病毒和細(xì)菌病原體的直接擴(kuò)增和檢測的制作方法
【專利摘要】本文中提供了用于鑒定來自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，其使用沒有提取核酸步驟的直接擴(kuò)增，但保留測定提取核酸的方法的基本上相同的特異性和靈敏性。還提供了容許在沒有核酸提取步驟的情況下直接擴(kuò)增樣品的試劑混合物。
【專利說明】病毒和細(xì)菌病原體的直接擴(kuò)增和檢測
[0001]對相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年7月6日提交的美國申請流水號61/505，055和2011年10月27日提交的美國申請流水號61/552，405在35U.S.C.§ 119(e)下的權(quán)益。每篇在先申請的公開內(nèi)容視為本申請公開內(nèi)容的一部分并通過提述并入本申請的公開內(nèi)容。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及使用直接擴(kuò)增的針對病毒和細(xì)菌病原體核酸的診斷和檢測方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]以下對本發(fā)明背景的論述僅為幫助讀者理解本發(fā)明而提供，且不承認(rèn)描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0006]通常使用多種方法中的任一種來完成對病毒的臨床檢測。例如，可從生物學(xué)樣品(例如鼻咽抽吸物、喉拭樣、血液流體、糞材料等)分離病毒顆?；蚝怂??？赏ㄟ^血清學(xué)進(jìn)行回顧診斷。在此方法中最廣泛使用補(bǔ)體結(jié)合測試(CFT)，盡管可使用血凝抑制(HAI)和酶免疫測定法(EIA)來給出類型特異性診斷。對于更迅速的診斷，可實(shí)施抗原檢測或RNA檢測?？乖瓩z測可通過IFT或EIA進(jìn)行，然而，為了實(shí)現(xiàn)最高水平的靈敏性和特異性，使用通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的RNA檢測。然而，后者是昂貴的且技術(shù)要求較高的。
[0007]類似地，可使用多種方法，包括革蘭氏染色、培養(yǎng)、微陣列和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或?qū)崟r(shí)PCR完成細(xì)菌檢測。與病毒如流感(其具有由RNA構(gòu)成的基因組且因此需要轉(zhuǎn)錄步驟來創(chuàng)建靶cDNA以用于傳統(tǒng)的或?qū)崟r(shí)的PCR)的檢測不同，細(xì)菌檢測可使用標(biāo)準(zhǔn)PCR方案完成。然而，即使在沒有額外的RT步驟時(shí)，PCR或?qū)崟r(shí)PCR也是費(fèi)時(shí)且昂貴的診斷方法，如下文描述的。
[0008]RT-PCR是一種用于擴(kuò)增和量化靶核酸的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。該規(guī)程依照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一般原理，不過在RT-PCR中使用酶逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA鏈?zhǔn)紫饶孓D(zhuǎn)錄成它的DNA互補(bǔ)物(cDNA)，并使用傳統(tǒng)PCR或?qū)崟r(shí)PCR擴(kuò)增所得cDNA。根據(jù)使用的逆轉(zhuǎn)錄酶的特性，逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟可與PCR在相同管中(一步PCR)或在分開的管中(兩步PCR)使用介于約40°C和50°C之間的溫度實(shí)施。然后，將dsDNA于約95°C變性，從而使兩條鏈分開且引物能在較低的溫度再次結(jié)合并開始新的擴(kuò)增反應(yīng)。DNA從引物延伸使用熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶進(jìn)行，通常于約72°C。實(shí)時(shí)RT-PCR提供一種可以使用熒光報(bào)告分子隨著擴(kuò)增進(jìn)展顯現(xiàn)擴(kuò)增子的方法。
[0009]鑒于與從生物學(xué)樣品制備和處理病毒和細(xì)菌核酸用于檢測、診斷和/或定量有關(guān)的高度復(fù)雜性，在尋求快速診斷的情況下，存在對牽涉更少的步驟、更少的技術(shù)要求和更短的持續(xù)時(shí)間的方法的需要。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明基于允許在沒有核酸提取步驟的情況中直接擴(kuò)增樣品的試劑混合物的發(fā)現(xiàn)。
[0012]在一個(gè)方面 ，本發(fā)明提供一種用于鑒定從人獲得的生物學(xué)樣品中來自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括:(a)在如下的條件下使所述樣品與DNA聚合酶和緩沖液接觸，所述條件適合于在不從所述樣品提取所述靶核酸的情況中從所述樣品擴(kuò)增所述靶核酸；(b)將來自步驟(a)的所述樣品熱循環(huán)，從而使得所述靶核酸在存在時(shí)得到擴(kuò)增；并(C)檢測存在時(shí)從步驟(b)生成的擴(kuò)增的靶核酸，其中在擴(kuò)增前不提取樣品核酸。
[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定從人獲得的生物學(xué)樣品中來自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括:(a)在如下的條件下使所述樣品與DNA聚合酶和緩沖液接觸，所述條件適合于在不從所述樣品提取所述靶核酸的情況中從所述樣品擴(kuò)增所述靶核酸；(b)將來自步驟(a)的所述樣品熱循環(huán)，從而使得所述靶核酸在存在時(shí)得到擴(kuò)增；并(C)檢測存在時(shí)從步驟(b)生成的擴(kuò)增的靶核酸；其中在擴(kuò)增前不從樣品提取樣品中的核酸，且其中所述緩沖液包含至少一種選自下組的組分:KC1、牛血清清蛋白和表面活性劑。
[0014]在一些實(shí)施方案中，在步驟(a)前不稀釋樣品核酸。在別的實(shí)施方案中，可以在步驟(b)前加熱所述樣品，或者在又一些實(shí)施方案中，在步驟(a)前加熱所述樣品?？梢栽诓襟E(b)前將所述樣品于至少約70°C的溫度加熱至少約2分鐘。
[0015]在別的實(shí)施方案中，所述緩沖液可以包含氯化鉀(KCl)，且在一些實(shí)施方案中，KCl可以以約5mM至約50mM的濃度存在。所述緩沖液還可以包含GoTaq?Flexi緩沖液，其在步驟(b)期間可以以I倍至5倍濃度存在。所述緩沖液還可以包含牛血清清蛋白。所述緩沖液可以包含表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑是陽離子型表面活性劑。在又一些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是Taq聚合酶。靶核酸可以是DNA，或在一些實(shí)施方案中是RNA。當(dāng)樣品是RNA時(shí)，可以將其進(jìn)一步與逆轉(zhuǎn)錄酶接觸。所述樣品可以同時(shí)與DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶接觸。
[0016]在別的實(shí)施方案中，所述樣品選自下組:血液、血清、血漿、腦脊髓液、口腔流體和糞。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是全血。在一些實(shí)施方案中，所述樣品從頰區(qū)(buccalregion)獲得。在又一些實(shí)施方案中，所述微生物可以是病毒，或可以選自下組:流感病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒和腸道病毒。在一些實(shí)施方案中，所述微生物還可以是細(xì)菌，如在別的實(shí)施方案中是艱難梭菌(C.difficile)。
[0017]如本文中使用的，術(shù)語“RNA”指與如DNA中找到的糖脫氧核糖形成對比包含糖核糖的核酸分子。如本文中使用的，RNA指所有種類或RNA，包括信使RNA (mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、以及具有調(diào)節(jié)功能的小RNA種類?！靶NA種類”具有特定的意義，并且指在細(xì)菌中具有持家或調(diào)節(jié)作用的非翻譯RNA。“小RNA種類”不是rRNA或tRNA。
[0018]如本文中使用的，術(shù)語“靶核酸”指診斷特定病毒或細(xì)菌(包括例如病原體病毒或細(xì)菌)的任何核酸分子或片段。靶核酸可以是源自靶物種的DNA或RNA分子。
[0019]如本文中使用的，術(shù)語“熱循環(huán)”指使用實(shí)驗(yàn)室裝置，利用升高的和降低的溫度的預(yù)編程循環(huán)用引物延伸反應(yīng)來擴(kuò)增核酸區(qū)段的任何技術(shù)。熱循環(huán)的例子包括但不限于PCR、實(shí)時(shí) PCR 和 RT-PCR。
[0020]如本文中使用的，術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“ RT-PCR”指用于合成和擴(kuò)增DNA分子(其序列為RNA序列的拷貝)的任何技術(shù)。RT-PCR可用于檢測RNA種類(如在基因表達(dá)的定量分析中)，以及用于生成RNA的DNA拷貝，用于克隆、cDNA文庫構(gòu)建、探針合成和原位雜交中的信號放大。[0021]如本文中使用的，術(shù)語“試劑混合物”指具有實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要的所有要素的組合物，包含但不限于分別對診斷用靶RNA或DNA序列具有特異性的引物，和聚合酶。
[0022]如本文中使用的，“引物”指合成或天然存在的寡核苷酸，其在置于由聚合酶催化互補(bǔ)鏈合成的條件下時(shí)能夠充當(dāng)沿模板鏈進(jìn)行核酸合成或復(fù)制的啟動(dòng)點(diǎn)。在逆轉(zhuǎn)錄的背景內(nèi)，引物由核酸構(gòu)成且在RNA模板上引發(fā)。在PCR的背景內(nèi)，引物由核酸構(gòu)成且在DNA模板上引發(fā)。
[0023]如本文中使用的，術(shù)語“DNA聚合酶”指幫助催化脫氧核糖核苷酸聚合成DNA鏈的任何酶。DNA聚合酶作用為向新形成鏈的3’端添加游離核苷酸，導(dǎo)致新鏈在5’ -3’方向上的延長。
[0024]如本文中使用的，“裂解”意指促進(jìn)接近或釋放細(xì)胞RNA或DNA的對細(xì)胞壁或病毒顆粒的擾動(dòng)或改變。裂解的必然要求既不是細(xì)胞壁的完全破壞也不是破裂。
[0025]如本文中使用的，術(shù)語“循環(huán)閾值”或“Ct”指熱循環(huán)期間由于產(chǎn)物形成所致的熒光升高達(dá)到顯著且可檢測的高于背景信號的水平的循環(huán)。
[0026]如本文中使用的，術(shù)語“直接擴(kuò)增”指在沒有在先的純化、提取或濃縮的情況中從樣品擴(kuò)增靶核酸的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。它是對PCR反應(yīng)中靶物濃度的相對量度。除了靶物濃度以外，還有許多因素影響Ct的絕對值。然而，改變與Ct計(jì)算有關(guān)的熒光測量的來自反應(yīng)混合物或儀器的偽像(artifact)將導(dǎo)致對Ct值的模板不依賴性改變。
[0027]如本文中使用的，術(shù)語“提取”指從樣品中存在的其它(非核酸)材料取出核酸所采用的任何行為。這類行為包括但不限于機(jī)械或化學(xué)裂解、添加去污劑或蛋白酶、或沉淀及除去非核酸如蛋白質(zhì)。
[0028]如本文中使用的，術(shù)語“干擾性物質(zhì)”或“干擾物”指樣品中不是靶核酸的任何物質(zhì)。這類干擾性物質(zhì)包括合成的和生物學(xué)的物質(zhì)。這類合成物質(zhì)包括化學(xué)藥品和藥品。這類生物學(xué)物質(zhì)包括血液、尿液、蛋白質(zhì)和其它生物分子。
[0029]附圖簡述
[0030]圖1 (A)是描繪HlNl測定法結(jié)果的線圖，其中具有FastStart緩沖液的樣品依照FastStart方案進(jìn)行直接擴(kuò)增；(B)是描繪HlNl測定法結(jié)果的線圖，其中具有GoTaq緩沖液的樣品依照GoTaq方案進(jìn)行直接擴(kuò)增。
[0031]圖2 (A)和(B)是描繪兩種樣品貯存緩沖液的效果的線圖:使用FastStart方案比較通用運(yùn)輸介質(zhì)(universal transport medium) (UTM) (A)和 I 倍 Tris-EDTA( “TE”)(B)。
[0032]圖3(A)是描繪HlNl測定法結(jié)果的線圖，其中具有FastStart緩沖液的樣品在核酸提取后依照FastStart方案進(jìn)行擴(kuò)增；(B)是描繪HlNl測定法結(jié)果的線圖，其中在沒有任何在先的核酸提取或純化的情況下，具有FastStart緩沖液的樣品依照FastStart方案進(jìn)行直接擴(kuò)增。
[0033]圖4㈧和⑶是表明用于使用甲型流感陽性樣品直接擴(kuò)增的GoTaq化學(xué)和循環(huán)條件的效率的線圖。
[0034]圖5是描繪與沒有KCl的直接擴(kuò)增 測定法相比有添加的KCl的直接擴(kuò)增測定法的靈敏性的線圖。
[0035]圖6是描繪與沒有表面活性劑的直接擴(kuò)增測定法相比有添加的表面活性劑的直接擴(kuò)增測定法的靈敏性的線圖。
[0036]圖7是描繪與沒有預(yù)熱的直接擴(kuò)增測定法相比有預(yù)熱的直接擴(kuò)增測定法的靈敏性的線圖。
[0037]圖8是描繪來自單一血液樣品的擴(kuò)增圖的線圖，所述單一血液樣品在不同管中暴露于不同抗凝血?jiǎng)?肝素、EDTA、檸檬酸鹽)。
[0038]圖9是描繪直接擴(kuò)增測定法檢測來自頰拭樣的樣品的能力的線圖。
[0039]發(fā)明詳述
[0040]本發(fā)明涉及使用PCR方法檢測人病原體的診斷方法，所述病原體包括例如呼吸道病毒如甲型和乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)、腸道病毒、單純皰疹病毒I和2 (分別為HSV-1和HSV-2)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV);以及(病原性)細(xì)菌如艱難梭菌，所述PCR方法不牽涉在PCR前分離病毒/細(xì)菌(即靶)核酸的提取或純化步驟，并且提供與使用特定提取或純化方案的類似測定法基本上相等(或更好)的靈敏性。
[0041]更具體地，本方法牽涉向PCR混合物添加表面活性劑以裂解細(xì)胞或病毒體、組合的某些規(guī)程步驟以增加靶核酸的利用度。然后，在逆轉(zhuǎn)錄酶步驟前將樣品加熱至約50°C，而且這協(xié)助病毒裂解和RNA酶的滅活。在RT步驟后，實(shí)施PCR反應(yīng)。對于細(xì)菌或DNA病毒靶物，不需要逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0042] 以約10-40%患者樣品與60-90%試劑混合物，且最佳地，20-30%患者樣品與70-80%試劑混合物的比率將患者樣品添加至試劑混合物。試劑混合物包含源自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的聚合酶(例如GoTaq FlexiDNA聚合酶?; Promega)和包含離子型去污劑的擴(kuò)增緩沖液(例如GoTaq Flexi PCR Buffer?;Promega)。將可以以10倍緩沖液提供的擴(kuò)增緩沖液稀釋至約5倍、約2.5倍或約I倍濃度來使用。試劑混合物還包含KCl (僅對于病毒樣品)和MgC12，以及dNTP。在本發(fā)明涵蓋的一種配方中，RT-PCR試劑混合物含有:0.5 μ L5X GoTaq Flexi?PCR 緩沖液、0.25 μ L25mM MgCl2、0.05 μ LlOmM dNTP、0.20 μ L5U/ μ L Go Taq FlexiDNA?聚合酶和(λ 5 μ LlOmM KCl。可以在RT步驟前或后加熱患者樣品，然后進(jìn)行PCR。
[0043]本發(fā)明的試劑混合物允許從樣品直接擴(kuò)增核酸，而不需要在擴(kuò)增前進(jìn)行核酸提取或純化。不希望受任何理論束縛，認(rèn)為在需要時(shí)裂解經(jīng)由加熱和表面活性劑作用的組合發(fā)生。此外，認(rèn)為發(fā)明的試劑混合物中和通常存在于RT-PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增抑制劑，從而消除稀釋標(biāo)本的需要；一種在其它直接擴(kuò)增方法學(xué)中使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。相對較高的鹽濃度可通過提高寡核苷酸結(jié)合效率來促成性能。然而，試劑混合物隨靶核酸類型而變化。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，用于病毒RNA檢測的試劑混合物最少包含逆轉(zhuǎn)錄酶、高濃度的正向和反向引物(最佳為蝎狀(scorpion)引物)、MgCl2、氯化鉀、dNTP、5倍GoTaqFlexi?PCR緩沖液(Promega ;目錄號M89IA或M890A)或其等同物、和水生棲熱菌衍生的聚合酶如5U/yl Taq聚合酶(例如GoTaq FlexiDNA聚合酶?;Promega目錄號Μ8295)。為了改進(jìn)性能，還可以添加RNAsin。另外，用于脊髓液或糞樣品中病原體檢測的試劑混合物還含有BSA。
[0045]用于細(xì)菌檢測的試劑混合物應(yīng)最少包含高濃度的正向和反向引物(最佳為蝎狀引物)、MgCl2、BSA、dNTP、5 倍 GoTaq Flexi?PCR 緩沖液(Promega ;目錄號 M891A 或 M890A)或其等同物、和水生棲熱菌衍生的聚合酶如5U/ μ I Taq聚合酶(例如GoTaq FlexiDNA聚合酶?;Promega目錄號M8295)。為了改進(jìn)性能,還可以添加RNAsin。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，測定法包括無模板對照(NTC)、陽性對照和DNA內(nèi)部對照(IC)0測定法可基于對照的Ct值評估。在一個(gè)例子中，在用于檢測艱難梭菌的測定法中，如果NTC的Ct值是O且IC為< 40，那么對照有效。在另一個(gè)例子中，在用于檢測艱難梭菌的測定法中，如果陽性對照的Ct值是0，那么該測定法被視為無效。在另一個(gè)例子中，在用于檢測艱難梭菌的測定法中，如果連同有效的NTC，艱難梭菌的Ct值< 40但古0，那么該測定法運(yùn)行被視為有效且可接受的。在另一個(gè)例子中，在用于檢測艱難梭菌的測定法中，如果艱難梭菌的Ct值=0，且IC的Ct值< 40但古0，那么艱難梭菌被視為未檢出的。在另一個(gè)例子中，在用于檢測艱難梭菌的測定法中，如果艱難梭菌的Ct值=0，且IC的Ct值=0，那么該測定法被視為無效。
[0047]病毒顆粒的來源
[0048]從樣品中獲得用于檢測測定法的病毒核酸可以經(jīng)由收集液體樣品、提取固體或半固體樣品、拭抹表面或其它技術(shù)進(jìn)行。如果存在的濃度適宜地提供用于RT-PCR反應(yīng)的靶RNA，那么可直接測定病毒RNA?；蛘撸赏ㄟ^如離心、經(jīng)由免疫吸附或其它相互作用結(jié)合表面、或過濾等方法來濃縮病毒體。
[0049]細(xì)菌細(xì)胞的來源
[0050]從樣品中獲得用于檢測測定法的細(xì)菌細(xì)胞可以經(jīng)由收集液體樣品、提取固體或半固體樣品、拭抹表面或其它技術(shù)進(jìn)行。如果存在的濃度適宜地提供用于RT-PCR反應(yīng)的靶RNA，那么可直接測定細(xì)菌細(xì)胞。或者，可通過如離心、經(jīng)由免疫吸附或其它相互作用結(jié)合表面、或過濾等方法來濃縮細(xì)菌細(xì)胞。另外，細(xì)菌細(xì)胞數(shù)可通過在濃縮或直接測定法前在培養(yǎng)板上或在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來增加。
[0051]本發(fā)明背景內(nèi)合適的典型細(xì)菌是革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于利斯特氏菌屬(Listeria)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、梭菌屬(Clostridium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、彎曲桿菌屬(Camplobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、志賀氏菌屬(Shigella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、博德特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、和假單胞菌屬(Pseudomonas)。
[0052]靶核酸
[0053]可作為靶核酸測定的RNA類型包括rRNA、mRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)-RNA (tRNA)或其它RNA多核苷酸。rRNA的種類包括5S、16S和23S多核苷酸，其可含有一組相關(guān)細(xì)菌特征性的一種或多種子序列。特征性序列的檢測能力是可變的，且依賴于要通過測定法檢測的病毒或細(xì)菌的關(guān)聯(lián)性水平?？墒褂闷渌黂NA多核苷酸作為診斷性靶RNA，只要它們含有適當(dāng)區(qū)分期望關(guān)聯(lián)性水平的細(xì)菌的獨(dú)特子序列。可從tRNA和mRNA種類以及從在細(xì)菌細(xì)胞中生成的、包含一種或多種特征性子序列的任何RNA鑒定出例子。引物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)以引發(fā)拷貝DNA的合成，其在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用靶RNA作為模板進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知曉如何設(shè)計(jì)引物對在PCR中使用拷貝DNA作為模板擴(kuò)增靶RNA的獨(dú)特子序列。本領(lǐng)域中公知，在PCR中同時(shí)使用的引物應(yīng)具有類似的雜交解鏈溫度。必須使得細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的診斷用靶RNA對RT或RT-PCR反應(yīng)組合物可接近。收集后，可將核酸樣品直接加入反應(yīng)組合物，其然后經(jīng)歷熱循環(huán)。
[0054]盡管是任選存在的，但優(yōu)選地從試劑混合物省略特定的裂解劑，因?yàn)闆]有它也獲得自樣品的病毒/細(xì)菌核酸的充分釋放。一般地，裂解劑在與RT、RT-PCR、或PCR反應(yīng)組合物接觸前添加。裂解劑的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。裂解劑包括但不限于化學(xué)物、酶、物理剪切、滲透劑和高溫。術(shù)語“裂解緩沖液”意指含有至少一種裂解劑的緩沖液。典型的酶促裂解劑包括但不限于溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose)、溶細(xì)胞酶(Iyticase)、蛋白酶K、蛋白酶E、和病毒內(nèi)溶素(endolysin)和外溶素(exolysin)。病毒內(nèi)溶素和外溶素來自噬菌體或原噬菌體細(xì)菌及這些的組合。典型的病毒內(nèi)溶素包括但不限于來自利斯特氏菌噬菌體(A118和PLYI18)的內(nèi)溶素、來自噬菌體PM2的內(nèi)溶素、來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)噬菌體PBSX的內(nèi)溶素、來自乳桿菌(Lactobacillus)原噬菌體Lj928、Lj965和曬菌體15Phiadh的內(nèi)溶素、來自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)卩遼菌體Cp-1的內(nèi)溶素(Cpl-1)、和無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)卩遼菌體B30的雙功能肽聚糖溶素。這最后兩種具有不同的細(xì)菌菌株特異性。還涵蓋兩組分，也就是holin-內(nèi)溶素，即沃氏葡萄球菌(Staphylococcus wameri)M卩遼菌體varphiWMY的細(xì)胞20裂解基因hoIWMY和IysWMY。還涵蓋這些的內(nèi)溶素組合。對于病毒裂解的論述，特別參見Loessner，M J等(1995)Applied Environmental Microbiology 161:1150-1152。
[0055]代替使用內(nèi)溶素，在RT步驟前或后用加熱處理有助于本方法中的裂解。在從約25°C至低于約100°C的溫度范圍中，且優(yōu)選地約50°C和75°C的樣品溫育可改進(jìn)細(xì)菌RNA作為RT或RT-PCR的模板的可接近性。根據(jù)溫育溫度，此熱預(yù)處理可達(dá)范圍為約I分鐘至約60分鐘的時(shí)間段，典型為I至20分鐘的處理。熱處理可包括在不同溫度多次溫育。熱處理可在存在或缺乏如下文描述的RNA酶抑制劑的情況下進(jìn)行。特別可用的處理是在RNA酶抑制劑存在下在約50°C達(dá)約5至20分鐘。
[0056]可向病毒體或細(xì)菌細(xì)胞添加至少一種RNA酶抑制劑。通常，抑制劑及其濃度選擇為使得不干擾任何引物指導(dǎo)的擴(kuò)增過程和組分。RNA酶抑制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且包括化學(xué)物如異硫氰酸胍和二乙基-焦碳酸酯、蛋白質(zhì)抑制劑如Superaseln(Ambion)、RNA酶Block(Stratagene)、人胎盤核糖核酸酶抑制劑和豬肝RNA酶抑制劑(Takara MirusBio)、抗核酸酶抗體如抗RNA酶(Novagen)和核糖核酸酶Inhib III (PanVera),以及試劑如RNAlater (Ambion)和 RNA 保護(hù)細(xì)菌試劑(Qiagen)。
[0057]測定方法
[0058] 在本方法中，通過單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄或者優(yōu)選地通過逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來測試診斷性靶RNA的存在。當(dāng)一起使用時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以在兩個(gè)步驟中序貫實(shí)施，或在一個(gè)步驟中一起實(shí)施(其中將所有反應(yīng)組合物添加到樣品中)。將樣品在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物中溫育允許從靶RNA合成DNA拷貝。試劑混合物包含與靶RNA雜交以引發(fā)拷貝DNA合成的引物。另外，試劑混合物包含dNTP、MgCl2、KCl (僅在病毒樣品中)、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(僅在病毒樣品中)，且對于糞樣品，還包含BSA(僅在細(xì)菌樣品中)。如果期望從超過一種靶RNA制備DNA拷貝，那么可納入超過一種引物。然而，不使用RNA酶抑制劑。然后，可將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)測定管，其中依照本領(lǐng)域中公知的方案實(shí)施PCR。PCR組合物通常包含一對引物，其啟動(dòng)從逆轉(zhuǎn)錄的模板合成期望的DNA區(qū)段。另外，PCR混合物通常包含dNTP、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Taq聚合酶、和聚合酶緩沖液。如果期望合成多種DNA區(qū)段，那么可以納入超過一對引物。還可以添加單一的新引物，其會(huì)作為引物對的第二引物與原始RT-PCR引物一起擴(kuò)增DNA區(qū)段?？捎糜诓《緲悠返钠渌孓D(zhuǎn)錄酶包括但不限于HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(Ambion)、Transcriptor逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche)、Thermoscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)。可以使用的其它DNA聚合酶包括但不限于Pfu、Vent和Sequitherm DNA聚合酶(EPICENTRE)。
[0059]不管RT-PCR是以兩步還是一步實(shí)施，都先運(yùn)行RT步驟，RT步驟通常由在介于約37°C和約70°C之間的溫度的單一溫度溫育組成。對于不同Rt酶和不同引物，不同溫度是適宜的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。隨后的PCR反應(yīng)通常包括在約94°C至約96°C達(dá)約6至約15分鐘的起始溫育。該步驟用于使cDNA變性，且還用于激活熱激活的酶Taq聚合酶。然后，這繼之以對cDNA靶物的多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)期間進(jìn)行3種操作:靶物變性、引物退火和引物延伸。靶物變性通常在超過約90°C進(jìn)行。引物退火溫度由在反應(yīng)中使用的特定引物的解鏈溫度規(guī)定，而引物延伸根據(jù)使用的熱穩(wěn)定性聚合酶在范圍為約60°C至約72°C的溫度實(shí)施。當(dāng)在同一溫度實(shí)施引物退火和延伸時(shí)，這就是兩溫度PCR，相比之下其中3個(gè)步驟中每一個(gè)在不同溫度進(jìn)行的是三溫度PCR。在完成擴(kuò)增階段后，通常加入最終延伸時(shí)間以確保合成完整擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0060]靶核酸還包括DNA，包括例如源自細(xì)菌物種和DNA病毒的DNA。適于評估的病毒DNA包括直接從病毒殼體獲得的DNA以及整合到宿主基因組中的DNA。
[0061 ] RT和RT-PCR產(chǎn)物的檢測
[0062]用于直接檢測RT反應(yīng)的cDNA產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且利用摻入或附接于cDNA產(chǎn)物的標(biāo)記 物?？墒褂玫男盘柹蓸?biāo)記物是本領(lǐng)域中公知的且包括例如熒光模塊、化學(xué)發(fā)光模塊、顆粒、酶、放射性標(biāo)簽、或光發(fā)射模塊或分子。熒光模塊尤其可用，特別是能夠附接核酸并發(fā)出熒光信號的熒光染料。多種染料是本領(lǐng)域中已知的，如熒光素、Texas Red和羅丹明。尤其可用的是單反應(yīng)性染料Cy3和Cy5，兩者均為商品化的(例如，購自 Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, 111.) ? 一種更靈敏的特異性檢測經(jīng)標(biāo)記DNA的方式是將產(chǎn)物對固定化于基質(zhì)(如尼龍膜或玻璃載玻片)中的靶DNA序列雜交。然后，可用具有適當(dāng)過濾的激光掃描器掃描雜交后的信號以檢測使用的特定染料。這是本領(lǐng)域中，特別是在DNA微陣列技術(shù)中公知的。標(biāo)記物可在RT反應(yīng)中的cDNA合成中摻入其中，或者可在其合成后將其附接于cDNA產(chǎn)物。例如，RT反應(yīng)可用經(jīng)標(biāo)記的引物實(shí)施。一種類型的經(jīng)標(biāo)記引物具有附接的顆粒，該顆粒具有大量的信號生成分子。使用經(jīng)標(biāo)記核苷酸(如用染料標(biāo)記的UTP和/或CTP)的逆轉(zhuǎn)錄將標(biāo)記物摻入到轉(zhuǎn)錄的核酸中?；蛘?，可利用合成后偶聯(lián)反應(yīng)來檢測cDNA產(chǎn)物。將標(biāo)記物附接于核酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且可通過例如使用例如經(jīng)標(biāo)記RNA的末端標(biāo)記，或通過用激酶處理核酸，隨后附接將樣品核酸連接至標(biāo)記物(例如熒光團(tuán))的核酸接頭來完成。在另一種標(biāo)記方法中，通過偶聯(lián)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來擴(kuò)增來自RT反應(yīng)的DNA產(chǎn)物。例如，將T7啟動(dòng)子區(qū)摻入用于RT反應(yīng)的引物中。然后，可以使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒來生成大量的RNA以增加檢測靈敏性。T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒可購自Ambion (2130Woodward, Austin, Tex.)或其他商業(yè)來源。
[0063]RT-PCR 檢測
[0064]用于RT-PCR產(chǎn)物檢測的方法包括凝膠電泳分開和溴化乙啶染色，或檢測產(chǎn)物中摻入的熒光標(biāo)記物或放射性標(biāo)記物。還可以使用在檢測擴(kuò)增產(chǎn)物前不需要分開步驟的方法。這些方法通常稱為實(shí)時(shí)PCR或同質(zhì)性檢測。大多數(shù)實(shí)時(shí)方法通過監(jiān)測熱循環(huán)期
間的熒光變化來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物形成。這些方法包括但不限于:TaqMan?雙重標(biāo)記探針
(Applied Biosystems, Foster City, Calif.94404)、分子信標(biāo)(Molecular Beacons) (Tyagi
Sand Kramer FR(1996)Nat BiotechnoI 14:303-308)和SYBR?綠色染料(Molecular
Probes, Inc Eugene, Oreg.97402-0469)。這些相同同質(zhì)性方法中的一些也可用于擴(kuò)增產(chǎn)物
的端點(diǎn)檢測。此類方法的例子是SYBR?.綠色染料解離曲線分析。在解離曲線分析中，溫
度中的最后緩慢爬升(一般約60°C至90°C )與熒光監(jiān)測組合能檢測解鏈點(diǎn)并由此檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在(Ririe 等(1997)Anal.Biochem.245:154-60)。
[0065]測定靈敏性
[0066]直接擴(kuò)增測定法的靈敏性可通過向測定法中使用的緩沖液添加一種或多種提高靈敏性的組分來提高。這類組分包括但不限于KC1、表面活性劑和清蛋白。在一些實(shí)施方案中，清蛋白是牛血清清蛋白。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑是陽離子型表面活性劑。直接擴(kuò)增測定法的靈敏性還可通過向測定法提供額外加熱(如在添加試劑前預(yù)熱樣品)來提高。在一些實(shí)施方案中，可通過組合提高靈敏性的組分和額外加熱來提高靈敏性。
實(shí)施例
[0067]通過提述以下實(shí)施例將更容易地理解如此一般性描述的本方法，所述實(shí)施例通過例示提供且不意圖限制本方法和試劑盒。
[0068]實(shí)施例1:通用主混合物(Master Mix)
[0069]除非另外記載，以下列比例制備2.5倍通用主混合物(UMM)。下表提供了適于制備15ml UMM的試劑體積，然而，可根據(jù)需要制備任何適宜體積。
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒定從人獲得的生物學(xué)樣品中來自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括: (a)在如下的條件下使所述樣品與DNA聚合酶和緩沖液接觸，所述條件適合于在不從所述樣品提取所述靶核酸的情況中從所述樣品擴(kuò)增所述靶核酸； (b)將來自步驟(a)的所述樣品熱循環(huán)，從而在存在的情況中使得所述靶核酸得到擴(kuò)增；并 (c)在存在的情況中檢測從步驟(b)生成的擴(kuò)增的靶核酸， 其中在擴(kuò)增前不從所述樣品提取所述樣品中的核酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)前不稀釋所述樣品。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(b)前加熱所述樣品。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在步驟(a)前加熱所述樣品。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(b)前將所述樣品于至少約70°C的溫度加熱至少約2分鐘。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖液包含氯化鉀(KCl)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述KCl以約5mM至約50mM的濃度存在。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖液包含GoTaq?Flexi緩沖液。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述GoTaqTMFleXi緩沖液在步驟(b)期間以I倍_5倍濃度存在。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶是Taq聚合酶。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸是DNA。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸是RNA。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在擴(kuò)增前還使所述樣品與逆轉(zhuǎn)錄酶接觸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中使所述樣品同時(shí)與所述DNA聚合酶和所述逆轉(zhuǎn)錄酶接觸。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品選自下組:血液、血清、血漿、腦脊髓液、口腔流體和糞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述血液是全血液。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品從頰區(qū)獲得。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是病毒。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述病毒選自下組:流感病毒、呼吸道合胞病毒、水痘帶狀皰疫病毒、單純皰疫病毒和腸道病毒。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是細(xì)菌。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)菌是梭菌屬(Clostridium)或鏈球菌屬(Streptococcus)。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖劑還包含清蛋白。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述清蛋白是BSA。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖劑還包含表面活性劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述表面活性劑是陽離子型表面活性劑。
26.一種用于鑒定從人獲得的生物學(xué)樣品中來自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括:(a)在如下的條件下使所述樣品與DNA聚合酶和緩沖劑接觸，所述條件適合于在不從所述樣品提取所述靶核酸的情況中從所述樣品擴(kuò)增所述靶核酸； (b)將來自步驟(a)的所述樣品熱循環(huán)，從而在存在的情況中使得所述靶核酸得到擴(kuò)增；并 (c)在存在的情況中檢測從步驟(b)生成的擴(kuò)增的靶核酸， 其中在擴(kuò)增前不從所述樣品提取所述樣品中的核酸， 且其中所述緩沖劑包含至少一種選自下組的組分:KC1、牛血清清蛋白和表面活性劑。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述表面活性劑是陽離子型表面活性劑。
28.權(quán)利要 求26的方法，其還包括在步驟(a)或步驟(b)前加熱所述樣品。
【文檔編號】C12P19/34GK103917663SQ201280039405
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月6日
【發(fā)明者】M.?？怂辜{, L.杰基, Y-P.陳, H.麥, M.M.塔布, M.艾耶 申請人:探索診斷投資公司