專利名稱：病原體檢測細(xì)胞保存系統(tǒng)的制作方法
病原體4企測細(xì)胞保存系統(tǒng)
相關(guān)申請
本申請要求于2005年11月30日提交的美國臨時(shí)申請No. 60/741,384的優(yōu)先權(quán)。
上述申請的全部教導(dǎo)引入本文作為參考。
政府支持
本發(fā)明在整體上或者部分上受到美國空軍合同號 F19628-00-C-0002的政府基金的支持。政府享有本發(fā)明的一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
生物和化學(xué)武器的擴(kuò)散加強(qiáng)了對能夠長時(shí)間監(jiān)測環(huán)境的小型、 快速、靈敏的生物戰(zhàn)劑探測器的需要。在戰(zhàn)場條件下，有用的探測 器在探測到特定生物或化學(xué)戰(zhàn)劑時(shí)可以迅速給士兵發(fā)出警報(bào)，從而 可以快速實(shí)施應(yīng)對措施。這些探測器也可以用于非軍事領(lǐng)域。快速 檢測患者中的抗生素抗性細(xì)菌將會(huì)幫助醫(yī)生選擇更有效的治療方 案。連續(xù)監(jiān)測城市飲用水供應(yīng)可提供對潛在病原體的早期預(yù)警，使 公共工作部門有更多的時(shí)間處理這種對公眾的潛在健康威脅。另外， 在肉類和禽類檢驗(yàn)中使用這樣的探測器將比現(xiàn)有的"刺-嗅"法具有顯 著的改進(jìn)。通常，在醫(yī)學(xué)(例如獸醫(yī)學(xué))、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)(例如 診斷不良建筑物綜合征)和食品加工或管理領(lǐng)域的分析和診斷應(yīng)用 中非常需要這樣的探測器。
利用抗體多樣性檢測多種稀少目標(biāo)粒子或抗原的裝置已經(jīng)在
(例如)美國專利No. 6,087，114和美國專利No. 6,248,542中描述。這 些裝置通常包括含有傳感細(xì)胞(例如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)
(傳感細(xì)胞在此也被稱為"CANARY"細(xì)胞或"發(fā)射"細(xì)胞(emittercell))的液體介質(zhì)、光學(xué)探測器和接受待檢測的目標(biāo)粒子的液體介 質(zhì)。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在-80。C或更冷的溫度下凍存，但是眾所 周知當(dāng)它們以液體狀態(tài)在冷藏溫度或環(huán)境溫度下保存時(shí)在數(shù)周內(nèi)喪 失存活力。此外，以干燥狀態(tài)長時(shí)間保存細(xì)胞而同時(shí)保持其存活力 的技術(shù)仍在發(fā)展中。在-80。C或更冷的溫度以外的溫度和條件下保存 傳感細(xì)胞將大大提高使用傳感細(xì)胞的裝置的方便性。
因此，需要在環(huán)境溫度或非冷藏溫度下保持存活或者可以以干 燥狀態(tài)保存的細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。特別是，需要可以檢測生物制 劑或其它材料并且在環(huán)境溫度或非冷藏溫度下保持存活或者可以以 干燥狀態(tài)保存的傳感細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了當(dāng)細(xì)胞在可能導(dǎo)致細(xì)胞存活力降低或喪失的環(huán)境 溫度或非冷藏溫度下保存時(shí)保持細(xì)胞存活力的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞保存技術(shù)用于發(fā)射細(xì)胞(在此也被稱 為CANARY細(xì)胞或傳感細(xì)胞)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)射細(xì)胞 表達(dá)目標(biāo)粒子的一種或多種受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是 一種抗體。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是Fc受體。在一個(gè)進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，發(fā)射細(xì)胞是B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。
在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，發(fā)射細(xì)胞表達(dá)發(fā)射分子。在一個(gè)具 體實(shí)施方案中，發(fā)射分子響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣的增加而發(fā)出光子。在一個(gè) 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，發(fā)射分子是水母發(fā)光蛋白(a叫uorin)。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞保存方法包括用 一種或多種 胱天蛋白酶(caspase)抑制劑、蛋白水解酶抑制劑和/或蛋白體 (proteosome)抑制劑的組合保護(hù)細(xì)胞(如發(fā)射細(xì)胞)以阻止其凋亡、 氧化和/或蛋白質(zhì)降解。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞保存方法另外或者可替代地包括
增強(qiáng)負(fù)責(zé)誘導(dǎo)和/或保持靜止的基因在細(xì)胞中的表達(dá)，從而延長細(xì)胞 保持靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞保存方法另外或者可替代地 包括控制調(diào)節(jié)凋亡的基因的表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，凋亡抑
制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Protein, IAP)在細(xì)胞中表達(dá)。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞保存方法另外或者可替代地包括 將條件擴(kuò)展為包括在環(huán)境溫度和冷藏溫度下在液體中長期保存。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞保存方法另外或者可替代地 包括誘導(dǎo)保護(hù)性靜止?fàn)顟B(tài)，包括加入細(xì)胞周期抑制劑。在一個(gè)具體 實(shí)施方案中，細(xì)胞周期抑制劑選自放線菌素D、絲裂霉素C、雷帕霉 素、美伐他汀、衣霉素和渥曼青霉素。
本文所述的本發(fā)明還提供了一種發(fā)射細(xì)胞，它是一種嗜極微生 物(extremophile)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述嗜極微生物是耐 受干燥的嗜極微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述嗜極微生物是衣藻 (chlamydomonas algae )。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述嗜極微生物 表達(dá)目標(biāo)粒子的一種或多種受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是 一種抗體。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是Fc受體。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述嗜極微生物表達(dá)發(fā)射分子。 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)射分子響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣的增加而發(fā)出光子。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，發(fā)射分子是水母發(fā)光蛋白。


本專利或申請文件包括至少 一幅彩色附圖。具有彩色附圖的該 專利或?qū)＠暾埞_文本的復(fù)印件可由本局在收到請求和支付的必
要費(fèi)用后提供。
通過以下對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的更具體的描述，如附圖所示， 本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。這些附圖 不一定是放大、強(qiáng)調(diào)，而是說明本發(fā)明的原理。
圖l是細(xì)胞保存技術(shù)的概述以及B細(xì)胞在球狀體(spheroid)形成 過程中的照片。
圖2是一張曲線圖，顯示細(xì)胞在室溫下保存一周后的活性。20 圖3是一 張曲線圖和一 張條圖，曲線圖顯示細(xì)胞在室溫下保存一 周后的活性，條圖顯示在室溫下保存l-3周后活細(xì)胞的百分比，其中
使用或不使用廣譜胱天蛋白酶III抑制劑(Pan-Caspase IIIinhibitor)。 圖4是一張曲線圖，顯示在誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞靜止、保存和復(fù)蘇 過程中基因表達(dá)分析的結(jié)果。
圖5概括了在不同溫度和干燥保存條件下細(xì)胞的保存和使用條 件的B細(xì)胞保障(Logistics)。
圖6(a)和6(b)顯示了應(yīng)用可增強(qiáng)長期保存的CANARY細(xì)胞活性的 處理和添加劑的結(jié)果。圖6(a)表明在4 。 C下保存的細(xì)胞當(dāng)在準(zhǔn)備用于 測定前與渥曼青霉素 一 起孵育、并且在胱天蛋白酶抑制劑 Z-LEED-FMK和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸、亞竭酸鈉、去鐵胺和氨 基胍存在下保存時(shí)，細(xì)胞存活力和活性提高。圖6(b)表明在室溫下保 存的細(xì)胞在準(zhǔn)備用于測定前與衣霉素一起孵育、并且在胱天蛋白酶 抑制劑III存在下保存時(shí)，存活力和活性提高。這種處理使細(xì)胞可以
圖7顯示與對照(x-軸上的"0")相比，用2% DMSO處理24小時(shí)后(x畫 軸上的"r)、在室溫下旋轉(zhuǎn)24小時(shí)后(x-軸上的"2")以及在4。C下保存l 周后(x-軸上的"3") ， CANARY細(xì)胞中的基因表達(dá)模式(水平)。
圖8證明舊金山灣卣蟲(Artemia franciscana)熱休克基因artemin 的過量表達(dá)提高了室溫保存的細(xì)胞的活性，使保存時(shí)間延長到1周， 而不喪失活性。
圖9是一張條圖，證明抗凋亡基因Bcl-XL的過量表達(dá)提高了在 4。C下保存的細(xì)胞的存活力和活性，使保存時(shí)間從2周延長到4周。
的活性比較。利用CANARY測定法比較等量(1600個(gè)細(xì)胞)的新鮮制備 的(新鮮的)鼠疫耶爾森氏菌(Y. pestis)特異性細(xì)胞和在室溫下保存3 周的(保存的)相同細(xì)胞對抗原的應(yīng)答。
發(fā)明詳述 7盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在-80。(^或更低的溫度下凍存，但是眾所 周知當(dāng)它們以液體狀態(tài)在冷藏溫度或環(huán)境溫度下保存時(shí)在數(shù)周內(nèi)喪 失存活力。此外，以干燥狀態(tài)長時(shí)間保存細(xì)胞而同時(shí)保持其存活力 的技術(shù)仍在發(fā)展中。改善活細(xì)胞干燥保存的幾種技術(shù)涉及在細(xì)胞內(nèi) 或細(xì)胞外使用非還原二糖，如海藻糖，但是它們只荻得有限的成功。最近通過誘導(dǎo)靜止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)保持 一定水平的含水量并且減少可利用的氧和靜電，實(shí)現(xiàn)了人類細(xì)胞系 在環(huán)境溫度下的6周保存[Jack等人，J. Cell. Physiol" 206(2): 526-536 (2005)]。通過使細(xì)胞在被稱為球狀體的三維結(jié)構(gòu)中生長來誘導(dǎo)靜止 狀態(tài)，認(rèn)為這種靜止?fàn)顟B(tài)提供了阻止凋亡和其它形式的細(xì)胞死亡的 保護(hù)。
本發(fā)明使用 一種或多種以下細(xì)胞保存技術(shù)改進(jìn)了上述技術(shù)，該 細(xì)胞保存技術(shù)包括(l)與胱天蛋白酶抑制劑(例如，Z-AEVD-FMK、 Z-DEVD誦FMK、 Z-LEED-FMK 、 Z-LEHD-FMK 、 Z-WEHD-FMK 、 Z-VAD-FMK、 Z畫VDVAD-FMK、 Z國YVAD-FMK 、 Z-VEID-FMK、 Z-IETD-FMK、 OPH-109、和/或廣譜胱天蛋白酶III抑制劑)、抗氧化 劑(例如，亞硒酸鈉、N-乙酰半胱氨酸、去鐵胺、氨基胍、Trolox、 苯并硒唑酮(ebsden)、和/或Tempo1)、和/或蛋白水解酶抑制劑和/ 或蛋白體抑制劑(例如，AEBSF、抑酶肽(aprotonin)、苯丁抑制素 (bestatin)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpeptin )、組織蛋白酶L抑制劑、 E-64、亮抑酶肽、和/或胃酶抑素A)組合，提供阻止凋亡、氧化和/或 蛋白質(zhì)降解的進(jìn)一步保護(hù)；(2)增強(qiáng)負(fù)責(zé)誘導(dǎo)和保持靜止的基因的表 達(dá)，以延長細(xì)胞保持靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間(例如，可以使用本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的技術(shù)通過轉(zhuǎn)錄分析來鑒定這些基因)。增強(qiáng)的基因表達(dá) 可以用本領(lǐng)域公知的任何手段來實(shí)現(xiàn)，例如，利用強(qiáng)啟動(dòng)子在細(xì)胞 中過量表達(dá)一種或多種基因；(3)控制調(diào)節(jié)凋亡的基因的表達(dá)，例如， 采用遺傳學(xué)方法，如過量表達(dá)凋亡抑制蛋白(IAP)如XIAP; (4)將條件擴(kuò)展到包括在環(huán)境溫度和冷藏溫度下在液體中長期保存；和/或(5)利 用細(xì)胞周期抑制劑(例如，放線菌素D、絲裂霉素C、雷帕霉素、美伐 他汀、衣霉素和/或渥曼青霉素)誘導(dǎo)保護(hù)性靜止?fàn)顟B(tài)。如本文使用的 "長期保存"是指超過大約10年、超過大約1年、超過大約9個(gè)月、超過 大約6個(gè)月、超過大約3個(gè)月、超過大約2個(gè)月、超過大約l個(gè)月、超 過大約2周、超過大約1周、或者超過大約72小時(shí)的時(shí)間段。
此外，如本文所述，本發(fā)明提供了在環(huán)境溫度、冷藏溫度或非 冷藏溫度下以液體、半液體或干燥狀態(tài)保存細(xì)胞如發(fā)射細(xì)胞的方法。 如本文使用的環(huán)境溫度或非冷藏溫度的范圍是從大約5。C至大約 50°C、從大約10。C至大約40。C、從大約15。C至大約30。C、以及從大 約20。C至大約30。C。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，對發(fā)射細(xì)胞(在本文中也被稱為
CANARY細(xì)胞或傳感細(xì)胞)應(yīng)用一種或多種細(xì)胞保存技術(shù)。在此處使 用時(shí)，發(fā)射細(xì)胞用于檢測目標(biāo)粒子(如生物抗原、可溶性抗原、核酸、 毒素、化學(xué)物質(zhì)等)。目標(biāo)粒子的檢測在過去是通過將目標(biāo)粒子與發(fā) 射細(xì)胞表面上表達(dá)的受體直接或間接結(jié)合來進(jìn)行的。直接結(jié)合可以 通過直接與目標(biāo)粒子特異性結(jié)合的受體例如抗體來進(jìn)行。目標(biāo)粒子 的間接結(jié)合可以通過(例如)與附著(例如結(jié)合)到目標(biāo)粒子上的 抗體結(jié)合的Fc受體來進(jìn)行?？乖c受體的結(jié)合導(dǎo)致鈣濃度升高。發(fā) 射細(xì)胞在它們的細(xì)胞溶質(zhì)中也含有一種或多種發(fā)射分子(例如水母發(fā) 光蛋白)，該發(fā)射分子響應(yīng)細(xì)胞溶質(zhì)中鈣濃度的升高而發(fā)出光子。光 子發(fā)射可以被探測到，由此檢測目標(biāo)粒子的存在。這在本文中也4皮 稱為"CANARY測定"。關(guān)于發(fā)射細(xì)胞、使用發(fā)射細(xì)胞的光電檢測系 統(tǒng)和CANARY測定的進(jìn)一步的信息，參見，例如，美國專利序號 11/001,583、美國專利申請No. 2004/0121402、美國專利6，087，114和 美國專利6,248,542,它們的內(nèi)容都全部《1入本文作為參考。
一種替代方法是遺傳修飾耐干燥的極端嗜極微生物，用作 CANARY細(xì)胞。例如，已知衣藻在其局部生活環(huán)境因缺少降水而千 燥時(shí)形成孢子。據(jù)報(bào)道這些孢子再水合的存活力超過孢子形成后70年。此外，還已知衣藻具有類似于B細(xì)胞的細(xì)胞表面受體活化的鉤信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。因此，可以遺傳工程改造一種嗜極微生物，使其表達(dá)
一種或多種受體，如抗體或Fc受體，和發(fā)射分子，如水母發(fā)光蛋白。
當(dāng)細(xì)胞表面上的受體被病原體或抗原交聯(lián)時(shí)，它的表達(dá)刺激信號級
聯(lián)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，而這種升高的細(xì)胞內(nèi)4丐離子濃度刺激 發(fā)射分子發(fā)光，可以測量這種發(fā)光，并且與目標(biāo)抗原或病原體的存 在相關(guān)聯(lián)。因此，嗜極微生物發(fā)射細(xì)胞可以在例如環(huán)境溫度、冷藏 溫度或非冷藏溫度下以脫水狀態(tài)保存延長的時(shí)間(例如長期保存)， 并且在再水合后保持存活，例如可用于CANARY測定。
實(shí)施例
實(shí)施例l
衣霉素可提高CANARY B細(xì)胞的細(xì)胞存活力和活性(見圖2)。在 CANARY B細(xì)胞(表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌特異性受體)與衣霉素在室溫 下一起保存后，CANARY B細(xì)胞保持對鼠疫耶爾森氏菌的檢測靈敏 性(見圖2)。
此外，用渥曼青霉素處理CANARY細(xì)胞也提高了冷藏的 CANARY細(xì)胞的存活力和抗原檢測活性。 實(shí)施例2
與不使用渥曼青霉素在室溫下保存l、 2、 3周的細(xì)胞相比，用廣 譜胱天蛋白酶III抑制劑(在圖3的條圖中被稱為"胱天蛋白酶nr)處 理細(xì)胞提高了在室溫下保存l、 2、 3周的細(xì)胞的存活力(見圖3，條圖)。
實(shí)施例3
證明了細(xì)胞保存保障(Logistics)的改善
已證明CANARY B細(xì)胞生物制劑傳感器技術(shù)是任何已知生物制 劑鑒定技術(shù)的速度和靈敏性的最佳結(jié)合[Rider等人，5We"ce 301: 213 (2003)]。 CANARY可以檢測多種基質(zhì)和形式(包括空氣、食物、表 面和醫(yī)學(xué)樣品)中的病原體。然而，仍然需要對B細(xì)胞本身的容易并 且便宜的保存和保障。細(xì)胞一般冷凍或冷藏保存到準(zhǔn)備使用前，對于許多醫(yī)學(xué)和棲息環(huán)境來說這是可接受的(盡管不是最佳的)，但 不是對所有情況都理想的，例如對于向前展開的軍事單位來說。另 外，大多數(shù)使用者希望有一種發(fā)射細(xì)胞(例如B細(xì)胞)試劑盒，其可以 在環(huán)境溫度下在倉庫或?qū)嶒?yàn)室架子上放置大約6個(gè)月至大約10年或 者更長時(shí)間，并且可以取出、裝入傳感器中，用于進(jìn)行檢測。這些
試劑盒包含，例如，發(fā)射細(xì)胞和任選的在測定如CANARY測定中j吏 用發(fā)射細(xì)胞的說明書。
在申請人的本發(fā)明之前，CANARY細(xì)胞試劑的擱置保存期為室 溫下2天和4。C下2周。細(xì)胞可以在-80。C或更低的溫度下無限期地冷凍 保存，但是這需要液氮或特殊的冰箱，不是所有的實(shí)驗(yàn)室都能夠擁 有。本文描述了可提高在室溫(例如環(huán)境溫度)和/或4。C下長期保存的 細(xì)胞存活力和活性的多種處理、添加劑和基因過量表達(dá)的實(shí)例。
方法與材料
研究的化學(xué)添加劑是胱天蛋白酶抑制劑AEVD、 DEVD、 LEED、 LEHD(在50 ^M時(shí)具有毒性)、WEHD (在50 iaM時(shí)具有毒性)、 VAD、 VDVAD、 YVAD、 VEID、 IETD (R&D Systems) 、 OPH-109(MP Biomedicals),胱天蛋白酶抑制劑III (Calbiochem);蛋白水解酶抑制 劑AEBSF、抑酶肽、苯丁抑制素、鈣蛋白酶抑制蛋白、組織蛋白酶 L抑制劑、E-64、亮抑酶肽、胃酶抑素A (Sigma);細(xì)胞周期抑制劑雷 帕霉素(LCLabs)、放線菌素D、絲裂霉素C、美伐他汀、衣霉素、渥 曼青霉素(Sigma);抗氧化劑亞硒酸鈉、N-乙酰半胱氨酸、去鐵胺、 氨基胍、Trolox、苯并竭唑酮、Tempol (Sigma) 、 MnTBAP (A.G. Scientific)。
為了在4。C下保存，將細(xì)胞以2.5-3 x 1()5細(xì)胞/mL的密度在l-3 nM 渥曼青霉素中37。C孵育24小時(shí)，然后以5 x 1()S細(xì)胞/mL的濃度在20/0 DMSO中37。C孵育24小時(shí)。然后將細(xì)胞在含有50 腔腸素 (coelenterazine ) (Molecular Probes, Eugene, OR)的測定』備養(yǎng)基[不依 賴于C02的培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50jLig/ml鏈霉素，50U/ml青霉素 和250 ng/mL兩性霉素B (Life Technologies)]中在暗處室溫孵育2小時(shí)。然后將細(xì)胞洗滌兩次，以5 x 1()S細(xì)胞/mL的終濃度重懸浮在添加 有下列成分的測定培養(yǎng)基中100 |uM Z-LEED-FMK, 50 |tig/mL N-乙 酰半胱氨酸，150 ng/mL亞硒酸鈉，15 iuM去鐵胺(新鮮制備的D&存液)， 1.5 mM氨基胍(新鮮制備的貯存液)，使其在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜。
為了在室溫下保存，將細(xì)胞以2.5-3 x 1()S細(xì)胞/mL的密度在0.1 lag/mL衣霉素中37。C孵育24小時(shí)，然后以5 x 1()5細(xì)胞/mL的濃度在2% DMSO中37。C孵育24小時(shí)。然后將細(xì)胞在含有50 nM腔腸素的測定培 養(yǎng)基中在暗處室溫孵育2小時(shí)，洗滌兩次，以5 x 1()S細(xì)胞/mL的終濃 度重懸浮在含有100 pM胱天蛋白酶抑制劑III的測定培養(yǎng)基中。
使用MagicVac密封機(jī)將細(xì)胞管真空密封在食物保存袋中，并且 通過將細(xì)胞保存在空間沒有充滿的15 mL和50 mL管中提供頂部空 間。用抗CD40刺激的細(xì)胞以2 x 10"田胞/mL的濃度與抗體(BD Biosciences)在37。C下孵育24小時(shí)，然后如上所述用2% DMSO處理并 且在腔腸素中孵育。熱休克條件為42。C下2-5小時(shí)。通過用驅(qū)動(dòng)熒火 蟲螢光素酶和花蟲螢光素酶質(zhì)粒(作為轉(zhuǎn)染率的對照)表達(dá)的Hsp70-反應(yīng)性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染，測定熱休克反應(yīng)。通過電穿孔法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使 其恢復(fù)24-48小時(shí)，進(jìn)行熱休克，次日用雙螢光素酶報(bào)道測定法(Dual Luciferase Reporter Assay ) (Promega)進(jìn)行觀'j定。
在500 ing/mL潮霉素(Invitrogen)中篩選用鹵蟲p26和pcDNA3.1質(zhì) 粒中的artemin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過RT-PCR克隆鼠GADD45p，將其插入 pEF6/V5/His-TOPO (Invitrogen)中。在5 pg/mL殺稻瘟素(Blasticidin ) (Invitrogen)中篩選用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過PCR向人Bcl-XL基因 (Invivogen)中添加限制性酶切位點(diǎn)，將其插入pcDNA3.1 (Invitrogen) 的NheI和XhoI位點(diǎn)中，并且證實(shí)其序列。在保存期間雖過量表達(dá)4旦 不提供保護(hù)的其它基因包括卣蟲p22和p21 (兩種形式， 一種在氨基酸 位點(diǎn)62處具有G,另一種具有E)、 BiP、 XIAP、桿狀病毒p35、和顯示 組成型活性的HSFl的缺失突變體(氨基酸221-35) [Voellmy， Me/ZzoA 35: 199 (2005)]。
在270 V, 950 iuP條件下通過電穿孔(BioRad)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過有限稀釋法進(jìn)行克隆。使用TaqMan 基因表達(dá)測定法(Applied Biosystems)通過定量RT-PCR分析克隆的表達(dá)。選擇幾個(gè)具有中度和 高度表達(dá)的克隆進(jìn)行隨后的保存實(shí)驗(yàn)。通過在添加2% DMSO的生長 培養(yǎng)基中以5 x 1()S細(xì)胞/mL的濃度孵育B細(xì)胞，準(zhǔn)備B細(xì)胞用于發(fā)光測 定。20-24小時(shí)后，將細(xì)胞在含有50 juM腔腸素(Molecular Probes, Eugene， OR)的測定培養(yǎng)基[不依賴于C02的培養(yǎng)基，10%胎牛血清， 50 iug/ml鏈霉素，50 U/ml青霉素和250 ng/mL兩性霉素B (Life Technologies)]中在暗處室溫孵育2小時(shí)。然后將細(xì)胞洗滌兩次,以5 x 105細(xì)胞/mL的終濃度重懸浮在1.5 mL微量離心管中的測定培養(yǎng)基中， 在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜。準(zhǔn)備后，將細(xì)胞保存在1.5mL微量離心管中的測 定培養(yǎng)基中。 結(jié)果
檢測在準(zhǔn)備測定和/或保存過程中向細(xì)胞中加入化學(xué)物質(zhì)提高細(xì) 胞在4。C或室溫下保存時(shí)的活性和/或存活力的情況?；瘜W(xué)物質(zhì)選自以 下類別凋亡抑制劑、抗氧化劑、細(xì)胞周期抑制劑、和蛋白水解酶 抑制劑。完全清單在"方法與材料，，部分中給出，見上文。每種添 加劑都以不同濃度應(yīng)用。在保存前以及在保存期間以1周間隔評價(jià)存 活力并且檢測活性。然后將確定為有益的添加劑在進(jìn) 一 步的實(shí)驗(yàn)中 互相組合。
通常，在一種保存溫度下有益的處理在另外一種保存溫度下不 一定具有益處，而且在一種情況下(在4。C下保存的衣霉素處理的細(xì)胞) 是有害的。當(dāng)細(xì)胞在準(zhǔn)備用于CANARY測定之前與渥曼青霉素一起 孵育，并且在胱天蛋白酶抑制劑Z-LEED-FMK和抗氧化劑N-乙酰半 胱氨酸、亞硒酸鈉、去鐵胺和/或氨基胍的存在下保存時(shí)，發(fā)現(xiàn)了在4。C 下保存的細(xì)胞的存活力和活性提高。該處理使細(xì)胞在4。C下保存而不 喪失活性的時(shí)間從2周延長到3周。當(dāng)獨(dú)立應(yīng)用時(shí)，發(fā)現(xiàn)渥曼青霉素 處理提高了存活力和活性，而在Z-LEED-FMK和抗氧化劑中保存〗叉提 高了活性。類似地，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞在準(zhǔn)備用于測定之前與衣霉素一起 孵育，并且在胱天蛋白酶抑制劑III的存在下保存時(shí)，在室溫下保存的細(xì)胞的存活力和活性提高。該處理使細(xì)胞在室溫下保存而不喪失 活性的時(shí)間從2天延長到1周。當(dāng)獨(dú)立應(yīng)用時(shí)，衣霉素處理和在胱天 蛋白酶抑制劑III中保存都提高了存活力和活性。使細(xì)胞活性提高的
其他處理包括真空密封、利用頂部空間保存細(xì)胞、以及用抗CD40抗
血清刺激細(xì)胞。然而，在這些處理后保存的細(xì)胞的應(yīng)答是不一致的，
圖6所示的結(jié)果代表在 一半以上、但不超過75%的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的結(jié)果。 還研究了某些基因的過量表達(dá)在保存期間的保護(hù)性益處。生長
地轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這些細(xì)胞在室溫保存6周后仍然存活[Jack等人，《/. CW/ 尸/z—/. 206: 526 (2006)]。類似地，CANARY B細(xì)胞也在準(zhǔn)備用于測 定后上調(diào)GADD45(3，并且在整個(gè)保存期間保持該水平(見圖7 )。已 經(jīng)證明來自舊金山灣卣蟲的熱休克蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)提 供對應(yīng)激的抗性[參見，例如，Ma等人，O_yo6/o/. 51: 15 (2005); Villeneuve等人,Ce〃 5Yms^ C72"pe/xw^ 11: 71 (2006》Collins和Clegg, CW/ 28: 449 (2004)]。 GADD45(3和卣蟲p26和artemin的過量
表達(dá)提高了在室溫下保存的B細(xì)胞的活性，使保存時(shí)間延長到1周而 不喪失活性(見圖8)。通常，表達(dá)artemin的細(xì)胞的活性好于表達(dá)p26 或過量表達(dá)GADD45(3的細(xì)胞的活性。Bcl-XL (—種抗凋亡蛋白)的 過量表達(dá)提高了在4°C下保存的細(xì)胞的存活力和活性，使最長保存時(shí) 間從2周延長到4周(參見圖9)。在少數(shù)實(shí)驗(yàn)中，這些細(xì)胞在長達(dá)6周時(shí) 間里保持完全活性。當(dāng)對任意過量表達(dá)的細(xì)胞系應(yīng)用上述添加劑和 處理時(shí)，沒有觀察到益處。 討論
CANARY提供了其它方法無法匹敵的速度和靈敏性的結(jié)合。然 而，活細(xì)胞試劑通常具有室溫下2天和4。C下2周的有限的保存期。試 劑(即CANARY細(xì)胞)可以在-80。C或更低的溫度下凍存，但是這需要 液氮或特殊的冰箱。將保存的細(xì)胞與新鮮制備的細(xì)胞進(jìn)行比較的實(shí) 驗(yàn)表明，保存期間活性的喪失不僅是由于存活力的降低，也是由于 每個(gè)細(xì)胞響應(yīng)抗原的發(fā)光量的降低(見圖10)。因此申請人在尋找隨時(shí)間延長保持細(xì)胞應(yīng)答性和存活力的方法。申請人發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶 抑制劑和抗氧化劑都是有益的，這可能是因?yàn)殡滋斓鞍酌敢种苿┍?持存活力而抗氧化劑保持總體細(xì)胞健康或水母發(fā)光蛋白、腔腸素的 輔因子的氧化狀態(tài)。
HEK293細(xì)胞可以在室溫下保存長達(dá)6周，而具有良好的存活性， 靜止?fàn)顟B(tài)對于它們的存活是關(guān)鍵性的[Jack等人，J CW/ P/z>w'o/. 206: 526 (2006)]。為了誘導(dǎo)靜止?fàn)顟B(tài)，用阻滯細(xì)胞周期的化學(xué)物質(zhì)處理 CANARY細(xì)胞。有意思的是，盡管證明用渥曼青霉素和衣霉素處理 細(xì)胞具有有益效果，但這不是在抑制細(xì)胞生長的濃度上。
在多種應(yīng)激條件下誘導(dǎo)熱休克應(yīng)答，其代表為保護(hù)細(xì)胞避免非 折疊中間物聚集和沉淀的蛋白質(zhì)，包括分子伴侶和蛋白水解酶 [Winter和Jakob， 紐腸c/ 醫(yī)M /.腸/. 39: 297 (2004》Mosser 等人，Afo/. CW/ 17: 5317 (1997)]。發(fā)現(xiàn)卣蟲熱休克基因p26和
artemin的表達(dá)保持在室溫下保存的CANARY細(xì)胞的活性。
GADD45(3在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡中都起作用。它是一種抗凋亡 蛋白質(zhì)，由B細(xì)胞的CD40剌激誘導(dǎo)，并且介導(dǎo)Fas-誘導(dǎo)的凋亡的抑制。 它也被描述為應(yīng)激應(yīng)答基因，GADD45卩的表達(dá)在用DMSO處理后的 C AN A RY細(xì)胞中上調(diào)，申請人發(fā)現(xiàn)該D M S O處理步驟有助于確保一 致的活性。GADD45[3不是唯一 的在DMSO處理后的CANARY細(xì)胞中 顯示表達(dá)變化的DNA損傷相關(guān)基因。GADD45f3和組蛋白1 Hlc (HistlHlc)的表達(dá)提高，而淋巴特異性解旋酶(Hells)的表達(dá)降低(見圖 7)。然而，GADD45(3的上調(diào)在HEK293細(xì)胞中更顯著，該細(xì)胞在保存 后也顯示更好的存活力。通過誘導(dǎo)該基因的更高表達(dá)，我們能夠證 明在室溫下保存的CANARY細(xì)胞的活性提高。
盡管未能證明凋亡是引起保存期間活細(xì)胞損失的機(jī)制，但是有 幾條證據(jù)表明它們可能至少部分相關(guān)。第一，存在至少兩種可提高 保存細(xì)胞的存活力和活性的凋亡抑制劑。第二，轉(zhuǎn)錄分析揭示有幾 種凋亡促進(jìn)因子如Bc。-樣11 (Bcl"ll)、程序性細(xì)胞死亡l配體l (Pdcdllgl)和Bcl2修飾因子(Bmf)上調(diào)(見圖7)。已經(jīng)證明Bmf在物理上與抗凋亡家族的成員(Bc12、 Bcl-w、 Mcl-l和Bcl-XL)結(jié)合，并且認(rèn)為 Bmf抑制所述成員隔離及滅活促凋亡蛋白的能力，從而解除對凋亡途 徑的抑制。而且，Bmf在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的過量表達(dá)誘導(dǎo)了凋亡， 這一效應(yīng)可以通過過量表達(dá)上述抗凋亡蛋白來克服。申請人已經(jīng)證 明過量表達(dá)Bcl-XL的細(xì)胞在4。C保存后存活力和活性均提高。有意思 的是，其他人已經(jīng)證明p35的表達(dá)也逆轉(zhuǎn)了Bmf過量表達(dá)的效果，但 是當(dāng)它在CANARY細(xì)胞中表達(dá)時(shí)沒有提供明顯的益處。
另外一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，盡管在CANARY細(xì)胞中過量表達(dá)的許多基因 沒有可觀察到的效果，但是XIAP的過量表達(dá)完全抑制了細(xì)胞對抗原 的應(yīng)答。這不可能是由于意料之外的插入效應(yīng)，因?yàn)樗谵D(zhuǎn)染人類 和鼠XIAP時(shí)，以及在檢測的所有克隆中都發(fā)生。
這些結(jié)果表明，活細(xì)胞試劑如發(fā)射細(xì)胞的保存期可以延長?？?抑制凋亡或用作分子伴侶的基因的過量表達(dá)提供了阻止細(xì)胞死亡的 保護(hù)，并且也許提供阻止細(xì)胞成分降解的保護(hù)，并且使CANARY細(xì) 胞的保存期延長至室溫下1周和4。C下至少大約4周。
已經(jīng)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案具體說明和描述了本發(fā)明，但 是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離所附權(quán)利要求書包括的本發(fā) 明范圍的情況下可以在形式和細(xì)節(jié)上進(jìn)行各種變化。
此處引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利申請的有關(guān)教導(dǎo)都整體 引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1. 一種細(xì)胞保存方法，包括用胱天蛋白酶抑制劑、蛋白水解酶抑制劑、蛋白體抑制劑或它們的組合處理細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)胞是發(fā)射細(xì)胞。
3. —種細(xì)胞保存方法，包括增強(qiáng)靜止調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而 延長細(xì)胞保持靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞是發(fā)射細(xì)胞。
5. —種細(xì)胞保存方法，包括控制調(diào)節(jié)凋亡的基因的表達(dá)。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述調(diào)節(jié)凋亡的基因是一種凋亡抑 制蛋白(IAP)基因。
7. 權(quán)利要求5的方法，其中所述表達(dá)是凋亡抑制因子基因的上調(diào)。
8. 權(quán)利要求5的方法，其中所述表達(dá)是凋亡活化基因的下調(diào)。
9. 一種細(xì)胞保存方法，包括誘導(dǎo)靜止。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述誘導(dǎo)靜止包括抑制細(xì)胞的細(xì)胞周期。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述抑制細(xì)胞周期包括向細(xì)胞中 加入一種或多種細(xì)胞周期抑制劑。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞周期抑制劑 選自放線菌素D、絲裂霉素C、雷帕霉素、美伐他汀、衣霉素、渥曼 青霉素和它們的組合。
13. —種發(fā)射細(xì)胞，其中所述發(fā)射細(xì)胞是一種嗜極微生物。
14. 權(quán)利要求13的發(fā)射細(xì)胞，其中所述發(fā)射細(xì)胞是一種耐受干 燥的嗜極微生物。
15. 權(quán)利要求14的發(fā)射細(xì)胞，其中所述嗜極微生物是衣藻。
16. 權(quán)利要求13的發(fā)射細(xì)胞，其中所述嗜極微生物表達(dá)目標(biāo)粒 子的受體和發(fā)射分子。
17. 權(quán)利要求16的發(fā)射細(xì)胞，其中所述受體是一種抗體。
18. 權(quán)利要求16的發(fā)射細(xì)胞，其中所述受體是Fc受體。
19. 權(quán)利要求13的發(fā)射細(xì)胞，其中發(fā)射分子響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)4丐的增 加而發(fā)出光子。
20. 權(quán)利要求19的發(fā)射細(xì)胞，其中所述發(fā)射分子是水母發(fā)光蛋白。
全文摘要
描述了在環(huán)境溫度或非冷藏溫度下保持存活或者可以以干燥狀態(tài)保存的細(xì)胞的生產(chǎn)方法。特別是，細(xì)胞保存是細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞在保持細(xì)胞存活的同時(shí)在環(huán)境溫度或非冷藏溫度下的長期保存。還提供了可以檢測目標(biāo)粒子、生物制劑或其它材料并且在環(huán)境溫度或非冷藏溫度下保持存活或者可以以干燥狀態(tài)保存的傳感細(xì)胞。
文檔編號A01N1/02GK101511169SQ200680044871
公開日2009年8月19日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者E·施沃貝爾, F·納爾吉, J·哈珀, M·S·佩特羅維克, T·賴德 申請人:麻省理工學(xué)院