專利名稱：增強植物對細菌病原體的抗性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農業(yè)生物技術領域，特別地，本發(fā)明涉及增強植物對細菌病原體的抗性的方法。
背景技術：
植物總是處于多種病原體的攻擊之中，但是疾病癥狀相當少見。細胞自身的先天免疫確保每個植物細胞具有對病原體攻擊作出響應的能力。相反，動物通過循環(huán)系統(tǒng)來確保先天免疫力的完全的空間上的覆蓋，而有顎的脊椎動物通過獲得性免疫系統(tǒng)的進化而補充了這種防御。雖然在植物和動物中存在類似的先天免疫策略，但是所感知的確切表位是不同的。因此，任何的相似性可能是趨同進化的結果，而非從共同的祖先發(fā)生的趨異進化(Zipfel and Felix, G. (2005)Current Opinion in Plant Biology 8:353-360; Ausubel (2005) Nature Immunology 6:973-979)。在植物中，先天免疫主要由三個防御系統(tǒng)組成物理的、局部的和系統(tǒng)性的。物理防御包括蠟質表皮和堅硬的細胞壁，以及具有抗微生物性質的次級代謝物和酶。氣孔或創(chuàng)傷會部分地打破這種防御。于是在局部水平上的識別依賴于微生物化合物的特異性察覺。模式識別受體(PRR)識別與病原體相關的分子模式(PAMP)，引起PAMP激發(fā)的免疫力(PTI)。有毒的病原體將效應子分泌進入植物胞質中以抑制PTI。然而，抗性(R)蛋白察覺這些微生物效應子以引起效應子激發(fā)的免疫力 (ΕΤΙ)。設計為抑制ETI的另外的病原體效應子可以打破這些防御。之字形模型(zig-zag model)將這些分子相互作用總結為發(fā)生于植物及其病原體之間的動態(tài)的共同進化中的五個時期(Jones and Dangl (2006)Nature 444 :323-3 ;Chisholm 等人，(2006) Cell 124 803-814)。此外，由PAMP和/或效應子蛋白誘導的系統(tǒng)性防御應答為進一步的攻擊準備原始組織。這三個方面聯(lián)合起來構成有效的防御網絡，其促成了多數(shù)植物對于多數(shù)微生物具有抗性的現(xiàn)象(NUrnberger 等人，(2004) Immunological Reviews 198:249-266)。引起PTI的針對細菌侵襲的主要免疫應答起始于PPR對PAMP的識別。PTI包含多種良好表征的應答，包括鈣、乙烯、活性氧(ROS)和細胞外pH的升高，有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)和防御基因表達的激活，胼胝質的沉積和幼苗生長的抑制(Ma and Berkowitz (2007)Cellular Microbiology 9 :2571-2585 ;Chisholm 等人，(2006)Cell 124 :803-814 ;NUrnberger 等人，(2004) Immunological Reviews 198:249-266)。這些應答對于很多細菌PAMP引起的以及來自真菌和卵菌的誘發(fā)是共同的。因此，PAMP是保守性的微生物特征，其指示普遍的危險性；信號不可能傳導允許植物區(qū)分不同病原體的信息 (Zipfel 等人，(2006)Cell 125:749-760)。近年來，已經發(fā)現(xiàn)了很多潛在的植物PAMP，而對應的PRR卻難以鑒定。已經清楚地認識到各個PAMP的感知寬度是顯著不同的。在細菌PAMP中，鞭毛蛋白被多數(shù)植物物種識別，而針對延伸因子-Tu(EF-Tu)和冷擊蛋白CSP的應答分別僅限于十字花科 (Brassicaceae)禾口爺禾斗(Solanaceae) (Zipfel and Felix, G. (2005)Current opinion in Plant Biology 8 :353-360)。這種感知上的差異指示了植物各科之間的趨異進化。發(fā)生了進化競賽其中細菌PAMP進化以避免被識別，而植物PRR反進化以增強敏感性。然而，植物能夠感知每種微生物中的多種PAMP。例如，模型植物擬南芥(Arabidopsis thaliana，At) 能夠感知細菌的PAMP 鞭毛蛋白、EF-Tu，脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)，以及真菌的PAMP 幾丁質八聚體和乙烯誘導的木聚糖酶(EIX)。然而，目前僅鑒定出了針對鞭毛蛋白和EF-Tu 的負責此類識別的擬南芥受體。在番茄中，受體LeEIXl/2感知幾丁質，而受體CEBiP識別 EIX (Kaku 等人，(2006) Proc Natl Acad Sci USA 103 :11086-1109 ；Ron and Avni (2004) Plant Cell 16 :1604-1615)。但是，雖然在擬南芥中存在明顯的同源物，但是它們的作用尚未被證明。然而，受體樣激酶CERKl (也稱作LysM RLK1)對于擬南芥中幾丁質誘發(fā)劑的信號傳導是必不可少的(Miya 等人，(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104:19613-19618 ；Wan 等人，(2008) Plant Cell 20:471-381)。同時，針對LPS和PGN的植物受體仍然是完全未知的(Newman 等人，(2007) Journal of Endotoxin Research 13 :69-84 ;Gust 等人，O007)J Biol Chem 282 :32338-48)。雖然先天免疫力在總體上而言是有效的，但是植物疾病仍然是主要的社會和經濟上的問題。迫切需要有效且穩(wěn)定的疾病控制方法，尤其是針對變形桿菌綱(Proteobacteria)的方法，該綱包括假單胞菌屬(I^seudomonas)和黃單孢菌屬 (Xanthomonas)。該門的細菌具有廣闊的宿主范圍，在這些宿主中它們引起不同的癥狀，影響作物產量和質量(Abramovitch 等人，(2006)Nature Reviews Molecular Cell Biology 7 :601-611)。主要有三種人類干預的方法(i)傳統(tǒng)方法，包括清除感染源；通過改變播種時間和使用化學噴霧劑來消除和控制媒介物；和就增強的抗性進行育種。(ii)生物技術方法，包括產生無病原體的種子和使用生物學控制方法以輔助防治流行病學。(iii)第三種控制方法是通過轉基因。這種強大的技術可用于通過表達另外的基因來增強植物的免疫力。 轉基因植物可以表達源自植物的蛋白，例如另外的受體、信號傳導分子或抗微生物的肽，或者，它們可以表達源自病原體的蛋白，例如效應子。本項目著眼于通過轉基因表達另外的 PRR來改善疾病抗性的潛在可能。PRR FLS2和EF-Tu受體(EFR)由于下列兩項原因而引起關注目前為止，它們是僅有的在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的PRR，并且它們是僅有的已知的針對植物PAMP的PRR(Zipfel等人，(2004)Nature 似8 :764-767 ;Zipfel 等人，(2006)Cell 125:749-760)。二者都屬于富含亮氨酸的重復序列受體樣激酶(LRR-RLK)家族，該家族包含具有共同的結構域結構的成員。已知LRR區(qū)域是多個蛋白家族中的關鍵的蛋白識別基序(Kobe and Kajava(2001) Curr. Opin. Struct. Biol. 11 :725-732)。在PRR基因中，LRR結構域是細胞外的結構域，并且被認為提供了介導關鍵的蛋白-蛋白相互作用的結構框架。例如，F(xiàn)LS2中的LRR包含對于flg22的結合和感知鞭毛蛋白必不可少的殘基(Chinchilla等人，Q006)Ilie Plant Cell 18 :465-476 ;Dunning 等人，(2007) The Plant Cell 19 :3297-3313) LRR 結構域包含LRR重復序列的串聯(lián)的拷貝。一個LRR重復序列的長度為20- 個殘基并且包含保守性的11個氨基酸的基序LxxLxLxxN/CxL，其中χ可以是任意氨基酸，L可以以更不規(guī)則的重復序列的方式被置換為其它的疏水性殘基(Kobe and Kajava (2001) Curr. Opin. Struct. Biol. 11 :725-732) 0 LRR重復序列的排列使得所有的次級結構都平行于共同的軸，產生馬蹄形。該家族的成員還包含單次跨膜結構域和細胞內的Ser/Thr激酶結構域，其與果蠅中的 Pelle 相關(Shiu 等人，(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:10763-10768)。有趣的是，其結構與IV類R基因例如存在于水稻中的)(a21是相同的(Song等人，(1995)SCienCe 270:1804-1806)。這暗示了 R基因是從更古老的PRR基因改編而來的。因此，之字形模型中的事件將以其進化的順序出現(xiàn)(NUrnberger等人，Q004) Immunological Reviews 198 249-266)。最近，在擬南芥屬中鑒定了 EF-Tu受體(EFR) (Zipfel等人，(2006) Cell 125 749-760)。EFR是負責感知EF-Tu的受體激酶。EFR識別高度保守的位于真細菌的EF-Tu的 N-乙?；┒说?8個氨基酸的區(qū)域(Kunze等人，(2004) The Plant Cell 16 =3496-3507 ； Zipfel等人，(2006)Cell 125:749-760)。值得注意的是，真細菌的EF-Tu不同于存在于植物線粒體和質體中的EF-Tu，這限制了 EFR僅識別“非己”。以前在本氏煙草(Nicotiana benthamiana, Nb)中瞬間表達AtEFR后顯示EFR對于EF-Tu響應性是足夠的，并且PRR下游的信號傳導成分在植物的各科中是保守的(Zipfel等人，(2006)Cell 125 :749-760)。然而，未知的是，穩(wěn)定表達EFR是否賦予轉化的植物對EF-Tu表位elf 18的識別并引發(fā)其中的基礎性免疫應答的激活。同樣未知的是，這種穩(wěn)定表達EFR的轉化的植物是否也能夠識別存在于完整致病性細菌中的EF-Tu，從而引起對細菌病原體的增強的疾病抗性。

發(fā)明內容
提供了用于增強植物對植物病原體的抗性的方法。所述方法包括以包含編碼 EF-Tu受體(EFR)的核苷酸序列的多核苷酸構建體轉化植物細胞。所述多核苷酸構建體還包括驅動在植物中的表達并且與所述編碼EFR的核苷酸序列可操作地連接的啟動子。所述方法還包括從經轉化的植物細胞再生出轉化的植物。本發(fā)明的經轉化的植物顯示出對至少一種細菌病原體的增強的抗性。還提供了通過本發(fā)明的方法產生的表達盒、植物、植物部分、種子、植物細胞和其它非人類宿主細胞。


圖1.在野生型和EFR轉基因本氏煙草中產生的氧化迸發(fā)(oxidative burst)。發(fā)光的峰值對應于野生型或EFR(#18)本氏煙草植物響應于IOOnM elf 18或flg22的活性氧的釋放。數(shù)值為平均值士SE (n = 12)。圖2.野生型和EFR轉基因本氏煙草中早期防御標志物基因的表達。RT-PCR揭示了在elf 18或flg22處理后0、30、60和180分鐘的時間點的防御標志物基因的誘導程度。 組成型表達的EF-I α用作上樣對照。圖3.野生型和EFR轉基因本氏煙草的幼苗生長的抑制。測定了幼苗的新生的重量以檢測是否發(fā)生了生長抑制。以連續(xù)稀釋的elf 18 (A)或flg22(C)處理本氏煙草的幼苗。 類似地，以相同稀釋的elfl8(B)或flg22(D)處理擬南芥的幼苗。顯示的結果對應于平均值 ±SE (n = 8)。圖4.野生型和EFR轉基因本氏煙草的細菌易感性。通過超過4天的噴霧而接種的4種不同的致病變種(pathovars)的細菌生長曲線。圖中數(shù)據(jù)代表平均值士SE (n = 4)。圖5.野生型和EFR轉基因本氏煙草植物中的疾病病癥。噴霧接種I3SS B728a(A 和E)、Pstab 11528 (B) 10天后獲得葉子和整株植物的照片。
圖6.野生型和EFR轉基因本氏煙草對轉基因(GV3101/pBmi9-35S: :GUS-HA)和野生型腫瘤生成性(A^l)根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的易感性。(A)農桿菌滲透2天后瞬間GUS表達的定量分析。(B)以A281莖部刺傷3周后的冠癭的照片。(C) 切除的癭的平均的新生重量(n = 15) 士SE(C)。圖7.來自多種植物致病細菌的Ε1Π8肽的氨基酸序列。圖8.來自多種植物致病細菌的Ε1Π8肽具有PAMP的活性。圖 9.轉基因 EFR 番茄 Moneymaker 栽培變種(Solanum Iycopersicum cv. Moneymaker)植物對于青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)GMI1000引起的細菌性枯萎抗性更高。圖 10.在接種后(dpi) 14 天，以 Xanthomonas perforans T4 菌株 4B [Xp (T4)-4B] 進行的2例35S :EFR轉基因的T3番茄Moneymaker栽培變種品系[L(16)和P(I)]的浸蘸生長測驗的結果——重復1。作為陽性對照，同時感染表達來自胡椒的主要顯性R基因 Bs2的番茄VF36栽培變種。陰性對照是非轉基因的Moneymaker和VF36。圖 11.在接種后(dpi) 14 天，以 Xanthomonas perforans T4 菌株 4B [Xp (T4)-4B] 進行的2例35S::EFR轉基因的T3番茄Moneymaker栽培變種品系[L(16)和P(I)]的浸蘸生長測驗的結果——重復2。作為陽性對照，同時感染表達來自胡椒的主要顯性R基因Bs2 的番茄VF36變種。陰性對照是非轉基因的Moneymaker和VF36。序列表隨附的序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列以用于核苷酸堿基的標準字母縮寫和用于氨基酸的三字符來表示。核苷酸序列按照從序列的5'末端開始并前進(即每行從左至右)至3'末端的標準規(guī)則書寫。僅顯示了每個核酸序列的一條鏈，但是應該理解為 對所顯示的鏈的任意引述都包括了互補的鏈。氨基酸序列按照從序列的氨基末端開始并前進(即每行從左至右)至羧基末端的標準規(guī)則書寫。SEQ ID NO :1顯示了 AtEFR基因的全長編碼序列。AtEFR基因的編碼序列對應于登記號 NM_122055。SEQ ID NO 2顯示了由SEQ ID NO 1編碼的AtEFR氨基酸序列。SEQ ID NO :3顯示了除去了終止密碼子的AtEFR基因的全長編碼序列。SEQ ID N0: 3的核苷酸1-3093對應于SEQ ID NO 1的核苷酸1-3093。如果需要，可以向SEQ ID NO 3 的核苷酸序列或任何其它缺少終止密碼子的編碼序列的3'末端添加終止密碼子。此類終止密碼子包括例如TAA、TAG和TGA。SEQ ID NO :4顯示了 AtEFR基因的基因組序列。AtEFR基因對應于擬南芥屬基因組的基因座At5g20480。起始密碼子始于SEQ ID NO 4的核苷酸1081。SEQ ID NO :5顯示了 AtEFR啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :5的核苷酸1-1080 對應于SEQ ID NO 4的核苷酸1-1080。SEQ ID NO :6顯示了來自甘藍黑腐病菌甘藍致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris) 8004和甘藍黑腐病菌甘藍致病變種BlOO的EF-Tu表位elf 18的氨基酸序列。SEQ ID NO :7顯示了來自香蕉細菌性萎蔫病菌(Xanthomonas campestris pv. musacearum)、柑桔饋蕩病菌(Xanthomonas axononpodis pv. citri)、野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 85—10禾口水稻黃單胞菌 7K稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)MAFF311018 的 EF-Tu 表位 elfl8 的氨基酸序列。SEQ ID NO 8顯示了來自青枯雷爾氏菌的EF-Tu表位elf 18的氨基酸序列。SEQ ID NO :9顯示了來自丁香假單胞桿菌番茄致病變種(I^seudomonas syringae pv. tomato) DC3000 的 EF-iTu 表位 elf 18 的氨基酸序列。SEQ ID NO 10顯示了來自丁香假單胞菌菜豆致病變種(Pseudomonas syringae pv. phaseolicola) 1448a>(Pseudomonas syringae pv. syringae) B728a 禾口焚光 fi 單胞菌(Pseudomonas fluorescens) PfO-I 的 EF-Tu 表位 elflS的氨基酸序列。SEQ ID NO 11 顯示了來自熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) Pf_5 的 EF-Tu表位elf 18的氨基酸序列。SEQ ID NO 12 顯示了來自黑Jg病菌(Pectobacterium atrosepticum)禾口 Dickeya 的EF-Tu表位elf 18的氨基酸序列。SEQ ID NO 13 顯示了來自柑橘黃龍病亞洲種(Candidatus Liberibacter asiaticus)Psy62株的EF-Tu表位elf 18的氨基酸序列。
具體實施例方式本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)十字花科的EFR基因在本氏煙草(茄屬植物)中的轉基因表達增強植物對細菌病原體的抗性。EFR是模式識別受體(PRR)，其與細菌EF-Tu特異性結合，并且人們認為，正是這種體內的結合引起與PAMP激發(fā)的免疫力(PTI)相關的多種防御應答。由于并不知道真細菌EF-Tu在十字花科植物以外的植物中引起PTI，所以關于“十字花科EFR在非十字花科植物中的轉基因表達引起PTI”的發(fā)現(xiàn)是令人驚奇的。雖然本發(fā)明不被任何特定的生物學機理所限，但是，十字花科EFR有可能是通過與十字花科植物中的生物學機理類似的生物學機理在非十字花科植物中引起PTI的。本發(fā)明的方法用于農業(yè)，尤其是用于開發(fā)具有增強的對植物疾病的抗性的農作物植物。此類農作物植物包括抗性和易感性植物品種。此類抗性植物品種可以包含例如通過常規(guī)植物育種方法和/或通過涉及重組DNA的轉化而導入所述植物品種中的一個或多個R 基因。本發(fā)明提供了用于增強植物對細菌病原體抗性的方法。本方法涉及使用包含編碼真細菌EF-Tu受體(EFR)的核苷酸序列的多核苷酸構建體轉化植物細胞并從中再生出轉化的植物。如下文所討論，EF-Tu的與EFR相互作用以引發(fā)PTI的結構域在真細菌EF-Tu蛋白之間是高度保守性的。因此，預期本發(fā)明的方法會增強植物對不僅僅一種或兩種細菌病原體的抗性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，編碼EFR的核苷酸序列是編碼在本文中被稱作 AtEFR的EFR的核苷酸序列，所述AtEFR是對應于擬南芥屬基因組的基因座At5g20480的 EFR0編碼AtEFR的核苷酸序列包括但不限于，如SEQ ID NO :1、3和4所示的核苷酸序列， 以及編碼如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在其它實施方式中，編碼EFR同源物的核苷酸序列選自對應于擬南芥屬基因組的基因座 AT3G47110、AT5G39390、AT3G47580、AT3G47570、AT3G47090 和 AT2G24130 的編碼序列。擬南芥屬基因組的基因座和對應的氨基酸序列可以見！"he Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/)禾口 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法增強植物對一種或多種真細菌病原體的抗性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法增強植物對2種、3種、4種、5種或更多種真細菌病原體的抗性。最優(yōu)選地，本發(fā)明的方法增強植物對能夠在未經本文公開的方法增強的類似植物中引起疾病癥狀的所有真細菌病原體的抗性。此類“類似植物”與通過本文公開的方法增強了疾病抗性的本發(fā)明的植物是相同的物種。優(yōu)選地，此類“類似植物”與本發(fā)明的增強的植物是相同的品種或栽培變種。除非另有指明或從上下文可以明顯看出，否則“真細菌病原體”是指植物病原體， 其是“真細菌(eubacteria)”，也稱作“真正的細菌(true bacteria)”?！罢婕毦笔侵赋斯偶毦獾乃屑毦?。在本發(fā)明的方法中，多核苷酸構建體還包含驅動在植物中的表達并且與編碼EFR 的核苷酸序列可操作地連接的啟動子。本發(fā)明不依賴于特定的啟動子。啟動子可以是天然 EFR啟動子或來自另一種植物或非植物基因的啟動子，其能夠驅動可操作地連接的EFR編碼序列在目標植物中在需要的時間和植物的位置處的表達。此類啟動子包括但不限于，組成型啟動子、病原體可誘導的啟動子、組織優(yōu)選的啟動子和化學物質調節(jié)的啟動子。為了進行EFR蛋白在植物或植物細胞中的表達，本發(fā)明的方法包括使用本發(fā)明的多核苷酸構建體轉化植物，所述構建體包含編碼EFR蛋白的核苷酸序列。此類核苷酸序列可以與驅動在植物細胞中表達的啟動子可操作地連接。本發(fā)明不依賴于特定的啟動子。啟動子可以是天然EFR啟動子或來自另一種植物或非植物基因的啟動子，其能夠驅動可操作地連接的EFR編碼序列在目標植物中在需要的時間和植物的位置處的表達。本發(fā)明的方法中可以使用本領域已知的任意啟動子，包括但不限于，天然EFR啟動子、組成型啟動子、病原體可誘導的啟動子、創(chuàng)傷可誘導的啟動子、組織優(yōu)選的啟動子和化學物質調節(jié)的啟動子。 啟動子的選擇將取決于在經轉化的植物中所需要的表達時間和位置，或其它因素。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用天然AtEFR啟動子以在植物中表達EFR蛋白，所述天然AtEFR啟動子可以與下游AtEFR基因序列天然基因組地結合，或者，其可以是另外包含AtEFR編碼序列的重組核酸分子的一部分。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，啟動子是包含SEQ ID NO 5 所示核苷酸序列的AtEFR啟動子。用于增強植物對至少一種細菌病原體的抗性的方法可用于開發(fā)改進的農作物、水果和觀賞植物品種。此類植物品種將顯示出對一種或多種細菌病原體的增強的抗性，從而相對于未經本文公開的方法增強的類似的植物品種而言，減少了施用潛在有害的化學殺蟲劑的需要。在其它實施方式中，所述方法可以包括另外的R基因以增強植物對單一植物病原體的抗性或增強植物對不同植物病原體的抗性。此類基因通常編碼含有富含亮氨酸的重復序列(LRR)的蛋白。此類R蛋白可以包含跨膜結構域，或者可以定位于細胞內。另外， 很多R蛋白包含以多種方式組合的結合核苷酸的(NB)結構域(也稱作P-環(huán))、Toll-白介素-1受體(TIR)結構域或蛋白激酶結構域。已經從多種植物物種中分離了 R基因，包括擬南芥、亞麻、玉米、水稻、小麥、大豆、番茄、馬鈴薯等(綜述見例如=Ellis等人，Q000) Curr. Opin. plant Biol. 3 :278-84 Jones and Dangl (2006) Nature 444 :323-29 ；Bent and Mackey (2007) Annu. Rev. Phytopathol. 45 :399-436 ； Tame ling and Takken (2008) Eur. J. Plant Pathol. 121 :243-255)。在本發(fā)明的一個實施方式中，在本文公開的方法中使用胡椒植物，其包含至少一個Bs2抗性基因，至少一個Bs3抗性基因，或至少一個Bs2抗性基因和至少一個Bs3抗性基因。以前已經公開了 Bs2和Bs3的核苷酸序列。參見例如美國專利號 6，262，343 和 6，762，285 (Tai 等人，(1999) Proc Natl. Acad. Sci USA 96:14153-14158)， 禾口 Rijmer等人，(2007) Science 318 :645-648 ；各自通過引用方式并入本文。本發(fā)明包括分離的或實質上純化的多核苷酸或蛋白成分的用途?！胺蛛x的”或“純化的”多核苷酸或蛋白或其生物學活性部分是指實質上或基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該多核苷酸或蛋白或與其相互作用的成分。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白實質上不含其它細胞物質或培養(yǎng)基(當通過重組技術產生時)，或實質上不含化學前體或其它化學物質(當通過化學方式合成時)。任選地，“分離的”多核苷酸不含在產生該多核苷酸的生物的基因組DNA中天然側接該多核苷酸(即位于該多核苷酸的5'和3'末端的序列)的序列(任選地為蛋白編碼序列)。例如，在多個實施方式中，分離的多核苷酸可以包含小于大約5吐、41^、31^、21^、11^、0. 51Λ或0. 11Λ的在產生該多核苷酸的細胞的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的核苷酸序列。實質上不含細胞物質的蛋白包括具有小于大約30%，20%、10%、5%或(干重)的污染蛋白的蛋白制劑。當通過重組方式產生本發(fā)明的蛋白或其生物學活性部分時，任選地，培養(yǎng)基顯示小于大約30^^20^^10^5%或
(干重)的化學前體或非目標蛋白的化學物質。本發(fā)明還包括所公開的EFR多核苷酸及其所編碼的蛋白的片段和變體。“片段”是指多核苷酸的一部分或其所編碼的氨基酸序列和蛋白的一部分。包含編碼序列的多核苷酸的片段可以編碼保留天然蛋白的生物活性并因此保留EFR活性的蛋白片段?；蛘撸米麟s交探針的多核苷酸的片段一般不編碼保留生物活性或者不保留啟動子活性的蛋白。因此， 核苷酸序列的片段可以是至少大約20個核苷酸，大約50個核苷酸，大約100個核苷酸，直至本發(fā)明的全長多核苷酸。編碼本發(fā)明的EFR蛋白的生物活性部分的EFR多核苷酸的片段將編碼本發(fā)明的全長EFR蛋白的至少15、25、30、50、100、150、200、250或300個連續(xù)氨基酸，或直至存在于其中的全部數(shù)目的氨基酸(例如，SEQ ID N0:2的1031個氨基酸)?？捎米麟s交探針或PCR 引物的EFR多核苷酸的片段一般無需編碼EFR蛋白的生物活性部分或EFR啟動子。因此，EFR多核苷酸的片段可以編碼EFR蛋白的生物活性部分或EFR啟動子，或者其可以是可用作雜交探針或PCR引物(使用如下文公開的方法)的片段。EFR蛋白的生物活性部分可以這樣制備分離一種本發(fā)明的EFR多核苷酸的一部分，表達所編碼的EFR蛋白的部分(例如，通過在體內重組表達)，和測定所編碼的EFR蛋白的該部分的活性。作為 EFR核苷酸序列的片段的多核苷酸包含本文公開的全長EFR多核苷酸的至少16、20、50、75、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400、1500、2000、2500或3000個連續(xù)核苷酸，或直至存在于其中的全部數(shù)目的核苷酸(例如，對于SEQ ID NO :1、3和4而言，分別是3096,3093和4563個核苷酸)?！白凅w”意指實質上相似的序列。對于多核苷酸而言，變體包括在天然多核苷酸的5’和/或3’末端有刪除(即截短)的多核苷酸；在天然多核苷酸的一個或多個內部位點刪除和/或添加一個或多個核苷酸的多核苷酸；和/或在天然多核苷酸的一個或多個位點替換一個或多個核苷酸的多核苷酸。如本文使用的“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。對于多核苷酸，保守性變體包括這樣的序列由于遺傳密碼的簡并性而編碼一種本發(fā)明的EFR多肽的氨基酸序列?？梢允褂檬熘姆肿由飳W技術，例如使用如下文所述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術來鑒定例如這些天然存在的等位基因變體。變體多核苷酸還包括合成衍生的多核苷酸，例如通過使用定點誘變產生的仍然編碼本發(fā)明的EFR蛋白的多核苷酸。一般而言，本發(fā)明的特定多核苷酸的變體與該特定多核苷酸具有至少大約 40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，如通過本文其它地方描述的序列比對程序和參數(shù)所確定。還可以通過比較變體多核苷酸編碼的多肽與參考多核苷酸編碼的多肽之間的序列同一性百分率來評價本發(fā)明的特定多核苷酸(即參考多核苷酸)的變體。因此，例如，分離的多核苷酸可以編碼與SEQ ID NO :2的多肽具有給定的序列同一性百分率的多肽。任意兩個多肽之間的序列同一性百分率可以通過使用本文其它地方描述的序列比對程序和參數(shù)來計算。當通過比較其所編碼的兩個多肽之間的序列同一性百分率來評價本發(fā)明的任意給定的一對多核苷酸時，所編碼的兩個多肽之間的序列同一性百分率是至少大約60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性?！白凅w”蛋白意指通過刪除天然蛋白的N-末端和/或C-末端的一個或多個氨基酸(所謂的截短)、通過在天然蛋白的一個或多個內部位點處刪除和/或添加一個或多個氨基酸、或通過在天然蛋白的一個或多個位點處替換一個或多個氨基酸而從天然蛋白衍生的蛋白。本發(fā)明包括的變體蛋白是有生物活性的，也就是說，它們仍然具有天然蛋白的想要的生物活性，即，它們感知細菌EF-Tu肽的存在并激發(fā)如本文描述的植物疾病抗性應答。本發(fā)明的變體蛋白的生物活性可以這樣測定例如，通過農桿菌的介導在本氏煙草中瞬間表達， 然后測定由elfl8激發(fā)的氧化迸發(fā)，如Zipfel等人，(2006)Cell 125 :749-760所描述。也可以使用擬南芥efr-Ι葉子替代本氏煙草的葉子來進行這種相同的測定。此類變體可以來源于，例如，遺傳多態(tài)性或人類操作。本發(fā)明的天然EFR蛋白的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序列具有至少大約 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%,96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，如通過本文其它地方描述的序列比對程序和參數(shù)所確定。本發(fā)明的蛋白的生物活性變體與該蛋白的差異可以是僅1-15個氨基酸殘基，僅1-10個例如6-10個，僅5個，僅4、3、2或僅1個氨基酸殘基。本發(fā)明的變體蛋白的生物活性可以這樣測定例如，通過農桿菌的介導在本氏煙草中瞬間表達，然后測定由elfl8激發(fā)的氧化迸發(fā)，如Zipfel等人，^)06)Cell 125 749-760所描述。也可以使用擬南芥err-Ι葉子替代本氏煙草的葉子來進行這種相同的測定?？梢酝ㄟ^多種方式改變本發(fā)明的蛋白包括氨基酸替換、刪除、截短和插入。用于此類操作的方法是本領域通常已知的。例如，可以通過DNA中的突變來制備EFR蛋白的氨基酸序列變體和片段。用于誘變和多核苷酸改變的方法是本領域熟知的。參見，例如，Kimkel(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488-492 ;Kunkel 等人，(1987) Methods in Enzymo 1. 154 :367-382 ；美國專利號 4，873，192 ;Walker and Gaastra, eds. (1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York)以及其中引用的參考文獻。不影響目標蛋白的生物活性的合適的氨基酸替換的指導見模型=Dayhoff等人，(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.)，通過引用方式并入本文。保守性替換(例如將一個氨基酸替換為另一個具有相似性質的氨基酸)是理想的。因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變形式。類似地，本發(fā)明的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體和修飾形式。此類變體仍然具有想要的EFR生物活性。顯而易見的是，在編碼變體的DNA中進行的突變一定不能將該序列置于讀碼框外，最理想是不產生互補性區(qū)域以免產生二級mRNA結構。參見，EP專利申請
發(fā)明者C·B·茲普菲, J·D·G·瓊斯 申請人:雙刃基金會