發(fā)明領域本發(fā)明大體上涉及靶向至少兩種不同的細菌毒力因子的多特異性結合分子。具體說來，該結合分子包含至少兩個特異性結合于不同葡萄球菌蛋白的結合結構域(即，該分子至少為雙特異性的)。第一結合結構域優(yōu)選地為抗體或其片段，能夠結合于糖基化葡萄球菌表面蛋白，優(yōu)選地糖基化含絲氨酸-天冬氨酸二肽重復序列(SDR)蛋白。第二結合結構域優(yōu)選地為替代骨架，能夠結合于葡萄球菌白細胞毒素，優(yōu)選地LukAB、LukD或LukE。這些多特異性結合化合物具有針對葡萄球菌的殺滅活性，并且因此可用于預防、治療和/或改善金黃色葡萄球菌感染，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染。背景由葡萄球菌細菌引起的細菌感染(即，“葡萄球菌感染”)在一般人群中非常普通。約25％的個體通常在其皮膚上或在其鼻子中攜帶葡萄球菌細菌。這些細菌多半時間不會在相對輕微的皮膚感染中造成問題或后果。然而，如果細菌更深地侵入個體的身體中，例如進入血流、關節(jié)、骨、肺或心臟中，那么葡萄球菌感染可變得致命。過去，致命葡萄球菌感染可能已經(jīng)在住院或具有慢性疾病或虛弱免疫系統(tǒng)的人體內出現(xiàn)?，F(xiàn)在，日益常見在其它方面健康的個體發(fā)展危急生命的葡萄球菌感染。重要的是，許多葡萄球菌感染不再對常見抗生素起反應。金黃色葡萄球菌(通常稱作“葡萄球菌(staph)”、金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)”或“金黃色葡萄球菌(S.aureus)”)為主要的人類病原體，產生多種毒力因子，從而使其能夠引起數(shù)種類型的感染，從淺表病變至中毒病和危急生命的全身性病狀，如心內膜炎、骨髓炎、肺炎、腦膜炎和敗血癥(在Miller和Cho,“ImmunityAgainstStaphylococcusaureusCutaneousInfections,”Nat.Rev.Immunol.11:505-518(2011)中回顧)。盡管大多數(shù)個體在出生后不久遭遇金黃色葡萄球菌(Holtfreter等人,“TowardstheImmuneProteomeofStaphylococcusaureus-TheAnti-S.aureusAntibodyResponse,”Int.J.Med.Microbiol.300:176-192(2010))并且具有針對金黃色葡萄球菌的抗體和增加感染后的抗金黃色葡萄球菌效價的能力，但這些抗體通常并未具保護性以免于復發(fā)性金黃色葡萄球菌感染(FosterTJ,“ImmuneEvasionbyStaphylococci,”Nat.Rev.Microbiol.3:948-958(2005))。僅在美國，每年有超過20,000的死亡人數(shù)歸因于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，超過由流感、病毒性肝炎和HIV/AIDS引起的死亡(Foster,TJ.,“ImmuneEvasionbyStaphylococci,”Nat.Rev.Microbiol.3:948-958(2005)；Klevens等人,“TheImpactofAntimicrobial-Resistant,HealthCare-AssociatedInfectionsonMortalityintheUnitedStates,”Clin.Infect.Dis.47:927-930(2008))。病原體產生多種可能促進人類宿主中或人類宿主上的存活的分子。雙組分、成孔白細胞毒素在由金黃色葡萄球菌產生的分泌毒力因子當中。這些毒素可分泌為寡聚的水溶性單體，并且接著將孔插入質膜中，該質膜隨后破壞細胞滲透平衡和膜電位，從而導致靶向細胞的死亡，最為顯著的是多形核白細胞(PMN)和單核吞噬細胞(Bischogberger等人,“PathogenicPore-FormingProteins:FunctionandHostResponse,”CellHostMicrobe12(3):266-275(2012)，其以引用的方式整體并入本文)。在白細胞毒素ED(LukED)的情況下，宿主吞噬細胞的靶向、結合和殺滅經(jīng)由位于吞噬細胞表面上的細胞靶標CCR5、CXCR1和CXCR2發(fā)生(AlonzoIII等人,“StaphylococcusaureusLeucocidinEDContributestoSystemicInfectionbyTargetingNeutrophilsandPromotingBacterialGrowthInVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；AlonzoIII等人“CCR5isaReceptorforStaphylococcusaureusLeukotoxinED,”Nature493(7430)51-55(2012)；和Reyes-Robles等人,“StaphylococcusaureusLeukotoxinEDTargetstheChemokineReceptorsCXCR1andCXCR2toKillLeukocytesandPromoteInfection,”CellHost&Microbe14:453-459(2013))。實際上，當LukED的細胞靶標CCR5不存在于宿主免疫細胞上時，宿主動物對其它情況下致命的金黃色葡萄球菌感染具抗性(AlonzoIII等人“CCR5isaReceptorforStaphylococcusaureusLeukotoxinED,”Nature493(7430):51-55(2012))。白細胞毒素AB(LukAB)也可殺滅宿主吞噬細胞，并且其溶細胞活性可在微生物被吞噬至宿主細胞中之后從細胞的外部和從細胞的內部發(fā)揮(Dumont等人,“StaphylococcusaureusLukABCytotoxinKillsHumanNeutrophilsbyTargetingtheCD11bSubunitoftheIntegrinMac-1,”PNAS110(26):10794-10799(2013))。由于這些白細胞毒素均致病的作用，其已經(jīng)被視為關鍵金黃色葡萄球菌毒力因子(AlonzoIII和Torres,“BacterialSurvivalAmidstanImmuneOnslaught:TheContributionoftheStaphylococcusaureusLeukotoxins,”PLOSPath9(2):e1003143(2013))。針對金黃色葡萄球菌的致病成功的另一關鍵因子取決于其表面蛋白的特性(Clarke等人,“SurfaceAdhesinsofStaphylococcusaureus,”Adv.Microb.Physiol.51:187-224(2006)；Patti等人,“MSCRAMM-MediatedAdherenceofMicroorganismstoHostTissues,”Annu.Rev.Microbiol.48:585-617(1994)；和Patti等人,“MicrobialAdhesinsRecognizingExtracellularMatrixMacromolecules,”Curr.Opin.CellBiol.6:752-758(1994))。金黃色葡萄球菌使用識別粘附基質分子的微生物表面組分(MSCRAMM)以便粘附于并且定殖宿主組織。MSCRAMM可識別膠原蛋白、肝素相關多糖、纖維蛋白原和/或纖連蛋白。金黃色葡萄球菌表達MSCRAMM的子集，該子集均含有絲氨酸-天冬氨酸二肽重復序列(SDR)結構域，包括凝集因子A(ClfA)、凝集因子B(ClfB)、SdrC、SdrD和SdrE(Becherelli等人“ProtectiveActivityoftheCnaBE3DomainConservedAmongStaphylococcusaureusSdrProteins,”PLoSOne8(9):e74718(2013))。表皮葡萄球菌也表達這一家族的三個成員SdrF、SdrG和SdrH(McCrea等人,“TheSerine-AspartateRepeat(Sdr)ProteinFamilyinStaphylococcusEpidermidis,”Microbiology146:1535-1546(2000))。所有這些蛋白共享相繼包含N端配體結合A結構域、SDR結構域的類似結構，該SDR結構域可含有25-275個之間的絲氨酸-天冬氨酸二肽重復序列。這些蛋白的C端部分含有LPXTG-基序，其促進細胞壁由轉肽酶分選酶A錨定。含SDR蛋白中的絲氨酸-天冬氨酸二肽區(qū)通過依序添加聚糖由兩種糖基轉移酶修飾。首先，SdgB附接所述絲氨酸-天冬氨酸二肽區(qū)內的絲氨酸殘基上的N-乙?；咸前?GlcNAc)，隨后對糖蛋白進行SdgA修飾，產生二糖部分。這種糖基化可保護含SDR葡萄球菌蛋白免于組織蛋白酶G介導的降解(Hazenbos等人,“NovelStaphylococcalGlycosyltransferasesSdgAandSdgBMediateImmunogenicityandProtectionofVirulence-AssociatedCellWallProteins,”PLoSPathog9(10):e1003653(2013))。另外，也位于金黃色葡萄球菌表面上的蛋白A通過捕捉宿主IgG的Fc結構域以及IgG和IgM的VH3家族的Fab結構域而有助于葡萄球菌逃避保護性免疫反應(Sjodahl等人,“RepetitiveSequencesinProteinAfromStaphylococcusaureus.ArrangementofFiveRegionsWithintheProtein,FourBeingHighlyHomologousandFc-Binding,”Eur.J.Biochem.73:343-351(1997)；和Cary等人,“TheMurineClanV(H)IIIRelated7183,J606andS107andDNA4FamiliesCommonlyEncodeforBindingtoaBacterialBcellSuperantigen,”Mol.Immunol.36:769-776(1999))。另外，金黃色葡萄球菌表達稱作免疫球蛋白的第二結合蛋白(Sbi)的第二免疫球蛋白結合蛋白(Zhang等人,“ASecondIgG-BindingProteininStaphylococcusaureus,”Microbiology144:985-991(1998)和Atkins等人,“S.aureusIgG-bindingProteinsSpAandSbi:HostSpecificityandmechanismsofImmuneComplexFormation,”Mol.Immunol.45:1600-1611(2008))，該蛋白由細胞外被膜分泌或與細胞外被膜締合(Smith等人,“TheSbiProteinisaMultifunctionalImmuneEvasionFactorofStaphylococcusaureus”Infection&Immunity79:3801-3809(2011)和Smith等人,“TheImmuneEvasionProteinSbiofStaphylococcusaureusOccursbothExtracellularlyandAnchoredtotheCellEnvelopebyBindingtoLipotechoicAcid”Mol.Microbiol.83:789-804(2012))并且與參與結合于IgG蛋白的Fc區(qū)的蛋白A共享一對保守螺旋(Atkins等人,“S.aureusIgG-bindingProteinsSpAandSbi:HostSpecificityandmechanismsofImmuneComplexFormation,”Mol.Immunol.45:1600-1611(2008))。此外，金黃色葡萄球菌分泌多種已經(jīng)牽涉于免疫逃避中的蛋白酶。Rooijakkers等人證明了葡萄球菌激酶(血纖維蛋白溶酶原激活蛋白)的金黃色葡萄球菌分泌導致血纖維蛋白溶酶的激活，血纖維蛋白溶酶裂解表面結合的IgG和補體C3b，最終減少免疫介導的金黃色葡萄球菌破壞(Rooijakkers等人,“Anti-OpsonicPropertiesofStaphylokinase,”MicrobesandInfection7:476-484(2005))。金黃色葡萄球菌還分泌絲氨酸蛋白酶谷氨酰內肽酶V8(GluV8)，其可直接裂解E233與L234之間的下部鉸鏈區(qū)中的人類IgG1(EU編號(Edelman等人,“TheCovalentStructureofanEntireGammaGImmunoglobulinMolecule,”PNAS63:78-85(1969)，Brezski等人,“HumanAnti-IgG1HingeAutoantibodiesReconstitutetheEffectorFunctionsofProteolyticallyInactivatedIgGs,”J.Immunol.181:3183-3192(2008))。最近還證明了人類抗金黃色葡萄球菌IgG在結合于金黃色葡萄球菌的表面時快速地裂解(FernandezFalcon等人,“ProteaseInhibitorsDecreaseIgGSheddingFromStaphylococcusaureus,IncreasingComplementActivationandPhagocytosisEfficiency,”J.Med.Microbiol.60:1415-1422(2011))?？傊?，這些研究指示金黃色葡萄球菌利用了多種機制，這些機制可能通過直接地裂解mAb、通過蛋白A結合螯合mAb，或通過殺死治療功效所需的特別效應細胞而不利地影響標準的基于IgG1的單克隆抗體(mAb)治療劑。因此，不意外目前不存在已經(jīng)獲得用于人類的最終批準的靶向金黃色葡萄球菌的基于mAb的治療劑。因此，仍需要可治療葡萄球菌感染的方法和組合物，其(i)逃避蛋白A和Sbi結合，(ii)逃避葡萄球菌誘導的蛋白水解，(iii)可中和白細胞毒素和(iv)能夠調理和遞送金黃色葡萄球菌至吞噬細胞。本申請滿足這些和其它需要。概述本公開提供包含至少第一結合結構域和第二結合結構域的多特異性結合分子，這些結合結構域中的每個特異性結合于不同的細菌毒力因子，尤其是不同的葡萄球菌毒力因子。第一和第二結合結構域任選地經(jīng)由連接肽連接。第一結合結構域能夠結合于糖基化葡萄球菌表面蛋白，如葡萄球菌含SDR蛋白。一方面，葡萄球菌含SDR蛋白為ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE、SdrF、SdrG和SdrH。優(yōu)選地，葡萄球菌含SDR蛋白為ClfA、ClfB、SdrC、SdrD或SdrE。一方面，第一結合結構域為全長抗體或抗體片段。優(yōu)選地，全長抗體或抗體片段抵抗由裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶(如在SEQIDNO:60內的殘基222-237(EU編號)之間或殘基處裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶，例如金黃色葡萄球菌V8蛋白酶)引起的蛋白水解降解。另一方面，全長抗體或抗體片段為人類、人類化或嵌合抗體或抗體片段。一方面，結合分子不能特異性結合于人類FcγRI，不能特異性結合于蛋白A，并且不能特異性結合于Sbi。一方面，結合分子能夠特異性結合于FcRn。一方面，第一結合結構域包含具有選自VH區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的組的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變(VH)區(qū)。另一方面，第一結合結構域包含具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區(qū)。或者，第一結合結構域包含(a)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH區(qū)；和(b)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL區(qū)。在一個實施方案中，第一結合結構域包含(1)具有氨基酸序列SEQIDNO:60的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:61的VL區(qū)；(2)具有氨基酸序列SEQIDNO:62的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:63的VL區(qū)；(3)具有氨基酸序列SEQIDNO:64的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:65的VL區(qū)；(4)具有氨基酸序列SEQIDNO:66的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的VL區(qū)；(5)具有氨基酸序列SEQIDNO:68的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:69的VL區(qū)；(6)具有氨基酸序列SEQIDNO:70的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:71的VL區(qū)；(7)具有氨基酸序列SEQIDNO:72的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:73的VL區(qū)；(8)具有氨基酸序列SEQIDNO:74的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:75的VL區(qū)；(9)具有氨基酸序列SEQIDNO:76的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:77的VL區(qū)；或(10)具有氨基酸序列SEQIDNO:78的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:79的VL區(qū)。另一方面，結合分子包含(a)第一結合結構域，其包含(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH區(qū)；和(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL區(qū)；和(b)第二結合結構域，其包含氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者。一方面，第二結合結構域包含氨基酸序列SEQIDNO:14或SEQIDNO:22。第二結合結構域能夠結合于葡萄球菌白細胞毒素。一方面，葡萄球菌白細胞毒素選自由白細胞毒素A(LukA)、白細胞毒素B(LukB)、白細胞毒素AB(LukAB)、白細胞毒素D(LukD)、白細胞毒素E(LukE)、白細胞毒素ED(LukED)、Panton-Valentine殺白細胞素S(LukS-PV)、Panton-Valentine殺白細胞素F(LukF-PV)、Panton-Valentine殺白細胞素(LukSF/PVL)、γ溶血素A(HlgA)、γ溶血素C(HlgC)、γ溶血素B(HlgB)、γ溶血素AB(HlgAB)和γ溶血素BC(HlgBC)組成的組。一方面，葡萄球菌白細胞毒素為LukAB、LukD或LukE。一方面，第二結合結構域為替代骨架。一方面，替代骨架包含纖連蛋白III型(FN3)結構域。一方面，F(xiàn)N3結構域結合于具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA、具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB、具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD或具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE?；蛘?，F(xiàn)N3結構域結合于包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA和具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB的LukAB復合物，和/或包含具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE和具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD的LukED復合物。一方面，結合分子的第二結合結構域與具有氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者的FN3結構域競爭結合于(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA；(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB；(iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD；和/或(iv)具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE。一方面，第二結合結構域為包含選自由SEQIDNO:14-59和SEQIDNO:113-666組成的組的氨基酸序列的FN3結構域。一方面，第二結合結構域為包含氨基酸序列SEQIDNO:14或SEQIDNO:22的FN3結構域。一方面，結合分子進一步包含一個或多個額外結合結構域，其中一個或多個額外結合結構域能夠(i)結合于與第一結合結構域所結合不同的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或(ii)結合于與第二結合結構域所結合不同的葡萄球菌白細胞毒素。本公開還提供編碼上述結合分子的核酸序列以及包含一個或多個核酸序列的載體。另外，本發(fā)明涵蓋包含這些載體的宿主細胞。此外，本公開提供一種用于制造上述結合分子的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)含有包含編碼本發(fā)明結合分子的一個或多個核酸序列的載體的宿主細胞，和(b)從培養(yǎng)物回收所述結合分子。此外，本公開提供一種包含如本文所述的結合分子的藥物組合物。本文所提供的結合分子可用于治療、預防或改善葡萄球菌感染。一方面，葡萄球菌感染有金黃色葡萄球菌引起，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)。相應地，本公開提供一種用于治療、預防或改善葡萄球菌感染的方法，該方法包括(a)向有需要的受試者施用如本文所述的結合分子。這種治療、預防或改善葡萄球菌感染的方法可涉及如本文所述的結合分子的重復施用，或結合分子與一種或多種其它試劑組合施用，所述其它試劑如抗感染劑、抗生素劑和/或抗微生物劑。本文所提供的結合分子也可用于診斷受試者中的葡萄球菌感染的方法中。一方面，用于診斷葡萄球菌感染的方法涉及使如本文所述的結合分子與來自受試者的樣品接觸和基于接觸檢測所述樣品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的存在或不存在。這種方法進一步涉及基于所述樣品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或所述葡萄球菌白細胞毒素的檢測診斷受試者中的葡萄球菌感染。類似方法可用于檢測樣品中的葡萄球菌。具體說來，用于檢測樣品中的葡萄球菌的方法涉及使如本文所述的結合分子與樣品接觸，和基于接觸檢測樣品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的存在或不存在，由此糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的存在指示樣品中葡萄球菌的存在。此外，本發(fā)明的結合分子可用于預防葡萄球菌感染。一方面，所述用于預防葡萄球菌感染的方法涉及使本文所述的結合分子與來自受試者的樣品接觸，和由于接觸檢測樣品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素。方法進一步涉及基于所述樣品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的檢測向受試者中施用適用于預防葡萄球菌感染的試劑。本公開還涵蓋一種包含如本文所提供的結合分子的試劑盒，和一種包含編碼所提供的結合分子的核酸分子、包含編碼所提供的結合分子的核酸分子的載體和/或含有載體的宿主細胞的試劑盒。附圖簡述圖1A和1B顯示抗LukDFN3結構域的表征。LukED(75nM)在與hPMN混合之前與遞增濃度的所指示的FN3結構域混合持續(xù)30分鐘。使細胞中毒持續(xù)1h。由至少三個獨立的供血者產生數(shù)據(jù)，并且誤差棒表示平均值±SEM。圖1A顯示由CellTiter測量(細胞代謝)獲得的數(shù)據(jù)。圖1B顯示由LDH測量值(膜損傷)獲得。圖2A和2B顯示抗LukABFN3結構域的表征。LukAB(18.8nM)在與hPMN混合之前與遞增濃度的所指示的FN3結構域混合持續(xù)30分鐘。使細胞中毒持續(xù)1h。由至少三個獨立的供血者產生數(shù)據(jù)，并且誤差棒表示平均值±SEM。圖2A顯示由溴化乙錠滲透性分析(EtBr)(成孔/膜滲透性)獲得的數(shù)據(jù)。圖2B顯示由LDH測量值(膜損傷)獲得的數(shù)據(jù)。圖3顯示抗LukEFN3結構域的表征。LukED(75nM)在與hPMN混合之前與遞增濃度的所指示的FN3結構域混合持續(xù)30分鐘。使細胞中毒持續(xù)1h。由LDH測量值(膜損傷)獲得數(shù)據(jù)。由至少三個獨立的供血者產生數(shù)據(jù)，并且誤差棒表示平均值±SEM。圖4A至圖4F描繪含有靶向結合于白細胞毒素中和結構域的Staph抗原的抗體可變區(qū)的示例性多特異性結合蛋白。圖4A顯示含有單特異性、二價抗StaphmAb可變結構域和重鏈C端結合LukAB、LukD或LukE中和結構域的示例性多特異性結合蛋白。圖4B說明含有單特異性、二價抗StaphmAb可變結構域和輕鏈C端結合LukAB、LukD或LukE中和結構域的示例性多特異性結合蛋白。圖4C顯示含有單特異性、二價抗StaphmAb可變結構域以及輕鏈C端結合LukAB、LukD或LukE中和結構域和重鏈C端結合LukAB、LukD或LukE中和結構域的示例性多特異性結合蛋白。圖4D顯示含有單特異性、二價抗StaphmAb可變結構域和具有串聯(lián)C端結合LukAB、LukD或LukE中和結構域的重鏈C端結合LukAB、LukD或LukE中和結構域的示例性多特異性結合蛋白。圖4E顯示含有雙特異性抗StaphmAb可變結構域和重鏈C端結合LukAB中和結構域和重鏈C端結合LukAB中和結構域和重鏈C端結合LukD或LukE中和結構域的示例性多特異性結合蛋白。圖4F說明含有單特異性、二價抗StaphmAb和重鏈C端結合LukAB中和結構域和重鏈C端結合LukD或LukE中和結構域的示例性多特異性結合蛋白。圖5顯示mAb5133識別金黃色葡萄球菌的SdgB-糖基化SDR蛋白。mAb5133不檢測金黃色葡萄球菌的sdgB突變株中的高分子量色帶，如通過來自不同金黃色葡萄球菌株的溶解產物的蛋白質印跡所分析。圖6顯示IgG1的下部鉸鏈區(qū)的突變賦予增加的對GluV8消化的抗性。與含有野生型(wt)人類IgG1下部鉸鏈區(qū)的構建體(IgG1同型對照和構建體3)相比，具有突變型下部鉸鏈區(qū)并且在重鏈的C端上不具有或具有FN3結構域的PRASA構建體(分別為構建體4和構建體6)抵抗由金黃色葡萄球菌蛋白酶GluV8引起的蛋白水解。圖7A至圖7D顯示FN3結構域的添加不會影響結合于人類FcγR的PRASA變體。使用競爭分析以便分析抗Staph靶向構建體結合于FcγR的能力。如圖7A的圖形所示，PRASA構建體(構建體4-7)不顯示與FcγRI的可檢測結合。所有構建體(IgG1同型對照和構建體3-7)均顯示類似的與人類FcγRIIa(R131)的結合，如圖7B所示。圖7C的圖形顯示與IgG1和A6構建體(分別為IgG1同型對照和構建體3)相比，PRASA構建體(構建體4-7)具有減少的與人類FcγRIIb的結合。如圖7D的圖形所示，所有構建體(IgG1同型對照和構建體3-7)均顯示類似的與人類FcγRIIIa(V158)的結合。圖8顯示CH3突變H435R/Y436F減少和/或消除蛋白A結合，如使用直接蛋白AELISA分析所確定。PRASAA6變體(構建體4-7)不在基于板的ELISA分析中顯示與蛋白A的可檢測結合，而人類IgG1(IgG1同型對照)結合于蛋白A。圖9顯示mAb-FN3結構域結合的結合物能夠在基于流式細胞術的結合分析中結合于金黃色葡萄球菌(Newman菌株)。圖10A至圖10B顯示mAb-FN3結構域結合物的表征。由至少三個獨立的供血者取得LDH測量值(膜損傷)，并且誤差棒表示平均值±SEM。圖10A的圖形顯示在細胞暴露之前在hPMN暴露于與遞增濃度的所指示的mAb或FN3結構域-mAb結合物混合持續(xù)30分鐘的LukED(75nM)之后，LDH從hPMN釋放。使細胞中毒持續(xù)1h。圖10B的圖形顯示在hPMN暴露于在與hPMN混合之前與遞增濃度的所指示的mAb或mAb-FN3結構域結合物混合持續(xù)30分鐘的LukAB(18.8nM)之后，LDH從hPMN釋放。使細胞中毒持續(xù)1h。圖11顯示StaphLukAB介導的吞噬后細胞毒性可由mAb-FN3結構域結合物中和。原代人類PMN感染先前用不同的mAb5133抗體或不用抗體調理的Staph。調理過的細菌用于在溴化乙錠存在下以MOI10感染hPMN。Staph誘導膜損傷的能力通過歷經(jīng)2h測量溴化乙錠滲透性來評估。由至少三個獨立的供血者產生數(shù)據(jù)，并且誤差棒表示平均值±SEM。圖12顯示具有抗LukABFN3結構域的mAb-FN3結構域融合蛋白中和白細胞毒素LukAB并且促進人類多形核中性粒細胞(PMN)介導的對金黃色葡萄球菌的生長的限制。這些實驗使用具有表達綠色熒光蛋白(gfp)的質粒的金黃色葡萄球菌株Newman的變體。新鮮生長的GFP標記的細菌標準化至1×107CFU/mL并且1mL等分試樣通過離心集結成粒并且再懸浮于300μl在1.5mg/mL下的不同mAb或mAb-FN3融合蛋白或PBS(未調理)中。用RPMI-HH使樣品達到1mL并且接著在37℃下孵育20分鐘以進行調理。調理過的細菌隨后與2×105個新鮮分離的原代hPMN以約10:1(細菌:hPMN)的感染復數(shù)(MOI)混合。細菌和細胞通過在1500RPM下離心7分鐘來同步并且放置于37℃5％CO2孵育器中。感染后5小時測量GFP熒光，其為細菌生長的指標。如圖12所示，這些實驗證明了與IgG1同型對照相比，A6構建體3和PRASAA6構建體4促進hPMN介導的金黃色葡萄球菌生長-限制。這與5133mAb的調理能力一致。重要的是，與PRASAA6親本mAb(構建體4)相比，所述LukABFN3結構域-mAb5133結合物(PRASAA6HC-AB構建體6和PRASAA6LC-DHC-AB構建體7)增強PMN介導的生長限制。缺乏CR5133/抗LukDFN3結構域-mAb(PRASAA6LC-D構建體5)對生長限制的增強與以下先前發(fā)現(xiàn)一致：LukED產生在離體感染模型期間為最少的。圖13顯示具有絲氨酸天冬氨酸重復序列(SDR)元件的重組蛋白(SdrC4)的SdgB介導的糖基化導致產生由mAb5133識別的特異性表位。用由金黃色葡萄球菌株JE2(圖13，面板B，泳道2和6)制備的細胞溶解產物和其它情況下等基因的sdgA突變體衍生物(圖13，面板B，泳道3和7)孵育樹脂結合的SdrC4蛋白導致通過使用mAb5133的蛋白質印跡法檢測特異性約95kDa物質。相比之下，在用由不表達SdgB糖基轉移酶的金黃色葡萄球菌株JE2的sdgB突變體衍生物(圖13，面板B，泳道4和8)制備的溶解產物孵育樹脂結合的SdrC4蛋白之后或在對照PBS樣品(圖13，面板B，泳道1和5)中未由mAb5133檢測到蛋白色帶。圖13面板A顯示對應于圖13B的印跡的凝膠的膠體藍染色，指示基本上等量的重組SdrC4蛋白裝載于泳道1-4和5-8中。圖14A至圖14C為一系列蛋白質印跡，其顯示用純化的重組SdgB糖基轉移酶蛋白使具有絲氨酸天冬氨酸重復序列(SDR)元件的重組蛋白體外糖基化導致產生由mAb5133識別的表位。具有聚組氨酸(His)6親和標簽的重組SDR蛋白(SdrC4和SdrC5)用單獨緩沖液、緩沖液加上尿苷二磷酸N-乙?；咸前?UDP-GlcNac)或緩沖液加上UDP-GlcNac加上金黃色葡萄球菌SdgB糖基轉移酶的重組形式孵育。反應產物通過SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜并且所得蛋白質印跡(i)用呈原發(fā)抗體的mAb5133探測并且使用二次HRP結合的山羊抗人類IgG(H+L)檢測抗體檢測(圖14A、14B和14C的面板A)，或(ii)用對聚組氨酸(His)6親和標簽具特異性的HRP結合的mAb探測(圖14A、14B和14C的面板B)。圖15顯示mAb5133結合SdgB糖基化SdrC4蛋白(圖15，面板A)，但不結合純化的金黃色葡萄球菌LTA(圖15，面板B)。相比之下，帕吉昔單抗(充分表征的抗LTAmAb)結合純化的金黃色葡萄球菌LTA(面板B)，但不結合SdgB糖基化SdrC4蛋白(面板A)。ELISA格式分析使用板固定、重組SdgB糖基化SdrC4蛋白或純化的金黃色葡萄球菌LTA和用于結合任一抗原的原發(fā)抗體mAb5133、帕吉昔單抗或作為陰性對照的對呼吸道合胞病毒F(RSV-F)具特異性的mAb。圖16顯示mAb5133和具有消除鉸鏈區(qū)中GluV8介導的蛋白酶裂解(PRASA)和/或蛋白A結合(A6)的突變的變體保持結合于人類(圖16，面板A)和小鼠(圖16，面板B)FcRn受體。ELISA格式競爭分析使用結合于銅涂布的板上的人類或小鼠FcRn受體的聚組氨酸標記的重組形式，和作為競爭者mAb的靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白(CNTO3929)的人類IgG1抗體。圖17顯示具有消除鉸鏈區(qū)中GluV8介導的蛋白酶裂解(PRASA)和/或蛋白A結合(A6)的突變的mAb-FN3結構域融合蛋白保持結合于人類FcRn受體。ELISA格式競爭分析使用結合于銅涂布的板上的人類FcRn受體的聚組氨酸標記的重組形式，和作為競爭者mAb的靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白(CNTO3929)的人類IgG1抗體。圖18A至圖18B顯示具有消除蛋白A結合(A6)的突變的mAb1533變體不能與金黃色葡萄球菌IgG結合蛋白、蛋白A或Sbi接合。由金黃色葡萄球菌株JE2(用于表達蛋白A和Sbi的野生型)和衍生物NE286(JE2的蛋白A缺乏spa突變體)、NE453(缺乏Sbi蛋白的表達的JE2的sbi突變體)和Wood46(已知缺乏蛋白A的表達的菌株)制備細胞溶解產物，通過SDS-PAGE分離，并且轉移至PVDF膜。所得蛋白質印跡用(i)mAb5133(圖18，面板A)，(ii)具有消除蛋白A結合的A6突變的mAb1533變體(圖18A，面板B)，或(iii)具有A6突變加上消除鉸鏈區(qū)中GluV8介導的蛋白酶裂解(PRASA)的突變的mAb1533變體(圖18B，面板C)探測，其中經(jīng)由二次抗體(山羊抗人類IgG(H+L)進行二次檢測。圖19顯示由代表性FN3結構域蛋白Luk151和Luk129對γ溶血素HlgAB的差異結合和中和。FN3結構域與純化的重組HlgA的結合通過ELISA確定。關于白細胞毒素中和研究，F(xiàn)N3結構域測試物品用純化的重組HlgAB孵育，接著添加新鮮分離的原代人類中性粒細胞并且在37℃下孵育一小時。剩余中性粒細胞的存活力通過測量從具有損傷膜的細胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)來確定。如圖19所示，F(xiàn)N3結構域變體Luk151展現(xiàn)結合于HlgA亞單位，但不中和HlgAB白細胞毒素的溶細胞活性。相比之下，Luk129展現(xiàn)結合于HlgA亞單位并且中和HlgAB白細胞毒素的溶細胞活性，如通過LDH釋放的完全抑制所例示。圖20顯示由代表性FN3結構域蛋白Luk357和Luk188對γ溶血素HlgCB的差異結合和中和。FN3結構域與純化的重組HlgC的結合通過ELISA確定。關于白細胞毒素中和研究，F(xiàn)N3結構域測試物品用純化的重組HlgCB孵育，接著添加新鮮分離的原代人類中性粒細胞并且在37℃下孵育一小時。剩余中性粒細胞的存活力通過測量從具有損傷膜的細胞釋放的LDH來確定。如圖20所示，F(xiàn)N3結構域變體Luk357展現(xiàn)結合于HlgC亞單位，但不中和HlgCB白細胞毒素的溶細胞活性。相比之下，Luk188展現(xiàn)結合于HlgC亞單位并且中和HlgCB白細胞毒素的溶細胞活性，如通過LDH釋放的完全抑制所例示。圖21顯示由代表性FN3結構域蛋白Luk540和Luk647對Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)的差異結合和中和。FN3結構域與純化的重組LukS-PV的結合通過ELISA確定。關于殺白細胞素中和研究，F(xiàn)N3結構域測試物品用純化的重組PVL殺白細胞素孵育，接著添加新鮮分離的原代人類中性粒細胞并且在37℃下孵育一小時。剩余中性粒細胞的存活力通過測量從具有損傷膜的細胞釋放的LDH來確定。如圖21所示，F(xiàn)N3結構域變體Luk540展現(xiàn)結合于PVL白細胞毒素的LukS-PV亞單位，但不中和PVL的溶細胞活性。相比之下，Luk647展現(xiàn)結合于PVL白細胞毒素的LukS-PV亞單位并且中和PVL白細胞毒素的溶細胞活性，如通過LDH釋放的完全抑制所例示。詳述本發(fā)明提供包含能夠結合于糖基化葡萄球菌表面蛋白的第一結合結構域和能夠結合于葡萄球菌白細胞毒素的第二結合結構域的結合分子。相應地，結合分子至少為雙特異性的，因為其能夠特異性地結合于至少兩種不同的葡萄球菌毒力因子。優(yōu)選地，結合分子為人類結合分子。在一個實施方案中，結合分子的第一結合結構域和第二結合結構域包含抗體(或其片段)、替代骨架或其組合(例如結合分子包含抗體(或其片段)和替代骨架，這些結合分子中的每個結合于不同的細菌毒力因子)。還提供制造這些結合分子的方法。優(yōu)選地，這些多特異性結合分子展現(xiàn)針對葡萄球菌的殺菌活性，并且因此可用于預防、治療、檢測、診斷和/或改善葡萄球菌感染，包括MRSA感染和MSSA感染。在詳細地公開本發(fā)明之前，提供以下定義。除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的技術人員通常所理解相同的含義。在本公開的情況下術語“結合分子”指示能夠特異性地結合于兩種或更多種不同抗原或靶標、與該抗原或靶標相互作用或識別該抗原或靶標的任何分子。在這種意義上，本發(fā)明的結合分子至少為“雙特異性的”，如本文所用的該術語是指至少包含能夠結合于一種抗原或靶標的第一結合結構域和能夠結合于另一抗原或靶標的第二結合結構域的分子。具體說來，本發(fā)明的結合分子能夠結合于葡萄球菌白細胞毒素和糖基化葡萄球菌表面蛋白，與葡萄球菌白細胞毒素和糖基化葡萄球菌表面蛋白相互作用和/或識別葡萄球菌白細胞毒素和糖基化葡萄球菌表面蛋白。本發(fā)明的結合分子還包括能夠同時結合兩種或更多種抗原的多特異性結合分子，包括但不限于具有三個結合結構域的三特異性結合分子、具有四個結合結構域的四特異性分子等。多特異性結合分子的各結合結構域能夠結合不同抗原或細菌蛋白，例如不同葡萄球菌抗原或蛋白。根據(jù)本發(fā)明，示例性結合分子為多肽。多肽可包括蛋白部分和非蛋白部分(例如，化學連接子或化學交聯(lián)劑)。術語“結合結構域”關于本公開表征結合分子的結構域，該結構域能夠特異性地結合于靶標分子上的給定靶標表位或給定靶標位點/與靶標分子上的給定靶標表位或給定靶標位點相互作用，靶標分子例如葡萄球菌白細胞毒素(例如LukAB、LukD和/或LukE)和/或糖基化葡萄球菌表面蛋白(例如SdgB糖基化葡萄球菌含SDR蛋白)。結合結構域可源于結合結構域供體，例如抗體、蛋白A、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(Kunitz結構域)、Ras結合蛋白AF-6(PDZ-結構域)、北非蝎毒素(蝎子毒素)、CTLA-4、Min-23(打結素)、脂質運載蛋白(脂籠蛋白)、新制癌菌素、纖連蛋白結構域、錨蛋白共有重復序列結構域或硫氧還蛋白(Skerra,A.,“AlternativeNon-AntibodyScaffoldsforMolecularRecognition,”Curr.Opin.Biotechnol.18:295-304(2005)；Hosse等人,“ANewGenerationofProteinDisplayScaffoldsforMolecularRecognition,”ProteinSci.15:14-27(2006)；Nicaise等人,“AffinitytransferbyCDRgraftingonaNonimmunoglobulinScaffold,”ProteinSci.13:1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen,“ScaffoldsforEngineeringNovelBindingSitesinProteins,”Curr.Opin.Struc.Biol.7:463-469(1997)，其均以引用的方式整體并入本文)。預想本發(fā)明的結合結構域至少包含任何上述結合結構域中結合于靶標分子上的給定靶標表位或給定靶標位點/與靶標分子上的給定靶標表位或給定靶標位點相互作用所需的所述部分。設想上述結合結構域供體的結合結構域的特征在于這些供體中負責結合對應靶標的那部分，即當該部分從結合結構域供體去除時，供體喪失其結合能力。“喪失”意指當與結合供體相比時，結合能力的至少50％減少。定位這些結合位點的方法為所屬領域中眾所周知的，因此其在熟練人員定位(locate/map)結合結構域供體的結合位點并且由此從對應的結合結構域供體“衍生”該結合結構域的標準知識內。結合分子的第一和/或第二結合結構域可包含免疫球蛋白，例如抗體、其片段或其衍生物。結合分子的第一和/或第二結合結構域可替代地包含替代骨架。在一個實施方案中，結合分子可包含一個或多個免疫球蛋白結合結構域和一個或多個替代骨架結合結構域。如本文所用，術語“替代骨架”是指典型地具有減少的尺寸(例如，少于約200個氨基酸)的單鏈多肽骨架，其含有與允許插入、缺失或其它取代的具有高構象容限的可變結構域締合的高度結構化核心。這些骨架是基于常規(guī)Ig骨架，或源于完全無關蛋白。這些可變結構域可經(jīng)過修飾以產生針對任何靶向蛋白的新穎結合界面。例如，骨架可源于蛋白A(具體說來其Z-結構域(親和體))、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(Kunitz結構域)、Ras結合蛋白AF-6(PDZ-結構域)、北非蝎毒素(蝎子毒素)、CTLA-4、Min-23(打結素)、脂質運載蛋白(脂籠蛋白)、新制癌菌素、纖連蛋白結構域、錨蛋白共有重復序列結構域或硫氧還蛋白(Skerra,A.,“AlternativeNon-AntibodyScaffoldsforMolecularRecognition,”Curr.Opin.Biotechnol.18:295-304(2005)；Hosse等人,“ANewGenerationofProteinDisplayScaffoldsforMolecularRecognition,”ProteinSci.15:14-27(2006)；Nicaise等人,“AffinityTransferbyCDRGraftingonaNonimmunoglobulinScaffold,”ProteinSci.13:1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen,“ScaffoldsforEngineeringNovelBindingSitesinProteins,”Curr.Opin.Struc.Biol.7:463-469(1997)，其均以引用的方式整體并入本文))。替代骨架的結構會變化，但優(yōu)選地具有人類起源以用于作為治療劑開發(fā)的那些?；诜荌g的骨架包括但不限于脂質運載蛋白(以“脂籠蛋白”使用)、錨蛋白重復序列(AR)蛋白(以“設計的AR蛋白”或“DARPin”使用)、纖連蛋白結構域衍生物(以“脂聯(lián)素”使用)和親合力多聚體(還稱作“親合多聚體”)。脂籠蛋白(包含脂質運載蛋白骨架的工程改造的蛋白骨架)為用于本發(fā)明的結合分子的合適的基于非Ig的替代骨架。脂質運載蛋白(轉運如類固醇、后膽色素、類視色素和脂質的小疏水性分子的蛋白家族)為脂籠蛋白的親本蛋白結構。脂質運載蛋白具有有限的序列同源性，但共享基于八個反向平行b-筒的通用三級結構架構。這些蛋白含有在剛性β-筒結構上建立的四個暴露環(huán)。示例性脂質運載蛋白具有約160個氨基酸至約180個氨基酸的結構域尺寸并且已經(jīng)開發(fā)為在所述四個暴露環(huán)內含有16個可接近氨基酸的隨機化。包含錨蛋白重復序列(AR)蛋白的蛋白為用于本發(fā)明的結合分子的另一種合適的基于非Ig的替代骨架。AR蛋白包含由通過環(huán)分離的兩個α螺旋組成的33個氨基酸的蛋白基序，該重復序列介導蛋白-蛋白相互作用。設計的錨蛋白重復序列蛋白(DARPin)包含由基于人類AR蛋白的合理設計策略(例如，多序列比對和統(tǒng)計學分析)產生的工程改造的蛋白骨架。DARPin可使用基于具有七個隨機化位置的33個氨基酸的AR基序建構的組合AR文庫產生。DARPin文庫優(yōu)先使用核糖體展示來篩選，并且文庫成員典型地在大腸桿菌中良好產生，不聚集，并且展示高熱力學穩(wěn)定性。優(yōu)選地，DARPin含有兩個至四個側接N端和C端加帽基序的這些基序以遮蔽疏水區(qū)并且允許增加的溶解性。源于纖連蛋白III(FN3)結構域的蛋白也可用于產生合適的基于非Ig的替代骨架。例如，人類纖連蛋白的第十個纖連蛋白III型結構域(FN10)對應于具有七個β-鏈和三個連接環(huán)的β-夾層，該連接環(huán)顯示在無二硫橋的情況下與Ig結構域的結構同源性。一方面，F(xiàn)N10的連接環(huán)(各自為約15個至21個氨基酸長)可隨機化并且所述結構域在噬菌體和酵母上均展示以選擇具有所需特性的骨架。脂聯(lián)素(Adnexus，現(xiàn)為Bristol-Myers-Squibb)為使用以這種方式隨機化并且展示的第10個FN3結構域產生的示例性骨架。包含F(xiàn)N3結構域的替代示例性骨架為CentyrinTM。CentryrinsTM含有人類肌腱蛋白C(TNC)的FN3結構域的共有序列。CentyrinTM骨架具有具有與抗體可變結構域(即，CDR1、CDR2和CDR3)的結構同源性的環(huán)(即，DE、BC和FG)，并且為小(約10kDa)、簡單且高度穩(wěn)定的單一結構域蛋白，所述蛋白不含半胱氨酸、二硫化物或糖基化殘基。這些分子具有卓越的生物物理特性(例如，大于100mg/mL表達、大于170mg/mL溶解度、大于82℃熔化溫度、低的預測免疫原性和在血清中穩(wěn)定超過一個月)，并且可針對改進的穩(wěn)定性進行工程改造。因此，CentyrinsTM為用于本發(fā)明結合分子的源于FN結構域的合適替代骨架。在一個實施方案中，如本文所述的結合分子包含CentyrinTM或FN3結構域，該結構域包含氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者。本文所述的結合分子的示例性FN3結構域序列包括Luk17和Luk12(分別為SEQIDNO:14和SEQIDNO:22)。親合多聚體結構也可用作蛋白骨架以產生合適的基于非Ig的替代骨架。親合多聚體骨架是基于來自低密度脂蛋白(LRL)細胞表面受體的A-結構域的寡聚。優(yōu)選地，親合多聚體骨架包含A-結構域的普遍保守殘基，A-結構域為約35個氨基酸長并且包含具有三個二硫橋的四個環(huán)。另外，本發(fā)明還涵蓋包含選自例如納米抗體、結構域抗體(dAb)、雙特異性T細胞銜接器(BiTE)、雙重親和重靶向蛋白(DART)和四價tANDem抗體(TandAb)的Ig樣骨架的結合分子(參看例如Wurch等人,“NovelProteinScaffoldsasEmergingTherapeuticProteins:FromDiscoverytoClinicalProof-of-Concept,”TrendsinBiotechnology30(11):575-582(2012)，其以引用的方式整體并入本文)。結合分子還可為包含連接至替代骨架的抗體、其片段或衍生物的融合蛋白。在一個實施方案中，結合分子包含抗體、纖連蛋白結構域或抗體-纖連蛋白結構域融合蛋白。例如，一方面，本發(fā)明的結合分子包含能夠結合于如SdgB-糖基化含SDR蛋白的糖基化葡萄球菌表面蛋白的全長抗體或抗體片段，并且進一步包含能夠結合于如LukAB、LukD或LukE的葡萄球菌白細胞毒素的替代骨架。應了解，葡萄球菌的臨床分離菌株可在不同菌株當中具有變化序列。因此，一方面，替代骨架包含能夠結合于具有與SEQIDNO:10具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukA、具有與SEQIDNO:11具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukB、具有與SEQIDNO:12具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukD或具有與SEQIDNO:13具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukE的FN3結構域。一方面，結合分子的替代骨架包含能夠結合于具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA、具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB、具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD或具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE的FN3結構域。另一方面，結合分子的替代骨架包含能夠結合包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA和具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB的LukAB復合物的FN3結構域。另一方面，結合分子的替代骨架包含能夠結合包含具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD和具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE的LukED復合物的FN3結構域。設想結合分子通過噬菌體展示或文庫篩選方法制造(或可通過所述方法獲得)?；蛘撸Y合分子通過將來自預先存在的(單克隆)抗體的CDR序列接枝至骨架(例如，如本文所公開的骨架)中來制造。術語“能夠結合于”、“結合于”、“特異性地識別”、“針對”和“與……反應”意指根據(jù)本發(fā)明，結合分子能夠與表位的一個或多個氨基酸特異性地相互作用。術語“不能特異性結合”意指本發(fā)明的結合結構域不在所測試的條件下結合另一蛋白或抗原，例如非靶標蛋白。例如，在本公開中，蛋白A結合使用基于板的直接ELISA分析在實施例中所規(guī)定的條件下測量，該分析對于含有CH3突變H435R/Y436F的結合分子(例如構建體3-7)未檢測到與蛋白A的明顯結合。然而，如果用100-1000倍過量的蛋白執(zhí)行相同實驗，那么可檢測到一些蛋白A結合(非特異性)。這一普遍原理在本文所提供的條件下還適用于人類FcγRI結合(或其缺乏)和Sbi結合(或其缺乏)?！暗鞍住?包括其片段，優(yōu)選地生物活性片段，和肽，通常具有少于30個氨基酸)包含經(jīng)由共價肽鍵彼此偶聯(lián)的一個或多個氨基酸(產生氨基酸的鏈)。如本文所用的術語“多肽”為超過30個偶聯(lián)在一起的氨基酸的鏈。多肽可形成多聚體，如二聚體、三聚體和高碳寡聚物，即由超過一個多肽分子組成。形成所述二聚體、三聚體等的多肽分子可為同一或非同一的。多聚體的相應高級結構因此稱為同型二聚體或異質二聚體、同型三聚體或異質三聚體等。異質多聚體的實例為抗體分子，其天然存在形式由兩個同一的輕多肽鏈和兩個同一的重多肽鏈組成。術語“多肽”和“蛋白”還稱為天然修飾的多肽/蛋白，其中修飾例如通過如糖基化、乙?；?、磷酸化等翻譯后修飾來實現(xiàn)。當本文中提及“多肽”時，其也可經(jīng)過化學修飾，如聚乙二醇化。修飾是本領域中眾所周知的。術語“氨基酸”或“氨基酸殘基”典型地指具有其公認定義的氨基酸，如選自由以下組成的組的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；組氨酸(His或H)；異亮氨酸(Ile或I)；亮氨酸(Leu或L)；賴氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；絲氨酸(Ser或S)；蘇氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和纈氨酸(Val或V)，不過必要時可使用修飾的、合成或罕見氨基酸。一般說來，氨基酸可分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；帶負電側鏈(例如Asp、Glu)；帶正電側鏈(例如Arg、His、Lys)；或不帶電極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。如本文所用的術語“毒力因子”是指由細菌表達的分子，其使得所述細菌能夠實現(xiàn)小生境在宿主中的定殖(包括粘附于細胞)、免疫逃避(即，宿主的免疫反應的逃避)、免疫抑制(即，宿主的免疫反應的抑制)、進入細胞中和離開細胞(如果病原體為細胞內病原體)和/或從宿主獲得營養(yǎng)。毒力因子可在如噬菌體的可動遺傳因子上編碼，并且可容易地通過水平基因轉移傳播。金黃色葡萄球菌毒力因子的非限制性實例包括透明質酸酶、蛋白酶、凝結酶、脂肪酶、脫氧核糖核酸酶、腸毒素和其它毒素，例如作用于細胞膜的毒素，如LukAB、LukD或LukE。出于本發(fā)明的目的，葡萄球菌表面蛋白(如含SDR蛋白，例如ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE、SdrF、SdrG和SdrH)也被視為毒力因子。術語“抗體”的定義包括如單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人類化抗體和人類抗體的實施方案。除了全長抗體以外，該定義還包括抗體衍生物和抗體片段，尤其如Fab片段?？贵w片段或衍生物進一步包含F(xiàn)(ab′)2、Fv、scFv片段或單一結構域抗體(如結構域抗體)或納米抗體、單一可變結構域抗體或僅包含一個可變結構域的免疫球蛋白單一可變結構域，該一個可變結構域可能為VHH、VH或VL，其獨立于其它V區(qū)或結構域特異性地結合抗原或表位；參看例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringharborPress(1988)；Harlow和Lane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1999)；Kontermann和Dübel,ANTIBODYENGINEERING,Springer,第2版2010；和Little,RECOMBINANTANTIBODIESFORIMMUNOTHERAPY,CambridgeUniversityPress2009，其各自以引用的方式整體并入本文。該術語還包括雙功能抗體或雙重親和重靶向(DART)抗體。進一步設想(雙特異性)單鏈雙功能抗體、串聯(lián)雙功能抗體(Tandab)、“微抗體”(其由如下結構例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2)、“FcDART”和“IgGDART”、多功能抗體(如三功能抗體)。免疫球蛋白單一可變結構域不僅涵蓋分離的抗體單一可變結構域多肽，而且涵蓋包含抗體單一可變結構域多肽序列的一種或多種單體的較大多肽。多種程序為所屬領域中已知的并且可用于制造所述抗體和/或片段。因此，(抗體)衍生物可通過肽模擬物制造。此外，關于單鏈抗體的制造所述的技術(尤其參看Ladner等人的美國專利號4,946,778，Kontermann和Dübel,ANTIBODYENGINEERING,Springer,第2版2010，和Little,RECOMBINANTANTIBODIESFORIMMUNOTHERAPY,CambridgeUniversityPress,2009，其各自以引用的方式整體并入本文)可經(jīng)調適以制造對所選的多肽具特異性的單鏈抗體。另外，轉基因動物可用于表達對本發(fā)明的多肽和融合蛋白具特異性的人類化抗體。關于單克隆抗體的制備，可使用提供由持續(xù)細胞系培養(yǎng)物制造的抗體的任何技術。關于該技術的實例包括雜交瘤技術(和Milstein,“ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,”Nature256:495-497(1975)，其以引用的方式整體并入本文)、三源雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人,“TheProductionofMonoclonalAntibodiesFromHumanLymphocytes,”ImmunologyToday4:72-79(1983)，其以引用的方式整體并入本文)和制造人類單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(Cole等人,MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,第77-96頁(1985)，其以引用的方式整體并入本文)。如BIAcore系統(tǒng)中所用的表面等離子體共振可用于增加結合于靶標多肽的表位的噬菌體抗體(如CD3ε)的效率(Schier等人,“EfficientInVitroAffinityMaturationofPhageAntibodiesUsingBIAcoreGuidedSelections,”HumanAntibodiesHybridomas7:97-105(1996)；Malmborg等人,“BIAcoreasaToolinAntibodyEngineering,”J.Immunol.Methods183:7-13(1995)，其各自以引用的方式整體并入本文)。在本發(fā)明的背景中還設想術語“抗體”包含抗體構建體，其可如下文所述在宿主中表達，例如可尤其經(jīng)由病毒或質粒載體轉染和/或轉導的抗體構建體。此外，如本文所用的術語“抗體”還涉及本文所述的抗體的衍生物或變體，其展示與該抗體相同的特異性。“抗體變體”的實例包括非人類抗體的人類化變化、“親和成熟”抗體(參看例如Hawkins等人,“SelectionofPhageAntibodiesbyBindingAffinity.MimickingAffinityMaturation,”J.Mol.Biol.254:889-896(1992)和Lowman等人,“SelectingHigh-AffinityBindingProteinsbyMonovalentPhageDisplay,”Biochemistry30:10832-10837(1991)，其各自以引用的方式整體并入本文)和具有改變的效應子功能的抗體突變體(參看例如Winter等人的美國專利號5,648,260，Kontermann和Dübel,ANTIBODYENGINEERING,Springer,第2版2010，和Little,RECOMBINANTANTIBODIESFORIMMUNOTHERAPY,CambridgeUniversityPress,2009，其各自以引用的方式整體并入本文)。一種制造抗體的示例性方法包括篩選蛋白表達文庫，例如噬菌體或核糖體展示文庫。噬菌體展示描述于例如Ladner等人的美國專利號5,223,409；Smith,“FilamentousFusionPhage:NovelExpressionVectorsThatDisplayClonedAntigensontheVirionSurface,”Science228:1315-1317(1985)；Clackson等人,“MakingAntibodyFragmentsUsingPhageDisplayLibraries,”Nature352:624-628(1991)中，其各自以引用的方式整體并入本文。除了使用展示文庫以外，規(guī)定抗原也可用于免疫非人類動物，例如嚙齒動物、小鼠、倉鼠或大鼠。例如，有可能用人類Ig基因座的大片段工程改造缺乏小鼠抗體產生的小鼠品系。使用雜交瘤技術，可制造并且選擇源于具有所需特異性的基因的抗原特異性單克隆抗體。參看例如XENOMOUSETM,Green等人,“Antigen-SpecificHumanMonoclonalAntibodiesFromMiceEngineeredWithHumanIgHeavyandLightChainYACs,”NatureGenetics7:13-21(2004)，Jakobovits等人的US2003-0070185，Kucherlapati等人的WO96/34096，和Kucherlapati等人的WO96/33735，其各自以引用的方式整體并入本文?？贵w或其片段也可通過人類T細胞表位的特異性缺失或由Carr等人的WO98/52976和Carr等人的WO00/34317中公開的方法“去免疫化”來修飾，該專利以引用的方式整體并入本文。簡單地說，抗體的重鏈和輕鏈可變結構域可針對結合于MHCII類的肽進行分析；這些肽表示潛在T細胞表位(如Carr等人的WO98/52976和Carr等人的WO00/34317中所定義，這兩個專利均以引用的方式整體并入本文)。關于潛在T細胞表位的檢測，可應用稱作“肽穿線”的計算機建模方法，并且另外，可針對存在于VH和VL序列中的基序搜索人類MHCII類結合肽的數(shù)據(jù)庫，如Carr等人的WO98/52976和Carr等人的WO00/34317中所述，這兩個專利均以引用的方式整體并入本文。這些基序結合于18種主要的MHCII類DR同種異型中的任一者，并且因此構成潛在T細胞表位。所檢測的潛在T細胞表位可通過取代可變結構域中的少量氨基酸殘基或優(yōu)選地通過單一氨基酸取代來消除。典型地，進行保守取代。通常，但并非排外地，可使用人類生殖系抗體序列中的位置的常見氨基酸。人類生殖系序列例如公開于Tomlinson等人,“TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsAboutFiftyGroupsofVHSegmentsWithDifferentHypervariableLoops,”J.Mol.Biol.227:776-798(1992)；Cook等人,“TheHumanImmunoglobulinVHRepertoire,”Immunol.Today16(5):237-242(1995)；和Tomlinson等人,“TheStructuralRepertoireoftheHumanVKappaDomain,”EMBOJ.14:14:4628-4638(1995)中，其各自以引用的方式整體并入本文。VBASE目錄提供了人類免疫球蛋白可變區(qū)序列的全面目錄(由Tomlinson,LA.等人MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK匯編)。這些序列可用作人類序列的來源，例如關于構架區(qū)和CDR。也可使用共有人類構架區(qū)，舉例來說，如描述于Knappik等人的美國專利號6,300,064中，此專利以引用的方式整體并入本文。VH和VL的配對一起形成單一抗原結合位點。最接近VH的恒定重鏈(CH)結構域是指定為CH1。每個L鏈通過一個共價二硫鍵連接于H鏈，而兩個H鏈通過一個或多個二硫鍵彼此連接，視H鏈同型而定。VH和VL結構域由四個稱為構架區(qū)的相對保守序列區(qū)域(FR1、FR2、FR3和FR4)組成，這些區(qū)域形成三個高變序列區(qū)域(互補決定區(qū)，CDR)的骨架。CDR含有負責抗體與抗原的特異性相互作用的殘基的大部分。CDR是稱為CDR1、CDR2和CDR3。因此，重鏈上的CDR組分是稱為H1、H2和H3，而輕鏈上的CDR組分是稱為L1、L2和L3。術語“可變”是指免疫球蛋白結構域中展現(xiàn)其序列的可變性并且參與決定特定抗體的特異性和結合親和力的部分(即，“可變結構域”或“V區(qū)”)?？勺冃晕淳鶆虻胤植加诳贵w的可變結構域中；其集中于重鏈和輕鏈可變區(qū)中的每一個的子結構域中。這些子結構域稱作“高變”區(qū)或“互補決定區(qū)”(CDR)?？勺兘Y構域的較保守(即，非高變)部分稱作“構架”區(qū)(FRM)。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FRM區(qū)，F(xiàn)RM區(qū)大部分采用β-折疊配置，通過三個高變區(qū)連接，高變區(qū)形成連接所述β-折疊結構并且在一些情況下形成所述β-折疊結構的一部分的環(huán)。每個鏈中的高變區(qū)通過所述FRM緊密接近地結合在一起并且與來自另一鏈的高變區(qū)一起促進形成抗原結合位點(參看Wu和Kabat,“AnAnalysisoftheSequencesoftheVariableRegionsofBenceJonesProteinsandMyelomaLightChainsandtheirImplicationsforAntibodyComplementarity,”J.Exp.Med.132:211-250(1970)，其以引用的方式整體并入本文)。恒定結構域并未直接參與抗原結合，但展現(xiàn)多種效應子功能，例如抗體依賴性細胞毒性和補體激活。術語“高變區(qū)”(還稱作“互補決定區(qū)”或CDR)當用于本文中時是指抗體的氨基酸殘基，其在免疫球蛋白的V區(qū)結構域內(通常為三個或四個極具序列可變性的短區(qū))，其形成抗原結合位點并且為抗原特異性的主要決定子。存在至少兩種用于鑒定CDR殘基的方法：(1)基于交叉物種序列可變性的方法(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布號91-3242(1991)，其以引用的方式整體并入本文)；和(2)基于抗原-抗體復合物的結晶學研究的方法(Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其以引用的方式整體并入本文)。然而，就兩種殘基鑒定技術定義重疊區(qū)而非同一區(qū)來說，其可組合以定義雜合CDR。然而，一般說來，CDR殘基優(yōu)選地根據(jù)Kabat(編號)系統(tǒng)來鑒定。術語“抗原結合結構域”、“抗原結合片段”和“抗體結合區(qū)”當用于本文中時是指抗體分子的一部分，其包含負責抗體與抗原之間的特異性結合的氨基酸?？乖杏煽贵w特異性地識別和結合的部分是稱作如上文所述的“表位”。如上文所提及，抗原結合結構域可典型地包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)；然而，其并非必須包含兩者。Fd片段例如具有兩個VH區(qū)并且通常保留完整抗原結合結構域的一些抗原結合功能。抗體的抗原結合片段的實例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定輕鏈(CL)和CH1結構域的單價片段；(2)F(ab′)2片段，具有由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(3)具有兩個VH和CH1結構域的Fd片段；(4)具有抗體單臂的VL和VH結構域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“BindingActivitiesofaRepertoireofSingleImmunoglobulinVariableDomainsSecretedFromEscherichiacoli,”Nature341:544-546(1989)，其以引用的方式整體并入本文)，其具有VH結構域；(6)分離的互補決定區(qū)(CDR)，和(7)單鏈Fv(scFv)，例如源于scFV-文庫。盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH是由獨立基因編碼，但其可通過合成連接子使用重組方法接合，合成連接子使得其被制備為其中VL和VH區(qū)配對以形成單價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv))(參看例如Huston等人,“ProteinEngineeringofAntibodyBindingSites:RecoveryofSpecificActivityinanAnti-DigoxinSingle-ChainFvAnalogueProducedinEscherichiacoli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)，其以引用的方式整體并入本文)。這些抗體片段使用所屬領域的技術人員已知的常規(guī)技術獲得，且以與完整抗體相同的方式評估所述片段的功能。如本文所用的術語“單克隆抗體”是指獲自大致均勻抗體的群體的抗體，即構成該群體的個別抗體為同一的，除了可少量存在的可能的天然存在突變和/或翻譯后修飾(例如異構化、酰胺化)。單克隆抗體為高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與典型地包括針對不同決定子(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑形成對比，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定子。除了其特異性，該單克隆抗體也為有利的，因為其通過雜交瘤培養(yǎng)合成，未受其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”指示抗體獲自抗體的大致均勻群體的特性，并且不應解釋為需要通過任何特定方法制造所述抗體。例如，欲根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等人,“ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,”Nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法制造，或可通過重組DNA方法制造(參看例如Cabilly等人的美國專利號4,816,567)，其各自以引用的方式整體并入本文?！皢慰寺】贵w”也可使用例如Clackson等人,“MakingAntibodyFragmentsUsingPhageDisplayLibraries,”Nature352:624-628(1991)和Marks等人,“By-PassingImmunization.HumanAntibodiesFromV-geneLibrariesDisplayedonPhage,”J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技術從噬菌體抗體文庫分離，這些文獻中的每個以引用的方式整體并入本文。本發(fā)明的單克隆抗體特異性地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源于特定物種或屬于特定抗體類別或子類的抗體中的對應序列同一或同源，而該鏈的剩余部分與源于另一物種或屬于另一抗體類別或子類的抗體中的對應序列同一或同源，以及抗體的片段，只要其展現(xiàn)所需生物活性(Cabilly等人的美國專利號4,816,567；Morrison等人,“ChimericHumanAntibodyMolecules:MouseAntigen-BindingDomainsWithHumanConstantRegionDomains,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)，其均以引用的方式整體并入本文)。本文所關注的嵌合抗體包括包含源于非人類靈長類動物(例如舊大陸猴、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人類恒定區(qū)序列的“靈長類化”抗體。單克隆抗體可獲自非人類動物，并且接著進行修飾，例如人類化、去免疫化、嵌合，可使用所屬領域中已知的重組DNA技術制造。已經(jīng)描述多種用于制造嵌合抗體的方法。參看例如Morrison等人,“ChimericHumanAntibodyMolecules:MouseAntigen-BindingDomainsWithHumanConstantRegionDomains,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1985)；Takeda等人,“ConstructionofChimericProcessedImmunoglobulinGenesContainingMouseVariableandHumanConstantRegionSequences,”Nature314:452(1985)；Cabilly等人的美國專利號4,816,567；Boss等人的美國專利號4,816,397；Tanaguchi等人的EP0171496；Morrison等人的EP0173494，Neuberger等人的GB2177096，其各自以引用的方式整體并入本文。非人類(例如鼠科動物)抗體的“人類化”形式為主要為人類序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(如抗體的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它抗原結合子序列)，其含有源于非人類免疫球蛋白的最小序列。在極大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的高變區(qū)(也為CDR)的殘基由來自具有所需特異性、親和力和能力的非人類物種(供體抗體)的高變區(qū)的殘基置換，非人類物種如小鼠、大鼠或兔。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv構架區(qū)(FR)殘基由對應非人類殘基置換。此外，如本文所用的“人類化抗體”也可包含在接受者抗體和供體抗體中均未發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾以進一步改進和優(yōu)化抗體性能。人類化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地人類免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。關于進一步細節(jié)，參看Jones等人,“ReplacingtheComplementarity-DeterminingRegionsinaHumanAntibodyWithThoseFromaMouse,”Nature321:522-525(1986)和Reichmann等人,“ReshapingHumanAntibodiesforTherapy,”Nature332:323-329(1988)，其各自以引用的方式整體并入本文。人類化抗體還可例如使用表達人類重鏈和輕鏈基因但不能表達內源小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的轉基因小鼠來制造。Winter描述了一種示例性CDR移植方法，該方法可用于制造本文所述的人類化抗體(Winter等人的美國專利號5,225,539，其以引用的方式整體并入本文)。特定人類抗體的所有CDR均可用非人類CDR的至少一部分置換，或CDR中僅一些可用非人類CDR置換。僅有必要置換使人類化抗體結合于預定抗原所需的數(shù)目的CDR。人類化抗體或其片段可例如通過置換Fv可變結構域中未直接參與抗原與來自人類Fv可變結構域的相等序列的結合的序列而產生。用于產生人類化抗體或其片段的示例性方法由Morrison,SL.,“TransfectomasProvideNovelChimericAntibodies,”Science229:1202-1207(1985)；Queen等人的美國專利號5,585,089；Queen等人的美國專利號5,693,761；Queen等人的美國專利號5,693,762；Adair等人的美國專利號5,859,205；和Carter等人的美國專利號6,407,213提供，這些文獻中的每個以引用的方式整體并入本文。那些方法包括分離、操縱和表達編碼來自重鏈或輕鏈中的至少一種的免疫球蛋白Fv可變結構域的全部或一部分的核酸序列。核酸可獲自如上文所述產生針對預定靶標的抗體的雜交瘤，以及獲自其它來源。編碼人類化抗體分子的重組DNA可接著克隆至適當表達載體中。人類化抗體可通過引入保守取代、保守序列取代、生殖系取代和/或回復突變來優(yōu)化。改變的免疫球蛋白分子可通過所屬領域中已知的數(shù)種技術中的任一種來制備(例如Teng等人,“ConstructionandTestingofMouse--HumanHeteromyelomasforHumanMonoclonalAntibodyProduction,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:7308-7312(1983)；Kozbor等人,“TheProductionofMonoclonalAntibodiesfromHumanLymphocytes,”ImmunologyToday4:72-79(1983)；Olsson等人,“Human--HumanMonoclonalAntibody-ProducingHybridomas:TechnicalAspects,”Meth.Enzymol.92:3-16(1982)，其各自以引用的方式整體并入本文)，并且可根據(jù)Winter的EP239400的教導來制備，其以引用的方式整體并入本文。術語“人類抗體”包括具有大致對應于所屬領域中已知的人類生殖系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體，人類生殖系免疫球蛋白序列包括例如由Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布號91-3242(1991)所述的那些，這些文獻以引用的方式整體并入本文。本發(fā)明的人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR并且具體說來CDR3中。人類抗體可具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個用不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基置換的位置?！半p特異性”或“雙功能”抗體或免疫球蛋白為具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同的結合位點的人造雜合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體可通過多種方法制造，該方法包括雜交瘤的融合或Fab′片段的連接(參看例如Songsivilai和Lachmann,“BispecificAntibody:AToolforDiagnosisandTreatmentofDisease,”Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)，其以引用的方式整體并入本文)。所屬領域的技術人員已知的多種方法可用于獲得抗體或其抗原結合片段。例如，抗體可使用重組DNA方法制造(Cabilly的美國專利號4,816,567，其以引用的方式整體并入本文)。單克隆抗體也可根據(jù)已知方法通過產生雜交瘤來制造(參看例如Kohler等人,“ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,”Nature256:495(1975)，其以引用的方式整體并入本文)。以這種方式形成的雜交瘤接著使用標準方法，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和表面等離子體共振(BIACORETM)分析來篩選，以鑒定一種或多種產生與規(guī)定抗原特異性地結合的抗體的雜交瘤。任何形式的規(guī)定抗原均可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在形式、其任何變體或片段以及其抗原肽。術語“CDR”和其復數(shù)形式“CDRs”是指互補決定區(qū)(CDR)，其中三者構成輕鏈可變區(qū)的結合特性(CDRL1、CDRL2和CDRL3)并且三者構成重鏈可變區(qū)的結合特性(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。CDR有助于抗體分子的功能活性并且通過包含骨架或構架區(qū)的氨基酸序列分離。精確定義的CDR邊界和長度經(jīng)受不同分類和編號系統(tǒng)。CDR可因此通過Kabat、Chothia、接觸或任何其它邊界定義來提及。盡管有不同邊界，但這些系統(tǒng)各自在構成可變序列內的所謂的“高變區(qū)”的部分中具有一些程度的重疊。根據(jù)這些系統(tǒng)的CDR定義可因此在長度和邊界區(qū)域方面相對于相鄰構架區(qū)不同。參看例如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布號91-3242(1991)；Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)；和MacCallum等人,“Antibody-AntigenInteractions:ContactAnalysisandBindingSiteTopography,”J.Mol.Biol.262:732(1996))，其各自以引用的方式整體并入本文。典型地，CDR形成可歸類為典型結構的環(huán)結構。術語“典型結構”是指抗原結合(CDR)環(huán)所采用的主要鏈構象。由比較結構研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)六種抗原結合環(huán)中的五種僅具有有限的可用構象譜系。每個典型結構的特征可在于多肽骨架的扭轉角。抗體之間的代理環(huán)可因此具有極其類似的三維結構，盡管在環(huán)的大多數(shù)部分中存在高氨基酸序列可變性(Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)；Chothia等人,“ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions,”Nature342:877(1989)；Martin和Thornton,“StructuralFamiliesinLoopsofHomologousProteins:AutomaticClassification,ModellingandApplicationtoAntibodies,”J.Mol.Biol.263:800(1996)，其各自以引用的方式整體并入本文)。此外，在所采用的環(huán)結構與圍繞該結構的氨基酸序列之間存在關系。特定典型類別的構象通過環(huán)的長度和停留于所述環(huán)內以及保守構架內(即，環(huán)的外部)的關鍵位置處的氨基酸殘基決定。對特定典型類別的指派可因此基于這些關鍵氨基酸殘基的存在來進行。術語“典型結構”也可包括關于抗體的線性序列的考慮，舉例來說，如由Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布號91-3242(1991)編入目錄，其以引用的方式整體并入本文。Kabat編號方案(系統(tǒng))為用于以一致方式對抗體可變結構域的氨基酸殘基編號的廣泛采用標準并且為應用于本發(fā)明的優(yōu)選方案，如本文中別處也有提及。額外結構考慮也可用于確定抗體的典型結構。例如，不完全由Kabat編號反映的那些差異可通過Chothia等人的編號系統(tǒng)描述和/或通過例如結晶學和兩維或三維計算機建模的其它技術披露。因此，給定抗體序列可放入典型類別中，該典型類別尤其允許鑒定適當?shù)妆P序列(例如，基于在文庫中包括多種典型結構的期望)。如由Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)(其以引用的方式整體并入本文)所述的抗體氨基酸序列的Kabat編號和結構考慮以及其牽連用于建構抗體結構的典型方面描述于文獻中。CDR3典型地為抗體結合位點內分子多樣性的最大來源。舉例來說，H3可短到兩個氨基酸殘基或超過26個氨基酸。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結構和三維配置在所屬領域中為眾所周知的。關于抗體結構的回顧，參看Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Harlow等人編,1988，其以引用的方式整體并入本文。所屬領域的技術人員將認識到每個亞單位結構(例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR結構)包含活性片段，例如VH、VL或CDR亞單位中結合抗原的部分(即，抗原結合片段)，或例如CH亞單位中結合于和/或激活例如Fc受體和/或補體的部分。CDR典型地是指KabatCDR，如SequencesofProteinsofimmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices(1991),Kabat等人編(其以引用的方式整體并入本文)中所述。用于表征抗原結合位點的另一標準是指如Chothia(參看例如Chothia等人,“StructuralRepertoireoftheHumanVHSegments,”J.Mol.Biol.227:799-817(1987)；和Tomlinson等人,“TheStructuralRepertoireoftheHumanVKappaDomain,”EMBOJ.14:4628-4638(1995)，其各自以引用的方式整體并入本文)所述的高變環(huán)。另一標準為由OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件使用的AbM定義。一般來說，參看例如ProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyVariableDomains.AntibodyEngineeringLabManual,Duebel和Kontermann(編),Springer-Verlag，其以引用的方式整體并入本文)。關于KabatCDR所述的實施方案或者可使用關于Chothia高變環(huán)或AbM定義的環(huán)類似描述的關系來執(zhí)行。在組裝和體細胞突變后抗體基因的序列高度變化，并且估計這些變化的基因編碼1010種不同的抗體分子(ImmunoglobulinGenes,第2版,Jonio等人編,AcademicPress,1995，其以引用的方式整體并入本文)。因此，免疫系統(tǒng)提供免疫球蛋白的譜系。術語“譜系”是指完全地或部分地源于編碼至少一種免疫球蛋白的至少一個序列的至少一個核苷酸序列。該序列可通過重鏈的V、D和J區(qū)段和輕鏈的V和J區(qū)段的體內重排而產生?；蛘撸撔蛄锌捎杉毎貞谠撝嘏虐l(fā)生(例如體外刺激)而產生。或者，所述序列的部分或全部可通過DNA剪接、核苷酸合成、誘變和其它方法獲得，參看例如Hoogenboom等人的美國專利號5,565,332，其以引用的方式整體并入本文。譜系可僅包括一個序列或可包括多個序列，包括在遺傳多樣性集合中的序列。術語“構架區(qū)”是指抗體可變區(qū)中存在于更具趨異性(即，高變)CDR之間的公認部分。該構架區(qū)典型地稱作構架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并且提供用于在三維空間中呈遞六個CDR(三個來自重鏈并且三個來自輕鏈)的骨架，以形成抗原結合表面。如本文所用的術語“纖連蛋白III型(FN3)結構域”(FN3結構域)是指經(jīng)常存在于包括纖連蛋白、肌腱蛋白、細胞內細胞骨架蛋白、細胞因子受體和原核酶的蛋白中的結構域(Bork和Doolittle,“ProposedAcquisitionofanAnimalProteinDomainbyBacteria,”Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:8990-8994(1992)；Meinke等人,“Cellulose-BindingPolypeptidesFromCellulomonasfimi:EndoglucanaseD(CenD),aFamilyAbeta-1,4-Glucanase,”J.Bacteriol.175:1910-1918(1993)；Watanabe等人,“GeneCloningofChitinaseA1FromBacilluscirculansWL-12RevealeditsEvolutionaryRelationshiptoSerratiachitinaseandtotheTypeIIIHomologyUnitsofFibronectin,”J.Biol.Chem.265:15659-15665(1990)，其各自以引用的方式整體并入本文)。示例性FN3結構域為存在于人類肌腱蛋白C中的15種不同F(xiàn)N3結構域、存在于人類纖連蛋白(FN)中的15種不同F(xiàn)N3結構域和如例如Jacobs等人的美國專利公布號2010/0216708(其以引用的方式整體并入本文)中所述的非天然合成FN3結構域。個別FN3結構域由結構域數(shù)目和蛋白名稱提及，例如肌腱蛋白的第3個FN3結構域(TN3)或纖連蛋白的第10個FN3結構域(FN10)。如本文所用的術語“取代(substituting)”或“取代(substituted)”或“突變(mutating)”或“突變(mutated)”是指多肽或聚核苷酸序列中改變、缺失或插入一個或多個氨基酸或核苷酸以產生該序列的變體。如本文所用的術語“隨機化(randomizing)”或“隨機化(randomized)”或“多樣化(diversified)”或“多樣化(diversifying)”是指在聚核苷酸或多肽序列中進行至少一種取代、插入或缺失。如本文所用的“Tencon”是指具有以SEQIDNO:1顯示的序列并且描述于Jacobs等人的美國專利公布號US2010/0216708(其以引用的方式整體并入本文)中的合成纖連蛋白III型(FN3)結構域。術語“文庫”是指變體的集合。文庫可由多肽或聚核苷酸變體構成。術語“載體”意指能夠在生物系統(tǒng)內復制或可在所述系統(tǒng)中移動的聚核苷酸。載體聚核苷酸典型地含有用于促進生物系統(tǒng)中這些聚核苷酸的復制或維持的元件，如復制起點、聚腺苷酸化信號或選擇標記物。生物系統(tǒng)的實例可包括細胞、病毒、動物、植物和利用能夠復制載體的生物組分的重構生物系統(tǒng)。包含載體的聚核苷酸可為DNA或RNA分子或這些分子的雜合物。載體可用于生物系統(tǒng)中或重構生物系統(tǒng)中以指導由存在于所述載體中的聚核苷酸序列編碼的多肽的翻譯。因此，如本文所用的“載體”廣泛地是指用于在包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞的任何細胞中組成性地或誘導性地體外或體內表達本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達系統(tǒng)。該術語包括線性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術語包括保持游離體或整合至宿主細胞基因組中的表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)可具有自主復制或無法自主復制(即僅驅動細胞中的短暫表達)的能力。該術語包括僅含有重組核酸的轉錄所需的最小元件的重組表達盒。本申請大體上涉及結合于至少兩種不同細菌毒力因子的多特異性分子，用于制造這些結合分子的方法，和這些結合分子用于檢測或診斷、預防和/或治療細菌感染的用途。具體說來，該結合分子包含至少兩個結合結構域，例如抗體或抗體片段和替代骨架。第一結合結構域能夠結合于糖基化葡萄球菌表面蛋白，優(yōu)選地SdgB糖基化含SDR蛋白。第二結合結構域能夠結合于葡萄球菌白細胞毒素，優(yōu)選地LukAB、LukD或LukE。這些多特異性結合分子具有針對其結合的蛋白抗原的中和活性，即一旦結合分子結合于其靶標葡萄球菌蛋白，那么那些蛋白的活性大致或完全消除。因此，多特異性結合分子還具有針對葡萄球菌本身的中和或殺菌活性，并且因此可用于治療和/或改善葡萄球菌感染，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌。本文中結合分子也可能夠特異性地結合于葡萄球菌(和其它革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌)的一個或多個片段，尤其如源于葡萄球菌的一種或多種蛋白和/或(多)肽或一種或多種重組產生的葡萄球菌蛋白和/或多肽的制劑。關于治療和/或預防葡萄球菌感染的方法，結合分子優(yōu)選地能夠特異性地結合于葡萄球菌的表面可接近蛋白。葡萄球菌的表面蛋白包括但不限于凝集因子(Clf)A和ClfB、SDR-蛋白(例如SdrC、SdrD、SdrE、SrdF、SdrG和SdrH)、蛋白A、Sbi、纖連蛋白結合蛋白(FnbA)和用于血小板的富絲氨酸粘附素(SraP)。在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中，所有含SDR蛋白的SDR結構域均通過至少兩種糖基轉移酶SdgA和SdgB顯著糖基化，其防止這些蛋白由宿主蛋白酶降解，由此保留細菌宿主組織相互作用。這些糖修飾還表示顯性抗體表位。優(yōu)選地，結合分子結合于糖基化表面葡萄球菌蛋白，具體說來SdgB糖基化SDR蛋白(Hazenbos等人,“NovelStaphylococcalGlycosyltransferasesSdgAandSdgBMediateImmunogenicityandProtectionofVirulence-AssociatedCellWallProteins,”PLoSPathog.9(10):e1003653(2013)，其以引用的方式整體并入本文)。如本文所述，本文中結合分子可包含完整免疫球蛋白分子(如多克隆或單克隆抗體)或抗原結合片段，包括但不限于Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體和至少含有免疫球蛋白中足以賦予與葡萄球菌或其片段的特異性抗原結合的片段的(多)肽。在某些實施方案中，本文中結合分子為人類單克隆抗體。一方面，第一結合結構域為全長抗體或抗體片段。優(yōu)選地，全長抗體或抗體片段抵抗由裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶(如在SEQIDNO:60內的殘基222-237(EU編號)之間或殘基處裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶金黃色葡萄球菌V8蛋白酶)引起的蛋白水解降解。另一方面，全長抗體或抗體片段為人類、人類化或嵌合抗體或抗體片段。一方面，第一結合結構域包含具有選自VH區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的組的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變(VH)區(qū)。另一方面，第一結合結構域包含具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區(qū)。或者，第一結合結構域包含(a)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH區(qū)；和(b)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL區(qū)。在一個實施方案中，第一結合結構域包含(1)具有氨基酸序列SEQIDNO:60的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:61的VL區(qū)；(2)具有氨基酸序列SEQIDNO:62的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:63的VL區(qū)；(3)具有氨基酸序列SEQIDNO:64的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:65的VL區(qū)；(4)具有氨基酸序列SEQIDNO:66的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的VL區(qū)；(5)具有氨基酸序列SEQIDNO:68的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:69的VL區(qū)；(6)具有氨基酸序列SEQIDNO:70的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:71的VL區(qū)；(7)具有氨基酸序列SEQIDNO:72的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:73的VL區(qū)；(8)具有氨基酸序列SEQIDNO:74的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:75的VL區(qū)；(9)具有氨基酸序列SEQIDNO:76的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:77的VL區(qū)；或(10)具有氨基酸序列SEQIDNO:78的VH區(qū)，和具有氨基酸序列SEQIDNO:79的VL區(qū)。本文所述的結合分子包含能夠特異性地結合于包括例如雙組份毒素的其它葡萄球菌分子的第二結合結構域。除了PVL(還稱作殺白細胞素S/F-PV或LukSF-PV)和γ溶血素(HlgAB和HlgCB)以外，還已知由金黃色葡萄球菌產生的雙組份白細胞毒素的譜系包括殺白細胞素E/D(“LukED”)、殺白細胞素A/B(“LukAB”)和殺白細胞素M/F(“LukMF”)。因此，這些雙組份殺白細胞素的S類別子單位包括HlgA、HlgC、LukE、LukS-PV、LukA和LukM，并且F類別亞單位包括HlgB、LukD、LukF-PV、LukB和LukF’-PV。金黃色葡萄球菌S-和F-亞單位不具殺白細胞素特異性。也就是說，其可互換使得其它雙組份組合可能在白血球中產生功能孔，極大地增加白細胞毒素的譜系(Meyer等人,“AnalysisoftheSpecificityofPanton-ValentineLeucocidinandGamma-HemolysinFComponentBinding,”Infect.Immun.77(1):266-273(2009)，其公開內容以引用的方式整體并入本文)。在一個實施方案中，本發(fā)明的結合分子結合于選自白細胞毒素A(LukA)、白細胞毒素B(LukB)、白細胞毒素AB(LukAB)、白細胞毒素D(LukD)、白細胞毒素E(LukE)、白細胞毒素ED(LukED)、Panton-Valentine殺白細胞素S(LukS-PV)、Panton-Valentine殺白細胞素F(LukF-PV)、Panton-Valentine殺白細胞素(LukSF/PVL)、γ溶血素A(HlgA)、γ溶血素C(HlgC)、γ溶血素B(HlgB)、γ溶血素AB(HlgAB)和γ溶血素BC(HlgBC)的一種或多種葡萄球菌白細胞毒素。在一個實施方案中，該結合分子結合于選自LukAB、LukD或LukE的一種或多種葡萄球菌白細胞毒素。在另一實施方案中，本文中結合分子能夠特異性地結合于上述蛋白的片段，其中該片段至少包含由本文中結合分子識別的抗原決定子。如本文所用的“抗原決定子”為能夠以足夠高的親和力結合于本文中結合分子以形成可檢測的抗原-結合分子復合物的部分。在另一實施方案中，本文中結合分子能夠特異性地結合于上述葡萄球菌白細胞毒素蛋白中含有中和表位的片段。結合于白細胞毒素蛋白的中和表位會消除或大致消除所述蛋白的活性。一方面，能夠結合葡萄球菌白細胞毒素的第二結合結構域為替代骨架。優(yōu)選地，第二結合結構域包含纖連蛋白III型(FN3)結構域，例如基于纖連蛋白III型(FN3)重復蛋白的共有序列的分離、重組和/或合成蛋白骨架。本發(fā)明的FN3骨架提供優(yōu)于常規(guī)治療劑的優(yōu)勢，如局部、口服或跨血腦屏障施用的能力、在大腸桿菌中表達從而允許隨資源而變的蛋白表達相對哺乳動物細胞表達增加的能力、工程改造成結合于多個靶標或相同靶標的多個表位的雙特異性分子的能力、結合于藥物、聚合物和探針的能力、配制成高濃度的能力和該分子有效地穿透患病組織的能力。此外，F(xiàn)N3骨架相對于模擬抗體的可變區(qū)的其折疊具有多種抗體特性。例如，F(xiàn)N3結構域的定向使得FN3環(huán)能夠類似于抗體互補決定區(qū)(CDR)暴露。該環(huán)區(qū)能夠結合于細胞靶標并且可改變，例如親和力成熟，以改進某些結合或相關特性。在一個實施方案中，本文所述的結合分子包含一個或多個FN3結構域。一方面，結合分子的FN3結構域源于Tencon的非天然存在FN結構域(SEQIDNO:1)。如同其它FN3結構域，Tencon具有β-夾層結構，該β-夾層結構具有由六個環(huán)(稱作AB、BC、CD、DE、EF和FG環(huán))連接的七個β-鏈(稱作A、B、C、D、E、F和G)(Bork和Doolittle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8990-8992(1992)和Koide等人的美國專利號6,673,901，其以引用的方式整體并入本文)。此六個環(huán)中的三個(即，BC、DE和FG環(huán))處于FN3結構域的頂部，并且這些環(huán)中的三個(即，AB、CD和EF環(huán))處于該FN3結構域的底部。這些環(huán)跨SEQIDNO:1的氨基酸殘基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81或所述氨基酸殘基周圍。優(yōu)選地，在SEQIDNO:1的殘基22-28、51-54和75-81處或周圍的環(huán)區(qū)針對在本文所述的結合分子中的結合特異性和親和力發(fā)生改變。一方面，本文所述的結合分子包括一個或多個包含替代骨架的結合結構域，該替代骨架包含在SEQIDNO:1的殘基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和/或75-81處或周圍的至少一個、至少兩個或所有三個環(huán)。一方面，結合分子包括一個或多個包含替代骨架的結合結構域，所述替代骨架包含在SEQIDNO:1的殘基22-28、51-54和75-81處或周圍的至少一個、至少兩個或所有三個環(huán)區(qū)。這些環(huán)區(qū)中的一個或多個用維持其作為骨架部分的序列的其它環(huán)區(qū)和/或其它鏈隨機化以填充文庫，并且可從對特定蛋白靶標具高親和力的文庫選擇有效粘合劑。該環(huán)區(qū)中的一個或多個可類似于抗體CDR與靶標蛋白的相互作用與該蛋白相互作用。如上文所討論，F(xiàn)N3結構域在分子的相對面上含有CDR樣環(huán)的兩個集合(即，BC、DE和FG環(huán)和AB、CD和EF環(huán))。環(huán)的兩個集合由形成FN3結構的中心的β-鏈分離。如同所述環(huán)，這些β-鏈可改變以增強結合特異性和親和力。優(yōu)選地，β鏈中的一些或全部表面暴露殘基隨機化而不影響(會最小程度地影響)骨架的固有穩(wěn)定性。β-鏈中的一個或多個可與靶標蛋白相互作用。骨架中的β-鏈提供扁平結合表面(與含有相鄰環(huán)的蛋白骨架中發(fā)現(xiàn)的彎曲結合表面相比)，該表面影響靶標蛋白或那些靶標蛋白上可由所述骨架有效地結合的特異性表位。一方面，本發(fā)明的結合分子包括包含替代骨架的結合結構域，該替代骨架包含一個或多個結合于細菌毒力因子(例如葡萄球菌白細胞毒素)的β-鏈。一方面，結合分子的第二結合結構域包含結合于具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA、具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB、具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD或具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE的FN3結構域?；蛘?，結合分子的第二結合結構域包含結合于包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA和具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB的LukAB復合物和/或包含具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE和具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD的LukED復合物的FN3結構域。一方面，結合分子的第二結合結構域與具有氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者的FN3結構域競爭結合于(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA；(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB；(iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD；和/或(iv)具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE。另一方面，結合分子包含(a)第一結合結構域，其包含(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH區(qū)；和(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL區(qū)；和(b)第二結合結構域，其包含氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者。在一個實施方案中，第二結合結構域包含氨基酸序列SEQIDNO:14或SEQIDNO:22。另一方面，結合分子包含一個或多個額外結合結構域，例如第三、第四、第五等結合結構域。額外結合結構域能夠結合于與該結合分子的第一結合結構域所結合不同的糖基化葡萄球菌表面蛋白，并且能夠結合于與該結合分子的第二結合結構域所結合不同的葡萄球菌白細胞毒素。換句話說，結合分子的每個接合結構域結合于獨特抗原。結合分子的額外結合結構域可為免疫球蛋白結構域、替代骨架結構域或其組合。一方面，結合分子不展現(xiàn)與其它葡萄球菌或宿主(例如人類)蛋白抗原的非特異性結合。例如，一方面，結合分子不能特異性結合于葡萄球菌蛋白A或免疫球蛋白的第二結合蛋白(Sbi)。另一方面，結合分子不能特異性結合于FcγRI，具體說來人類FcγRI。另一方面，結合分子確實保留特異性結合于FcRn的能力。本公開的結合分子可并入其它亞單位，例如經(jīng)由共價相互作用?？贵w恒定區(qū)的全部或一部分可連接于該結合分子以賦予抗體樣特性，例如補體活性(CDC)、半衰期等。例如，效應子功能可例如通過修飾Clq結合和/或FcγR結合并且由此改變補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性來提供和/或控制。“效應子功能”負責激活或削弱生物活性(例如，受試者中)。效應子功能的實例包括但不限于：Clq結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調等。效應子功能可需要Fc區(qū)與結合結構域(例如蛋白骨架環(huán))組合并且可使用多種分析(例如Fc結合分析、ADCC分析、CDC分析等)來評估。另外，毒素結合物、白蛋白或白蛋白粘合劑、聚乙二醇(PEG)分子可連接于結合分子用于所需特性。這些融合物中的任一種均可通過標準技術，例如通過由使用公開可得基因序列建構的重組融合基因表達結合分子來產生。本公開的結合分子可以單體形式呈單特異性使用或以多聚體形式呈雙特異性或多特異性(關于不同蛋白靶標或相同蛋白靶標上的表位)使用。連接可為共價或非共價。例如，二聚體雙特異性結合分子具有一個對第一靶標蛋白或表位具特異性的亞單位和對第二靶標蛋白或表位具特異性的第二亞單位。結合分子亞單位可以多種構象接合，構象可增加價態(tài)并且因此增加抗原結合的親合力。本公開的結合分子也可包含連接肽，該連接肽在所屬領域中已知連接蛋白或多肽結構域與生物活性肽，從而產生融合蛋白。該連接肽可用于由兩種不相關蛋白制造功能性融合蛋白，其保留兩種蛋白的活性。例如，特異性地結合于白細胞毒素的FN3結構域可借助于連接子融合至能夠結合于葡萄球菌表面蛋白的抗體、抗體片段、scFv或肽配體以形成融合蛋白，該融合蛋白結合于該葡萄球菌表面蛋白并且中和有害的白細胞毒素效應。融合蛋白可通過公認的克隆技術來制造。例如，編碼該連接肽的寡核苷酸接合于編碼所關注的結構域的基因之間以形成一種編碼完整單鏈蛋白的融合基因。連接子寡核苷酸的5'末端融合至第一基因的3'末端，并且連接子的3'末端融合至第二基因的5'末端。完整融合基因可借助于適當表達載體轉染至宿主細胞中。本發(fā)明的連接肽可在長度和氨基酸組成方面改變。例如，本發(fā)明的連接肽可為約2至約50個氨基酸長、約20至約45個氨基酸長、約25至約40個氨基酸長、約30至約35個氨基酸長、約24至約27個氨基酸長或約20個氨基酸長。大多數(shù)連接肽由氨基酸甘氨酸和絲氨酸中的一種或多種的重復模塊構成。示例性連接肽包括例如(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n和(Gly3-Ser)n，其中n為整數(shù)1-25。連接子的長度可適當?shù)丶右哉{節(jié)，只要其不影響多肽的功能。標準15個氨基酸的(Gly4-Ser)3連接肽已經(jīng)得到充分表征(例如，在抗體單鏈Fv(scFv)結構域的情形內)并且已經(jīng)顯示采用非結構化、柔性構象。此外，這種連接肽不會干擾其連接的結構域的組裝和結合活性(Freund等人,“CharacterizationoftheLinkerPeptideoftheSingle-ChainFvFragmentofanAntibodybyNMRSpectroscopy,”FEBS320:97(1993)，其公開內容以引用的方式整體并入本文)。因此，用于形成雙功能融合蛋白的尤其有效連接子包含Gly-Ser連接子。一方面，連接肽含有以下氨基酸序列(SEQIDNO:2)：-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-。然而，本發(fā)明的連接肽還涵蓋這種連接肽的變體形式，該變體形式可通過將一種或多種核苷酸取代、添加或缺失引入至編碼該連接肽的核苷酸序列中，使得一種或多種氨基酸取代、添加或缺失被引入至連接肽中而產生。例如，可通過標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變引入突變。優(yōu)選地，在一種或多種非必需氨基酸殘基處進行保守氨基酸取代，使得連接肽的能力不改變?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲邪被釟埢镁哂蓄愃苽孺湹陌被釟埢脫Q的取代。具有類似側鏈的氨基酸殘基的家族已經(jīng)在所屬領域中定義，包括堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在包含gly-ser基序(例如(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n和(Gly3-Ser)n)的肽連接子的情形內的保守氨基酸取代將包括Gly和/或Ser殘基用另一不帶電極性側鏈(即，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。本發(fā)明的結合分子優(yōu)選地為“分離的”結合分子?！胺蛛x的”當用于描述本文中公開的結合分子時意指已經(jīng)鑒定、從其產生環(huán)境的組分分離和/或回收的結合分子。優(yōu)選地，分離的結合分子不與來自其產生環(huán)境的所有其它組分締合。其產生環(huán)境的污染物組分(如由重組轉染細胞產生)為將典型地干擾關于多肽的診斷或治療用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質。在優(yōu)選實施方案中，結合分子將純化，(1)通過使用轉杯式測序儀至足以獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(2)通過在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或優(yōu)選地銀染色進行SDS-PAGE至均質性。然而，通常地，分離的結合分子將通過至少一個純化步驟來制備。預期本文所述的結合分子的氨基酸序列修飾。例如，可需要改進抗體的結合親和力和/或其它生物特性。結合分子的氨基酸序列變體通過將適當核苷酸改變引入至結合分子核酸中，或通過肽合成來制備。修飾包括例如所述結合分子的氨基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或取代。進行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終構建體，限制條件是最終構建體具有所需特征，如蛋白A結合和FcγRI結合的取消或蛋白酶抗性。證明對取代的功能敏感性的那些氨基酸位置接著通過在取代位點處或針對取代位點引入進一步或其它變體來改進。因此，雖然預定用于引入氨基酸序列變異的位點，但無需預定突變本身的性質。例如，為了分析在給定位點處突變的性能，在靶標密碼子或區(qū)域處進行Ala掃描或隨機誘變并且針對所需活性篩選表達的結合分子變體。優(yōu)選地，氨基酸序列插入包括長度介于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至含有一百個或更多殘基的多肽范圍內的氨基和/或羧基端融合物，以及單一或多個氨基酸殘基的序列內插入。本文中預期所述結合分子的其它修飾。例如，結合分子可連接于多種非蛋白聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。結合分子也可被截留于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊(分別例如羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或巨乳液中。此技術公開于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第16版,Oslo,A.編,(1980)中，此文獻以引用的方式整體并入本文。關于治療用途，本文所述的結合分子可制備為在藥學上可接受的載體中含有有效量的作為活性成分的結合分子的藥物組合物。術語“載體”是指用于施用活性化合物的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。媒介物可為液體，如水和油，油包括石油、動物、植物或合成起源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％生理鹽水和0.3％甘氨酸。這些溶液為無菌的并且一般不含微粒物質。其可通過常規(guī)、眾所周知的滅菌技術(例如過濾)來滅菌。該組合物可根據(jù)需要含有藥學上可接受的輔助物質至近似生理條件，如pH調節(jié)和緩沖劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、潤滑劑和著色劑等。該藥物制劑中本發(fā)明試劑的濃度可廣泛變化，即從少于約0.5％、通常或至少約1％至多達15或20重量％并且將主要根據(jù)所選的特定施用模式基于所需劑量、流體體積、粘度等加以選擇。合適的媒介物和制劑(包括其它人類蛋白，例如人類血清白蛋白)例如描述于例如REMINGTON:THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY,第21版,Troy,D.B.編,LipincottWilliamsandWilkins,2006,第5部分,PharmaceuticalManufacturing第691-1092頁,尤其參看第958-989頁中，其獻以引用的方式整體并入本文。本文所述的結合分子可以非分離或分離形式使用。此外，本文中結合分子可單獨或以包含至少一種本文中結合分子的混合物形式使用。換句話說，結合分子可組合使用，例如呈包含兩種或更多種本文中結合分子、其變體或片段的藥物組合物形式。例如，具有不同但互補活性的結合分子可組合于單一療法中以實現(xiàn)所需治療效應，但或者，具有同一活性的結合分子也可組合于單一療法中以實現(xiàn)所需預防、治療或診斷效應。任選地，混合物進一步包含至少一種其它治療劑。一方面，其它治療劑可為適用于葡萄球菌感染的預防和/或治療的抗感染劑、抗生素劑和/或抗微生物劑。另一方面，其它治療劑可為適用于與葡萄球菌感染有關的病狀的預防和/或治療的試劑。一種制造本文中結合分子的方法為本公開的額外部分。該方法包括步驟(a)在適用于制造結合分子的條件下培養(yǎng)包含含有編碼該結合分子的核酸序列的載體的宿主細胞，和(b)從培養(yǎng)物回收結合分子。宿主細胞優(yōu)選地為哺乳動物宿主細胞，如非人類哺乳動物宿主細胞。因此，另一方面涉及編碼結合分子(或其片段)的核酸分子。這些核酸分子可插入至載體(即，表達載體)中，并且接著在適當宿主細胞中轉化(或轉染)和/或在轉基因動物中表達。如此表達的結合分子(或其片段)可接著通過所屬領域中已知的方法分離。參看例如Maniatis等人,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL[第3版]ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)，其以引用的方式整體并入本文。本發(fā)明的重組載體包含呈適用于本發(fā)明核酸在宿主細胞中的表達的形式的核酸，其意指所述重組表達載體包括基于欲用于表達的宿主細胞所選擇的一個或多個調控序列，調控序列操作性連接于欲表達的核酸序列。在重組表達載體內，“操作性連接”意圖意指所關注的核苷酸序列以允許該核苷酸序列的表達的方式連接于調控序列(例如，在體外轉錄/翻譯系統(tǒng)中或當載體被引入至宿主細胞中時在宿主細胞中)。術語“調控序列”意圖包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。調控序列描述于例如GoeddelGENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress(1990)中，其以引用的方式整體并入本文。調控序列包括指導多種類型的宿主細胞中核苷酸序列的組成性表達的那些和指導某些宿主細胞中核苷酸序列的表達的那些(例如組織特異性調控序列)。所屬領域的技術人員應了解，表達載體的設計可取決于如欲轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白表達水平的因素。本發(fā)明的表達載體可引入至宿主細胞中以由此產生由如本文所述的核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。宿主細胞可用兩種或更多種如本文所述的表達載體共轉染，第一表達載體含有編碼操縱子和第一結合結構域(例如，結合于糖基化葡萄球菌表面蛋白的抗體或抗體片段)的DNA并且第二載體含有編碼操縱子和第二結合結構域(例如結合于葡萄球菌白細胞毒素的替代骨架，如FN3)的DNA。這兩種載體含有不同的可選標記物，但優(yōu)選地實現(xiàn)第一結合結構域和第二結合結構域多肽的大致相等表達?；蛘撸墒褂脝我惠d體，載體包括編碼第一結合結構域和第二結合結構域的DNA。第一結合結構域和第二結合結構域的編碼序列可包含cDNA、基因組DNA或兩者。本發(fā)明的重組表達載體可設計用于在原核或真核細胞中制造結合分子。例如，本發(fā)明的結合分子可在如大腸桿菌的細菌細胞、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。合適的宿主細胞進一步論述于Goeddel,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress(1990)中，其以引用的方式整體并入本文?；蛘撸亟M表達載體可體外轉錄和翻譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。原核生物中蛋白的表達最通常在大腸桿菌中用含有指導融合或非融合蛋白的表達的組成性或誘導性啟動子的載體進行。融合載體添加多個氨基酸至其中編碼的蛋白，至重組蛋白的氨基或羧基端。融合載體典型地用于三種目的：(i)增加重組蛋白的表達；(ii)增加重組蛋白的溶解度；和(iii)通過充當親和純化中的配體來幫助純化重組蛋白。通常，在融合表達載體中，蛋白水解裂解位點被引入融合部分和重組蛋白的結處以使得能夠在融合蛋白的純化之后使重組蛋白與融合部分分離。酶和其同源識別序列包括因子Xa、凝血酶、PreScission、TEV和腸激酶。典型融合表達載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith和Johnson,“Single-StepPurificationofPolypeptidesExpressedinEscherichiacoliasFusionsWithGlutathioneS-Transferase,”Gene67:31-40(1988)，其以引用的方式整體并入本文)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其分別融合谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A至靶標重組蛋白。重組哺乳動物表達載體能夠指導特定細胞類型中核酸的表達(例如使用組織特異性調控元件來表達核酸)。組織特異性調控元件是所屬領域中已知的。關于本文所述的結合分子的有效制造，優(yōu)選將編碼結合分子的核苷酸序列放置于針對所需宿主中的表達優(yōu)化的表達控制序列的控制下。例如，序列可包括優(yōu)化的轉錄和/或翻譯調控序列(例如改變的Kozak序列)。一種最大化大腸桿菌中的重組蛋白表達的策略是在具有削弱的蛋白水解裂解重組蛋白的能力的宿主細菌中表達該蛋白(參看例如Gottesman,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGYAcademicPress185:119-128(1990)，其以引用的方式整體并入本文)。另一種策略是改變欲插入至表達載體中的核酸的核酸序列，使得針對每種氨基酸的個別密碼子為優(yōu)先用于大腸桿菌中的那些(參看例如Wada等人,“CodonUsageTabulatedFromtheGenBankGeneticSequenceData,”Nucl.AcidsRes.20:2111-2118(1992)，其以引用的方式整體并入本文)。核酸序列的改變可通過標準DNA合成技術來進行。另一種解決密碼子偏好的策略是通過使用BL21-密碼子加上細菌株(Invitrogen)或Rosetta細菌株(Novagen)，這些菌株含有罕見大腸桿菌tRNA基因的額外拷貝。編碼本文所述的結合分子的表達載體可為酵母表達載體。用于酵母釀酒酵母中的表達的載體的實例包括pYepSec1(Baldari等人,“ANovelLeaderPeptideWhichAllowsEfficientSecretionofaFragmentofHumanInterleukin1betainSaccharomycescerevisiae,”EMBOJ.6:229-234(1987)，其以引用的方式整體并入本文)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,“StructureofaYeastPheromoneGene(MFalpha):aPutativeAlpha-FactorPrecursorContainsFourTandemCopiesofMatureAlpha-Factor,”Cell30:933-943(1982)，其以引用的方式整體并入本文)、pJRY88(Schultz等人,“ExpressionandSecretioninYeastofa400-kDaEnvelopeGlycoproteinDerivedFromEpstein-BarrVirus,”Gene54:113-123(1987)，其以引用的方式整體并入本文)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA.)和picZ(InvitrogenCorp,SanDiego,CA.)或者，本文所述的結合分子可在昆蟲細胞中使用桿狀病毒表達載體來制造。可用于培養(yǎng)的昆蟲細胞(例如SF9細胞)中蛋白的表達的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人,“ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCellsInfectedWithaBaculovirusExpressionVector,”Mol.Cell.Biol.3:2156-2165(1993)，其以引用的方式整體并入本文)和pVL系列(Luckow等人,“HighLevelExpressionofNonfusedForeignGenesWithAutographacalifornicaNuclearPolyhedrosisVirusExpressionVectors,”Virology170:31-39(1989)，其以引用的方式整體并入本文)。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸在哺乳動物細胞中使用哺乳動物表達載體表達。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed,B.,“AnLFA-3cDNAEncodesaPhospholipid-LinkedMembraneProteinHomologoustoitsReceptorCD2,”Nature329:840(1987)，其以引用的方式整體并入本文)和pMT2PC(Kaufman等人,“TranslationalEfficiencyofPolycistronicmRNAsandTheirUtilizationtoExpressHeterologousGenesinMammalianCells,”EMBOJ.6:187-193(1987)，其以引用的方式整體并入本文)、pIRESpuro(Clontech)、pUB6(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)pREP4(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)。當用于哺乳動物細胞中時，表達載體的控制功能通常由病毒調控元件提供。例如，通常使用的啟動子源于多形瘤、腺病毒2、巨細胞病毒、勞氏肉瘤病毒和猿猴病毒40。關于用于原核細胞和真核細胞的其它合適表達系統(tǒng)，參看例如Sambrook等人(編),MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第3版)ColdSpringHarborLaboratory(2001)，其以引用的方式整體并入本文。宿主細胞可為任何原核細胞或真核細胞。例如，本發(fā)明的結合分子可在如大腸桿菌的細菌細胞、昆蟲細胞、酵母、植物或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、COS、HEK293細胞)中制造。其它合適的宿主細胞為所屬領域的技術人員已知的。載體DNA可經(jīng)由常規(guī)轉化或轉染技術引入至原核細胞或真核細胞中。如本文所用，術語“轉化”和“轉染”意圖指多種用于將外來核酸(例如DNA)引入至宿主細胞中的公認技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體轉染或電穿孔。用于轉化或轉染宿主細胞的合適方法可發(fā)現(xiàn)于Sambrook等人[編],MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第3版)冷泉港實驗室和其它實驗室手冊(2001)，其以引用的方式整體并入本文。可使用任何用于將外來核苷酸序列引入至宿主細胞中的眾所周知的程序。這些程序包括使用磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、血漿載體、病毒載體和任何用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外來遺傳材料引入至宿主細胞中的其它眾所周知的方法。參看例如Sambrook等人(編)MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第3版)ColdSpringHarborLaboratory(2001)和Walker和PapleyMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY(第5版)RoyalSocietyofChemistry(2009)，其以引用的方式整體并入本文。唯一有必要的是，所用的特定基因工程改造程序能夠成功地將至少一種核酸分子引入至能夠表達所關注的一種或多種結合分子的宿主細胞中。關于哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉染，已知視所用的表達載體和轉染技術而定，僅一小部分的細胞可將外來DNA整合至其基因組中。為了鑒定并且選擇這些整合體，編碼可選標記物的基因(例如抗生素抗性)一般連同所關注的基因被引入至宿主細胞中。各種可選標記物包括對如G418、潮霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素和甲氨蝶呤的藥物賦予抗性的那些。編碼可選標記物的核酸可被引入至宿主細胞中與編碼如本文所述的一種或多種結合分子的載體相同的載體上，或可被引入至獨立載體上。用所引入的核酸穩(wěn)定轉染的細胞可通過藥物選擇來鑒定(例如，已經(jīng)并入可選標記物基因的細胞將存活，而其它細胞死亡)。本發(fā)明的宿主細胞，如培養(yǎng)的原核或真核宿主細胞可用于制造(即，表達)本發(fā)明的結合分子。相應地，本發(fā)明進一步提供使用本發(fā)明的宿主細胞來制造本發(fā)明的結合分子的方法。在一個實施方案中，該方法包括在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞(其中已經(jīng)引入編碼如本文所述的結合分子的重組表達載體)，使得制造一種或多種本發(fā)明的結合分子。在另一實施方案中，該方法進一步包括從培養(yǎng)基或宿主細胞分離本發(fā)明的結合分子。在表達載體被引入至細胞中之后，轉染的細胞在有利于所關注的一種或多種結合分子的表達的條件下培養(yǎng)，結合分子接著使用標準技術從培養(yǎng)物回收。該技術的實例為所屬領域中眾所周知的(參看例如Zuker等人的WO00/06593，其以引用的方式整體并入本文)。此外，本發(fā)明的結合分子可用于治療、預防或改善葡萄球菌感染。葡萄球菌感染可由任何葡萄球菌屬引起。一方面，葡萄球菌感染由金黃色葡萄球菌(包括金黃色葡萄球菌的MRSA和MSSA菌株)引起。相應地，本公開提供一種用于治療、預防或改善葡萄球菌感染的方法，該方法涉及向有需要的受試者施用如本文所述的結合分子。根據(jù)這一方面，靶標“受試者”涵蓋任何動物，例如哺乳動物，如人類。在出于預防受試者中的葡萄球菌感染的目的施用本發(fā)明的組合物的情形中，靶標受試者涵蓋處于感染葡萄球菌或發(fā)展葡萄球菌感染的風險中的任何受試者。易感性受試者包括嬰兒和青少年，以及免疫受損的青少年、成人和老年人。然而，處于發(fā)展葡萄球菌感染的風險中的任何嬰兒、青少年、成人或老年人或免疫受損個體均可根據(jù)本文所述的方法進行治療。在出于治療受試者中的葡萄球菌感染的目的施用本發(fā)明的組合物的情形中，靶標受試者群體涵蓋感染葡萄球菌的任何受試者。尤其合適的受試者包括處于感染風險中的那些或感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)的那些。其它合適的受試者包括可具有由葡萄球菌感染引起的病狀或處于發(fā)展由葡萄球菌感染引起的病狀的風險中的那些受試者，該病狀即葡萄球菌相關病狀，例如皮膚傷口和感染、組織膿腫、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、燙傷樣皮膚綜合征、敗血病、膿毒性關節(jié)炎、心肌炎、心內膜炎和中毒性休克綜合征。在一個實施方案中，預防性施用本文所述的結合分子以預防、延遲或抑制處于發(fā)展葡萄球菌感染或相關病狀的風險中的受試者中葡萄球菌感染的發(fā)展。一方面，一種或多種本文所述的結合分子的預防性施用有效地完全預防個體中的金黃色葡萄球菌感染。在其它實施方案中，預防性施用有效地預防將在其它情況下在施用不存在下發(fā)展的全感染程度，即大致預防、抑制或最小化個體中的葡萄球菌感染。在另一實施方案中，本文所述的結合分子治療性施用于具有葡萄球菌感染的個體以抑制感染的進展和進一步發(fā)展，即抑制和/或預防感染擴展至個體中的其它細胞、減少感染和治療或緩解感染的一種或多種癥狀。本文所述的結合分子的治療有效量可根據(jù)標準程序來確定，該標準程序考慮多種因素，包括例如藥物組合物中結合分子的濃度、施用模式和頻率、欲治療(或預防)的葡萄球菌感染的嚴重程度和受試者詳情(如年齡、重量和總體健康狀況和免疫病狀)。一般指導可發(fā)現(xiàn)于例如國際協(xié)調會議(InternationalConferenceonHarmonization)的公布中和REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPublishingCompany1990)(其以引用的方式整體并入本文)中。臨床醫(yī)生可以單一劑量施用包含本文所述的結合分子的組合物或根據(jù)多劑量方案施用該組合物直至達到提供所需或需要的預防或治療效應的劑量。這種療法的進展可容易通過常規(guī)分析來監(jiān)測。在預防性應用中，以相對不頻繁的時間間隔在一段長時期內施用相對低劑量。在治療性應用中，有時需要在相對短時間間隔下的相對高劑量，直至疾病的進展減小或終止，并且優(yōu)選地直至受試者顯示疾病癥狀的部分或完全改善。本發(fā)明的治療組合物可單獨或作為聯(lián)合一種或多種其它活性劑的組合療法的一部分施用，視所治療的葡萄球菌感染的性質而定。所述額外活性劑包括所屬領域中容易知曉的抗感染劑、抗生素劑和抗微生物劑。本文所述的結合分子的施用模式可為遞送所述結合分子至宿主的任何合適途徑，如腸胃外施用，例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內或皮下、肺；經(jīng)粘膜(口服、鼻內、陰道內、直腸)；使用呈片劑、膠囊劑、溶液劑、粉劑、凝膠劑、顆粒劑形式的制劑；和含于注射器、植入器件、滲透泵、藥筒、微型泵中；或熟練技術人員所了解的其它方式，如所屬領域中眾所周知。位點特異性施用可通過例如關節(jié)內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、大腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心臟內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網(wǎng)膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、血管內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經(jīng)皮遞送實現(xiàn)。本文所提供的結合分子也可用于診斷受試者中的葡萄球菌感染的方法中。一方面，用于診斷葡萄球菌感染的方法涉及使如本文所述的結合分子與來自欲診斷的受試者的樣品接觸，和檢測該樣品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素，即檢測樣品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的存在或不存在?；谶@種檢測在受試者中診斷葡萄球菌感染。換句話說，糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的檢測指示葡萄球菌感染的陽性診斷。根據(jù)這一方面，來自受試者的樣品可包含血液、組織、細胞、血清或其它生物樣品。另一方面涉及一種用于檢測樣品中的葡萄球菌感染的方法。這種方法涉及使如本文所述的結合分子與樣品接觸，和檢測糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的存在或不存在。糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的檢測指示樣品中葡萄球菌的存在。根據(jù)這一方面，樣品可為獲自環(huán)境、動物或人類的任何生物樣品。本文所述的涉及檢測來自受試者或別處的樣品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的方法涉及使用可檢測性標記的結合分子。相應地，一方面，如本文所述的結合分子可偶聯(lián)于可檢測標記。合適的可檢測標記為所屬領域中眾所周知的并且包括可檢測標簽(例如聚組氨酸(His6–)標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST–)標簽或麥芽糖結合蛋白(MBP–)標簽)；放射性標記(例如碳(14C)或磷(32P))；熒光標記(例如熒光素和其衍生物、熒光素異硫氰酸酯、若丹明和其衍生物、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白)；發(fā)光標記(例如魯米諾)；生物發(fā)光標記(例如熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白)；或酶標記(例如熒光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶)。或者，結合分子可由可檢測標記結合，例如由含有可檢測標記的二次抗體結合。用于檢測結合于樣品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素的標記的結合分子的檢測分析為所屬領域中眾所周知的并且包括例如免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或熒光激活細胞分選(FACS)。此外，本發(fā)明的結合分子可用于預防葡萄球菌感染。這種方法涉及使如本文所述的結合分子與來自受試者的樣品接觸，和由于所述接觸檢測該樣品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素。如果在受試者樣品中檢測到糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白細胞毒素，那么將適用于預防葡萄球菌感染的試劑施用于所述受試者。示例性預防劑包括但不限于：本文所述的結合分子、一種或多種抗生素(例如莫匹羅星、萘夫西林、頭孢唑林、雙氯西林、氯林肯霉素、萬古霉素、利奈唑胺、利福平、新諾明-三甲氧芐二氨嘧啶)和/或有效對抗葡萄球菌感染的其它抗感染劑。實施例下文提供實施例以說明本發(fā)明。這些實施例并未意圖將本發(fā)明限于任何特定應用或操作理論。實施例1.結合并且中和白細胞毒素的纖連蛋白III型(FN3)結構域的建構和選擇。Tencon(SEQIDNO：1)為由來自人類肌腱蛋白C的十五個FN3結構域的共有序列設計的免疫球蛋白樣骨架、纖連蛋白III型(FN3)結構域(Jacobs等人，“DesignofNovelFN3DomainsWithHighStabilitybyaConsensusSequenceApproach，”ProteinEngineering，Design，andSelection25：107-117(2012)，其公開內容以引用的方式整體并入本文)。Tencon的晶體結構顯示連接七個β-鏈的六個表面暴露環(huán)。這些環(huán)或在各環(huán)內的所選殘基可隨機化以便建構可用于選擇結合于LukAB、LukD或LukE的新穎分子的纖連蛋白III型(FN3)結構域文庫。Tencon：LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQIDNO：1)程序TCL7(TCL18)和TCL9(TCL17)文庫的建構。建構經(jīng)過設計以僅隨機化Tencon的F：G環(huán)TCL9(TCL17)或BC和FG環(huán)的組合TCL7(TCL18)的文庫以用于順式展示系統(tǒng)(Odegrip等人，“CISDisplay：InVitroSelectionofPeptidesFromLibrariesofProtein-DNAComplexes，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：2806-2810(2004)，其公開內容以引用的方式整體并入本文)。在這種系統(tǒng)中，產生針對Tac啟動子、Tencon文庫編碼序列、RepA編碼序列、順式元件和ori元件的線性雙鏈DNA并入序列。在體外轉錄/翻譯系統(tǒng)中表達后，形成FN3結構域-RepA融合蛋白的復合物，該RepA融合蛋白順式結合于用于對其進行編碼的DNA。接著分離結合于靶標分子的復合物并且通過如下文所述的聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增。使用Slonomics技術(SloningBiotechnologyGmbH)合成編碼具有隨機化BC或FG環(huán)序列的Tencon基因序列的DNA片段以便控制文庫的氨基酸分布并且消除終止密碼子。隨機化BC環(huán)或FG環(huán)的DNA分子的兩個不同集合獨立地合成并且稍后如下文所述進行組合，使得產生具有環(huán)長度的不同組合的文庫。下表1概述了這些Tencon環(huán)文庫的設計特征。表1.TCL7(TCL18)和TCL9(TCL17)文庫的BC和FG環(huán)的設計的氨基酸序列。顯示非隨機化TenconBC和FG環(huán)的序列以用于比較。X表示缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸的18種氨基酸的混合物。FG環(huán)文庫(TCL9(TCL17))的產生。產生合成DNA分子的集合，該分子由5’Tac啟動子、隨后Tencon的完全基因序列(除FG環(huán)中的隨機化密碼子以外)組成(Diem等人的美國專利公布號2013/0079243，其以引用的方式整體并入本文)。關于FG環(huán)隨機化，除了半胱氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸以相等百分比編碼。多樣化部分的長度使得其編碼FG環(huán)中的7、8、9、10、11或12個氨基酸。每個長度變化的子文庫單獨地以2ug的規(guī)模合成并且接著通過PCR使用oligosSloning-FOR和Sloning-Rev擴增。文庫的3’片段為含有用于展示的元件的恒定DNA序列，該元件包括PspOMI限制位點、repA基因的編碼區(qū)和順式和ori元件。執(zhí)行PCR反應以使用質粒(pCR4Blunt)(Invitrogen)作為模板由M13正向和M13反向引物擴增這一片段。所得PCR產物通過PspOMI消化過夜并且凝膠純化。為了接合文庫DNA的5’部分至含有repA基因的3’DNA，在NotI和PspOMI酶和T4連接酶存在下在37℃下將2pmol(約540ng至560ng)的5’DNA接合至相等摩爾(約1.25ug)的3’repADNA過夜。接合的文庫產物通過使用12個PCR循環(huán)用oligosPOP2250(SEQIDNO:6)和DigLigRev(SEQIDNO:7)擴增。關于每個子文庫，組合來自12個PCR反應的所得DNA并且通過Qiagen離心柱純化。關于TCL9(TCL17)的各子文庫的產量介于32-34ug范圍內。TCL7(TCL18)文庫建構。TCL7(TCL18)文庫提供具有隨機化TenconBC和FG環(huán)的文庫。在這一文庫中，長度6-9個氨基酸的BC環(huán)與7-12個氨基酸長的隨機化FG環(huán)組合性混合。產生合成Tencon片段BC6、BC7、BC8和BC9(分別為SEQIDNO:80-83)以包括編碼蛋白的N端部分直至并且包括殘基VX的Tencon基因，使得BC環(huán)用6、7、8或9個隨機化氨基酸置換。這些片段在L17A、N46V和E86I突變(CEN5243)的發(fā)現(xiàn)之前合成，但這些突變在下文所述的分子生物學步驟中引入。為了組合這一片段與編碼隨機化FG環(huán)的片段，進行以下步驟。首先，通過PCR使用oligosPOP2222ext(SEQIDNO:85)和LS1114(SEQIDNO:86)產生編碼Tac啟動子和Tencon的5’序列直至編碼氨基酸A17的核苷酸的DNA片段(130聚體-L17A)(SEQIDNO:84)。進行此舉以在文庫中包括L17A突變。接著，通過PCR使用作為模板的BC6、BC7、BC8或BC9和oligosLS1115(SEQIDNO:87)和LS1117(SEQIDNO:88)擴增編碼Tencon殘基R18-V74的DNA片段(包括隨機化BC環(huán))。這一PCR步驟在3’末端引入BsaI位點。這些DNA片段隨后通過重疊PCR使用oligosPOP2222ext和LS1117作為引物來接合。匯集所得240bp的PCR產物并且通過QiagenPCR純化試劑盒純化。純化的DNA用BsaI-HF消化并且凝膠純化。編碼FG環(huán)的片段通過PCR使用作為模板的FG7、FG8、FG9、FG10、FG11和FG12用寡核苷酸SDG10(SEQIDNO:89)和SDG24(SEQIDNO:90)擴增以并入BsaI限制位點和N46V和E86I變異。消化的BC片段和FG片段以16種可能的組合接合在一起，呈兩種BC環(huán)長度與2種FG環(huán)長度的組合的4種接合反應。各接合含有約300ng的總BC片段和300ng的FG片段。這4種接合方案接著通過PCR使用oligosPOP2222(SEQIDNO:5)和SDG28(SEQIDNO:91)擴增。7.5ug的每種反應產物接著用Not1消化并且用QiagenPCR純化柱凈化。5.2ug的這種DNA接合至相等摩爾量的用PspOMI消化的RepADNA片段(約14ug)并且產物通過PCR使用oligosPOP2222擴增。TCL19、TCL21、TCL23和TCL24文庫的設計。欲以特定文庫設計隨機化的殘基的選擇控制了所產生的相互作用表面的總體形狀。含有從其中BC、DE和FG環(huán)隨機化的文庫選擇以結合麥芽糖結合蛋白(MBP)的骨架蛋白的FN3結構域的X射線結晶學分析顯示具有大的彎曲界面，該界面適合MBP的活性位點(Koide等人,“High-AffinitySingle-DomainBindingProteinsWithaBinary-CodeInterface,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:6632-6637(2007)，其以引用的方式整體并入本文。相比之下，發(fā)現(xiàn)所選的結合于MBP的錨蛋白重復序列骨架蛋白具有平坦得多的相互作用表面并且結合于遠離活性位點的MBP外表面(Binz等人,High-AffinityBindersSelectedFromDesignedAnkyrinRepeatProteinLibraries,”Nat.Biotechnol.22:575-82(2004)，其以引用的方式整體并入本文)。這些結果表明骨架分子的結合表面的形狀(彎曲相對平坦)可規(guī)定何種靶標蛋白或那些靶標蛋白上的特異性表位能夠由骨架有效地結合。公布的圍繞工程改造含有用于蛋白結合的FN3結構域的蛋白骨架的努力已經(jīng)依賴于工程改造用于靶標結合的相鄰環(huán)，因此產生彎曲結合表面。這種方法可限制骨架可接近的靶標和表位的數(shù)目。Tencon和其它FN3結構域含有位于分子的相對面上的CDR樣環(huán)的兩個集合，第一個集合由BC、DE和FG環(huán)形成，并且第二個集合由AB、CD和EF環(huán)形成。這些環(huán)的兩個集合由形成FN3結構的中心的β-鏈分離。這種略微凹入的表面通過CD和FG環(huán)和兩個反向平行β-鏈C和Fβ-鏈形成，并且在本文中稱為C-CD-F-FG表面。C-CD-F-FG表面可用作模板以通過隨機化形成表面的殘基的子集設計蛋白骨架相互作用表面的文庫。β-鏈具有重復結構，該結構具有暴露于蛋白的表面的所有其它殘基的側鏈。因此，可通過隨機化β鏈中的一些或全部表面暴露殘基來產生文庫。通過選擇β-鏈中的適當殘基，Tencon骨架的固有穩(wěn)定性應最小程度地受損，同時提供用于與其它蛋白相互作用的獨特骨架表面?；谶@種前體的文庫(稱為TCL14)先前描述于Diem等人的US2013/0079243A1中，其以引用的方式整體并入本文。接著根據(jù)與TCL14的文庫極其類似的設計產生新的文庫。盡管所用的TCL14簡并NNS密碼子以多樣化Tencon骨架，但使用利用Slonomics技術(SloningBiotechnologyGmbH)合成的編碼Tencon基因的DNA片段產生TCL19(SEQIDNO：86)以便控制文庫的氨基酸分布并且消除終止密碼子。因此，下文中以“X”實現(xiàn)的各位置用18種氨基酸的等量混合物(無半胱氨酸或甲硫氨酸)置換。TCL19：LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT(SEQIDNO：92)；其中“X”為18種氨基酸的等量混合物(無半胱氨酸或甲硫氨酸)。表2.產生類似設計的兩種額外Tencon文庫。這兩種文庫TCL21和TCL23在與TCL14相同的位置處隨機化(描述于Diem等人的US2013/0079243A1中，其以引用的方式整體并入本文)；然而，存在于這些位置處的氨基酸的分布發(fā)生改變(下表3)。TCL21是設計為在每一個位置處包括18種天然氨基酸的等量分布(每一種5.55％)，僅排除半胱氨酸和甲硫氨酸。TCL23是設計成使得每個隨機化位置接近在如表3中所述的功能性抗體的CDR—H3環(huán)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸分布(Birtalan等人，“TheIntrinsicContributionsofTyrosine，Serine，GlycineandArgininetotheAffinityandSpecificityofAntibodies，”JournalofMolecularBiology377：1518-1528(2008)，其以引用的方式整體并入本文)。如同TCL21文庫一樣，排除半胱氨酸和甲硫氨酸。建立第三種額外文庫以擴展TCL21文庫的潛在靶標結合表面。在這種文庫TCL24中，如與文庫TCL14、TCL21和TCL23相比，4個額外Tencon位置隨機化。這些位置包括來自D鏈的N46和T48和來自G鏈的S84和I86。具體來說選擇位置46、48、84和86，因為這些殘基的側鏈從β-鏈D和G表面暴露并且在結構上位于與C和F鏈的隨機化位置相鄰處，因此增加可接近用于結合于靶標蛋白的表面積。在TCL24的每個位置處所用的氨基酸分布與關于TCL21和在表3中所述的氨基酸分布同一。TCL24：LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIXLXVPGSERSYDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLXAXFTT(SEQIDNO：667)其中“X”表示18種天然氨基酸的等量混合物。表3.在TCL21、TCL23和TCL24的各隨機化位置處的氨基酸出現(xiàn)率(％)。TCL21、TCL23和TCL24文庫的產生。使用Colibra文庫技術(Isogenica)產生TCL21文庫以便控制氨基酸分布。使用Slonomics技術(Morphosys)產生TCL23和TCL24基因片段以控制氨基酸分布。在初始合成、隨后接合至用于RepA的基因之后使用PCR來擴增各文庫以便用于使用如先前所述的CIS-展示系統(tǒng)的選擇(Odegrip等人,“CISDisplay:InVitroSelectionofPeptidesFromLibrariesofProtein-DNAComplexes,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2806-2810(2004)，其以引用的方式整體并入本文)。文庫篩選。使用順式展示從TCL17、TCL18和TCL19文庫選擇白細胞毒素結合結構域。重組LukA’B類毒素復合物(SEQIDNO:10和11)、LukD(SEQIDNO:12)和LukE(SEQIDNO:13)白細胞毒素使用標準方法進行生物素標記并且用于淘選。盡管修飾的LukA’B類毒素復合物用于本發(fā)明實施例中的淘選，已經(jīng)確認未修飾LukAB毒素的結合和/或中和。關于體外轉錄和翻譯(ITT)，2-6μg文庫DNA用總體積為100μL的0.1mM完整氨基酸、1XS30預混合組分和30μLS30萃取物(Promega)孵育并且在30℃下孵育。1小時后，添加450μL阻斷溶液(PBSpH7.4，補充有2％牛血清白蛋白、100μg/mL鯡魚精DNA和1mg/mL肝素)并且反應在冰上孵育15分鐘。關于結合，500μL阻斷的ITT反應物與100μL生物素標記的白細胞毒素混合并且在室溫下孵育1小時，之后用磁性中性親和素或抗生蛋白鏈菌素珠粒(Promega和Invitrogen)下拉結合的復合物。通過用PBST和PBS連續(xù)洗滌來去除未結合的文庫成員。在洗滌五輪、七輪和九輪之后，通過加熱至65℃持續(xù)10分鐘從結合的復合物洗脫DNA，通過PCR擴增，并且通過限制消化和接合連接于編碼RepA的DNA片段以用于其它數(shù)輪淘選(當repA并入文庫中時，這一步驟為任選的)。通過在各輪期間從400nM至2.5nM連續(xù)降低靶標白細胞毒素的濃度并且增加洗滌嚴格程度來分離高親和力粘合劑。通過七個(LukE)和九個(LukAB和LukD)連續(xù)輪執(zhí)行淘選。在淘選之后，通過PCR使用oligosMDD40(SEQIDNO:8)和MDD62(SEQIDNO:9)擴增所選的FN3結構域，亞克隆至經(jīng)過修飾以包括連接酶獨立性克隆位點的pET載體中，并且使用標準分子生物學技術轉化至BL21-GOLD(DE3)(Stratagene)細胞中以用于大腸桿菌中的可溶性表達。編碼C端聚組氨酸標簽的基因序列添加至各FN3結構域中以使得能夠純化和檢測。培養(yǎng)物在補充有100μg/mL羧芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中在1mL96孔板中在37℃下生長至0.6-0.8的光學密度，接著添加IPTG至1mM，此時溫度降至30℃。大約16小時后通過離心收集細胞并且在-20℃下冷凍。通過在室溫下在振蕩下在0.6mLHT溶解緩沖液(NovagenEMDBiosciences)中孵育各球粒持續(xù)45分鐘來實現(xiàn)細胞溶解。通過ELISA確認鎳純化的FN3結構域的抗原結合。結果在各毒素/類毒素分子的順式展示淘選之后，通過ELISA鑒定結合于LukA’B(類毒素)、LukD和LukE的FN3結構域。鑒定粘合劑的DNA序列并且分離獨特序列。鑒定由這些序列表達的單體蛋白并且確認預期分子量?？乖Y合、序列鑒定號和單體FN3結構域報告于表4中。表4.結合于LukAB、LukD和LukE的FN3結構域的表征。結合LukAB、LukD和LukE的額外FN3結構域在下文表6中作為SEQIDNO:113-666公開。概述順式展示淘選成功地鑒定了靶向LukA’B(4)、LukD(7)和LukE(35)的序列獨特、單體、staph白細胞毒素結合FN3結構域，如通過ELISA所檢測。實施例2.通過抗LukDFN3結構域中和白細胞毒素介導的免疫細胞殺滅。為了評估分離的抗LukDFN3結構域的功能性，開發(fā)基于細胞的細胞毒性中和分析。使用三種類型的FN3結構域，不具有連接子的FN3結構域和具有GS或GSM連接子的FN3結構域。程序為了針對中和活性篩選抗LukDFN3結構域，在冰上用最終體積為30μl的遞增濃度的不同F(xiàn)N3結構域孵育75nMLukED；殺滅100％細胞所需的劑量或LD100。新鮮分離的原代人類中性粒細胞(hPMN)(2×105個細胞于70μlRPMI+10mMHEPES+0.1％HAS中)接著添加至毒素-FN3結構域混合物中。在37℃5％CO2孵育器中孵育1h之后，10μlCellTiterAQONE溶液(Promega)添加至細胞中并且孵育1小時。CellTiter為通過監(jiān)測細胞代謝活性來評估細胞存活力的比色分析。比色反應使用PerkinElmerEnvisionMultilabel讀取器在492nm下測量。百分比活細胞使用以下等式來計算：％存活力＝100×[(Ab492樣品-Ab492TritonX100)/(Ab492組織培養(yǎng)基)]。膜損傷還通過監(jiān)測孵育后一小時的乳酸脫氫酶(LDH)釋放來測量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH試劑(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室溫下再孵育30min。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel讀取器(激發(fā)555nm、發(fā)射590nm)測量LDH活性并且數(shù)據(jù)針對由0.1％v/vTriton-X100誘導的100％PMN溶解標準化。結果如圖1所示，分析所選的抗LukDFN3結構域中和LukED對人類PMN的細胞毒性活性的能力。發(fā)現(xiàn)三種所選的抗LukDFN3結構域(Luk10、Luk12和Luk22)阻斷LukED介導的hPMN殺滅。當測量細胞代謝(CellTiter)以及膜損傷(LDH)時觀察到這種抑制作用。與抗LukDFN3結構域形成對比，使用TENCON對照FN3結構域未觀察到中和。概述如所預期，TENCON分子不能阻斷LukED的細胞毒性潛能。相比之下，所選的抗LukDFN3結構域中和LukED，無論其是否融合至連接子?？筁ukDFN3結構域以劑量依賴性方式阻斷LukED介導的細胞毒性。出于說明性目的，選擇Luk12抗LukDFN3結構域用于產生mAb-FN3結構域結合物。實施例3.通過抗LukABFN3結構域中和白細胞毒素介導的免疫細胞殺滅。為了評估分離的抗LukA’BFN3結構域的功能性，開發(fā)并且使用基于細胞的細胞毒性中和分析。使用三種類型的FN3結構域，不具有連接子的FN3結構域和具有GS或GSM連接子的FN3結構域。程序為了針對中和活性篩選抗LukA’BFN3結構域，在冰上用遞增濃度的FN3結構域Luk17的不同型式(+/-連接子)在96孔黑色孔透明底部組織培養(yǎng)物處理的板中孵育18.75nM活性LukAB毒素(LD100)持續(xù)30分鐘。在無酚紅RPMI+10mMHEPES+0.1％HSA中的2×105個新鮮分離的原代hPMN接著添加至毒素-FN3結構域復合物中并且樣品在37℃5％CO2孵育器中孵育一小時。膜損傷通過兩種分析評估：溴化乙錠滲透性和乳酸脫氫酶(LDH)釋放。溴化乙錠滲透性使用PerkinElmerEnvisionMultilabel讀取器(激發(fā)530nm、發(fā)射590nm)測量。LDH釋放至培養(yǎng)物上清液中也在孵育后一小時測量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH試劑(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室溫下再孵育30分鐘。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel讀取器(激發(fā)555nm、發(fā)射590nm)測量LDH活性并且數(shù)據(jù)針對由0.1％v/vTriton-X100誘導的100％PMN溶解標準化。結果如圖2所示，分析Luk17抗LukABFN3結構域中和LukAB對人類PMN的細胞毒性活性的能力。發(fā)現(xiàn)抗LukABFN3結構域阻斷LukAB介導的hPMN殺滅，如通過溴化乙錠滲透性和LDH釋放所評估。相比之下，使用對照FN3結構域分子未觀察到中和。概述如所預期，TENCON分子不能阻斷LukAB的細胞毒性潛能。相比之下，抗LukABFN3結構域(無論其是否融合至連接子)中和LukAB細胞毒性?？筁ukABFN3結構域以劑量依賴性方式阻斷LukAB介導的細胞毒性。出于說明性目的，選擇Luk17抗LukABFN3結構域用于產生mAB-FN3結構域結合物。實施例4：通過抗LukEFN3結構域中和白細胞毒素介導的免疫細胞殺滅。為了評估分離的抗LukEFN3結構域的功能性，使用關于抗LukDFN3結構域的評估所述的相同的基于細胞的細胞毒性中和分析。出于說明性目的，使用五種抗LukEFN3結構域(無連接子的FN3結構域)。程序為了針對中和活性篩選抗LukEFN3結構域，在冰上用最終體積為30μl的遞增濃度的不同F(xiàn)N3結構域孵育75nMLukED持續(xù)30分鐘；殺滅100％細胞所需的劑量或LD100。新鮮分離的原代hPMN(2×105個細胞于70μlRPMI+10mMHEPES+0.1％HAS中)接著添加至毒素-FN3結構域混合物中。在37℃5％CO2孵育器中孵育1h之后，經(jīng)由乳酸脫氫酶(LDH)釋放監(jiān)測細胞膜去穩(wěn)定化。LDH釋放至培養(yǎng)物上清液中在孵育后一小時測量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH試劑(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室溫下再孵育30min。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel讀取器(激發(fā)555nm、發(fā)射590nm)測量LDH活性并且數(shù)據(jù)針對由0.1％v/vTriton-X100誘導的100％PMN溶解標準化。結果分析所選的抗LukEFN3結構域中和LukED對人類PMN的細胞毒性活性的能力。發(fā)現(xiàn)所有所測試的抗LukEFN3結構域均阻斷LukED介導的hPMN殺滅(圖3)。概述由抗LukEFN3結構域進行的LukED中和為劑量依賴性的。在所測試的FN3結構域中，抗LukEFN3結構域Luk26、Luk27和Luk38展現(xiàn)最高中和活性。實施例5.融合蛋白的建構。利用描述于Throsby等人的美國專利號8,460,666(其以引用的方式整體并入本文)中的mAb5133(SEQIDNO:60和61)設計構建體，目的是經(jīng)由FabV-區(qū)銜接Staph抗原并且具有連接于輕鏈C端或重鏈C端的白細胞毒素中和構建體。下表5概述了設計的融合蛋白構建體。圖4A的左側構建體描繪了具有連接于各重鏈的C端的LukAB中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4A的右側構建體描繪了具有連接于各重鏈的C端的LukD或LukE中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4B的左側構建體描繪了具有連接于各輕鏈的C端的LukAB中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4B的右側構建體描繪了具有連接于每個輕鏈的C端的LukD或LukE中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4C的左側構建體描繪了具有連接于每個輕鏈的C端的LukAB中和構建體，和連接于每個重鏈的C端的LukD或LukE中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4C的右側構建體描繪了具有連接于每個輕鏈的C端的LukD或LukE中和構建體和連接于每個重鏈的C端的LukAB中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4D的左側構建體描繪了具有連接于各重鏈的C端的串聯(lián)LukAB中和構建體和連接于LukAB中和構建體的C端的LukD或LukE中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4D的右側構建體描繪了具有連接于各重鏈的C端的串聯(lián)LukD或LukE中和構建體和連接于LukD或LukE中和構建體的C端的LukAB中和構建體的單特異性、二價mAb。圖4E描繪了具有連接于重鏈識別Staph抗原2的C端的LukD或LukE中和構建體，和連接于重鏈識別Staph抗原1的C端的LukAB中和構建體的雙特異性、二價mAb。圖4F描繪了具有連接于一條重鏈的C端的LukAB中和構建體，和連接于相對重鏈的C端的LukD或LukE中和構建體的單特異性、二價mAb。表5.融合蛋白構建體的設計。實施例6.MAb5133強烈地結合于金黃色葡萄球菌的不同菌株，但不結合于sdgB突變株。mAb5133先前顯示結合于金黃色葡萄球菌的不同菌株并且具有調理吞噬細胞活性(描述于Throsby等人的美國專利號8,460,666中，其以引用的方式整體并入本文)。為了進一步分析mAb5133的特異性，使用金黃色葡萄球菌的不同菌株以及來自USA300親本JE2菌株的次代菌株執(zhí)行蛋白質印跡結合實驗，在次代菌株中已經(jīng)使用獲自NetworkonAntibioticResistanceinStaphylococcusaureus(NARSA)的序列定義的轉座子突變體(Fey等人,“AGeneticResourceforRapidandComprehensivePhenotypeScreeningofNonessentialStaphylococcusaureusGenes,”mBio4(1):e00537-12(2013)，其以引用的方式整體并入本文)破壞特異性基因。程序關于細胞溶解產物的制備，所用的方法遵循Brady等人,“IdentificationofStaphylococcusaureusProteinsRecognizedbytheAntibody-MediatedImmuneResponsetoaBiofilmInfection,”Infect.Immun.74:3415-3426(2006)(其以引用的方式整體并入本文)的制備。金黃色葡萄球菌株在胰蛋白酶大豆肉湯中在37℃、190rpm下培養(yǎng)過夜。關于攜帶轉座子插入的菌株，10μg/mL紅霉素包括于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物1:100稀釋于新鮮培養(yǎng)基中并且培養(yǎng)5-6小時，至約1.2的OD600。對于每個菌株，離心4.5mL培養(yǎng)物，并且細胞球粒再懸浮于75μL溶解緩沖液(50mMTris-HCl、20mMMgCl2和10μg/mL溶葡球菌酶)中。在37℃下孵育20分鐘之后，溶解完成。溶解產物接著在6,000rpm、4℃下離心20分鐘并且上清液轉移至新管中。關于蛋白質印跡分析，12μL各溶解產物在70℃下加熱10分鐘(具有50mMDTT的LDS樣品緩沖液)并且在MOPS緩沖液中在10％Bis-Tris凝膠(NovexNuPage,LifeTechnologies)上在150伏特下電泳2小時。該凝膠使用iBlot儀器(LifeTechnologies)印跡于PVDF膜上并且用CR5133使用FemtoMax試劑盒(Rockland)探測。結果如圖5所示，mAb5133在由金黃色葡萄球菌株ATCC29213和親本USA300菌株JE2產生的溶解產物中檢測到高分子量色帶(即，高于50kDa)。高分子量色帶也在缺乏含絲氨酸-天冬氨酸重復序列(SDR)蛋白SdrC、SdrD和SdrE的NARSA菌株中檢測到(泳道3NE432(sdrC突變體)、泳道4NE1289(sdrD突變體)、泳道5NE98(sdrE突變體)。模糊色帶在分選酶突變體(泳道8NE1787(srtA突變體)和蛋白A突變體(泳道9NE286(蛋白A突變體)中檢測到。高分子量色帶未在糖基轉移酶sdgB突變體(泳道7NE105(sdgB突變體))中檢測到，但在糖基轉移酶sdgA突變體(泳道6NE381(sdgA突變體))中檢測到。概述SDR結構域內的絲氨酸通過依序添加N-乙?；咸前?GlcNAc)首先由SdgB、隨后由SdgA修飾(Hazenbos等人,“NovelStaphylococcalGlycosyltransferasesSdgAandSdgBMediateImmunogenicityandProtectionofVirulence-AssociatedCellWallProteins,”PLoSPathog.9(10):e1003653(2013)，其以引用的方式整體并入本文)。在來自sdgB突變體的溶解產物中用mAb5133無法檢測到高分子量色帶與5133識別已經(jīng)通過SdgB糖基化的SDR表位一致。實施例7.融合蛋白的V8蛋白水解消化。人類IgG1易于經(jīng)受下部鉸鏈區(qū)中的裂解，并且這種裂解可導致體外和體內Fc介導的效應子功能的損失(Brezski等人,“Tumor-AssociatedandMicrobialProteasesCompromiseHostIgGEffectorFunctionsbyaSingleCleavageProximaltotheHinge,”PNAS106:17864-17869(2009)，其以引用的方式整體并入本文。金黃色葡萄球菌蛋白酶GluV8裂解下部鉸鏈區(qū)中氨基酸E233與L234之間的人類IgG1，并且先前證明這種裂解消除ADCC和CDC功能(Brezski等人,“HumanAnti-IgG1HingeAutoantibodiesReconstitutetheEffectorFunctionsofProteolyticallyInactivatedIgGs,”J.Immunol.181:3183-3192(2008)，其以引用的方式整體并入本文)。為了使mAb/FN3結構域構建體有效地起作用，其必須能夠結合于金黃色葡萄球菌締合的抗原并且銜接免疫細胞FcγR或補體以便促進吞噬作用。蛋白水解裂解可能解開mAb促進免疫效應細胞的吞噬作用的能力。因此，鉸鏈區(qū)經(jīng)過工程改造以具有增加的對GluV8的蛋白水解的抗性。程序金黃色葡萄球菌蛋白酶GluV8(目錄E-006)獲自BioCentrum?？贵w濃度在PBS中固定在3.3μM下并且反應通過添加0.66μM的GluV8來起始以關于GluV8產生20％摩爾比。消化在pH7.5下在37℃下執(zhí)行24小時。樣品在變性條件下制備并且使用Agilent2100基于微流體學的生物分析儀進行分析。百分比完整IgG基于通過毛細管電泳法(AgilentTechnologies)產生的電泳圖譜通過將保留于蛋白酶消化的樣品中的百分比完整IgG除以保留于無蛋白酶的對照樣品中的百分比完整IgG來計算。分析數(shù)據(jù)并且使用GraphPadPrism繪圖。結果如圖6所示，含有人類IgG1wt的下部鉸鏈(E233/L234/L235/G236)的構建體IgG1(IgG1同型對照)和A6(表5的構建體3)展示在用GluV8消化24小時之后保留15-25％范圍的完整IgG。具有突變型下部鉸鏈(缺失G236的E233P/L234V/L235A)的構建體PRASAA6(表5的構建體4)和PRASAA6HC-AB(表5的構建體6)展示增加的對GluV8的抗性，其中在24小時GluV8消化之后保留大于70％的完整IgG。概述這些結果指示IgG1的下部鉸鏈區(qū)的突變賦予增加的對GluV8消化的抗性。此外，在重鏈的C端包括抗LukABFN3結構域不會影響對GluV8裂解的易感性，因為關于不具有FN3結構域的下部鉸鏈突變型構建體PRASAA6(構建體4)的完整IgG的總量具有與含有FN3結構域的下部鉸鏈突變型構建體PRASAA6HC-AB(構建體6)類似的百分比保留的完整IgG。實施例8.使用競爭結合分析的Fcγ受體結合測量。使用競爭分析以便分析抗Staph靶向構建體結合于FcγR的能力。構建體最初是設計成結合于人類FcγR，因此構建體針對其結合于人類激活FcγR：FcγRI、FcγRIIa(R131)和FcγRIIIa(V158)，和抑制受體FcγRIIb的能力進行測試。程序在半孔體積96孔不透明板(Corning)中在分析緩沖液(PBS、0.05％BSA、0.01％Tween-20)中在pH7.4下進行競爭結合研究。所有競爭研究均針對生物素標記的IgG1野生型(1個IgG:2個生物素，使用EZLinkTMNHS-LC-生物素,Pierce)在固定濃度下并且使用競爭IgG1野生型和抗Staph構建體在連續(xù)3倍稀釋液中進行。分析中FcγR的最終濃度為0.2μg/ml。生物素標記的IgG1(0.2μg/ml最終)和IgG1野生型和抗Staph構建體(10μl)一式兩份依序添加至96孔板的各行中。其后，添加指定FcγR，隨后依序添加10μl的1/50稀釋的鎳螯合物(Ni)-受體珠粒和1/50稀釋的抗生蛋白鏈菌素(SA)-供體珠粒中的每一者。不透明板用鋁密封件覆蓋以維持避光條件，同時在定軌振蕩器上振蕩30分鐘。其后，去除密封件并且在配備有激發(fā)/發(fā)射光譜的適當濾光片集合的ENVISIONTM板式讀取器(PerkinElmer)上讀取熒光。原始數(shù)據(jù)轉移至GraphPadPRISMTM軟件并且針對最大信號標準化并且使用非線性回歸曲線擬合軟件繪制競爭曲線。使用以下等式產生競爭結合曲線：％最大信號＝(Exp–Min)/(Max–Min)×100％，其中最小值(Min)通過在最高濃度的測試物品mAb存在下檢測的信號確定并且最大值(Max)通過在僅含有生物素標記的IgG1、FcγR、鎳螯合物(Ni)-受體珠粒和抗生蛋白鏈菌素(SA)-供體珠粒而無任何抗Staph構建體的孔中檢測的信號確定。結果分析數(shù)種構建體競爭結合于具有人類IgG1野生型的受體的人類Fcγ家族的能力。構建體降低由生物素標記的IgG1野生型產生的最大信號的能力顯示于圖7A至7D中。如圖7A所示，IgG1(IgG1同型對照)和A6(構建體3)穩(wěn)固地結合于人類FcγRI。構建體PRASAA6(構建體4)、PRASAA6LC-D(構建體5)、PRASAA6HC-AB(構建體6)和PRASAA6LC-DHC-AB(構建體7)不展示在任何測試濃度下結合于人類FcγRI。構建體IgG1(IgG1同型對照)、A6(構建體3)、PRASAA6(構建體4)、PRASAA6LC-D(構建體5)、PRASAA6HC-AB(構建體6)和PRASAA6LC-DHC-AB(構建體7)均展示可相當結合于人類FcγRIIa(R131)(圖7B)。構建體IgG1(IgG1同型對照)和A6(構建體3)展示最高結合于抑制人類FcγRIIb，而構建體PRASAA6(構建體4)、PRASAA6LC-D(構建體5)、PRASAA6HC-AB(構建體6)和PRASAA6LC-DHC-AB(構建體7)展示低至不可檢測的結合(圖7C)。構建體IgG1(IgG1同型對照)、A6(構建體3)、PRASAA6(構建體4)、PRASAA6LC-D(構建體5)、PRASAA6HC-AB(構建體6)和PRASAA6LC-DHC-AB(構建體7)均展示可相當結合于人類FcγRIIIa(V158)(圖7D)。概述具有下部鉸鏈突變(缺失G236的E233P、L234V、L235A)的構建體均未展示結合于人類FcγRI(參看美國專利公布號2013/0011386A1)，并且在重鏈或輕鏈上包括C端FN3結構域不影響結合。所有構建體均展示可相當結合于激活人類FcγRIIa(R131)和FcγRIIIa(V158)，這指示包括FN3結構域不會影響結合于這些受體。構建體PRASAA6(4)、PRASAA6LC-D(5)、PRASAA6HC-AB(6)和PRASAA6LC-DHC-AB(7)展示低至不可檢測的結合于抑制受體FcγRIIb。這可能是有利的，因為與人類FcγRIIb的低結合和與激活受體FcγRIIa和FcγRIIIa的正常結合將增加激活(A):抑制(I)指數(shù)，一種被認為增加具有預期細胞毒性作用機制的mAb的功效的特性(Nimmerjahn和Ravetch,“DivergentImmunoglobulingSubclassActivityThroughSelectiveFcReceptorBinding,”Science310:1510-1512(2005)，其以引用的方式整體并入本文)。實施例9.蛋白A結合測量。使用基于板的ELISA分析以便分析構建體與涂布于ELISA板上的蛋白A的結合。蛋白A為Staph毒力因子，并且人類IgG1野生型抗體經(jīng)由結合于IgG1野生型的Fc螯合于Staph的表面上。這種方法被認為消除抗StaphmAb通過抗體V-區(qū)結合于表面決定子的能力并且同時阻斷Fc與宿主免疫系統(tǒng)的體液和細胞組分的相互作用。為了回避這種Staph毒力因子，工程改造構建體，目的是去除蛋白A結合。程序在透明96孔板(Nunc)中在ELISA阻斷緩沖液(3％牛血清白蛋白于PBS中)中進行直接蛋白A結合ELISA。生物素標記的蛋白A在室溫下在PBS中以2μg/ml持續(xù)1個小時涂布于96孔板中，在ELISA洗滌緩沖液(具有0.02％Tween-20的0.15MNaCl)中洗滌3次。板接著在室溫下用ELISA阻斷緩沖液阻斷1小時。板接著在ELISA洗滌緩沖液中洗滌3次。構建體以10μg/ml的起始濃度應用于該板，接著在該板中連續(xù)稀釋3倍并且在室溫下孵育1小時。板在ELISA洗滌緩沖液中洗滌3次。構建體用1:15,000稀釋于ELISA阻斷緩沖液中的辣根過氧化物酶(HRP)結合的山羊抗人類κ輕鏈抗體(Millipore)檢測并且樣品在室溫下孵育30分鐘。板在ELISA洗滌緩沖液中洗滌5次。這種分析中用于HRP的底物為TMB(Fitzgerald)，并且孵育板直至孔變藍。反應通過添加相等體積的0.5MHCl至TMB中來終止，并且板在450nm下讀取。用GraphPadPrism軟件使用非線性回歸曲線擬合分析數(shù)據(jù)。結果人類IgG1野生型構建體(構建體1)展示與蛋白A的可檢測結合。所有含有CH3突變H435R/Y436F的構建體(即A6(構建體3)、PRASAA6(構建體4)、PRASAA6LC-D(構建體5)、PRASAA6HC-AB(構建體6)和PRASAA6LC-DHC-AB(構建體7)在任何測試濃度下均不展示與蛋白A的可檢測結合(圖8)。概述CH3突變H435R/Y436F成功地消除了蛋白A結合，如這種分析中所分析。在重鏈或輕鏈的C端包括FN3結構域不會影響蛋白A結合。實施例10.如通過流式細胞術所測量結合于完整細菌。使用流式細胞術分析來分析mAb和FN3結構域-mAb結合物與金黃色葡萄球菌的Newman株的表面的結合。因為金黃色葡萄球菌毒力因子蛋白A可經(jīng)由抗體的Fc部分結合于IgG1并且可混淆分析，所以使用具有H435R/Y436F突變的抗體(指定A6)來消除mAb的Fc區(qū)域與在Staph的表面上表達的蛋白A的非特異性結合(參看實施例9)。因此，比較各自含有H435R/Y436F突變的A6(構建體3)、PRASAA6(構建體4)和mAb-FN3結構域結合物。含有恒定區(qū)突變E233P/L234V/L235A(G236缺失)H435R/Y436F的具有對脂磷壁質酸(LTA)具特異性的V-區(qū)的構建體(稱為“PRASAA6同型對照”)用作陰性對照，因為這種構建體的結合對于所選的金黃色葡萄球菌株為低的/陰性的。程序金黃色葡萄球菌Newman株在37℃下在腦心浸液(BHI)改良肉湯中在振蕩下在225rpm下生長直至培養(yǎng)物達到大約0.5的OD600nM。等分試樣在具有10％甘油(最終)的冷凍小瓶中冷凍。小瓶解凍并且用于通過連續(xù)稀釋和BHI瓊脂板上的生長來確定集落形成單位。關于流式細胞術分析，Newman株以每孔5×106個集落形成單位涂板并且在室溫下在FACS緩沖液中用指示的mAb5133構建體連續(xù)稀釋液孵育30分鐘。樣品用FACS緩沖液洗滌兩次，接著用20μg/mlAlexa647結合的F(ab')2山羊抗人類IgG(重和輕)染色以檢測構建體。使用BDFortessa和Flowjo軟件分析樣品。這些實驗重復兩次，具有類似結果。結果如圖9所示，如通過流式細胞術結合所分析，構建體A6(構建體3)、PRASAA6(構建體4)和PRASAA6HC-AB(構建體6)具有類似的與Newman金黃色葡萄球菌株的結合。抗LukDFN3結構域添加至輕鏈中導致與不具有FN3結構域結合物的相同抗體(通過EC50測試mAb/EC50PRASAA6(構建體4)所計算)相比關于構建體PRASAA6LC-D(構建體5)和PRASAA6LC-DHC-AB(構建體7)的結合降低大約2至3倍。概述抗LukAB添加至重鏈中不會影響抗體與金黃色葡萄球菌的結合，而抗LukDFN3結構域添加至輕鏈的C端導致略微降低的與金黃色葡萄球菌Newman株的結合的檢測(在兩個獨立實驗中EC50的2至3倍改變)。實施例11.通過mAb-FN3結構域結合物中和白細胞毒素介導的免疫細胞殺滅。為了評估m(xù)Ab-FN3結構域5133結合物的功能性，使用關于LukED和LukAB的中和的評估所述的基于細胞的細胞毒性中和分析。程序為了針對LukED和LukAB中和活性篩選mAb-FN3結構域5133結合物，75nMLukED和18.75nM活性LukAB毒素獨立地在冰上用最終體積為30μl的遞增濃度的不同mAb變體(IgG1同型對照；A6構建體3；PRASAA6構建體4)；PRASAA6LC-D構建體5；PRASAA6HC-D構建體8；PRASAA6HC-AB構建體6；PRASAA6LC-DHC-AB構建體7；PRASAA6HCAB-D構建體9；和PRASAA6HCD-AB構建體10)孵育30分鐘。新鮮分離的原代人類中性粒細胞(hPMN)(2×105個細胞于70μlRPMI+10mMHEPES+0.1％HAS中)接著添加至毒素-mAb混合物中并且在37℃5％CO2孵育器中孵育1小時。膜損傷通過監(jiān)測孵育后一小時的乳酸脫氫酶(LDH)釋放來測量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH試劑(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室溫下再孵育30min。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel讀取器(激發(fā)555nm、發(fā)射590nm)測量LDH活性并且數(shù)據(jù)針對由0.1％v/vTriton-X100誘導的100％PMN溶解標準化。結果分析不同的mAb5133和mAb-FN3結構域5133結合物中和LukED和LukAB對人類PMN的細胞毒性活性的能力。這些研究證明具有LukD(PRASAA6LC-D構建體5和PRASAA6HC-D構建體8)或抗LukABFN3結構域(PRASAA6HC-AB構建體6)的FN3結構域-mAb結合物能夠中和對應的毒素，無論FN3結構域是否附接于輕鏈或重鏈(PRASAA6LC-D構建體5相對PRASAA6HC-D構建體8)(圖10A)。此外，LukD和LukABFN3結構域與mAb5133的同時結合(PRASAA6LC-DHC-AB構建體7、PRASAA6HCAB-D構建體9和PRASAA6HCD-AB構建體10)(圖10A-10B)還導致對應毒素的有效中和。概述這些研究顯示僅FN3結構域-mAb結合物能夠阻斷原代hPMN的LukED和LukAB殺滅，而非IgG1同型對照、A6構建體3或PRASAA6構建體4mAb?？傊?，這些數(shù)據(jù)確定mAb-FN3結構域結合物為功能性的并且可阻斷有效Staph毒素的細胞毒性活性。實施例12.mAb-FN3結構域結合物在金黃色葡萄球菌介導的人類中性粒細胞殺滅的模型中在吞噬后的中和效應。在由Staph產生的雙組份毒素中，LukAB負責在用活細菌進行離體感染期間殺滅人類中性粒細胞(hPMN)。Staph產生的LukAB通過在吞噬后靶向質膜或吞噬體膜來殺滅hPMN。為了評估m(xù)Ab-FN3結構域結合物是否保護hPMN在活Staph的吞噬后免于LukAB介導的殺滅，開發(fā)離體感染模型。程序Staph菌株Newman(高度有毒的甲氧西林敏感性菌株)1:100在RPMI+CAS中繼代培養(yǎng)5小時并且標準化至在補充有10mMHEPES和0.1％HSA的RPMI(RPMI-HH)中的1×107CFU/mL。1mL標準化細菌的等分試樣通過離心集結成粒并且以1.5mg/ml再懸浮于300μl不同mAb5133或mAb-FN3結構域結合物中或PBS(非調理)中。用RPMI-HH使樣品達到1mL并且接著在37℃下孵育20分鐘以進行調理。調理過的細菌隨后與2×105個新鮮分離的原代hPMN以約10:1(細菌:hPMN)的感染復數(shù)(MOI)在補充有EtBr的RPMI-HH中混合。細菌和細胞通過在1500RPM下離心7分鐘來同步并且放置于37℃5％CO2孵育器中。溴化乙錠熒光(作為hPMN膜滲透性的指標)在兩小時感染期間加以測量。結果分析不同mAb5133和mAb-FN3結構域5133結合物中和LukAB的細胞毒性活性從而在Staph吞噬后保護hPMN的能力。這些實驗證明與PBS處理的細菌(無mAb)相比，A6構建體3和PRASAA6構建體4mAb對hPMN賦予最小程度的保護以免于金黃色葡萄球菌介導的殺滅。相比之下，兩種所測試的mAb-FN3結構域結合物(PRASAA6HC-AB構建體6和PRASAA6LC-DAB構建體7)保護hPMN免于吞噬后LukAB介導的膜損失。與含有抗LukAB和抗LukDFN3結構域的結合物的差異相比，在僅含有抗LukABFN3結構域的mAb-FN3結構域結合物之間未觀察到顯著差異(圖11)。這一發(fā)現(xiàn)與離體感染模型期間LukED產生的缺乏一致(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；Alonzo等人,“StaphylococcusaureusLeucocidinEDContributestoSystemicInfectionbyTargetingNeutrophilsandPromotingBacterialGrowthInVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)，其均以引用的方式整體并入本文)。概述這些實驗確定StaphLukAB介導的吞噬后細胞毒性可能在細胞內由mAb-FN3結構域結合物中和。實施例13.在中性粒細胞介導的金黃色葡萄球菌殺滅模型中mAb-FN3結構域結合物的中和效應。LukAB在吞噬后殺滅hPMN并且促進Staph逃避和生長(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusLukABCytotoxinKillsHumanNeutrophilsbyTargetingtheCD11bSubunitoftheIntegrinMac-1,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA110:10794-10799(2013)，其均以引用的方式整體并入本文)。用缺乏lukAB的等基因缺失突變型菌株感染hPMN已經(jīng)表明阻斷LukAB活性會在離體OPK分析中減弱細菌生長(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusLukABCytotoxinKillsHumanNeutrophilsbyTargetingtheCD11bSubunitoftheIntegrinMac-1,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA110:10794-10799(2013)，其均以引用的方式整體并入本文)。為了研究LukABmAb-FN3結構域結合物是否促進hPMN介導的對金黃色葡萄球菌生長的控制；實施OPK分析，其中細菌生長通過測量GFP熒光來監(jiān)測。程序關于這些實驗，使用含有通過使用sarA啟動子組成性地表達綠色熒光蛋白(gfp)的質粒的Staph菌株Newman(MSSA)。GFP標記的細菌1:100在補充有氯霉素的RPMI+CAS中繼代培養(yǎng)5小時并且標準化至在補充有10mMHEPES和0.1％HSA的RPMI(RPMI-HH)中的1×107CFU/mL。1mL標準化細菌的等分試樣通過離心集結成粒并且以1.5mg/ml再懸浮于300μl不同mAb或mAb-FN3結構域結合物中或PBS(非調理)中。用RPMI-HH使樣品達到1mL并且接著在37℃下孵育20分鐘以進行調理。調理過的細菌隨后與2×105個新鮮分離的原代hPMN以約10:1(細菌:hPMN)的感染復數(shù)(MOI)在RPMI-HH中混合。細菌和細胞通過在1500RPM下離心7分鐘來同步并且放置于37℃5％CO2孵育器中。感染后5小時測量GFP熒光，其為細菌生長的指標。結果分析不同mAb5133和mAb-FN3結構域5133結合物促進hPMN介導的Staph生長限制的能力。這些實驗證明了與IgG1同型對照相比，A6構建體3和PRASAA6構建體4促進hPMN介導的金黃色葡萄球菌生長-限制(圖12)。這與5133mAb的調理能力一致。重要的是，與PRASAA6親本mAb(構建體4)相比，LukABFN3結構域-mAb5133結合物(PRASAA6HC-AB構建體6和PRASAA6LC-DHC-AB構建體7)增強PMN介導的生長限制(圖12)。CR5133/抗LukDFN3結構域-mAb(PRASAA6LC-D構建體5)無法增強生長限制與先前的發(fā)現(xiàn)一致：在離體感染模型期間LukED產生為最小程度的(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；Alonzo等人,“StaphylococcusaureusLeucocidinEDContributestoSystemicInfectionbyTargetingNeutrophilsandPromotingBacterialGrowthInVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)，其均以引用的方式整體并入本文)。概述這些實驗確定抗LukABmAb-FN3結構域結合物中和LukAB，從而促進hPMN介導的Staph生長-限制。實施例14：用金黃色葡萄球菌細胞溶解產物對Ni-NTA樹脂結合的SdrC4蛋白進行的體外糖基化會產生由mAb5133識別的表位。為了進一步驗證SdgB介導的含SDR蛋白的糖基化導致產生由mAb5133識別的特異性表位，使用由不同金黃色葡萄球菌株制備的細胞溶解產物進行代表性SDR蛋白(由大腸桿菌純化的重組SdrC4蛋白)的體外糖基化并且通過SDS-PAGE分離反應產物并且通過蛋白質印跡分析加以分析。這些研究使用獲自NetworkonAntibioticResistanceinStaphylococcusaureus(NARSA)的USA300親本JE2金黃色葡萄球菌株和具有使sdgA或sdgB糖基轉移酶不活化的轉座子插入的突變體(Fey等人,“AGeneticResourceforRapidandComprehensivePhenotypeScreeningofNonessentialStaphylococcusaureusGenes,”mBio4(1):e00537-12(2013)，其以引用的方式整體并入本文)。程序由金黃色葡萄球菌株JE2、NE381(JE2的sdgA轉座子突變體)和NE105(JE2的sdgB轉座子突變體)制備溶解產物。該菌株的25mL培養(yǎng)物在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中在37℃、200rpm下生長并且通過離心在6,000rpm下持續(xù)10分鐘以0.4至0.6的OD600收集細胞。細胞球粒再懸浮于含有200μg溶葡球菌酶(SigmaL9043)和250單位的全能核酸酶(Pierce88700)的1mLPBS中。細胞在37℃下孵育45分鐘并且接著在13,000rpm、4℃下離心持續(xù)10分鐘。750μL上清液轉移至另一管中并且放置于冰水。由大腸桿菌純化的重組SdrC4蛋白結合于Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen1018244)。具體說來，100μLNi-NTA瓊脂糖放置于微量離心管中，離心并且用含有蛋白酶抑制劑(RocheCompleteEDTA-free)的500μLPBS洗滌一次。該樹脂接著與大約300μg蛋白一起再懸浮并且在搖動平臺上在4℃下孵育1.5小時。樹脂接著在12,000rpm下離心1分鐘并且用500μL洗滌緩沖液(50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0加上蛋白酶抑制劑)洗滌一次。該樹脂接著再懸浮于300μLPBS或金黃色葡萄球菌溶解產物中并且在37℃下孵育1小時。1小時后，樣品離心，用500μL洗滌緩沖液洗滌三次，并且結合的蛋白在150μL洗脫緩沖液(含有250mM咪唑的洗滌緩沖液)中在室溫下洗脫5分鐘。關于蛋白質印跡分析，洗脫的蛋白在70℃下在含有100mMDTT的1×LDS樣品緩沖液(LifeTechnologiesNP0007)中加熱10分鐘，并且接著在兩種10％bis-trisNuPAGE凝膠上在MOPS緩沖液中在150伏特下電泳1小時40分鐘。在電泳后，一種凝膠用膠體藍(LifeTechnologies46-7015和46-7016)染色，并且另一種凝膠使用iBlot儀器印跡于PVDF膜(LifeTechnologiesIB401002)。PVDF印跡用mAb5133在1:500稀釋度下探測并且隨后使用FemtoMax試劑盒(RocklandImmunochemicalsKCA001)檢測。結果如圖13所示，用由金黃色葡萄球菌株JE2(面板B，泳道2和6)制備的細胞溶解產物和其它情況下等基因的sdgA突變體衍生物(面板B，泳道3和7)孵育樹脂結合的SdrC4蛋白導致在使用mAb5133的蛋白質印跡法中檢測特異性約95kDa物質。相比之下，在用由金黃色葡萄球菌株JE2的sdgB突變體衍生物(面板B，泳道4和8)制備的溶解產物孵育樹脂結合的SdrC4蛋白之后或在其中PBS置換細胞溶解產物的對照樣品(面板B，泳道1和5)中未由mAb5133檢測到蛋白色帶。圖13面板A中所示的膠體藍染色的凝膠指示基本上等量的重組SdrC4蛋白裝載于泳道1-4和5-8中。概述在用由菌株JE2的sdgB突變體制備的溶解產物孵育柱結合的SdrC4蛋白之后用mAb5133無法檢測到約95kDa蛋白色帶進一步支持以下論點：SdgB為用于SdrC蛋白的特異性糖基轉移酶并且為mAb5133的表位的產生所必需的。實施例15：用純化的SdgB糖基轉移酶蛋白對SdrC4或SdrC5蛋白進行的體外糖基化導致產生由mAb5133識別的表位。為了進一步驗證SdgB介導的含SDR蛋白的糖基化導致產生由mAb5133識別的特異性表位，使用金黃色葡萄球菌SdgB糖基轉移酶的重組形式進行代表性SDR蛋白(SdrC4或SdrC5)的體外糖基化并且通過SDS-PAGE分離反應產物并且通過蛋白質印跡分析加以分析。程序具有C端聚組氨酸(His)6親和標簽的金黃色葡萄球菌SdgB糖基轉移酶的重組形式(SEQIDNO:99)在大腸桿菌中表達并且經(jīng)由Ni-NTA親和色譜法純化。關于體外糖基化反應，100μg重組SdrC4(SEQIDNO:100)或SdrC5(SEQIDNO:101)蛋白在37C下在最終體積100μl的100mMTrispH7.5或100μl100mMTrispH7.5加上10％甘油中+/-30μg尿苷二磷酸N-乙?；咸前?UDP-GlcNac)+/-4μg重組SdgB孵育1小時。關于蛋白質印跡分析，反應產物首先通過SDS-PAGE以在200V恒定下在NuPAGE4-12％Bis-TrisGel(NP0335BOX)上分離的每個泳道1μg蛋白解析，直至染料前部已經(jīng)到達凝膠的底部。蛋白接著使用InvitrogeniBlot轉移至PVDF膜(TransferiBlotGelTransferStacksPVDFIB401002)。在圖14A面板A中，原代抗體為PBS+3％BSA中2μg/ml的構建體3(mAb5133A6；SEQIDNO:64HC和65LC)并且二次檢測抗體為PBS+3％BSA蛋白質印跡中處于1:10,000稀釋度下的來自JacksonImmunoresearch(109-036-088批號101421)的HRP結合的山羊抗人類IgG(H+L)。在HRP化學發(fā)光底物檢測溶液(PierceECLPlus)中孵育之后，印跡暴露于X射線片。在圖14A面板B中，用于抗His標簽檢測的原代抗體為PBS+3％BSA中處于1:2000稀釋度下的HRP結合的抗6x組氨酸mAb(MAB050H批號EGE0608041,R&DSystems)，其中經(jīng)由X射線片進行后續(xù)檢測。在圖14B面板A中，原代抗體為PBS+3％BSA中2μg/ml的構建體3(mAb5133A6；SEQIDNO:64HC和65LC)并且二次檢測抗體為PBS+3％BSA蛋白質印跡中處于1:10,000稀釋度下的來自JacksonImmunoresearch(109-036-088批號101421)的HRP結合的山羊抗人類IgG(H+L)。在HRP化學發(fā)光底物檢測溶液(PierceECLPlus)中孵育之后，印跡暴露于X射線片。接著使用ThermoScientificRestoreWestern剝離緩沖液剝離該印跡并且接著使用PBS+3％BSA中處于1:2000稀釋度下的HRP結合的抗6x組氨酸mAb(MAB050H批號EGE0608041,R&DSystems)進行抗his檢測，其中經(jīng)由X射線片進行后續(xù)檢測(圖14B，面板B)。在圖14C面板A中，原代抗體為Rockland熒光western阻斷緩沖液(MB-070)中2μg/ml的構建體1(mAb5133；SEQIDNO:60HC和61LC)。二次檢測使用IRDye800CW山羊抗人類IgG(H+L)Li-cor926-32232，其中使用OdysseyInfraRed成像儀進行檢測。在圖14C面板B中，抗His檢測使用PBS+3％BSA中處于1:2000稀釋度下的HRP結合的抗6x組氨酸mAb(MAB050H批號EGE0608041,R&DSystems)，其中經(jīng)由X射線片進行后續(xù)檢測。結果如圖14A、14B和14C所示，在SdgB和UDP-GlcNAc存在下孵育由大腸桿菌純化的重組SdrC4或SdrC5蛋白導致產生由構建體1(mAb5133；SEQIDNO:60HC和61LC)和構建體3(mAb5133A6；SEQIDNO:64HC和65LC)檢測的物質。所有泳道中SdrC4和SdrC5構建體的(His)6表位的檢測驗證了接近等量的蛋白存在。概述這些結果進一步證實了先前的觀察結果：mAb5133僅在SdgB介導的糖基化后檢測SDR家族蛋白。實施例16：mAb5133不特異性結合金黃色葡萄球菌脂磷壁質酸(LTA)。金黃色葡萄球菌的脂磷壁質酸(LTA)先前已經(jīng)鑒定為mAb5133的細胞靶標(Throsby等人的美國專利號8,460,666，其以引用的方式整體并入本文)。為了確定這是否確實為實情，在平行ELISA格式分析中確定mAb5133與表面結合的金黃色葡萄球菌LTA和重組SdgB糖基化SdrC4蛋白的相對結合。作為LTA結合的陽性對照，包括帕吉昔單抗(SEQIDNO:102HC+SEQIDNO:103LC)，一種充分表征的抗LTAmAb(GinsburgI.,“RoleofLipoteichoicAcidinInfectionandInflammation,”LancetInfect.Dis.2(3):171-9(2002)；Weisman等人,“SafetyandPharmacokineticsofaChimerizedAnti-LipoteichoicAcidMonoclonalAntibodyinHealthyAdults,”InternationalImmunopharmacol.9:639-644(2009)，其以引用的方式整體并入本文)。作為SdgB糖基化SdrC4蛋白和LTA的結合的陰性對照，還包括CNTO3930(SEQIDNO:104HC+SEQIDNO:105LC)，一種特異性地靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白的mAb。程序高結合96孔ELISA板(Nunc)涂布有PBS中5μg/mL的SdgB糖基化重組SdrC4蛋白或金黃色葡萄球菌脂磷壁質酸(LTA)(L2515,Sigma)并且在4℃下孵育過夜。板用ELISA洗滌緩沖液(0.15MNaCl,0.02％Tween-20)洗滌三次并且在環(huán)境溫度下用阻斷緩沖液(SuperblockThermo37515)阻斷一小時。在獨立稀釋板中，抗體從10μg/mL開始連續(xù)地三倍稀釋于3％BSA-PBS阻斷緩沖液中。ELISA板用ELISA洗滌緩沖液洗滌三次并且抗體稀釋液從稀釋板轉移至ELISA板并且在環(huán)境溫度下孵育一小時。ELISA板用ELISA洗滌緩沖液洗滌三次并且二次山羊抗人類Fcγ特異性HRP(JacksonImmunoresearch109-035-098)1:15,000稀釋于阻斷緩沖液中并且添加至該板中。板在環(huán)境溫度下用二次抗體孵育一小時，接著用ELISA洗滌緩沖液洗滌五次。TMB底物(Fitzgerald)接著添加至該板中并且允許顯影大約四分鐘，并且接著反應通過添加0.5MHCl來終止。在SpectraMaxM5Microplate讀取器上在450nm下讀取吸光度。使用GraphPadPrism分析數(shù)據(jù)。值轉換為log標尺并且使用非線性回歸S形劑量-反應等式擬合，關于針對各抗原的各抗體產生11點結合曲線。結果如圖15面板A所示，mAb5133展現(xiàn)與SdgB糖基化SdrC4蛋白的有效且濃度依賴性結合。相比之下，用帕吉昔單抗或CNTO3930未檢測到與SdgB糖基化SdrC4蛋白的結合。圖15面板B顯示各測試物品與純化的金黃色葡萄球菌LTA的相對結合并且如所預期，帕吉昔單抗展現(xiàn)有效且濃度依賴性結合。相比之下，用CNTO3930或mAb5133分別未檢測到與LTA的結合或檢測到與LTA的極其微弱的結合。mAb5133與金黃色葡萄球菌LTA的表觀微弱結合可通過由原生SDR蛋白污染LTA制劑來說明，因為已知LTA制劑通常受宿主蛋白污染(Silvestri等人,“Purificationoflipoteichoicacidsbyusingphosphatidylcholinevesicles,”InfectionandImmunity22(1):107-118(1978)，其以引用的方式整體并入本文)。概述這些結果表明mAb5133識別SdgB糖基化SDR家族蛋白而非LTA。實施例17：mAb5133和具有PRASA和/或A6突變的變體保留結合于人類和小鼠FcRn受體。為了證明PRASA和A6突變不會顯著干擾在確定抗體的體內半衰期中起關鍵作用(Kuo和Aveson,“NeonatalFcReceptorandIgG-BasedTherapeutics,”mAbs3(5):422-30(2011)，其以引用的方式整體并入本文)的FcRn受體的銜接，在ELISA格式競爭結合分析中針對與純化的人類和/或小鼠FcRn受體的結合測試mAb5133和具有PRASA和/或A6突變的變體(Kinder等人,“EngineeredProtease-ResistantAntibodiesWithSelectableCell-KillingFunctions,”J.Biol.Chem.288:30843-30854(2013)，其以引用的方式整體并入本文)。程序所用的測試物品為mAb5133(SEQIDNO:60HC和61LC)、mAb5133PRASA(SEQIDNO:62HC和63LC)、mAb5133A6(SEQIDNO:64HC和65LC)和mAb5133PRASAA6(SEQIDNO:66HC和67LC)。CNTO3929(SEQIDNO:106HC和107LC)，一種靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白的人類IgG1抗體，用作競爭者mAb。使用競爭結合分析來分析不同測試物品與人類或小鼠FcRn-His6的重組形式(其中FcRn的跨膜和細胞質結構域與聚組氨酸親和標簽置換)的相對親和力。在用于這些分析中之前，測試物品和CNTO3929在4℃下透析至MES緩沖液(0.05MMES,pH6.0)中過夜。96孔銅涂布板(ThermoScientific)用于捕捉磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中5μg/mL的FcRn-His6，之后板用0.15MNaCl、0.02％Tween20(pH約為5)洗滌并且接著用阻斷試劑(0.05MMES、0.025％BSA、0.001％Tween20，pH6.0加上10％ChemiBLOCKER(Millipore))孵育。板如先前進行洗滌，并且接著競爭者測試抗體于阻斷試劑中的連續(xù)稀釋液在固定1μg/mL濃度的生物素標記的CNTO3929制劑存在下添加至該板中。板在室溫下孵育1h，如先前洗滌三次，并且接著在室溫下用抗生蛋白鏈菌素-HRP(JacksonImmunoResearchLaboratories)的1:10,000稀釋液孵育30min。板如上文洗滌五次，并且結合的抗生蛋白鏈菌素-HRP通過添加具有StableStop(FitzgeraldIndustriesInternational)的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物并且賦予4min來檢測。通過添加0.5MHCl來終止顯色。光學密度用SpectraMaxPlus384板式讀取器(MolecularDevices)在450-nm波長下確定。數(shù)據(jù)使用GraphPadPrismv5擬合至S形劑量-反應曲線。結果如圖16(面板A)所示，具有PRASA和/或A6突變的mAb5133變體在用于這種體外競爭結合分析(在pH6.0下進行)中的條件下展現(xiàn)與人類FcRn受體的不易覺察的結合。同樣，如圖16(面板B)所示，具有PRASA和A6突變的mAb5133變體在用于這種體外競爭結合分析中的條件下展現(xiàn)幾乎與mAb5133的結合同一的與小鼠FcRn受體的結合。概述單獨或組合引入PRASA和A6突變對mAb5133變體體外對于人類或小鼠FcRn受體的親和力具有最小程度的(如果有的話)可檢測影響。實施例18：具有PRASA和/或A6突變的融合蛋白保留結合于人類FcRn受體。為了證明在mAb-FN3結構域融合蛋白的情形中PRASA和A6突變不會顯著干擾FcRn受體的銜接，在ELISA格式競爭結合分析中針對與純化的人類FcRn受體的結合測試具有PRASA和/或A6突變的一系列融合蛋白(Kinder等人,“EngineeredProtease-ResistantAntibodiesWithSelectableCell-KillingFunctions,”J.Biol.Chem.288:30843-30854(2013)，其以引用的方式整體并入本文)。程序所用的測試物品為mAb5133PRASAA6(SEQIDNO:66HC和67LC)、mAb5133PRASAA6HCLukAB(SEQIDNO:70HC和71LC)、mAb5133PRASAA6HCLukD(SEQIDNO:74HC和75LC)、mAb5133PRASAA6HCLukDHCLukAB(SEQIDNO:78HC和79LC)和mAb5133PRASAA6HCLukABHCLukD(SEQIDNO:76HC和77LC)。CNTO3929(SEQIDNO:106HC和107LC)，一種靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白的人類IgG1抗體，用作競爭者mAb。使用競爭結合分析來分析不同測試物品與人類FcRn-His6的重組形式(其中FcRn的跨膜和細胞質結構域與聚組氨酸親和標簽置換)的相對親和力。在用于這些分析中之前，測試物品在4℃下透析至MES緩沖液(0.05MMES,pH6.0)中過夜。96孔銅涂布板(ThermoScientific)用于捕捉磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中5μg/mL的FcRn-His6，之后板用0.15MNaCl、0.02％Tween20(pH約為5)洗滌并且接著用阻斷試劑(0.05MMES、0.025％BSA、0.001％Tween20，pH6.0加上10％ChemiBLOCKER(Millipore))孵育。板如先前進行洗滌，并且接著競爭者測試抗體于阻斷試劑中的連續(xù)稀釋液在固定1μg/mL濃度的生物素標記的CNTO3929制劑存在下添加至該板中。板在室溫下孵育1h，如先前洗滌三次，并且接著在室溫下用抗生蛋白鏈菌素-HRP(JacksonImmunoResearchLaboratories)的1:10,000稀釋液孵育30min。板如上文洗滌五次，并且結合的抗生蛋白鏈菌素-HRP通過添加具有StableStop(FitzgeraldIndustriesInternational)的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物并且賦予4min來檢測。通過添加0.5MHCl來終止顯色。光學密度用SpectraMaxPlus384板式讀取器(MolecularDevices)在450-nm波長下確定。數(shù)據(jù)使用GraphPadPrismv5擬合至S形劑量-反應曲線。結果如圖17所示，具有重鏈附接的抗LukD和/或抗LukABFN3結構域的基于mAb5133PRASAA6的融合蛋白在用于這種體外競爭結合分析(在pH6.0下進行)中的條件下展現(xiàn)與人類FcRn受體的結合，其中與親本mAb(mAb5133PRASAA6)相比關于融合蛋白觀察到略微更微弱的結合。概述引入PRASA和A6突變對基于mAb5133的融合蛋白體外對于人類FcRn受體的親和力具有最小程度的影響。實施例19：具有A6突變的mAb1533變體不能與金黃色葡萄球菌IgG結合蛋白蛋白-A或Sbi中的任一者銜接。金黃色葡萄球菌表達兩種已知的免疫球蛋白結合蛋白蛋白A(參看FosterT.J.,“ImmuneEvasionbyStaphylococci,”NatureReviewsMicrobiology3:948-958(2005)，其以引用的方式整體并入本文，和免疫球蛋白的第二結合蛋白(Sbi)(Zhang等人,“ASecondIgG-BindingProteininStaphylococcusaureus,”Microbiology144:985-991(1998)，其以引用的方式整體并入本文)，蛋白各自以細胞表面錨定或分泌形式展示(Smith等人,“TheImmuneEvasionProteinSbiofStaphylococcusaureusOccursBothExtracellularlyandAnchoredtotheCellEnvelopebyBindingtoLipotechoicAcid”Mol.Microbiol.83:789-804(2012)；Becker等人,“ReleaseofProteinAFromtheCellWallofStaphylococcusaureus,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)111(4):1574-9(2014)，其以引用的方式整體并入本文)并且共享參與結合于IgG蛋白的Fc區(qū)的一對保守螺旋(Atkins等人,“S.aureusIgG-bindingProteinsSpAandSbi:HostSpecificityandmechanismsofImmuneComplexFormation,”Mol.Immunol.45:1600-1611(2008)，其以引用的方式整體并入本文)。為了進一步證明具有A6突變的mAb5133變體不能與金黃色葡萄球菌的免疫球蛋白結合蛋白中的任一者銜接，對由表達蛋白A和Sbi或僅表達這兩種蛋白之一的一系列菌株制備的溶解產物進行蛋白質印跡分析。程序用于Western分析的測試物品為mAb5133(SEQIDNO:60HC和61LC)、mAb5133A6(SEQIDNO:64HC和65LC)和mAb5133PRASAA6(SEQIDNO:66HC和67LC)。溶解產物由金黃色葡萄球菌株JE2(Fey等人,“AGeneticResourceforRapidandComprehensivePhenotypeScreeningofNonessentialStaphylococcusaureusGenes,”MBio.4:e00537-12(2013)，其以引用的方式整體并入本文)和Newman(Baba等人,“GenomeSequenceofStaphylococcusaureusStrainNewmanandComparativeAnalysisofStaphylococcalGenomes:PolymorphismandEvolutionofTwoMajorPathogenicityIslands,”J.Bacteriol.190(1):300-10(2008)，其以引用的方式整體并入本文)(均為用于表達蛋白A和Sbi的野生型)、JE2NE286(JE2的spa轉座子插入突變體)、NE453(JE2的sbi轉座子插入突變體)和Wood46(已知缺乏蛋白A的表達的菌株的衍生物制備(Forsgen等人,“LymphocyteStimulationbyProteinAofStaphylococcusaureus,”Eur.J.Immunol.6:207(1976)；Ringdenetal.,“ActivationofHumanBandTLymphocytesbyProteinAofStaphylococcusaureus,”Eur.J.Immunol.8:47(1978)，其以引用的方式整體并入本文)。簡單地說，該菌株的培養(yǎng)物在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中在37℃、200rpm下生長并且在過夜生長后通過離心在6,000rpm下持續(xù)10分鐘從1mL培養(yǎng)物收集細胞。細胞球粒再懸浮于1mL溶葡球菌酶緩沖液(50mMTris,pH8.0,20mMMgCl2，具有1微克/mL的溶葡球菌酶(SigmaL-9043))中。關于Western分析，約30微升的各樣品與約10微升的4xNuPAGELDS樣品緩沖液(InvitrogenNP0007)混合并且在4-12％梯度NuPAGE凝膠上電泳。凝膠轉移至PVDF膜并且隨后在PBS/3％牛奶溶液中阻斷1小時。Western檢測測試物品在室溫下在Rockland熒光western阻斷緩沖液中在輕柔攪動下以2μg/mL與印跡一起孵育(持續(xù)>＝2小時)并且用1XPBS0.5％洗滌四次(每次洗滌10min)。接著在室溫下與二次抗體(山羊抗人類IgG(H+L)Li-coIRDye(1:10,000)一起孵育1小時印跡并且接著用1XPBS0.5％洗滌4次(每次洗滌10min)。在洗滌之后，使用OdysseyInfraRed成像儀使蛋白質印跡膜成像。結果如圖18A面板A所示，mAb5133在所有測試菌株中檢測到一系列對應于絲氨酸天冬氨酸重復序列(SDR)蛋白家族成員的糖基化形式的蛋白(標記C)。關于菌株JE2(泳道1)，在大約55kDa和48kDa處遷移的色帶分別通過對應于蛋白A和Sbi蛋白的mAb5133檢測。如所預期，僅約48kDaSbi蛋白在由缺乏蛋白A:JE2NE286(泳道2)和Wood46菌株(泳道4)的表達的兩種菌株制備的溶解產物中由mAb5133檢測到。相比之下，僅約55kDa蛋白A色帶在由缺乏Sbi蛋白:NE453(泳道3)的菌株制備的溶解產物中由mAb5133檢測到。如圖18B面板B所示，對應于蛋白A或Sbi蛋白的色帶在這些相同溶解產物中均未由mAb5133A6測試物品檢測到并且支持以下觀點：A6突變消除與兩種蛋白的結合。同樣，如圖18B面板C所示，mAb5133PRASAA6測試物品無法在由表達這兩種蛋白的金黃色葡萄球菌株Newman或JE2制備的溶解產物中檢測到蛋白A或Sbi蛋白。概述這些結果證明具有A6突變的mAb5133變體不能與金黃色葡萄球菌的免疫球蛋白結合蛋白蛋白A或Sbi中的任一者銜接并且由ELISA格式分析(實施例9，圖8)證實了先前的觀察結果，在該分析中關于具有A6突變的一系列測試物品未檢測到與蛋白A的結合。實施例20：由FN3結構域結合并且中和γ溶血素HlgAB和HlgCB和Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)。為了證明FN3結構域的子集能夠展現(xiàn)結合于并且中和多種白細胞毒素，使用γ溶血素HlgAB和HlgCB和Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)進行一系列研究。程序這些研究中所包括的測試物品包括Luk129(SEQIDNO:151)、Luk151(SEQIDNO:163)、Luk188(SEQIDNO:185)、Luk357(SEQIDNO:339)、Luk540(SEQIDNO:424)和Luk647(SEQIDNO:526)的重組、純化的聚組氨酸標記形式。FN3結構域與純化的重組白細胞毒素的結合通過ELISA確定。簡單地說，96孔WhiteMaxisorp板(Nunc-目錄號436110)的每孔添加100μl5μg/mL的抗生蛋白鏈菌素溶液(于PBS中)并且在4℃下孵育過夜。孔接著用TBST(50mMTrisHCl(pH7.4)、150mMNaCl、0.1％Tween20)洗滌3次并且用StartingBlockT20(Pierce目錄號37543)以每孔300μL阻斷并且在室溫(RT)下孵育45-60分鐘。接著用TBST洗滌板3次并且0.2μg的白細胞毒素靶標蛋白的生物素標記形式(于100μL中)添加至各測試孔中并且在RT下在輕柔振蕩下孵育板45-60分鐘。接著用TBST洗滌板3次。測試物品在StartingBlockT20中稀釋至1μM并且100μL添加至測試孔中并且在RT下在輕柔振蕩下孵育板45-60分鐘。接著用TBST洗滌板3次。關于結合的測試物品的檢測，添加每孔100μL的1:5000稀釋于StartingblockT20中的多克隆抗FN3-HRP抗體并且在RT下在輕柔振蕩下孵育板45-60分鐘。接著用TBST洗滌板3次。為了檢測結合的抗FN3-HRP抗體，在板讀取之前即刻添加每孔100lμL的POD化學發(fā)光底物(Roche-目錄號11582950001)并且在底物添加的15分鐘內使用Paradigm或Envision讀取器讀取該板。關于白細胞毒素中和研究，F(xiàn)n3結構域測試物品(每孔4μg/10μl的400μg/ml)在4℃下與純化的重組白細胞毒素一起孵育30min。新鮮分離的原代人類中性粒細胞(hPMN，200,000個細胞于RPMI+10mMHEPES+0.1％HSA中)添加至毒素和FN3結構域蛋白的混合物中至100μl的最終體積。溴化乙錠接著以1:2000最終稀釋度添加至細胞中并且板在毒素添加后30和60min讀取。在37℃CO2孵育器中中毒1小時之后，使板1500RPM短暫離心持續(xù)10min，之后將25μl上清液小心地轉移至新的板中。CellTiter試劑(Promega)添加至剩余細胞中并且孵育1.5小時。25μl上清液與等量的CytoTox-ONETM分析試劑(Promega)混合，分析試劑快速地測量具有損傷膜的細胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放。釋放至培養(yǎng)基中的LDH用10-分鐘偶聯(lián)酶分析測量，該分析導致刃天青轉化為熒光試鹵靈產品。關于中和實驗，使用以下濃度的純化的重組白細胞毒素：HlgAB1.25μg/mL、HlgCB0.63μg/mL和PVL0.31μg/mL。結果如圖19所示，F(xiàn)n3結構域變體Luk151展現(xiàn)結合于HlgA亞單位，但不中和HlgAB白細胞毒素的溶細胞活性。相比之下，Luk129展現(xiàn)結合于HlgA亞單位并且中和HlgAB白細胞毒素的溶細胞活性，如通過LDH釋放的完全抑制所例示。如圖20所示，F(xiàn)n3結構域變體Luk357展現(xiàn)結合于HlgC亞單位，但不中和HlgCB白細胞毒素的溶細胞活性。相比之下，Luk188展現(xiàn)結合于HlgC亞單位并且中和HlgCB白細胞毒素的溶細胞活性，如通過LDH釋放的完全抑制所例示。如圖21所示，F(xiàn)n3結構域變體Luk540展現(xiàn)結合于PVL白細胞毒素的LukS-PV亞單位，但不中和PVL的溶細胞活性。相比之下，Luk647展現(xiàn)結合于PVL白細胞毒素的LukS-PV亞單位并且中和PVL白細胞毒素的溶細胞活性，如通過LDH釋放的完全抑制所例示。概述已經(jīng)鑒定展現(xiàn)結合于和/或中和γ溶血素HlgAB和HlgCB和Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)的FN3結構域。表6.本公開的核酸和氨基酸序列當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3