專利名稱：一種檢測病毒的方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及病毒的檢測方法，本發(fā)明還涉及應用于該方法的檢測試劑盒，屬于病毒學及化學生物學領域。
背景技術：
高靈敏高特異性的病原體快速檢測新技術對全世界(我國)食品安全、疾病防控與有效診治、國民生命安全至關重要。隨著SARS、艾滋病、甲型Hmi流感病毒等傳染病的爆發(fā)，人們急需發(fā)展新的病原體檢測方法用于有效控制傳染病的流行。禽流感病毒因為其高傳染性，易致病性以及對人和禽類帶來的危害，得到越來越多的關注。例如，目前檢測禽流感病毒方法主要有核酸檢測，雞胚病原分離等。但是這些方法都存在步驟繁瑣，耗時較長等問題，不利于病毒的快速檢測和鑒定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測病毒的方法，以克服現(xiàn)有技術檢測步驟繁瑣耗時較長的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是
提供一種檢測病毒的方法，該方法包括如下步驟通過將目標病毒外膜的糖蛋白的抗體與磁性納米微球偶聯(lián)得到免疫磁性納米微球，用該免疫磁性納米微球捕獲樣品中的目標病毒得到磁球病毒復合物，將生物素化的所述病毒的外膜的糖蛋白抗體與磁球病毒復合物孵育，再與鏈霉親和素偶聯(lián)的量子點孵育得到磁球-病毒-量子點復合物，通過檢測磁球-病毒-量子點復合物的熒光信號檢測病毒。上述磁性納米微球是表面經(jīng)過修飾的能夠與蛋白偶聯(lián)的磁性微球，例如表面帶有-NH2基團，微球的大小一般為納米級，優(yōu)選直徑為150ηπΓ250ηπι，在本發(fā)明實施例中，磁性微球直徑為200nm。上述病毒一般是指內(nèi)部具有核酸，外面具有衣殼的蛋白，包括但不限于，例如流感病毒、腸道病毒等等，或者是朊病毒。基于上述方法，本發(fā)明還進一步提供檢測H9N2的方法，該方法用商品化的磁性納米微球偶聯(lián)抗H9N2外膜HA的單克隆一抗抗體富集分離H9N2病毒，并利用H9N2外膜HA抗體的免疫作用使分離后的病毒與生物素(biotin)化的抗體相互作用，并被偶聯(lián)了鏈酶親和素(SA)的量子點(QDs)識別，通過量子點(QDs)。具體地，其包括如下步驟
①制備免疫磁性納米微球利用EDC活化法將抗H9N2外膜糖蛋白HA的單克隆一抗抗體連接到表面帶-NH2的磁性納米球表面，并用BSA對偶聯(lián)了抗體后的磁球進行封閉；
②富集分離H9N2病毒將該免疫磁性納米微球與加入到樣品溶液中，37°C下孵育15分鐘，用磁力架吸附微球除去溶液中未反應的病毒，得到磁球-病毒的復合物；
③制備生物素化抗體利用蛋白生物素標記試劑對抗H9N2外膜的糖蛋白HA的單克隆一抗抗體進行生物素化標記，得到biotin-mAb ；④量子點標記將biotion-mAb與磁球-病毒復合物在溶液中于37°C下孵育15min，用磁力架吸附磁球，去除溶液中未反應的biotion-mAb，再往磁球-病毒復合物溶液中加入鏈霉親和素偶聯(lián)量子點，37°C下反應15min，磁力架分離洗滌，除去未反應的量子點，沉淀加入溶液重懸均勻，形成磁球-病毒-量子點的復合物；
=5 \* GB3⑤量子點檢測利用熒光顯微鏡或者熒光分光光度計對磁球-病毒-量子點復合物進行檢測。此外，還可以增加陰性對照實驗，如重復①步驟后，分別用純水，滅活的H5m病毒以及其他禽類病毒代替H9N2，重復②一 =5 \* GB3⑤步驟。進一步本發(fā)明提供一種用于病毒檢測的檢測試劑盒，其包括
1)免疫磁性納米微球，所述微球表面偶聯(lián)有目標病毒外膜的糖蛋白抗體；
2)生物素化目標病毒外膜的糖蛋白；
3)鏈霉親和素偶聯(lián)的量子點。本發(fā)明通過具有靶向性的磁性納米球分離富集目標病毒，并利用病毒表面蛋白的免疫作用，和量子點的熒光特性作為檢測病毒的方法。由于磁性納米球分離操作簡單，量子點的熒光強度高，該方法具有易操作，無需對樣品進行預處理，靈敏度高，特異性強等特點。
圖1為本發(fā)明檢測禽流感H9N2流程示意圖。圖2為本發(fā)明所檢測的禽流感H9N2的熒光光譜，可以看出H9N2的樣品在602nm 處有量子點的特殊發(fā)射峰，對照樣品H5m和空白樣品H2O的熒光光譜中沒有明顯的量子點的發(fā)射峰。圖3為本發(fā)明所檢測的禽流感H9N2樣品的熒光共聚焦顯微鏡照片，只有當磁性靶向納米球捕抓到目標病毒，目標病毒經(jīng)過biotin化抗體的免疫反應，再被SA-QDs識別，才能在共聚焦顯微鏡下實現(xiàn)磁球與量子點的共定位。在對照實驗中，用H5W病毒代替H9N2 病毒，從共聚焦圖片可以看出，磁球上沒有出現(xiàn)量子點熒光。用空白樣品代替病毒樣品，共聚焦顯微鏡的圖片中也沒有看到量子點的熒光。圖4為用DIO染料為病毒染色的實驗結構，以證明H9N2病毒被特異性的捕獲和識別。在病毒被磁球捕獲后，用DIO染料對磁球-病毒的復合物進行染色，DIO染料是一種親脂染料，可以和病毒的囊膜結合而顯色。如圖所示，磁球(a)與病毒上的DIO熒光(b)和與病毒上結合的量子點熒光(c)可以共定位。同時，病毒在被捕獲前，先將病毒用DIO染料染色，用磁球捕獲被染色的病毒，再用量子點的識別病毒，如圖所示，磁球(e)與DIO熒光(b) 和量子點的熒光(g)可以共定位。圖5顯示的是本發(fā)明檢測方法的特異性。除了用空白樣品做對照外，還應用了幾種禽類的常見的病毒作為對照，圖中，單純磁球的背景值，減蛋綜合癥病毒(EDS)，傳染性法式囊病毒(IBDV)，新城疫病毒(NDV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)和H5W禽流感病毒，這些病毒均已經(jīng)過高溫滅活處理。對照病毒的信號均在陰性域值的范圍內(nèi)。圖6顯示的是本發(fā)明方法檢測禽流感病毒的工作曲線，即被檢測病毒的濃度與量子點熒光強度的關系，將已知濃度的病毒成倍稀釋，在保證磁球，抗體和量子點用量保持不變，并過量的情況下，用該方法對病毒進行捕獲并檢測，得到熒光與病毒濃度的關系曲線。如圖所示，在低濃度下，量子點的熒光與病毒的濃度成正比，隨著病毒濃度的增加，量子點熒光與病毒的濃度不再成正比的關系。圖7顯示的是模擬實際環(huán)境的樣品檢測結果為了更好的運用該方法，本發(fā)明模擬了實際檢測環(huán)境中的禽類組織(雞肝，雞肺，雞糞)樣品的環(huán)境，在禽類組織環(huán)境存在的情況下，用該方法對于低濃度和高濃度的H9N2病毒進行檢測。
具體實施例方式以下實施例僅用于進一步說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例1禽流感病毒H9N2的檢測
下面以禽流感病毒H9N2為例，對熒光磁性免疫夾心法檢測病毒的方法進行詳細的說明。一、方法
UH9N2抗體的制備 (一)實驗材料
1)免疫原禽流感病毒(AIV) H9N2亞型毒株(中科院病毒所)。2)試劑和培養(yǎng)基RPMI_1640購自GIBC0L，新生小牛血清(超級)購自杭州四季青生物工程公司；融合劑 50%PEq 購自 Sigma ； HAT 鹽(10 () x), GIBCOL ；HT 鹽(IOOx) ,GIBCOL ； 淋巴細胞分離液天津顴洋生物制品科技有限公司；鏈霉素為華北制藥廠產(chǎn)品；羊抗鼠 IgG-HRp:華美公司；秋水仙素sigma公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，Sigma
3)實驗動物Balb/c小鼠，8-12周齡，雌性，SPF級動物培養(yǎng)。(二)雜交瘤細胞系的建立 1)動物免疫
分別取適量經(jīng)純化的抗原(IOOyg)與等體積的弗氏完全佐劑乳化，小鼠背部皮下多點注射，以后每間隔14d加強1次，換用弗氏不完全佐劑乳化。最后于融合前3d(7 )，腹腔強化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。2)雜交瘤細胞的制備
按常規(guī)方法收集小鼠的脾細胞與SP2/0細胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000進行融合。用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后10 15天，取上清采用間接ELISA法篩選分泌抗AIV H9膜蛋白HA的雜交瘤細胞株。對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進行亞克隆。間接ELISA 法的操作步驟如下用200 μ 1的AIV Η9膜蛋白HA包板，用免疫小鼠血清1:2000作為陽性對照，無克隆生長的培養(yǎng)基上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔加1:2000 HRP-山羊抗小鼠IgG 100 μ 1，最后測定450nm OD值。凡0D450值大于陰性對照2倍以上者，即可初步判定為陽性克隆。3)雜交瘤細胞系的建立
重復步驟2，進行2次細胞融合，經(jīng)過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到5株AIV H9 膜蛋白HA，穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，將其中一株命名為H94C4。4)應用上述雜交瘤細胞系所得單抗的效價檢測
(i)細胞培養(yǎng)液上清效價測定間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價為1 50000-1 100000。
(ii)小鼠腹水效價測定間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞制備的腹水效價為 1 :500000-1 1000000。5)雜交瘤細胞系的傳代培養(yǎng)
將上述雜交瘤細胞系在含有10%太牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)進行培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)到10代后，雜交瘤細胞系仍然能夠生長良好、穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液上清效價仍然可以達到 1:10000 以上。以上結果表明，所得雜交瘤細胞系能夠穩(wěn)定傳代，可以持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗AIV H9膜蛋白HA的單克隆抗體。(三)單抗制備
選擇成年BALB/c小鼠，腹腔接種降植烷，每只小鼠0.5ml。7_10天后腹腔接種第16代雜交瘤細胞，每只小鼠1 X 106-2X 106個。間隔5天后，待腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用9號針頭采集腹水。采用辛酸一硫酸錢法對小鼠腹水進行純化取小鼠腹水10. OmL，加入等體積的巴比妥緩沖液，適量的二氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離心管中，4°C，1800 r/min離心20min；取上清液18. OmL，加入 36. 0 mLO. 06mo比醋酸鈉緩沖液，用HCL調(diào)pH值至4. 5，充分攪拌下在30min內(nèi)緩慢加入辛酸297 μ L;繼續(xù)攪拌lOmin，然后轉入4°C冰箱靜置濁，4°C，15000r/min離心30min，上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后體積為50mL;加入5. omLO. lmol/L的磷酸緩沖液，用NaOH調(diào)pH 值至7. 6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0. 277g/mL ；4°C冰箱靜置濁后，4°C，12000r/ min離心30min，棄上清；沉淀用5mL 0. lmol/L的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，對5000mL 0. 01mol/L pH7. 2PBS緩沖液充分透析后，再對2000 L蒸餾水透析，最后對3000m超純水透析；然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，收集上清液，測蛋白濃度。作SDS-PAGE電泳，鑒定單克隆抗體的純度。2、禽流感病毒H9N2的檢測
①將Iyg抗H9N2病毒表面蛋白(viral surface protein) HA蛋白的一抗H94C4與 200nm表面帶-NH2的磁球(購自法國ademtech公司)按約為5 1 (w/w)比例在(500 μ 1) PBS (0. IM ρΗ7. 2)中混合，渦旋均勻，加入活化劑EDC使其最終濃度為lmg/mL，室溫下孵育兩小時。磁力架將磁球聚集除去上清，加入100 μ 1 PBS (0. IM ρΗ7. 2)渦旋使磁球均勻分散。加入Ιμ 0. 5mg/mL bovine serum albumin (BSA)-PBS溶液對偶聯(lián)了抗體的磁球進行封閉。4°C保存。②將100 μ L106copy/mL目標的病毒(H9N2)加入到由①得到的靶相磁性納米球中， 加入PBS緩沖溶液使反應體系至200 μ 1，在37°C搖床緩慢搖動條件下反應15min，用磁力架聚集磁球除去溶液中未反應的病毒，并加入200 μ 1 0. IM PBS溶液重懸，形成磁球-病毒的復合物溶液。③將抗體 H94C4 與 biotin-reagent (Pierce Biotechnology 公司)混合，按試劑盒說明操作，室溫下反應半小時，通過脫鹽柱NAP-5 (購自GE公司)按試劑盒說明操作除去未反應的biotion-reagent小分子，濃縮得到biotin-H94C4，用紫外分光光度計測量在 280nm處的吸收計算biotin_H94C4的濃度。④將1 μ g biotion-H94C4加入到由②得到磁球-病毒的復合物溶液，室溫下孵育15min，磁力架吸附磁球與溶液分離，除去溶液中未反應的蛋白，再加入PBS重懸磁球，重
6復兩次，最終磁球重懸至200 μ 1的ρΗ7. 4 0. IM PBS緩沖液中。⑤往④重懸的200 μ 1磁球溶液中加入1 μ 1 10_7mol/L SA-QDs(購自武漢珈源量子點公司)，室溫下反應15min，磁力架分離磁球，除去溶液后，再用PBST緩沖(0. 01%tween in PBS)重懸，如此反復洗滌三次，除去未反應的量子點，最終加入150μ 1 ρΗ7. 4 0. IM PBS 重懸磁球，形成磁球-病毒-量子點的復合物溶液。⑥熒光分光光度計檢測設置激發(fā)光380nm，記錄602nm處的熒光發(fā)射峰。⑦熒光顯微鏡檢測取10 μ 1磁球-病毒-量子點的復合物溶液用于顯微鏡制片，熒光場，使用藍光紫外光激發(fā)。按照上述方法，以H5W為陽性對照以及H2O為空白對照，分別測定熒光值。3、檢測曲線
將2 X IO7 copy/mL濃度的病毒成倍稀釋至300 copy/mL共17個樣品，按照1描述的步驟進行檢測，并記錄每個樣品的熒光強度，繪制濃度與熒光強度關系曲線。4、特異性實驗
將步驟1中的禽流感病毒H9N2替換成高溫滅活的減蛋綜合癥病毒(EDS)，傳染性法式囊病毒(IBDV),新城疫病毒(NDV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)和H5W禽流感病毒作為陰性樣品進行檢測，并記錄熒光強度并與1步驟中的陽性樣品H9N2進行比較。5、重復性實驗
將濃度為2X 109copy/mL病毒原液按隨機比例稀釋4. 0X IO6,1.0X IO5, 5. OX IO4, 1. 0 X IO3倍，并用同一批按步驟1中①步驟修飾的免疫磁球進行檢測，每個樣品重復實驗5 次，記錄每次檢測結果的熒光值，計算批次內(nèi)差異系數(shù)htra-assay CV。同時，用5種不同批次修飾的免疫磁球對上述樣品進行檢測，記錄檢測結果的熒光值，計算批次間差異系數(shù) Inter-assay CV06、模擬實際環(huán)境檢測
將病毒溶液加入到雞組織(雞肝，雞肺，雞糞)混合溶液中，將組織搗碎，離心，取上清。 用免疫磁球按步驟1對上清溶液以及將上清溶液稀釋1000倍的溶液進行檢測，并用空白樣品作為對照，比較檢測結果。7、與PCR的比較
30個臨床H9N2咽拭子樣品，分別用熒光定量PCR(H9亞型熒光PCR檢測試劑盒(購自北京北方奇豐科技有限公司，貨號cat. 06150441，按照試劑盒中的說明進行操作)和該磁性免疫熒光夾心法進行比較，比較兩種方法檢測結果的符合率。二、結果
1、禽流感病毒H9N2的檢測
如圖2所示，根據(jù)本發(fā)明所檢測的禽流感H9N2的熒光光譜，可以看出H9N2的樣品在 602nm處有量子點的特殊發(fā)射峰，對照樣品H5W和空白樣品H2O的熒光光譜中沒有明顯的量子點的發(fā)射峰。通過禽流感H9N2樣品的熒光共聚焦顯微鏡照片(圖3)可以看出，只有當磁性靶向納米球捕抓到目標病毒，目標病毒經(jīng)過biotin化抗體的免疫反應，再被SA-QDs識別，才能在共聚焦顯微鏡下實現(xiàn)磁球與量子點的共定位。在對照實驗中，用H5W病毒代替H9N2病毒，從共聚焦圖片可以看出，磁球上沒有出現(xiàn)量子點熒光。用空白樣品代替病毒樣品，共聚焦顯微鏡的圖片中也沒有看到量子點的熒光。在病毒被磁球捕獲后，用DIO染料對磁球-病毒的復合物進行染色，DIO染料是一種親脂染料，可以和病毒的囊膜結合而顯色。如圖4所示，磁球(a)與病毒上的DIO熒光(b) 和與病毒上結合的量子點熒光(c)可以共定位。同時，病毒在被捕獲前，先將病毒用DIO染料染色，用磁球捕獲被染色的病毒，再用量子點的識別病毒，如圖所示，磁球(e)與DIO熒光 (b)和量子點的熒光(g)可以共定位。2、工作曲線
圖6顯示的是本發(fā)明方法檢測禽流感病毒的工作曲線，即被檢測病毒的濃度與量子點熒光強度的關系，將已知濃度的病毒成倍稀釋(2 X IO7 copy/mL濃度的病毒成倍稀釋至300 copy/mL共17個樣品)，在保證磁球，抗體和量子點用量保持不變，并過量的情況下，用該方法對病毒進行捕獲并檢測，得到熒光與病毒濃度的關系曲線。如圖所示，在低濃度下，量子點的熒光與病毒的濃度成正比，隨著病毒濃度的增加，量子點熒光與病毒的濃度不再成正比的關系。3、特異性
以幾種禽類的常見的病毒作為對照進行檢測，結果如圖5所示，圖中，單純磁球的背景值，減蛋綜合癥病毒(EDQ，傳染性法式囊病毒(IBDV),新城疫病毒(NDV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)和H5W禽流感病毒，這些病毒均已經(jīng)過高溫滅活處理。對照病毒的信號均在陰性域值的范圍內(nèi)。4、重復性
計算該方法的批次內(nèi)差異系數(shù)htra-assay CV和批次間差異系數(shù)hter-assay CV0 CV是變異系數(shù)也可稱為相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。計算批次內(nèi)差異系數(shù)是將同一病毒樣品稀釋到不同濃度，用同一批次的磁球重復實驗5次后計算各個濃度的標準偏差，然后取平均值。計算批間差異系數(shù)是將同一病毒樣品，稀釋到不同濃度，用五種不同批次的磁球對每種濃度病毒進行檢測記錄熒光強度，每個濃度取平均值后計算各個濃度的標準偏差，再取平均計算相對標準偏差。計算得到，批次內(nèi)差異系數(shù)為 1.35 士 0.47%，批次間差異系數(shù)為3.0 士 2. 06%，差異較小均在合理的范圍內(nèi)，說明該方法有較好的重復性。表1顯示的是本發(fā)明方法的重復性
權利要求
1.一種檢測病毒的方法，該方法包括如下步驟通過將目標病毒外膜的糖蛋白的抗體與磁性納米微球偶聯(lián)得到免疫磁性納米微球，用該免疫磁性納米微球捕獲樣品中的目標病毒得到磁球病毒復合物，將生物素化的所述病毒的外膜的糖蛋白抗體與磁球病毒復合物孵育，再與鏈霉親和素偶聯(lián)的量子點孵育得到磁球-病毒-量子點復合物，通過檢測磁球-病毒-量子點復合物的熒光信號檢測病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性納米微球的直徑為 150nnT250nm，表面帶有-NH2。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述病毒為流感病毒H9N2，所述抗體為其外膜的糖蛋白HA的單克隆一抗抗體。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟①制備免疫磁性納米微球利用EDC活化法將抗H9N2外膜的糖蛋白HA的單克隆一抗抗體連接到表面帶-NH2的磁性納米球表面，并用BSA對偶聯(lián)了抗體后的磁球進行封閉；②富集分離H9N2病毒將該免疫磁性納米微球與加入到樣品溶液中，37°C下孵育15分鐘，用磁力架吸附微球除去溶液中未反應的病毒，得到磁球-病毒的復合物；③制備生物素化抗體利用蛋白生物素標記試劑對抗H9N2表外膜的糖蛋白HA的單克隆一抗抗體進行生物素化標記，得到biotin-mAb ；④量子點標記將biotion-mAb與磁球-病毒復合物在溶液中于37°C下孵育15min，用磁力架吸附磁球，去除溶液中未反應的biotion-mAb，再往磁球-病毒復合物溶液中加入鏈霉親和素偶聯(lián)量子點，37°C下反應15min，磁力架分離洗滌，除去未反應的量子點，沉淀加入溶液重懸均勻，形成磁球-病毒-量子點的復合物；a量子點檢測利用熒光顯微鏡或者熒光分光光度計對磁球-病毒-量子點復合物進行檢測。
5.一種病毒檢測試劑盒，其包括1)免疫磁性納米微球，所述微球表面偶聯(lián)有目標病毒外膜的糖蛋白HA的單克隆一抗抗體；2)生物素化目標病毒外膜的糖蛋白HA的單克隆一抗抗體；3)鏈霉親和素偶聯(lián)的量子點。
6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述目標病毒為H9N2。
7.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述免疫磁性納米微球的直徑為 150 250nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種病毒的檢測方法，包括步驟通過將目標病毒外膜的糖蛋白的抗體與磁性納米/微球偶聯(lián)得到免疫磁性納米/微球，用該免疫磁性納米/微球捕獲樣品中的目標病毒得到磁球病毒復合物，將生物素化的所述病毒的外膜的糖蛋白的抗體與磁球病毒復合物孵育，再與鏈霉親和素偶聯(lián)的量子點孵育得到磁球-病毒-量子點復合物，通過檢測磁球-病毒-量子點復合物的熒光信號檢測病毒。運用該方法，本發(fā)明實現(xiàn)了H9N2亞型禽流感活病毒的特異性識別，富集分離和高靈敏度的檢測。本發(fā)明還提供了用于該方法的檢測試劑盒。本方明具有操作簡單，特異性強，靈敏度高等特點，整個檢測過程可在一個小時內(nèi)完成。
文檔編號G01N33/577GK102435746SQ20111028794
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權日2011年9月26日
發(fā)明者龐代文, 張萬坡, 張志凌, 王漢中, 趙蔚 申請人:武漢大學