培養(yǎng)條件下可于其后的繼代中良好地保持。

b.通過流動式細(xì)胞法細(xì)胞分選器(Flow Cytometry Cell Sorter,FCCS)分選EphA2-富集的MSC的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析

收集源自胎盤的細(xì)胞并在P0經(jīng)由JAZZ細(xì)胞分選器(BD,USA)以抗EphA2抗體分選。EphA2-分選的MSC的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析顯示第2～6代的細(xì)胞群體為99.5～100％CD73&CD90雙陽性，99.6～100％CD105&CD90雙陽性，99.5～100％EphA2&CD90雙陽性，99.8～100％CD73&EphA2雙陽性，99.5～100％CD105&EphA2雙陽性，及99.7～100％CD73&CD105雙陽性(參見下表4)。數(shù)據(jù)顯示EphA2蛋白在MSC培養(yǎng)的其后繼代中可持續(xù)地表達(dá)并保持。

表4：在體外擴(kuò)增期間的EphA2-FCCS-富集群體的免疫表型特性分析

在之后擴(kuò)增中的EphA2-富集的MSC的免疫表型特性分析。免疫表型可見于源自捐贈者#7的臍帶(UC)的MSC。MSC于P0經(jīng)由細(xì)胞分選器通過抗EphA2抗體分選，且在體外擴(kuò)增期間在之后的繼代中保存于經(jīng)優(yōu)化的MSC培養(yǎng)條件中。細(xì)胞表面標(biāo)志EphA2的表達(dá)可在其后的繼代中良好地保持。

實例3：胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及纖維母細(xì)胞中的EphA2轉(zhuǎn)錄物的即時定量PCR評估

來自胎盤源細(xì)胞(n＝8，包括第1代及第3代，來自胎盤的AM、CD、CM、UC，4個不同部份)及人類包皮纖維母細(xì)胞(新生兒，PC501A-HFF，SBI)的64個群體的總RNA使用Direct-zol少量試劑套組(Direct-zol miniprep Kit；Zymo Research Corporation,CA,USA)分離?；パa(bǔ)DNA(cDNA)是以轉(zhuǎn)錄因子第一股cDNA合成套組(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit；Roche,Basel,Switzerland)合成。接著，以LightCycler480II(Roche,Basel,Switzerland)使用Roche Universal ProbeLibrary System根據(jù)廠商指示進(jìn)行定量RT-PCR。

我們通過即時定量PCR評估EphA2的表達(dá)，以比較胎盤源多能性MSC及纖維母細(xì)胞?；虮磉_(dá)在不同細(xì)胞群體的內(nèi)以內(nèi)生基因甘油醛-3-磷酸酯去氫酶的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。EphA2轉(zhuǎn)錄物在MSC中的表達(dá)以與EphA2在纖維母細(xì)胞中的表達(dá)相比較的富集倍數(shù)計算。結(jié)果顯示相比于纖維母細(xì)胞，EphA2在MSC中高度表達(dá)(圖1)。

實例4：MSC與纖維母細(xì)胞的混合群體的流動式細(xì)胞測量術(shù)分析

為證明EphA2可作為分離胎盤源MSC與纖維母細(xì)胞的生物標(biāo)志，源自捐贈者#23的臍帶(UC)的MSC與纖維母細(xì)胞在微量離心管(Eppendorf tube)中通過以下比例混合(MSC：纖維母細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)表示)：2x10⁵:0、2x10⁵:2x10⁴、2x10⁵:4x10⁴、2x10⁵:2x10⁵、2x10⁵:1x10⁶、2x10⁵:2x10⁶及0:2x10⁵。接著通過流動式細(xì)胞測量術(shù)分析每一微量離心管中的EphA2⁺群體。結(jié)果顯示于圖2中，其顯示經(jīng)由流動式細(xì)胞測量術(shù)以抗EphA2抗體偵測到的EphA2⁺群體的百分比相應(yīng)于增加的纖維母細(xì)胞群體而成比例減少。

實例5：通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)剔除EphA2

為評估EphA2在分離的MSC群體中的功能，進(jìn)行通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的shRNA(shEphA2)剔除實驗。每一構(gòu)筑體具有一EGFP報導(dǎo)基因以監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。測試四個不同的shRNA序列，每一者具有三個不同的感染倍數(shù)(Multiplicity Of Infection,MOI)(2,5,10)，且每一實驗條件進(jìn)行三重復(fù)。剔除效率是以qRT-PCR評估。結(jié)果顯示于圖3中。可達(dá)到50％剔除的最佳剔除效率。

實例6：

在此研究中，我們研究MSC中的EphA2于體外在回應(yīng)諸如TNF-α信號的發(fā)炎刺激的角色。我們著重于EphA2涉及在發(fā)炎期間MSC的遷移的作用[51,63]。檢驗EphA2^high MSC與EphA2^low MSC在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下或在TNF-α發(fā)炎刺激存在下的活動性。

a.EphA2-剔除MSC的跨室遷移分析

在8μm跨越孔室(trans-well)中30,000個細(xì)胞的條件下培養(yǎng)野生型、由sh-隨意序列及由sh-EphA2標(biāo)靶的MSC。在下室中添加0.2％FBS及TNF-α以促動MSC的遷移。六小時后，根據(jù)廠商指示通過發(fā)光試劑偵測活遷移細(xì)胞。結(jié)果顯示于圖4A及4B。數(shù)據(jù)顯示EphA2的剔除損害TNF-α信號回應(yīng)能力與sh-EphA2MSC遷移能力。

b.EphA2^high MSC的跨室遷移分析

源自胎盤的細(xì)胞的初代培養(yǎng)是與由抗EphA2的抗人類抗體共軛的磁珠培育，且之后根據(jù)廠商指示以陽性選擇分選。流動式細(xì)胞測量術(shù)分析確認(rèn)在MACS分選后的EphA2⁺MSC及EphA2^-細(xì)胞群體。細(xì)胞是以于8μm跨越孔室(trans-well)中30,000個細(xì)胞的條件培養(yǎng)。在下室中添加0.2％FBS及TNF-α以活化MSC遷移。在六小時后，根據(jù)廠商手冊經(jīng)由發(fā)光試劑偵測活遷移細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示TNF-α信號回應(yīng)能力及MSC的遷移在EphA2-富集的群體中是增強(qiáng)的。

如在圖4A及4B中所示，MSC的遷移明顯受到于基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加TNF-α的影響。在以TNF-α刺激MSC后，以發(fā)光試劑偵測的MSC的遷移以TNF-α-劑量相依的方式增加(參見圖4A)。相對地，EphA2-剔除的MSC群體或經(jīng)分選的EphA2^-細(xì)胞則失去細(xì)胞活動性。當(dāng)將發(fā)光信號轉(zhuǎn)換成相對于在0.2％FBS中遷移野生型MSC對照組的遷移細(xì)胞群體時(以倍數(shù)變化表示)，EphA2分子在回應(yīng)TNF-α信號的MSC遷移中的作用更為明顯(參見圖4B)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解可對上述的實施例進(jìn)行改變而不背離其廣泛的發(fā)明概念。因此，應(yīng)了解本發(fā)明不受限于所揭示的特定實施例，而是意欲涵蓋在如隨附申請專利范圍所定義的本發(fā)明的精神與范疇內(nèi)的修改。

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