專利名稱：一種嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原及含有該抗原的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人粒細(xì)胞無(wú)形體病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原及含有該抗原的試劑盒。
背景技術(shù)：
人粒細(xì)胞無(wú)形體病(Human granulocytic anaplasmosis, HGA)是由嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體(Anaplasma phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒細(xì)胞引起，以發(fā)熱伴白細(xì)胞、血小板減少和多臟器功能損害甚至死亡為主要臨床表現(xiàn)的新發(fā)疾病。人粒細(xì)胞無(wú)形體病是硬蜱叮咬人體而引起的人獸共患性疾病。1994年美國(guó)報(bào)告首例人粒細(xì)胞無(wú)形體病病例(Chen SM, Dumler JS, Bakken JS, et al. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. J Clin Microbiol,1994,32(3) 589-595.)。2006年我國(guó)在安徽省發(fā)現(xiàn)首例人粒細(xì)胞無(wú)形體病病例，此后通過(guò)回顧性血清學(xué)與分子生物學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)浙江、山東、河南及湖北等省份均存在HGA病例Ghang L， Liu Y，Ni D，，et al. Nosocomial transmission of human granulocytic anaplasmosis in China. JAMA,2008,300(19) :2263-2270. Zhang S，Hai R，Li W，et al. Seroprevalence of human granulocytotropic anaplasmosis in central and southeastern China. Am J Trop Med Hyg，2009，81 (2) :293-295. Zhang L, Shan A， Mathew B， et al. Rickettsial Seroepidemiology among farm workers, Tianjin， People ' s Republic of China. Emerg Infect Dis，2008，14(6) :938-940. Chahan B，Jian Z,Xuan X，，et al. Serological evidence of infection of Anaplasma and Ehrlichia in domestic animals in Xinjiang Uygur Autonomous Region area，China.Vet Parasitol，2005，134 (3-4) 273-278.)。由于該病為新發(fā)疾病，相關(guān)的研究稍顯薄弱，一旦疾病爆發(fā)可能由于技術(shù)儲(chǔ)備不足而導(dǎo)致診斷不明，貽誤治療甚至引起恐慌。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要有包括血清及病原學(xué)檢測(cè)(1)急性期血清間接免疫熒光抗體(IFA)檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體IgM抗體陽(yáng)性。(2)急性期血清IFA檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體IgG抗體陽(yáng)性。( 恢復(fù)期血清IFA檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體IgG抗體滴度較急性期有4 倍及以上升高。(4)全血或血細(xì)胞標(biāo)本PCR檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體特異性核酸陽(yáng)性，且序列分析證實(shí)與嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的同源性達(dá)99%以上。(5)分離到病原體。由于人粒細(xì)胞無(wú)形體病無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，早期診斷較困難。病原學(xué)檢測(cè)包括PCR 檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體特異性核酸陽(yáng)性以及分離病原體。其中PCR檢測(cè)不適宜基層醫(yī)院使用，其檢測(cè)的陽(yáng)性率也偏低；病原體的分離更需一定的設(shè)備和技術(shù)儲(chǔ)備，不易成功。目前我國(guó)血清學(xué)檢測(cè)使用的免疫熒光試劑主要依賴美國(guó)進(jìn)口，價(jià)格非常昂貴，而且制備熒光片需大量培養(yǎng)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體，熒光片的制備很難標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化，因此利用免疫熒光方法進(jìn)行大規(guī)模的樣品檢測(cè)受到限制，再者，由于熒光片制備采用感染的全細(xì)胞易產(chǎn)生交叉反應(yīng)性，影響檢測(cè)的特異性。由于人粒細(xì)胞無(wú)形體病是硬蜱叮咬人體而引起的，因此開(kāi)展蜱傳播疾病的鑒別診
3斷顯得尤為重要。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的早期診斷對(duì)控制其傳播具有重要意義，而特異性抗原則是實(shí)驗(yàn)室診斷優(yōu)劣的關(guān)鍵所在。目前開(kāi)展嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的研究力量嚴(yán)重不足，尚缺乏高靈敏度、高特異性的血清檢測(cè)試劑。而酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法靈敏、簡(jiǎn)便被廣泛用于病原體的抗體檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。依據(jù)其采用抗原的不同，分為全菌體、基因工程表達(dá)重組抗原等。全菌體抗原也需要大量培養(yǎng)病原體，抗原的均一性、可重復(fù)性差，且其純化方法很難標(biāo)準(zhǔn)化，因此可能帶來(lái)非特異性反應(yīng)的問(wèn)題，同樣存在產(chǎn)業(yè)化的困難，因此利用全菌體抗原進(jìn)行大規(guī)模的樣品檢測(cè)也受到限制?；蚬こ炭乖瓱o(wú)需培養(yǎng)病原體，容易標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化，已成功應(yīng)用于丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體等不能體外培養(yǎng)的病原體的血清學(xué)檢測(cè)。國(guó)外已有報(bào)道采用基因工程抗原(全蛋白重組抗原)研制酶聯(lián)免疫試劑用于抗體檢測(cè)，但全長(zhǎng)的重組蛋白存在交叉反應(yīng) (全長(zhǎng)的MSP5重組蛋白與AM (A marginale)存在交叉反應(yīng))和表達(dá)量低等問(wèn)題，因此研究開(kāi)發(fā)重組表位抗原有望提高血清學(xué)檢測(cè)的特異性和靈敏度，而且獲得的優(yōu)勢(shì)診斷表位抗原不需細(xì)胞培養(yǎng)，適合大量樣品的檢測(cè)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原。本發(fā)明的目的還在于提供編碼上述抗原的多核苷酸及其表達(dá)載體和工程菌。本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgG抗體的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析試劑盒。一種嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原，所述抗原為含有優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位的長(zhǎng)肽，其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 9 所示。編碼權(quán)利要求1任何一項(xiàng)所述的長(zhǎng)肽的多核苷酸。包含權(quán)利要求2任何一項(xiàng)所述的多核苷酸的表達(dá)載體。包含權(quán)利要求3任何一項(xiàng)所述的表達(dá)載體的工程菌。根據(jù)權(quán)利要求1任何一項(xiàng)所述的長(zhǎng)肽制備的抗體。一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgG抗體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述任一抗原。一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述任一抗原。一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述任一抗原。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明是建立高效表達(dá)的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體重組抗原的基礎(chǔ)上，可有效地避免費(fèi)時(shí)費(fèi)力的病原體培養(yǎng)，降低了檢測(cè)成本，易于標(biāo)準(zhǔn)化。2、本發(fā)明抗原含有優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，在最大地保留抗原反應(yīng)性的前提下，盡量減少無(wú)關(guān)序列造成的交叉反應(yīng)性。表位抗原表達(dá)量高，克服全基因抗原表達(dá)量低不易制備的缺點(diǎn)。3、本發(fā)明利用 ELISA方法和免疫層析法檢測(cè)抗體，較之免疫熒光法可大大提高檢測(cè)的靈敏度，具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，適合基層醫(yī)院使用。尤其IgM抗體檢測(cè)采用IgM捕獲法，與間接ELISA技術(shù)相比，具有較高的特異性。


圖1為MSP2的B細(xì)胞表位分析；1_5代表MSP2優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段。圖2為MSP5的B細(xì)胞表位分析；橫線為MSP5優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段。圖3為160KD的B細(xì)胞表位分析；橫線為160KD優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段。圖4為130KD的B細(xì)胞表位分析；橫線為130KD優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例未說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或參照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例1抗原基因序列的獲得根據(jù)GenBank中的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體MSP2、MSP5、160KD和130KD基因序列，設(shè)計(jì)引物，以感染嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的小鼠血清基因組DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因， PCR擴(kuò)增條件如下95°C預(yù)變性2分鐘，94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 30-90秒(依據(jù)基因長(zhǎng)度而定)，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘?；厥誔CR產(chǎn)物，將其連接至pMD19克隆載體中，將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定。用于MSP2基因擴(kuò)增的引物序列如下MSP2-F (SEQ ID No. 10)，MSP2_R(SEQ ID No. 11)。用于MSP5基因擴(kuò)增的引物序列如下MSP5-F (SEQ ID No. 12)，MSP5_R(SEQ ID No. 13)。用于160KD基因擴(kuò)增的引物序列如下160KD-409F(SEQ ID No.14)，160KD_1595R(SEQ ID No. 15) ； 160KD-1371F(SEQ ID No.16)，160KD-1914R(SEQ ID No. 17) ； 160KD-1574F(SEQ ID No.18)，160KD_2374R(SEQ ID No.19) ； 160KD-1985F(SEQ ID No. 20)，160KD_3377R(SEQ ID No. 21) ； 160KD_2997F(SEQ ID No.22)，160KD-3890R(SEQ ID No. 23) ； 160KD-3732F(SEQ ID No.24)，160KD_4559R(SEQ ID No.25) ； 160KD-4264F(SEQ ID No. 26)，160KD_5190R(SEQ ID No. 27) ； 160KD_4924F(SEQ ID No.28)，160KD-5405R(SEQ ID No. 29)。用于130KD基因擴(kuò)增的引物序列如下130KD-226F(SEQ ID No. 30)，130KD_1361R(SEQ ID No. 31) ； 130KD-742F(SEQ ID No. 32)，130KD-2247R(SEQ ID No. 33) ；130KD-1277F(SEQ ID No. 34)，130KD-2636(SEQ ID No.35) ； 130KD-2410F(SEQ ID No. 36)，130KD_3238R(SEQ ID No. 37) ； 130KD_2838F(SEQ ID No.38)，130KD-3700R(SEQ ID No. 39)。將用上述引物擴(kuò)增出來(lái)的片段拼接，得到MSP2、MSP5、160KD和130KD基因序列。實(shí)施例2抗原的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)將實(shí)施例1克隆出來(lái)的MSP2、MSP5、160KD和130KD基因序列DNA序列翻譯為氨基酸序列，利用BioSun軟件分析嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體MSP2、MSP5、160KD和130KD等抗原的線性
5B細(xì)胞表位，首先輸入其氨基酸序列，然后用BioSim生物學(xué)軟件中蛋白質(zhì)模塊的B細(xì)胞表位分析，所得表位分布圖見(jiàn)圖1-4，結(jié)合BLAST分析結(jié)果，最終確定各個(gè)優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段的序列。MSP2優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段的氨基酸序列為MSP2-1(SEQ ID No. 1) ；MSP2-3(SEQ ID No. 2) ；MSP2-4(SEQ ID No. 3) ；MSP2-5 (SEQID No. 4)。MSP5優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段的氨基酸序列為(SEQ ID No. 5)。160KD優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段的氨基酸序列為160KD-1 (SEQ ID No. 6) ； 160KD_2(SEQ ID No. 7)。130KD優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段的氨基酸序列為130KD-1(SEQ ID No. 8) ； 130KD_2(SEQ IDNo. 9)。實(shí)施例3目的基因的克隆采用大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子，將實(shí)施例2所述優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段的氨基酸序列反推成核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，采用重疊PCR的方法合成上述表位抗原的基因。將目的基因連接入PMD19克隆載體中測(cè)序。分別合成基因片段，各需要2-3輪退火延伸PCR反應(yīng)，第一輪PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2 XPCR反應(yīng)液25 μ 1、雙蒸水23 μ 1、XFl及XRl引物各1 μ 1，其中X代表待合成基因，PCR反應(yīng)條件為94°C 1分鐘，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，5個(gè)循環(huán)；第2_3輪 PCR反應(yīng)體系為百泰克公司2父？0 反應(yīng)液25111、雙蒸水22111、XF2(或XF3)及)(R2 (或 XF3)引物各1 μ 1，其中X代表待合成基因，第一輪(或第二輪)PCR產(chǎn)物1 μ 1，反應(yīng)條件為 PCR反應(yīng)條件為94°C 3分鐘后，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，30個(gè)循環(huán)后再72°C 延伸5分鐘，即獲得待合成的基因。PCR引物設(shè)計(jì)如下MSP2-1F1(SEQIDNo.40)，MSP2-1R1 (SEQIDNo.41)
MSP2-1F2(SEQIDNo.42)，MSP2-1R2(SEQIDNo.43)
MSP2-3F1(SEQIDNo.44)，MSP2-3R1(SEQIDNo.45)
MSP2-3R2(SEQIDNo.46)，MSP2-3F2 (SEQIDNo.47)
MSP2-4F1(SEQIDNo.48)，MSP2-4R1(SEQIDNo.49)
MSP2-4F2(SEQIDNo.50)，MSP2-4R2(SEQIDNo.51)
MSP2-5F1(SEQIDNo.52)，MSP2-5R1(SEQIDNo.53)
MSP2-5F2(SEQIDNo.54)，MSP2-5R2(SEQIDNo.55)MSP5F1 (SEQ ID No. 56)，MSP5R1 (SEQ ID No. 57)；MSP5F2 (SEQ ID No. 58)，MSP5R2 (SEQ ID No. 59)；160KD-1F1(SEQ IDNo. 60)，160KD-1R1(SEQ IDNo. 61)；160KD-1F2(SEQ ID No. 62)，160KD-1R2(SEQ ID No. 63)160KD-1F3(SEQ ID No. 64)，160KD-1R3(SEQ ID No. 65)160KD-2F1 (SEQ ID No. 66)，160KD-2R1(SEQ ID No. 67)160KD-2F2(SEQ IDNo. 68)，160KD-2R2(SEQ IDNo. 69)；160KD-2F3(SEQ ID No. 70)，160KD-2R3(SEQ ID No. 71)
130KD-1F1(SEQ ID No. 72)，130KD-1R1(SEQ ID No. 73)；130KD-1F2(SEQ ID No. 74)，130KD-1R2(SEQ ID No. 75)；130KD-1F3(SEQ ID No. 76)，130KD-1R3(SEQ ID No. 77)；130KD-2F1(SEQ ID No. 78)，130KD-2R1(SEQ ID No. 79)；130KD-2F2(SEQ ID No. 80)，130KD-2R2(SEQ ID No. 81)；130KD-2F3 (SEQ ID No. 82)，130KD-2R3(SEQ ID No. 83)。合成的MSP2-1表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 84所示；合成的MSP2-3表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 85所示；合成的MSP2-4表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 86所示；合成的MSP2-5表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 87所示；合成的MSP5表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 88所示；合成的160KD-1表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 89所示；合成的160KD-2表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 90所示；合成的130KD-1表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 91所示；合成的130KD-2表位抗原區(qū)段的DNA序列如序列表SEQ ID No. 92所示。實(shí)施例4抗原的表達(dá)與純化將測(cè)序正確的目的基因，克隆入原核表達(dá)載體pBVIL-Ι質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化HBlOl挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。將測(cè)序正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒PBVIL-I系列載體轉(zhuǎn)化到HBlOl受體菌中， 經(jīng)42°C誘導(dǎo)后提取包涵體，采用變性條件鎳親和層析純化抗原，具體操做簡(jiǎn)述如下取以上合成基因產(chǎn)物及pBVIL-Ι表達(dá)載體各30 μ 1分別放于Eppendorf離心管中，各加入 10 X buffer (D) 4 μ 1、XhoI (lOu/μ 1)和 XbaI (12u/μ 1)各 1 μ 1，加滅菌蒸餾水至40μ 1，置37°C水浴酶切3小時(shí)。酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產(chǎn)物及載體pBVILl經(jīng)雙酶切后，用 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒回收純化，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。于滅菌Eppendorf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因各Ιμ 、 10XT4DNA Ligase buffer 1 μ 1, T4DNA Ligase (12u/ul) 1 μ 1，加滅菌蒸溜水至 10 μ 1，置 16°C過(guò)夜。在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌吸頭取100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞懸液于Eppendorf中，加入上述連接物5 μ 1，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分鐘。立即轉(zhuǎn)移到42°C水浴中放置2分鐘，每管加入 0. 5ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30°C水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0. 2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑選數(shù)個(gè)菌落， 分別接種于LB中(5ml/管)，培養(yǎng)過(guò)夜，次日各取0. Iml轉(zhuǎn)移到LB中(^iil/管)，37°C培養(yǎng) 3小時(shí)，420C誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇高表達(dá)的作為下一步大量表達(dá)用菌株，并測(cè)序鑒定。表達(dá)菌株10 μ 1接種于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日按2 %的比例轉(zhuǎn)種于LB 培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)0D600值達(dá)到0. 7時(shí)，轉(zhuǎn)至42°C誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)，收集菌液， BOOOrpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。用10倍體積的20mmol/L pH8. OTE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘， 共超10次。4°C，1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用lmol/L NaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用pH8. OTE配制)溶解，加1 % β -巰基乙醇。再于20°C，1，2000rpm，離心10分鐘，去沉淀取上清。采用變性條件鎳親和層析純化抗原。洗脫抗原采用SDS-PAGE進(jìn)行純化鑒定。實(shí)施例5 診斷用表位抗原的蛋白芯片和ELISA篩選采用蛋白芯片結(jié)合ELISA方法，用嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體感染動(dòng)物(小鼠和綿羊)和疑似患者的血清對(duì)上述獲得的表位抗原進(jìn)行抗原性評(píng)價(jià)，篩選用于診斷的表位抗原。蛋白芯片法采用點(diǎn)接觸法制備芯片，封閉室溫池，洗片，晾干4°C備用，加入稀釋的血清室溫反應(yīng)(濕盒)lh，洗液洗，加入cy3標(biāo)記的二抗(1 400)室溫反應(yīng)(濕盒)0. 5h，洗片，上機(jī)掃描。ELISA方法包被重組表位抗原，建立間接ELISA方法，檢測(cè)感染鼠和綿羊的系列血清的IgG抗體碳酸鹽緩沖液溶解抗原約2 μ g/ml，包被酶聯(lián)板，4°C過(guò)夜，次日1 % BSA封閉，干燥備用。將待測(cè)血清10倍稀釋，37°C孵育30min后洗板，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗IgG (二抗)，37°C孵育20min后洗板，顯色劑顯色lOmin，用酶標(biāo)儀讀取450nm吸光值。A 值大于Cut off為陽(yáng)性，A值大于Cut off為陰性。實(shí)施例6本實(shí)施例涉及一種利用實(shí)施例2所述抗原用于間接ELISA方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgG抗體的試劑盒和捕獲ELISA方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的試劑盒及其使用方法。檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgG抗體的試劑盒試劑盒包含實(shí)施例2所述任一抗原，碳酸緩沖液，酶聯(lián)板，牛血清白蛋白，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗IgG抗體，TMB顯色液。該試劑盒的使用方法將純化好的抗原用0. 05M pH9. 6的碳酸緩沖液濃度稀釋為 2 μ g/ml，包被酶聯(lián)板，每孔100 μ 1，4°C過(guò)夜，BSA封閉2小時(shí)后，拍干備用。每孔加入 1 10倍稀釋的待測(cè)血清樣本，37°C 30分鐘，棄液，用洗滌液洗板5次后棄液，拍干，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗IgG (二抗)100 μ 1，37°C溫浴20分鐘，棄液洗板5次拍干。加TMB 顯色液A和B液各50μ 1，37°C避光顯色10分鐘，每孔加入終止液50 μ 1，用酶標(biāo)儀讀取 450nm吸光值。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的試劑盒試劑盒包含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的實(shí)施例2所述任一抗原，抗IgM-μ鏈單抗包被酶聯(lián)板，牛血清白蛋白，TMB顯色液。該試劑盒的使用方法抗IgM-μ鏈單抗包被酶聯(lián)板(PBS稀釋到2 μ g/ml)，每孔 100 μ 1，4°C過(guò)夜后棄液，蒸餾水沖洗3次，拍干，每孔加入BSA 100 μ 1，室溫2小時(shí)，棄液。每孔加入1 10的待測(cè)血清樣本，37°C 30分鐘，棄液，用洗滌液洗板5次后棄液，拍干， 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原100 μ 1，37°C溫浴20分鐘，棄液洗板5 次拍干。加TMB顯色液=A和B液各50 μ 1，37°C避光顯色10分鐘，每孔加入終止液50 μ 1， 用酶標(biāo)儀讀取450nm吸光值。實(shí)施例7本實(shí)施例涉及一種利用實(shí)施例2所述抗原用于雙抗原夾心方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析試劑盒和捕獲方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的免疫層析試劑盒及其使用方法。用于雙抗原夾心方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析試劑盒，包含實(shí)施例2所述任一抗原，樣品墊，結(jié)合墊，吸收墊，硝酸纖維素膜，膠體金探針，兔免疫血清。雙抗原夾心方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析條的制備免疫層析檢測(cè)條由樣品墊、結(jié)合墊硝酸纖維素膜及吸收墊四部分組成。樣品墊和結(jié)合墊用玻璃纖維， 吸收墊用吸水濾紙。玻璃纖維膜上加膠體金探針，硝酸纖維素膜上包被嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原(檢測(cè)帶)及兔免疫血清(質(zhì)控帶)。以純化的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原劃線作為檢測(cè)帶(濃度細(xì)g/ml)，參數(shù)0. lul/mm劃線；檢測(cè)線與質(zhì)控線間距離約為7mm。兔免疫血清濃度為5mg/ml，直接劃線，參數(shù)0. lul/mm。標(biāo)記結(jié)束的膠體金溶液以含5%蔗糖、5% BSA的 0. lmmol/L Tris溶液重懸，調(diào)節(jié)至OD53tl為2，浸濕結(jié)合墊后37°C干燥濁。將吸收墊、樣品墊及處理后的結(jié)合墊硝酸纖維素膜疊加，組裝成完整的層析條，然后切割層析條，寬度3mm/ 條，室溫干燥避光保存。檢測(cè)及結(jié)果判讀將制備好層析條的樣品墊端插入待測(cè)液約1cm，或手工加樣 80ul，當(dāng)液體上行到吸收墊時(shí)，取出平放，20min后，檢測(cè)帶和質(zhì)控帶均出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，只有質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色為陰性，檢測(cè)帶和對(duì)照帶均不顯色，則為試劑失效，需換新的層析條重測(cè)。用于捕獲方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析試劑盒，包含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的實(shí)施例2所述任一抗原，樣品墊，結(jié)合墊，吸收墊，硝酸纖維素膜，抗IgM- μ鏈單抗，兔免疫血清，膠體金探針。捕獲方法檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的免疫層析的制備免疫層析檢測(cè)條由樣品墊、結(jié)合墊硝酸纖維素膜及吸收墊四部分組成。樣品墊和結(jié)合墊用玻璃纖維，吸收墊用吸水濾紙。玻璃纖維膜上加膠體金探針，硝酸纖維素膜上包被抗IgM-μ鏈單抗(檢測(cè)帶)及兔免疫血清(質(zhì)控帶)。以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原劃線作為檢測(cè)帶(濃度lmg/ml)，參數(shù)2ul/mm劃線；檢測(cè)線與質(zhì)控線間距離約為7mm。兔免疫血清濃度為lmg/ml，直接劃線，參數(shù)2ul/mm。標(biāo)記結(jié)束的膠體金溶液以含5%蔗糖、5% BSA的 0. lmmol/L Tris溶液重懸，調(diào)節(jié)至OD53tl為2，浸濕結(jié)合墊后37°C干燥濁。將吸收墊、樣品墊及處理后的結(jié)合墊硝酸纖維素膜疊加，組裝成完整的層析條，然后切割層析條，寬度3mm/ 條，室溫干燥避光保存。檢測(cè)及結(jié)果判讀將制備好層析條的樣品墊端插入待測(cè)液約1cm，或手工加樣 80ul，當(dāng)液體上行到吸收墊時(shí)，取出平放，20min后，檢測(cè)帶和質(zhì)控帶均出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，只有質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色為陰性，檢測(cè)帶和對(duì)照帶均不顯色，則為試劑失效，需換新的層析條重測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原，其特征在于，所述抗原為含有優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位的長(zhǎng)肽， 其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 9 所示。
2.編碼權(quán)利要求1任何一項(xiàng)所述的長(zhǎng)肽的多核苷酸。
3.包含權(quán)利要求2任何一項(xiàng)所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
4.包含權(quán)利要求3任何一項(xiàng)所述的表達(dá)載體的工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1任何一項(xiàng)所述的長(zhǎng)肽制備的抗體。
6.一種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgG抗體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述任一抗原。
7.—種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清IgM抗體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述任一抗原。
8.—種檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體血清抗體的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述任一抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于人粒細(xì)胞無(wú)形體病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的一種嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體抗原及含有該抗原的試劑盒。本發(fā)明的抗原含有優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，在最大地保留抗原反應(yīng)性的前提下，盡量減少無(wú)關(guān)序列造成的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明利用ELISA方法和免疫層析法檢測(cè)抗體，較之免疫熒光法可大大提高檢測(cè)的靈敏度，具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，適合基層醫(yī)院使用，尤其IgM抗體檢測(cè)采用IgM捕獲法，與間接ELISA技術(shù)相比，具有較高的特異性。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102286093SQ20111021285
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者何競(jìng), 劉瑋, 宋曉國(guó), 張賀秋, 曹務(wù)春, 楊錫琴, 江佳富, 王國(guó)華, 蔣寶貴, 詹琳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所