專(zhuān)利名稱(chēng)：用于狗肝銅積累的遺傳檢測(cè)和低銅寵物喂食的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定狗對(duì)肝銅積累和對(duì)銅相關(guān)肝疾病的易感性的方法。本發(fā)明涉及用于預(yù)防狗肝銅積累和銅相關(guān)肝疾病的狗食品和制造所述食品的方法。本發(fā)明還涉及測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法。
背景技術(shù)：
盡管肝疾病在狗中不常見(jiàn)，其最常見(jiàn)的形式之一是慢性肝炎(CH)。CH是一種組織學(xué)診斷，其特征在于纖維化、炎癥和肝細(xì)胞凋亡和壞死的存在。此疾病的最終階段可導(dǎo)致肝硬化。CH的病因之一是肝銅積累。肝銅積累可由于提高的銅攝入、肝銅代謝的原發(fā)性代謝缺陷或改變的銅膽汁排泄導(dǎo)致。肝銅積累的遺傳基礎(chǔ)未知。其困難之處在于在大量不同的生物學(xué)途徑中涉及銅，各途徑都高度復(fù)雜并涉及大量基因的事實(shí)。通常用D-青霉胺，一種有效的銅螯合劑來(lái)治療具有過(guò)量肝銅積累的狗。發(fā)明概述
發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在犬G0LGA5、ATP7a和UBL5基因或其區(qū)域中的多態(tài)性指示了狗對(duì)肝銅積累的易感性或受到免于肝銅積累的保護(hù)。這3個(gè)基因組區(qū)域中的多態(tài)性與肝銅積累的風(fēng)險(xiǎn)或可能性相關(guān)的發(fā)現(xiàn)為通過(guò)篩選多態(tài)性預(yù)測(cè)狗是否對(duì)肝銅積累敏感或受到免于肝銅積累的保護(hù)的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。使用涉及組合一種或多種定義的多態(tài)性的檢測(cè)結(jié)果的模型可放大所述檢測(cè)的預(yù)測(cè)能力。在狗肝中的銅積累可導(dǎo)致一種或多種由高肝銅引起的肝疾病或病癥。例如，高肝銅可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和最終的肝功能衰竭。本發(fā)明因此能夠鑒定易患這些與高銅相關(guān)的肝疾病或病癥的狗。一旦鑒定了狗對(duì)肝銅積累的易感性，有可能對(duì)該狗確定合適的預(yù)防措施以將肝銅水平維持在低或正常水平，例如通過(guò)施用本發(fā)明的食品。此外，鑒定為不具有對(duì)肝銅積累敏感相關(guān)突變的狗可理想地用于育種程序以產(chǎn)生不太可能患與高銅相關(guān)的肝疾病或其它病癥的狗。本發(fā)明因此提供了測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)
(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的狗基因組中G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性，和/或
(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏。本發(fā)明還提供
-數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息； -測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括
(a)將與狗基因組中存在或缺乏如本文定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；
(b)將數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)比較，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；和
(c)基于比較測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性；
-計(jì)算機(jī)程序，其包含這樣的程序編碼方式，即當(dāng)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行時(shí)，所述程序編碼方式命令計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明的方法；
-計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)介質(zhì)，其包含本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序和本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(kù)； -被設(shè)置以進(jìn)行本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含
(a)接收與狗基因組中存在或缺乏如本文定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)的裝置；
(b)數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；
(c)用于將數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較的模塊；和基于所述比較測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的裝置；
-檢測(cè)狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括在樣品中檢測(cè)狗基因組中(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的在G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性，和/或(b)與所述多態(tài)性(a) 處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏；和
-(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的在狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性，和/或 (b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性在測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性中的用途； 和
-選擇用于產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法，其包括 -測(cè)定候選的第一只狗的基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累易感性的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性；和由此測(cè)定候選的第一只狗是否適合產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代；
-任選地，測(cè)定與第一只狗性別相反的第二只狗的基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累易感性的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性；和
-任選地，將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。此外，并且令人驚訝地，發(fā)明者現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了比使用藥物青霉胺更有效地降低拉布拉多尋回犬(Labrador Retriever)的肝銅積累的食品。此食品因此在預(yù)防拉布拉多尋回犬品種狗的肝銅積累中有用，并可用于預(yù)防與高肝銅相關(guān)的疾病或病癥，例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。由此，本發(fā)明還提供了包含低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食品，所述食品用于在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病，優(yōu)選地，其中所述狗通過(guò)本發(fā)明的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感。本發(fā)明還提供
-在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法，優(yōu)選地，其中所述狗通過(guò)本發(fā)明的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感，其包括對(duì)狗喂食本發(fā)明的食品；
-銅在制造食品中的用途，所述食品用于具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗，優(yōu)選地，其中所述狗通過(guò)本發(fā)明的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感，其中所述食品包含低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅并用于預(yù)防在所述狗中由肝銅積累導(dǎo)致的疾病；
-包含具有低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食物和提供至少120mg/kg干物質(zhì)濃度的鋅的補(bǔ)充劑的套裝，其用于同時(shí)、分別或相繼使用以在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病，優(yōu)選地，其中所述狗通過(guò)本發(fā)明的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感；和-本發(fā)明的帶標(biāo)簽的食品或本發(fā)明的帶標(biāo)簽的套裝。與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)相關(guān)的多態(tài)性的鑒定為在育種程序中應(yīng)用而選擇具有這些突變的狗以產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)并因此不太可能患與高銅相關(guān)的肝疾病或其它病癥的狗提供了機(jī)會(huì)。因此，本發(fā)明提供了測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。本發(fā)明還提供
-數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息； -測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，所述方法包括
(a)將與狗基因組中存在或缺乏如本文定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；
(b)將數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)比較，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包含與SNPATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息；和
(c)基于比較測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性；
-計(jì)算機(jī)程序，其包含這樣的程序編碼方式，即當(dāng)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行時(shí)，所述程序編碼方式命令計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明的方法；
-計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)介質(zhì)，其包含本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序和本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(kù)； -被設(shè)置以進(jìn)行本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含
(a)接收與狗基因組中存在或缺乏如本文定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)的裝置；
(b)數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與SNPATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息；
(c)用于將數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較的模塊；和基于所述比較測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的裝置；
-檢測(cè)狗以測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括在樣品中檢測(cè)狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性；和
-(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和 / 或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性在測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)中的用途；和
-選擇狗以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的方法，其包括 -測(cè)定候選的第一只狗的基因組中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性；和由此測(cè)定候選的第一只狗是否適合產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代；
-任選地，測(cè)定與第一只狗性別相反的第二只狗的基因組中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性；和
-任選地，將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。附圖簡(jiǎn)述


圖1說(shuō)明不加治療的肝銅積累的進(jìn)展。該圖顯示了在任何治療以前，在相隔8. 7個(gè)月(范圍為6-15個(gè)月)的2次檢查中11只拉布拉多尋回犬的肝銅濃度(mg/kg干重)。在此時(shí)間內(nèi)對(duì)所有動(dòng)物喂食它們通常的維持飲食，根據(jù)制造商其包含以干物質(zhì)計(jì)12-25 mg/kg之間的飲食銅濃度和以干物質(zhì)計(jì)80-270 mg/kg之間的鋅濃度。菱形符號(hào)表示離群值。圖2說(shuō)明24只拉布拉多尋回犬在研究開(kāi)始和飲食管理中的2次控制檢查 (control examination)中的肝銅濃度(mg/kg干重)。將狗如下分為2組組1=飲食+葡萄糖酸鋅片，組2=飲食+安慰劑。χ-軸編號(hào)的解釋如下1+2=治療前，3+4=復(fù)查1 (8個(gè)月后的第一次控制檢查(范圍為5-13個(gè)月))，5+6=復(fù)查2(16個(gè)月后的第二次控制檢查(范圍為12-25個(gè)月))。檢測(cè)的狗數(shù)目如下1 在組1中N=12只狗，2 在組2中N=12只狗，3 在組1中N=9只狗，4 在組2中N=12只狗，5 在組1中N=6只狗，6 在組2中N=IO只狗。 菱形符號(hào)表示離群值。點(diǎn)線代表成年狗的肝銅正常水平。圖3說(shuō)明在18只拉布拉多尋回犬中本發(fā)明的飲食與青霉胺單獨(dú)作用相比對(duì)肝銅濃度(mg/kg干重)的有效性。χ-軸的解釋如下1=青霉胺前，2=青霉胺后/食物前，3=食物后。沿χ-軸從1至2的發(fā)展證明青霉胺的作用，而從2至3的發(fā)展證明食物的作用。點(diǎn)線代表成年狗的肝銅正常水平。圖4說(shuō)明布置用于實(shí)施本發(fā)明的功能組件的圖表實(shí)施方案。圖5描繪了在拉布拉多尋回犬中根據(jù)性別和ATP7a基因型的平均銅水平(表VII 的數(shù)據(jù))。y_軸為肝銅干重(mg/kg)。χ-軸為ATP7a基因型從左到右，前3個(gè)為研究中的雌性狗，最后2個(gè)為研究中的雄性狗。誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6為在拉布拉多尋回犬中根據(jù)性別和ATP7a基因型的銅組織學(xué)得分的箱形圖 (表VII的數(shù)據(jù))。y_軸為銅組織學(xué)得分值。X-軸為ATP7a基因型從左到右，前3個(gè)為研究中的雌性狗，最后2個(gè)為研究中的雄性狗。kruskal-walis ρ值為0. 000396。序列簡(jiǎn)述
SEQ ID NO: 1至142顯示了包含本發(fā)明SNP的多核苷酸序列。發(fā)明詳述
鑒定對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)
在肝中的銅積累在許多狗品種中導(dǎo)致肝疾病，所述狗品種包括拉布拉多尋回犬、杜賓犬(Doberman Pinscher )、德國(guó)牧羊犬(German Shepherd)、荷蘭獅毛犬(Keeshond)、 可卡犬(Cocker Spaniel)、西部高地白梗(West Highland White ^Terrier)、貝靈頓梗 (Bedlington Terrier)和斯凱梗(Skye Terrier)。任意品種的普通狗肝內(nèi)的平均銅濃度為以干重計(jì)200至400 mg/kg，盡管新生狗通常具有較高的肝銅濃度。對(duì)肝銅積累敏感的狗具有積累銅的傾向，從而其肝銅濃度達(dá)到高于400 mg/kg，例如高于 500 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg、1000 mg/kg、1500 mg/kg、2000 mg/kg,5000 mg/ kg或高于10000 mg/kg的水平。另一方面，受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗不具有積累銅至所述水平的傾向。根據(jù)本發(fā)明測(cè)定狗對(duì)肝銅積累敏感的風(fēng)險(xiǎn)或可能性涉及測(cè)定下述風(fēng)險(xiǎn)或可能性，即狗將積累肝銅至高于400mg/kg的水平。受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗具有積累肝銅的低風(fēng)險(xiǎn)或可能性，從而其肝銅濃度不太可能達(dá)到高于600mg/kg的水平。受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗的肝銅濃度將低于600 mg/kg，例如低于 550 mg/kg,500 mg/kg,450 mg/kg,400 mg/kg,350 mg/kg 或低于 300 mg/ kg。根據(jù)本發(fā)明測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的風(fēng)險(xiǎn)或可能性涉及測(cè)定下述風(fēng)險(xiǎn)或可能性，即狗將積累肝銅至高于600mg/kg的水平?？蓪⒁赘行曰虮Ｗo(hù)的風(fēng)險(xiǎn)或可能性表示為例如風(fēng)險(xiǎn)因子、百分比或概率。有可能測(cè)定狗是否會(huì)積累銅至上述水平。高于400mg/kg的肝銅積累水平與肝疾病相關(guān)，并可最終導(dǎo)致肝功能衰竭。因此測(cè)定狗基因組是否包含指示肝銅積累易感性的一種或多種多態(tài)性也提供測(cè)定狗對(duì)肝銅積累導(dǎo)致的疾病或病癥例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭的易感性的方法。相反地，測(cè)定狗基因組是否包含指示受到免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性指示所述狗不太可能患所述疾病或病癥。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)狗對(duì)肝銅積累相關(guān)疾病例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭的易感性或保護(hù)狗免于所述疾病的可能性的方法。闡明與遺傳性狀相關(guān)的多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明開(kāi)發(fā)了在一組個(gè)體中測(cè)定與遺傳性狀相關(guān)的多態(tài)性的方法，即“分區(qū)作圖”(又稱(chēng)“2D作圖”)。所述方法目前僅限于雙值條件(binary condition)(案例/對(duì)照研究)。具有遺傳關(guān)聯(lián)的復(fù)雜疾病通常由一個(gè)以上基因驅(qū)使。這些基因可以非線性方式相互作用，使其難以用傳統(tǒng)方法作圖。通過(guò)在一對(duì)個(gè)體水平上的研究有可能分解多種基因的影響，因?yàn)榛蜃蛘邥?huì)促成該對(duì)個(gè)體的表型，或不會(huì)如此。下面描述此方法的全部工作內(nèi)容。進(jìn)行此分析后，有可能獲得在各區(qū)域的風(fēng)險(xiǎn)等位基因并使用其它方法建立模型以預(yù)測(cè)表型?！胺謪^(qū)作圖”算法掃描基因組，每501Λ停1次。在這些點(diǎn)上分別分析每對(duì)個(gè)體。在每對(duì)個(gè)體中分析全染色體的基因型，在3種可能的情況下比較基因型的可能性。第一種情況是，在此對(duì)個(gè)體中具有驅(qū)使表型的隱性突變。第二種情況是，在此對(duì)個(gè)體中具有驅(qū)使表型的顯性突變。第三種情況是在此對(duì)狗的此位置沒(méi)有重要的突變。使用隱馬爾可夫模型計(jì)算可能性，如下描述。通過(guò)比較這些可能性，有可能在此對(duì)個(gè)體中生成傾向或不傾向在該點(diǎn)存在隱性或顯性表型驅(qū)使突變的貝葉斯因子。對(duì)這些值取對(duì)數(shù)；正值表示傾向隱性或顯性突變情況的權(quán)重更多，負(fù)值表示傾向這里沒(méi)有重要突變的證據(jù)更多。將成對(duì)個(gè)體按照Log-貝葉斯因子在該基因座分類(lèi)。之后以降序排列總結(jié)成對(duì)個(gè)體的Log-貝葉斯因子，在數(shù)據(jù)的各百分位取出證據(jù)的累積權(quán)重記錄。在大多數(shù)情況下一些 Log-貝葉斯因子為正，一些為負(fù)。這將給出一定百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)的記錄值升高并然后減低的作用。此值的最大值給出了朝向隱性或顯性模型的證據(jù)權(quán)重的測(cè)量。其被稱(chēng)為“峰值”。在有些情況下所述算法特別偏向基因組的純合子區(qū)或具有高密度多態(tài)性的區(qū)域。 此作用通過(guò)下述定量，即對(duì)4種可能的案例/對(duì)照狀態(tài)(案例-案例，案例-對(duì)照，對(duì)照-案例，對(duì)照-對(duì)照)中的每對(duì)排列個(gè)體進(jìn)行所述方法。對(duì)任意基因座，從正常峰值中減去排列模型下的峰值，這樣得到修正的峰值?？梢栽诮o出目的區(qū)域的基因組中比較修正的峰值。隱馬爾可夫模型
分區(qū)作圖的關(guān)鍵元素在于其不直接作用在基因型數(shù)據(jù)上。使用一層分析將一對(duì)狗之間的相關(guān)性程度模型化；此分析給出有關(guān)2個(gè)個(gè)體在其基因組的基因座上具有相同的祖先等位基因的信息。在一對(duì)狗的染色體之間有9種可能的關(guān)系，最有相關(guān)性的是所有4條染色體為相同的單倍體型，最不具相關(guān)性的是在此位點(diǎn)為4條不同的單倍體型。使用隱馬爾可夫模型計(jì)算了這9種狀態(tài)的可能性。
如果基因座作用于成對(duì)的研究個(gè)體，在案例-對(duì)照表型的一些排列下這些狀態(tài)中的一些是不可能的。因此可以從相對(duì)可能性中計(jì)算存在隱性或顯性等位基因的貝葉斯因子。對(duì)銅積累的易感性或免于銅積累的保護(hù)的多態(tài)性和指示
使用上述方法，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)在犬G0LGA5、ATP7a和UBL5基因中或其區(qū)域中的多態(tài)性指示對(duì)肝銅積累的易感性。本發(fā)明因此涉及測(cè)定狗基因組是否包含在這些基因組位置的指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性的方法。本發(fā)明提供了測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)(a) 狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因的多態(tài)性，其指示對(duì)肝銅積累的易感性和/或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏。發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了影響ATP7a蛋白質(zhì)序列的多態(tài)性，其指示了免于肝銅積累的保護(hù)。所述多態(tài)性改變了基因ATP7a在3 位氨基酸處的蛋白質(zhì)序列，從蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，這對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有潛在的重大影響。本發(fā)明因此涉及測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性的方法。本發(fā)明提供了測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，包括在狗基因組中檢測(cè)一種或多種選自下述的多態(tài)性的存在或缺乏(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。短語(yǔ)“檢測(cè)多態(tài)性的存在或缺乏”通常指測(cè)定多態(tài)性是否存在于狗基因組中。多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，微衛(wèi)星多態(tài)性，插入多態(tài)性和缺失多態(tài)性。優(yōu)選地，多態(tài)性為SNP。檢測(cè)SNP的存在或缺乏指將SNP按基因型分型或?qū)⒐坊蚪M中存在的核苷酸(一個(gè)或多個(gè))針對(duì)SNP分型。通常會(huì)測(cè)定2條同源染色體相同位置上存在的核苷酸。因此狗可被測(cè)定為在SNP的第一個(gè)等位基因上是純合的，在SNP的第二個(gè)等位基因上是雜合的或純合的。測(cè)定個(gè)體的表型，例如個(gè)體對(duì)疾病或病癥的易感性或保護(hù)個(gè)體免于疾病或病癥不限于檢測(cè)導(dǎo)致疾病或病癥的多態(tài)性。在遺傳作圖研究中，檢測(cè)個(gè)體樣品中一組標(biāo)記物基因座的遺傳變異以獲得與特定表型的聯(lián)系。如果在特定標(biāo)記物基因座和表型之間發(fā)現(xiàn)這樣的聯(lián)系，這表示在該標(biāo)記物基因座的變異影響目的表型，或在該標(biāo)記物基因座的變異與未被基因分型的真正表型相關(guān)基因座處于連鎖不平衡。在一組彼此處于連鎖不平衡的多態(tài)性的情況下，知道在特定個(gè)體中所有這些多態(tài)性的存在通常提供冗余信息。因此，當(dāng)測(cè)定狗基因組中是否包含一種或多種多態(tài)性(其指示對(duì)肝銅積累或銅相關(guān)肝疾病的易感性或免于肝銅積累或銅相關(guān)肝疾病的保護(hù))時(shí)，必須檢測(cè)所述多態(tài)性組中的僅一種多態(tài)性。作為連鎖不平衡的結(jié)果，不是功能易感性/保護(hù)性多態(tài)性而是與功能多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性可作為標(biāo)記物指示功能多態(tài)性的存在。與本發(fā)明的多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性指示對(duì)肝銅積累的易感性，或免于肝銅積累的保護(hù)。由此，如本文定義的任意一種多態(tài)位置可被直接分型，也就是說(shuō)通過(guò)測(cè)定在該位置存在的核苷酸，或被間接分型，例如通過(guò)測(cè)定與所述多態(tài)性位置處于連鎖不平衡的另一個(gè)多態(tài)位置存在的核苷酸。連鎖不平衡是種群中不同基因座上的等位基因的非隨機(jī)配子聯(lián)系。具有共同遺傳而不是通過(guò)隨機(jī)排列獨(dú)立遺傳傾向的多態(tài)性是處于連鎖不平衡的。如果2種多態(tài)性共同存在的頻率是2種多態(tài)性各自存在的頻率的乘積，則多態(tài)性是隨機(jī)排列的或彼此獨(dú)立遺傳的。例如，如果在不同多態(tài)位點(diǎn)的2種多態(tài)性在種群的50%染色體中存在，那么，如果這2 個(gè)等位基因共同在種群的25%染色體中存在，就可以說(shuō)它們是隨機(jī)排列的。更高的百分比將意味著這2個(gè)等位基因是連鎖的。如果在種群中2種多態(tài)性共同存在的頻率高于2種多態(tài)性獨(dú)立存在的頻率的乘積，則第一種多態(tài)性與第二種多態(tài)性處于連鎖不平衡。優(yōu)選地，如果2種多態(tài)性共同存在的頻率比2種多態(tài)性獨(dú)立存在的頻率的乘積高10%，例如高于30%， 高于50%或高于70%，則第一種多態(tài)性與第二種多態(tài)性處于連鎖不平衡。。處于連鎖不平衡的多態(tài)性經(jīng)常在物理上很接近，這解釋了它們?yōu)槭裁垂策z傳。與本文提及的多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性位于相同的染色體上。研究顯示連鎖不平衡在狗中是廣泛白勺(Extensive and breed-specific linkage disequilibrium in Canis familiar is, Sutter 藥Λ，Genome Research 14: 2388-2396)。在狗中處于連鎖不平衡的多態(tài)性通常位于多態(tài)性的5mb以?xún)?nèi)，優(yōu)選2mb以?xún)?nèi)、Imb以?xún)?nèi)、7001Λ以?xún)?nèi)、6001Λ以?xún)?nèi)、 500kb以?xún)?nèi)、400kb以?xún)?nèi)、200kb以?xún)?nèi)、IOOkb以?xún)?nèi)、50kb以?xún)?nèi)、IOkb以?xún)?nèi)、5kb以?xún)?nèi)、Ikb以?xún)?nèi)、 500bp以?xún)?nèi)、IOObp以?xún)?nèi)、50bp以?xún)?nèi)或IObp以?xún)?nèi)。使用常規(guī)技術(shù)鑒定與本文定義的任意一種多肽位置處于連鎖不平衡的多態(tài)性應(yīng)當(dāng)是技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。一旦選擇了潛在的多態(tài)性，技術(shù)人員可容易地測(cè)定此多態(tài)性是否與本文定義的任意一種多態(tài)性顯著相關(guān)，和所述多態(tài)性的哪種版本或等位基因與本文定義的任意一種多態(tài)性顯著相關(guān)。更詳細(xì)地，為測(cè)定多態(tài)性是否與本文定義的任意一種多態(tài)性處于連鎖不平衡，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)對(duì)候選多態(tài)性和一種或多種本文定義的多態(tài)性在一組狗中進(jìn)行基因分型。組的大小應(yīng)當(dāng)足夠大以得到統(tǒng)計(jì)上顯著的結(jié)果。通常應(yīng)當(dāng)對(duì)來(lái)自至少100，優(yōu)選至少150或至少200只不同狗的樣品進(jìn)行基因分型。組中的狗可為任意品種，但通常具有相同或相似的遺傳品種背景。一旦在一組狗中對(duì)多態(tài)性進(jìn)行了基因分型，使用多種可容易得到的統(tǒng)計(jì)軟件包中的任意一種可測(cè)量一對(duì)或多對(duì)多態(tài)性之間的連鎖不平衡。免費(fèi)軟件包的實(shí)例為 Haploview (Haploview analysis and visualisation of LD and haplotype maps, Barrett 等人，2005，Bioinformaticsj 21 (2) : 263-265)，可在 http://www. broadinstitute. or^/hapIoview/hapIoview 下載。連鎖不平衡的量度為D’。0. 5至1范圍的D’指示一對(duì)多態(tài)性處于連鎖不平衡，1 指示最顯著的連鎖不平衡。因此如果發(fā)現(xiàn)候選多態(tài)性和本文定義的特定多態(tài)性的D’處于 0. 5至1，優(yōu)選0. 6至1、0. 7至1、0. 8至1、0. 85至1、0. 9至1、0. 95至1或最優(yōu)選為1，則可以說(shuō)候選多態(tài)性預(yù)測(cè)本文定義的多態(tài)性，并且會(huì)因此指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，與本文定義的多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性在 680 kb以?xún)?nèi)并與本文定義的多態(tài)性處于相同的染色體上，并且多態(tài)性對(duì)之間的連鎖不平衡的計(jì)算量度D’大于或等于0. 95。連鎖不平衡的另一種量度是R平方，其中R為相關(guān)系數(shù)。R平方(又稱(chēng)“測(cè)定系數(shù)”)是第一種多態(tài)性基因型中的變異占第二種多態(tài)性基因型的變異的分?jǐn)?shù)。因此對(duì)候選多態(tài)性和本文定義的特定多態(tài)性來(lái)說(shuō)，0. 5的R平方意味著候選多態(tài)性占特定多態(tài)性變異的 50%。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)軟件包(例如Haploview)可產(chǎn)生R平方。通常地，認(rèn)為0. 25或更高(R>0. 5 或<-0. 5)的R平方是高相關(guān)性。因此對(duì)候選多態(tài)性和本文定義的特定多態(tài)性來(lái)說(shuō)，如果發(fā)現(xiàn)R平方為0. 5或更高，優(yōu)選0. 75、0. 8、0. 9或0. 95或更高，則可以說(shuō)候選多態(tài)性預(yù)測(cè)本文定義的多態(tài)性，并且會(huì)因此指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，與本文定義的多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性在680 1Λ以?xún)?nèi)并與本文定義的多態(tài)性處于相同的染色體上，并且多態(tài)性對(duì)之間的連鎖不平衡的計(jì)算量度R平方大于或等于 0. 95。一旦鑒定了與本文定義的多態(tài)性處于連鎖不平衡的(因此與其相關(guān)的)的多態(tài)性， 技術(shù)人員可容易地測(cè)定多態(tài)性的那種版本，即哪個(gè)等位基因與對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)相關(guān)。這可通過(guò)測(cè)定一組狗的肝銅積累表型并根據(jù)肝銅積累的水平將狗分類(lèi)而實(shí)現(xiàn)。然后將這組狗針對(duì)目的多態(tài)性進(jìn)行基因分型。然后將基因型與肝銅水平相關(guān)聯(lián)以測(cè)定基因型和肝銅水平的聯(lián)系，由此測(cè)定哪個(gè)等位基因與對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)相關(guān)。指示對(duì)肝銅積累的易感性的本發(fā)明的多態(tài)性可存在于G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的任意一個(gè)中或不存在于這些基因中的任意一個(gè)中但與這些基因中的任意一個(gè)中的多態(tài)性處于連鎖不平衡。本發(fā)明因此涉及檢測(cè)(a)在狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性和/或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏?？蓹z測(cè)多態(tài)性的任意數(shù)目和任意組合來(lái)實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選檢測(cè)至少2種多態(tài)性。 優(yōu)選檢測(cè)2至5、3至8或5至10種多態(tài)性?？蓪?duì)狗DNA在以下各個(gè)位置進(jìn)行分型 ⑴2種或更多種多態(tài)性(a)；
( ) 2種或更多種多態(tài)性(b);或
(iii) 一種或多種多態(tài)性(a)和一種或多種多態(tài)性(b)。當(dāng)為2種多態(tài)性(a)時(shí)，每種多態(tài)性可在單獨(dú)的G0LGA5、ATP7a和UBL5基因之一中或只在這些基因之一中。當(dāng)為3種或更多多態(tài)性(a)時(shí)，例如3至10種所述多態(tài)性，多態(tài)性可在同一個(gè)基因中，在2個(gè)基因中或在所有3個(gè)基因中。類(lèi)似地，當(dāng)為2種多態(tài)性(b)時(shí)，每種多態(tài)性可與在單獨(dú)的G0LGA5、ATP7a和UBL5 基因之一中或只在這些基因之一中的多態(tài)性處于連鎖不平衡。當(dāng)為3種或更多多態(tài)性(b) 時(shí)，例如3至10種所述多態(tài)性，多態(tài)性可與在同一個(gè)基因中，在2個(gè)基因中或在所有3個(gè)基因中的多態(tài)性處于連鎖不平衡。優(yōu)選的方法包括檢測(cè)(a)在狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中指示對(duì)肝銅積累的易感性的至少一種多態(tài)性和(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的至少一種多態(tài)性的存在或缺乏。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，多態(tài)性為SNP。SNP可為狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因或基因區(qū)域中指示對(duì)肝銅積累的易感性的任意SNP和/或與其處于連鎖不平衡的SNP。當(dāng)方法用于測(cè)定狗基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性時(shí)，優(yōu)選地，SNP選自表III、表IV和表V中鑒定的SNP。在表III和表IV中各SNP位于序列的第61位。提供了各SNP在該位置的第一和第二等位基因([第一 /第二])。在表V中，也指示了各SNP的第一和第二等位基因?？墒褂萌我鈹?shù)目和以任意組合的來(lái)自表 III、IV和V的SNP。SNP可與多態(tài)性的不同類(lèi)型組合。優(yōu)選地，測(cè)定狗基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性的方法包括檢測(cè)選自表III和表V中SNP的一種或多種SNP和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種SNP的存在或缺乏。因此優(yōu)選地，一種或多種SNP選自BICF2P506595 (SEQ ID N0:1)、BICF2P772765 (SEQ ID NO:2)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3)、BICF2P1324008 (SEQ ID N0:4)、BICF2P591872 (SEQ ID NO:5)、ATP7a_Reg4_F_9 (SEQ ID NO: 131)、UBL5_ ReglF_16 (SEQ ID NO: 132)、golga5_Regl_24 (SEQ ID NO: 13 、golga5_26 (SEQ ID NO: 134)、golga5_27 (SEQ ID NO: 135), golga5_28 (SEQ ID NO: 136), golga5_29 (SEQ ID NO: 137)、golga5_30 (SEQ ID NO: 138)、golga5_31 (SEQ ID NO: 139)、atp7aregl7_32 (SEQ ID NO: 140)、atp7aregl7_33 (SEQ ID NO: 141)和與其處于連鎖不平衡的一種或多種SNP。由此，可對(duì)這16種SNP中的任一種或與這16種SNP中的任一種處于連鎖不平衡的任意SNP進(jìn)行分型。優(yōu)選地，對(duì)這16種SNP或與其處于連鎖不平衡的SNP中的至少2種進(jìn)行分型。更優(yōu)選地，測(cè)定狗基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性的方法包括檢測(cè)選自表III中SNP的一種或多種SNP的存在或缺乏。由此，可對(duì)這5種 SNP中的任一種或與這5種SNP中的任一種處于連鎖不平衡的任意SNP進(jìn)行分型。優(yōu)選地， 對(duì)這5種SNP或與其處于連鎖不平衡的SNP中的至少2種進(jìn)行分型。更優(yōu)選地，對(duì)所有5 個(gè)位置進(jìn)行分型。因此優(yōu)選地，被分型的核苷酸(一個(gè)或多個(gè))選自與下述等同的位置
-SEQ ID NO: 1 的第 61 位(BICF2P506595, SNP1)； -SEQ ID NO: 2 的第 61 位(BICF2P772765, SNP 2)； -SEQ ID NO: 3 的第 6I 位(BICF2S2333I87, SNP 3)； -SEQ ID NO: 4 的第 61 位(BICF2P1324008, SNP 4)；
-SEQ ID NO: 5的第61位(BICF2P591872, SNP 5)；或與這些位置中的任一個(gè)處于連鎖不平衡的任意位置。優(yōu)選地，所述方法包括檢測(cè)SNP BICF2P506595 (SEQ ID N0:1)、 BICF2P772765 (SEQ ID NO:2)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3)、BICF2P1324008 (SEQ ID NO:4)和 BICF2P591872 (SEQ ID NO:5)的存在或缺乏。SNPl位于G0LGA5基因的內(nèi)含子中。SNP2、3和4位于UBL5基因區(qū)域中。SNP5位于ATP7a基因區(qū)域中。本發(fā)明的檢測(cè)方法因此涉及在一個(gè)或多個(gè)這些基因的區(qū)域中(在編碼區(qū)或其它區(qū)域中)存在的任意SNP，或與其處于連鎖不平衡的任意其它SNP。實(shí)施例1證明了這些SNP在建立對(duì)銅積累的易感性的Boolean模型中的用途。表 I表示在3個(gè)基因組位置上的等位基因的雙值條件。二進(jìn)制值指示具有指示對(duì)銅積累的易感性的等位基因(“壞”等位基因)的狗。例如000表示不具有3種壞等位基因中的任一種。 111表示具有所有3種壞等位基因。X是在該基因中未使用的等位基因。行Ixx和Oxx顯示了僅使用G0LGA5基因中的SNP的單基因檢測(cè)會(huì)得到的效力。發(fā)明者已測(cè)定出SNP BICF2P506595 (SNP 1)的A等位基因指示對(duì)肝銅積累的易感性。A等位基因純合的狗對(duì)肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測(cè)定SNP BICF2P506595的A等位基因的存在或缺乏，由此測(cè)定狗基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)SNP BICF2P506595的AA基因型的存在或缺乏。發(fā)明者已測(cè)定出SNP BICF2P772765 (SNP 2)的G等位基因指示對(duì)肝銅積累的易感性。G等位基因純合的狗對(duì)肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測(cè)定SNP BICF2P772765的G等位基因的存在或缺乏，由此測(cè)定狗基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)SNP BICF2P772765的GG基因型的存在或缺乏。發(fā)明者已測(cè)定出SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的C等位基因指示對(duì)肝銅積累的易感性。C等位基因純合的狗對(duì)肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測(cè)定SNP BICF2S2333187的C等位基因的存在或缺乏，由此測(cè)定狗基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)SNP BICF2S2333187的CC基因型的存在或缺乏。發(fā)明者已測(cè)定出SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的G等位基因指示對(duì)肝銅積累的易感性。G等位基因純合的狗對(duì)肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測(cè)定SNP BICF2P1324008的G等位基因的存在或缺乏，由此測(cè)定狗基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)SNP BICF2P13M008的GG基因型的存在或缺乏。發(fā)明者已測(cè)定出SNP BICF2P591872 (SNP 5)的A等位基因指示對(duì)肝銅積累的易感性。A等位基因純合的狗對(duì)肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測(cè)定SNP SNP BICF2P591872的A等位基因的存在或缺乏，由此測(cè)定狗基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)SNP SNP BICF2P591872的AA或AG基因型的存在或缺乏。因此，本發(fā)明更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)下述基因型的存在或缺乏
(i)SNP BICF2P506595 (SNP 1)的 AA 基因型；
(ii)SNP BICF2P772765 (SNP 2)的 GG 基因型；
(iii)SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的 CC 基因型；
(iv)SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的 GG 基因型；和 / 或
(v)SNP BICF2P591872 (SNP 5)的 AA 或 AG 基因型；
和由此測(cè)定狗基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)基因型⑴；基因型(ii)、(iii)和(iv)；或基因型(ν)的存在或缺乏。 甚至更優(yōu)選的方法包括檢測(cè)所有5種基因型(i)至(ν)的存在或缺乏。指示免于肝銅積累的保護(hù)的本發(fā)明的多態(tài)性為表VI鑒定的SNP (ATP7a_Reg3_ F_6 (SEQ ID NO: 142))和與此SNP處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。因此，當(dāng)本發(fā)明的方法用于測(cè)定狗基因組中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性時(shí)，所述方法包括檢測(cè)選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)或(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。可檢測(cè)多態(tài)性的任意數(shù)目和任意組合以實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選檢測(cè)至少2種多態(tài)性。優(yōu)選檢測(cè)2至5、3至8或5至10 種多態(tài)性?？蓪?duì)狗DNA在以下各個(gè)位置進(jìn)行分型 ⑴多態(tài)性(a)；
(ii)一種或多種多態(tài)性(b)；或
(iii)多態(tài)性(a)和一種或多種多態(tài)性(b)。優(yōu)選的方法包括檢測(cè)(a)SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和與所述多態(tài)性 (a)處于連鎖不平衡的至少一種多態(tài)性(b)的存在或缺乏。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性為SNP。優(yōu)選地，SNP為狗ATP7a基因或基因區(qū)域中的指示免于肝銅積累的保護(hù)的任意SNP。更優(yōu)選地，所述方法包括測(cè)定表VI中鑒定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))的存在或缺乏。發(fā)明者已測(cè)定出用于表VI中鑒定的ATP7a SNP的T等位基因指示免于肝銅積累的保護(hù)。此SNP位于X染色體上。對(duì)于T等位基因而言純合(在雌性狗的情況下)或半合(在雄性狗的情況下)的狗受到免于銅積累的保護(hù)。具有C等位基因的狗似乎不受到免于銅積累的保護(hù)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測(cè)定用于表VI中鑒定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))的T等位基因的存在或缺乏。由此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括檢測(cè)在ATP7a_ Reg3_F_6 (SNP 14 處的TT或TC基因型的存在或缺乏，由此測(cè)定狗基因組是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。鑒于表VI中鑒定的ATP7a SNP位于X染色體上和保護(hù)作用是隱性的事實(shí)，雄性狗更可能具有保護(hù)的表型。本發(fā)明的方法因此可包括測(cè)定狗的性別?？紤]到雄性狗與雌性狗相比通常對(duì)銅積累較不敏感，ATP7a SNP ((ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))對(duì)所有品種的狗(包括未知品種或混種(雜種)的狗)特別有用。實(shí)施例3也提供了證據(jù)支持本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有品種和在所有地理位置的狗。本發(fā)明的方法因此可包括測(cè)定混種或雜交狗，或雜種或遠(yuǎn)交狗的基因組在ATP7a基因中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。本發(fā)明的方法可包括測(cè)定指示對(duì)肝銅積累的易感性和免于肝銅積累的保護(hù)的SNP 組合的存在或缺乏。可對(duì)狗DNA在指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種SNP處分型和在指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種SNP處分型。一種或多種“易感性”SNP的存在與一種或多種“保護(hù)性”SNP的缺乏的組合指示狗對(duì)肝銅積累敏感。一種或多種“保護(hù)性”SNP的存在與一種或多種“易感性” SNP的缺乏的組合指示狗受到免于肝銅積累的保護(hù)?？蓪?duì)狗DNA在以下位置分型
(i) 一種或多種選自下述的SNP (a)表III、IV和V中鑒定的SNP和(b)與所述SNP (a)處于連鎖不平衡的一種或多種SNP ；和
⑴一種或多種選自下述的SNP (a)表VI中鑒定的SNP (ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))和(b)與所述SNP (a)處于連鎖不平衡的一種或多種SNP。對(duì)狗基因組中在表III、IV、V或VI中的任一個(gè)表中鑒定的位置(一個(gè)或多個(gè))處存在的核苷酸分型可能意味著對(duì)在與表III、IV、V或VI中鑒定的序列精確對(duì)應(yīng)的序列中在此位置存在的核苷酸分型。然而，應(yīng)當(dāng)理解在表III中鑒定的SEQ ID NO: 1至5，表IV 中鑒定的SEQ ID N0:6至130，表V中鑒定的SEQ ID N0: 131至141和表VI中鑒定的SEQ ID N0: 142中存在的精確序列不一定在待檢測(cè)的狗中存在。因此可在表III、IV、V或VI 中鑒定的位置或等同或?qū)?yīng)的位置對(duì)在序列中存在的核苷酸分型。因此如本文使用的術(shù)語(yǔ)等同的意思是在表III、IV、V或VI中鑒定的位置或其對(duì)應(yīng)位置。SNP的序列可發(fā)生變化， 因此其位置可發(fā)生變化，例如由于狗基因組中核苷酸的缺失或插入。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定與各SEQ ID NOs: 1至142中的相關(guān)位置對(duì)應(yīng)或等同的位置，例如使用計(jì)算機(jī)程序如 GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN、PILEUP 或 BLAST。UWGCG 軟件包提供了可用于計(jì)算同源性或排列序列的程序，包括GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN和PILEUP (例如使用它們的默認(rèn)設(shè)置)。BLAST算法也可用于比較或排列2個(gè)序列，通常使用其默認(rèn)設(shè)置。用于進(jìn)行2個(gè)序列的BLAST比較的軟件從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/)可公開(kāi)地獲得。此算法在下面進(jìn)一步描述。用于序列比對(duì)和比較的類(lèi)似可公開(kāi)獲得的工具可在歐洲生物信息研究所(European Bioinformatics hstitute)網(wǎng)站(http //www, ebi. ac. uk)找至lj，例如 ALIGN 禾口 CLUSTALW程序。有許多不同的方法可用于測(cè)定多態(tài)性是否指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)。通常將候選多態(tài)性與多態(tài)性及其與對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系的數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)對(duì)一組狗針對(duì)肝銅積累進(jìn)行表型分型，例如通過(guò)肝活組織檢查，并根據(jù)銅積累的水平將狗分類(lèi)而生成。所述組中的狗也針對(duì)一組多態(tài)性被基因分型。然后有可能測(cè)定各基因型和肝銅水平的聯(lián)系。因此通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)中定位多態(tài)性可測(cè)定多態(tài)性是否指示對(duì)肝銅的易感性或免于肝銅的保護(hù)。如果目的多態(tài)性不在上述數(shù)據(jù)庫(kù)中，仍然有可能測(cè)定多態(tài)性是否指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)。這可通過(guò)對(duì)一組狗針對(duì)肝銅積累進(jìn)行表型分型和根據(jù)肝銅積累的水平將狗分類(lèi)而實(shí)現(xiàn)。然后將所述組的狗針對(duì)目的多態(tài)性進(jìn)行基因分型。然后將基因型和肝銅水平相聯(lián)系以測(cè)定基因型和肝銅水平的關(guān)聯(lián)。一旦在狗基因組中檢測(cè)了到一種或多種本發(fā)明的多態(tài)性的存在或缺乏，就由此測(cè)定了狗是否對(duì)肝銅積累敏感或受到免于肝銅積累的保護(hù)。各單獨(dú)的多態(tài)性或與其它多態(tài)性組合的多態(tài)性的基因型指示狗對(duì)肝銅積累敏感或受到免于肝銅積累的保護(hù)。作為實(shí)例，表 I列舉了 G0LGA5、UBL5和ATP7a基因區(qū)域中5種SNP組合的不同可能的基因型和具有這些基因型且具有高銅(肝水平高于600 mg/kg)的狗的百分比。在此實(shí)例中，為了測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性，可使用狗的DNA樣品在狗基因組中對(duì)5種SNP進(jìn)行基因分型。一旦測(cè)定了 SNP的基因型，可基于實(shí)施例1中提供的譯碼(即基于基因型和高銅關(guān)聯(lián)的程度)將其轉(zhuǎn)化成二進(jìn)制值。然后，使用表I基于具有該基因型模式和高銅的狗的百分比將二進(jìn)制值轉(zhuǎn)化為風(fēng)險(xiǎn)因子。類(lèi)似地，為測(cè)定狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)，可使用狗的DNA樣品在狗基因組中對(duì)表VI中鑒定的SNP進(jìn)行基因分型。此功能突變位于ATP7a (在X染色體上)中，在純合(TT)時(shí)顯示為保護(hù)性的。這可解釋慢性肝炎的雌性偏向，因?yàn)樾坌詢(xún)H具有一個(gè)拷貝的 X染色體，因此在ATP7a基因座上為半合子。因?yàn)樾坌訶染色體的半合狀態(tài)，伴X染色體的隱性基因效應(yīng)更可能在雄性而不是雌性中見(jiàn)到。此處的保護(hù)性作用是隱性的，因此我們?cè)诖菩匀后w中觀察到更多的案例(見(jiàn)實(shí)施例2，表VII和圖5)。一旦測(cè)定了 SNP的基因型，就有可能測(cè)定狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)。可選等位基因(T)的存在指示免于肝銅積累的保護(hù)。可選等位基因?yàn)榧兒?TT)的狗最可能受到免于肝銅積累的保護(hù)。本發(fā)明優(yōu)選的方法因此包括測(cè)定在狗基因中ATP7a SNP的T等位基因的存在或缺乏。所述方法可包括測(cè)定狗對(duì)ATP7a SNP的T等位基因是純合的(在雌性狗的情況下)或半合的(在雄性狗的情況下)。通過(guò)本發(fā)明的方法可檢測(cè)在任意年齡的狗，例如從O至12、0至6、0至5、0至4、0 至3、0至2或O至1歲。優(yōu)選地，在盡可能小的年齡檢測(cè)狗，例如在其生命的頭一年，頭6 個(gè)月或3個(gè)月以?xún)?nèi)。優(yōu)選地在銅積累發(fā)生前檢測(cè)狗?？赡苤阑蚩赡懿恢拦返臍v史。例如，狗可能為已知父母的小狗，可能知道其父母關(guān)于銅積累的歷史?；蛘撸房赡転樽呤У幕虮痪仍墓?，具有未知出身和歷史。通過(guò)本發(fā)明的任意方法檢測(cè)的狗可為任意品種。本發(fā)明提供了測(cè)定混種或雜交狗，或雜種或遠(yuǎn)交狗的基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性的方法。當(dāng)方法用于測(cè)定狗基因組是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性時(shí)，狗可為疑為對(duì)肝銅積累敏感的狗。這可能是例如因?yàn)楣肪哂幸阎獙?duì)肝銅積累敏感的品種的遺傳品種特征。因此，優(yōu)選地，待檢測(cè)的狗為具有已知對(duì)肝銅積累敏感的品種的遺傳品種特征的狗。更優(yōu)選地，待檢測(cè)的狗具有選自拉布拉多尋回犬、杜賓犬、德國(guó)牧羊犬、荷蘭獅毛犬、可卡犬、西部高地白梗、貝靈頓梗和斯凱梗的品種的遺傳特征。狗可為混種或雜交狗，或雜種或遠(yuǎn)交狗。狗基因組可具有至少25%、至少50%或至少100%遺傳自任意純種或更優(yōu)選地遺傳自選自拉布拉多尋回犬、杜賓犬、德國(guó)牧羊犬、荷蘭獅毛犬、可卡犬、西部高地白梗、貝靈頓梗和斯凱梗的任意品種。狗可為純種的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，待檢測(cè)狗的一個(gè)或雙方父母為純種狗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)祖父母為純種狗。待檢測(cè)狗的1、2、3或所有4個(gè)祖父母可為純種狗。優(yōu)選地，在測(cè)定狗基因組是否包含指示肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性的方法中，狗具有拉布拉多尋回犬的遺傳品種特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬?；蛘?，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一個(gè)或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗的 1、2、3或4個(gè)祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至少 75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來(lái)源于拉布拉多尋回犬品種。當(dāng)方法用于測(cè)定狗基因組是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性時(shí)，狗可為疑為受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，狗具有拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬(Golden Retriever)或迷你貴賓犬(Miniature Poodle)的遺傳品種特征。狗可為混種或雜交狗，或雜種或遠(yuǎn)交狗。狗基因組可具有至少25%、至少50%或至少 100%遺傳自任意純種或更優(yōu)選地遺傳自選自拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬的任意品種。狗可為純種的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，待檢測(cè)狗的一個(gè)或雙方父母為純種狗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)祖父母為純種狗。待檢測(cè)狗的1、2、3或所有4個(gè)祖父母可為純種狗。優(yōu)選地，在測(cè)定狗基因組是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性的方法中，狗具有拉布拉多尋回犬的遺傳品種特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬。或者，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一個(gè)或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗的1、2、3或4個(gè)祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來(lái)源于拉布拉多尋回犬品種。通過(guò)評(píng)估遺傳標(biāo)記物(例如SNP或微衛(wèi)星)的等位基因頻率可測(cè)定狗的遺傳品種背景。在狗中不同SNP或微衛(wèi)星的等位基因頻率的組合提供了允許測(cè)定狗品種或產(chǎn)生混種狗的品種的識(shí)別標(biāo)志。這樣的遺傳檢測(cè)可為市售的檢測(cè)?；蛘撸恍枰獧z測(cè)狗的特定品種遺傳特征，因?yàn)槔绻分魅嘶颢F醫(yī)懷疑其具有特定品種特征。這可能是由于例如知道狗的祖先或由于其外觀。
本發(fā)明的預(yù)測(cè)檢測(cè)可與一種或多種其它預(yù)測(cè)或診斷檢測(cè)(例如測(cè)定狗的遺傳品種背景/特征或?qū)σ环N或多種其它疾病的易感性)共同實(shí)施。多態(tài)性的檢測(cè)
根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性的檢測(cè)可包括將來(lái)自狗的樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)與針對(duì)多態(tài)性的特異性結(jié)合試劑接觸并測(cè)定所述試劑是否結(jié)合所述多核苷酸或蛋白質(zhì)，其中試劑的結(jié)合指示多態(tài)性的存在，而不出現(xiàn)試劑的結(jié)合指示多態(tài)性的缺乏。所述方法通常在來(lái)自狗的樣品中體外實(shí)施，其中樣品包含來(lái)自狗的DNA。樣品通常包含狗的體液和/或細(xì)胞，例如使用拭子(例如口腔拭子)可獲得。樣品可為血液、尿、唾液、 皮膚、臉頰細(xì)胞或發(fā)根樣品。通常在實(shí)施方法前處理樣品，例如可進(jìn)行DNA提取。樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)可被物理或化學(xué)切割，例如使用合適的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在檢測(cè)多態(tài)性以前樣品中的多核苷酸部分被拷貝或擴(kuò)增，例如通過(guò)克隆或使用基于PCR的方法。在本發(fā)明中，任意一種或多種方法可包括測(cè)定一種或多種多態(tài)性在狗中的存在或缺乏。通常通過(guò)直接測(cè)定狗的多核苷酸或蛋白質(zhì)中多態(tài)序列的存在檢測(cè)多態(tài)性。這樣的多核苷酸通常為基因組DNA、mRNA或cDNA。可通過(guò)任意合適的方法(例如下面提及的那些)檢測(cè)多態(tài)性。特異性結(jié)合試劑是優(yōu)先或以高親和力與具有多態(tài)性的蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合但不與或僅以低親和力與其它多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑。特異性結(jié)合試劑可為探針或引物。探針可為蛋白質(zhì)(例如抗體)或寡核苷酸。探針可被間接標(biāo)記或能夠被間接標(biāo)記。探針與多核苷酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合可用于固定探針或多核苷酸或蛋白質(zhì)。通常在方法中，可通過(guò)測(cè)定試劑與狗的多態(tài)多核苷酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合檢測(cè)多態(tài)性。然而在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑也能夠結(jié)合對(duì)應(yīng)的野生型序列，例如結(jié)合在變異位置兩側(cè)的核苷酸或氨基酸，然而可以檢測(cè)到與野生型序列的結(jié)合和與含有多態(tài)性的多核苷酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合的方式不同。方法可基于寡核苷酸連接測(cè)定，其中使用2種寡核苷酸探針。這些探針結(jié)合至含有多態(tài)性的多核苷酸的相鄰區(qū)域，在結(jié)合后允許2種探針通過(guò)合適的連接酶連接在一起。 然而在一種探針中的單個(gè)錯(cuò)配的存在將破壞結(jié)合和連接。因此僅在含有多態(tài)性的多核苷酸中出現(xiàn)連接的探針，因此連接產(chǎn)物的檢測(cè)可用于測(cè)定多態(tài)性的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針用于基于異源雙鏈體分析的系統(tǒng)。在所述系統(tǒng)中當(dāng)探針與含有多態(tài)性的多核苷酸序列結(jié)合時(shí)，其在存在多態(tài)性的位點(diǎn)形成異源雙鏈體，因此不形成雙鏈結(jié)構(gòu)。這樣的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)可通過(guò)使用單鏈或雙鏈特異酶檢測(cè)。探針通常為RNA 探針，使用RNA酶H切割異源雙鏈體，通過(guò)檢測(cè)切割產(chǎn)物檢測(cè)多態(tài)性。所述方法可基于熒光化學(xué)切割錯(cuò)配分析，其在例如PCR Methods and Applications 3， 268—71 (1994) and Proc. Natl. Acad. Sci. 85， 4397—4401 (1998) 中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中使用PCR引物，只有當(dāng)其與含有多態(tài)性的多核苷酸結(jié)合時(shí)引發(fā) PCR反應(yīng)，例如序列特異性PCR系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物可測(cè)定多態(tài)性的存在。優(yōu)選地與多態(tài)性互補(bǔ)的引物區(qū)域在引物的3’端或靠近引物的3’端。使用基于熒光染料和猝滅劑的 PCR測(cè)定例如Taqman PCR檢測(cè)系統(tǒng)可測(cè)定多態(tài)性的存在。特異性結(jié)合試劑可能能夠特異性結(jié)合由多態(tài)序列編碼的氨基酸序列。例如，試劑可為抗體或抗體片段。檢測(cè)方法可基于ELISA系統(tǒng)。方法可為基于RFLP的系統(tǒng)。如果多核苷酸中的多態(tài)性的存在產(chǎn)生或破壞了被限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)，則可使用此系統(tǒng)?？苫诙鄳B(tài)性的存在導(dǎo)致多核苷酸或蛋白質(zhì)在凝膠電泳中遷移率的改變測(cè)定多態(tài)性的存在。在多核苷酸的情況下，可使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)或變性梯度凝膠電泳 (DDGE)分析。在另一個(gè)檢測(cè)多態(tài)性的方法中，對(duì)含有多態(tài)區(qū)域的多核苷酸在含有多態(tài)性的區(qū)域測(cè)序以測(cè)定多態(tài)性的存在?？赏ㄟ^(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET )檢測(cè)多態(tài)性的存在。具體來(lái)說(shuō)，可通過(guò)雙雜交探針系統(tǒng)檢測(cè)多態(tài)性。此方法包括使用2種彼此位置接近且與靶目的多核苷酸的內(nèi)部區(qū)段互補(bǔ)的寡核苷酸探針，其中2種探針?lè)謩e用熒光團(tuán)標(biāo)記。任意合適的熒光標(biāo)記物或染料可用作熒光團(tuán)，使一種探針(供體)上的熒光團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)與第二種探針(接受體)上的熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)部分重疊。通常的供體熒光團(tuán)為熒光素(FAM)，通常的接受體熒光團(tuán)包括德克薩斯紅、羅丹明、LC-640、LC-705和青色素5 (Cy5)。為了使熒光共振能量轉(zhuǎn)移能夠發(fā)生，2種探針與靶雜交后2種熒光團(tuán)需要相距很近。當(dāng)供體熒光團(tuán)被合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，發(fā)射譜能量被轉(zhuǎn)移至接受體探針上的熒光團(tuán)，得到其熒光。因此，在合適波長(zhǎng)下激發(fā)供體熒光團(tuán)時(shí)檢測(cè)此波長(zhǎng)的光指示雜交和2種探針上熒光團(tuán)的緊密聯(lián)系?？稍谝欢擞脽晒鈭F(tuán)標(biāo)記每種探針，使位于上游(5’)的探針在其3’端被標(biāo)記，位于下游(3’)的探針在其5’端被標(biāo)記。當(dāng)與靶序列結(jié)合時(shí)2種探針之間的間隔可為1至20個(gè)核苷酸，優(yōu)選1至17個(gè)核苷酸，更優(yōu)選1至10個(gè)核苷酸，例如1、2、4、6、8或 10個(gè)核苷酸的間隔?？蓪?種探針中的第一種設(shè)計(jì)為與多態(tài)性相鄰基因的保守序列結(jié)合，將第二種探針設(shè)計(jì)為與包括一種或多種多態(tài)性的區(qū)域結(jié)合。在第二種探針靶向的基因序列中的多態(tài)性可通過(guò)測(cè)量由產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配導(dǎo)致的解鏈溫度的改變而檢測(cè)。解鏈溫度改變的程度將取決于核苷酸多態(tài)性涉及的數(shù)目和堿基類(lèi)型。使用引物延伸技術(shù)也可進(jìn)行多態(tài)性分型。在此技術(shù)中，多態(tài)性位點(diǎn)周?chē)陌袇^(qū)域被拷貝或擴(kuò)增，例如通過(guò)使用PCR。之后進(jìn)行單堿基測(cè)序反應(yīng)，其使用在遠(yuǎn)離多態(tài)性位點(diǎn)一個(gè)堿基的位置退火的引物(等位基因特異性核苷酸并入)。然后檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物以測(cè)定在多態(tài)位點(diǎn)存在的核苷酸。有幾種方法可檢測(cè)延伸產(chǎn)物。例如在一種檢測(cè)方法中，使用熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸終止子在多態(tài)位點(diǎn)處終止延伸反應(yīng)?；蛘?，使用質(zhì)量修飾的雙脫氧核苷酸終止子，并使用質(zhì)譜檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物。通過(guò)特異性標(biāo)記一種或多種終止子，可推斷出延伸的引物的序列和因此推斷出在多態(tài)位點(diǎn)存在的核苷酸。每次反應(yīng)可分析多于一種反應(yīng)產(chǎn)物，因此如果特異性標(biāo)記多于一種的終止子，可測(cè)定在2條同源染色體上存在的核苷酸。本發(fā)明還提供了可用于檢測(cè)本文定義的任意SNP的引物或探針以用于預(yù)測(cè)對(duì)銅積累的易感性。本發(fā)明的多核苷酸還可作為引物用于引物延伸反應(yīng)以檢測(cè)本文定義的SNP。這些引物、探針和其它多核苷酸片段的長(zhǎng)度優(yōu)選地可為至少10個(gè)，優(yōu)選地至少15 或至少20個(gè)，例如至少25個(gè)，至少30個(gè)或至少40個(gè)核苷酸。它們的長(zhǎng)度通常多達(dá)40、50、 60、70、100或150個(gè)核苷酸。探針和片段的長(zhǎng)度可超過(guò)150個(gè)核苷酸，例如多達(dá)200、300、 400、500、600、700個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，或甚至比本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸序列短至幾個(gè)核苷酸， 例如5或10個(gè)氨基酸。
可使用本領(lǐng)域已知的任意合適的設(shè)計(jì)軟件使用表III和IV中的SNP序列設(shè)計(jì)對(duì)本發(fā)明的SNP進(jìn)行基因分型的引物和探針。這些多核苷酸序列的同源物也適于設(shè)計(jì)引物和探針。這些同源物通常具有至少70%的同源性，優(yōu)選至少80、90%、95%、97%或99%的同源性，例如覆蓋至少15、20、30、100或更多連續(xù)核苷酸的區(qū)域?？苫诤塑账嵬恍?有時(shí)被稱(chēng)為“硬同源性(hard homology)")計(jì)算同源性。例如UWGCG軟件包提供了可用于計(jì)算同源性的BESTFIT程序(例如在其默認(rèn)設(shè)置上使用XDevereux 藥Λ (1984) Nucleic Acids ResearchYl, p387_395)?？墒褂?PILEUP 和BLAST算法可用于計(jì)算同源性或排列序列(例如鑒定等同或?qū)?yīng)序列(通常使用其默認(rèn)設(shè)置)，例如在 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F ^A (1990) J Mol Biol 215:403-10 中所描述的。進(jìn)行BLAST分析的軟件在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(http://www. ncbi.nlm.nih. gov/)可公開(kāi)地獲得。此算法涉及通過(guò)鑒定當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字串比對(duì)時(shí)匹配或滿(mǎn)足一定正值閾值得分T的查詢(xún)序列中的長(zhǎng)度為W的短字串而首先鑒定高得分序列對(duì) (HSP)。T被稱(chēng)為鄰近字串得分閾值(Altschul #U，見(jiàn)上文)。這些最初的相鄰字串擊中作為種子用于起始檢索以尋找含有它們的HSP。字串擊中在每條序列的2個(gè)方向上延伸，只要可增加累積的比對(duì)得分。當(dāng)累積比對(duì)得分從其最大獲得值下降X的量；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的累積，累積得分到達(dá)O或更低；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)，在各自方向上的字串擊中延伸終止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對(duì)的敏感度和速度。BLAST程序使用 11 的字串長(zhǎng)度(W)、BL0SUM62 得分矩陣(見(jiàn) Henikoff 和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915_10919)、50 的比對(duì)(B)、10 的期望(Ε)、M=5、N=4 和 2 條鏈的比較作為默認(rèn)設(shè)置。BLAST算法對(duì)2條序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；見(jiàn)例如Kar 1 in and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787。BLAST 算法提供的一種相似性的測(cè)量為最小和概率(P(N))，其提供了 2條多核苷酸序列間會(huì)偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果第一條序列與第二條序列的比較的最小和概率低于約1，優(yōu)選地低于約 0. 1，更優(yōu)選地低于約0. 01，和最優(yōu)選地低于約0. 001，則認(rèn)為一條序列與另一條序列相似。同源序列通常具有至少1、2、5、10、20或更多個(gè)突變的差異，其可為核苷酸的取代、缺失或插入。本發(fā)明的多核苷酸例如引物或探針可以分離的或基本上純化的形式存在。它們可與不干擾其預(yù)期用途的載體或稀釋劑混合并仍被視為是基本上分離的。它們也可為基本上純化的形式，在這種情況下它們將通常包含至少90%，例如至少95%、98%或99%的制品的多核苷酸。檢測(cè)抗體
檢測(cè)抗體為一種抗體，其特異針對(duì)一種多態(tài)性但不與如本文描述的任意其它多態(tài)性結(jié)合。檢測(cè)抗體在例如涉及免疫沉淀技術(shù)的純化、分離或篩選方法中有用?？贵w可針對(duì)本發(fā)明多肽的特定表位產(chǎn)生。當(dāng)抗體或其它化合物與其特異性針對(duì)的蛋白質(zhì)優(yōu)先或高親和力結(jié)合但與其它多肽基本上不結(jié)合或僅以低親和力結(jié)合時(shí)，抗體或其它化合物“特異性結(jié)合”多肽。多種測(cè)定抗體的特異性結(jié)合能力的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或免疫放射測(cè)定法的實(shí)驗(yàn)方案是本領(lǐng)域所熟知的(見(jiàn)例如Maddox ，J. Exp. Med.1211-1226，1993)。這些免疫測(cè)定通常涉及特定蛋白質(zhì)和其抗體間的復(fù)合物的形成以及復(fù)合物形成的測(cè)量。用于本發(fā)明的目的，除非另外規(guī)定，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括結(jié)合本發(fā)明多肽的片段。這些片段包括Fv，F(xiàn)(ab’)和？(油’)2片段，以及單鏈抗體。此外，抗體和其片段可為嵌合抗體、CDR-移植的抗體或人源化抗體?？贵w可用于在生物樣品中(例如任意本文提及的這些樣品)檢測(cè)本發(fā)明多肽的方法，所述方法包括
I提供本發(fā)明的抗體；
II將生物樣品與所述抗體在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下孵育；和 III測(cè)定包含所述抗體的抗體-抗原復(fù)合物是否形成。本發(fā)明的抗體可通過(guò)任意合適方法產(chǎn)生。制備和表征抗體的方法是本領(lǐng)域所熟知的，見(jiàn)例如Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual”， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY。例如，可通過(guò)在宿主動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)完整多肽或其片段(例如其抗原表位，下文中的“免疫原”)的抗體而產(chǎn)生抗體。片段可為本文提及的任意片段(通常至少10或至少15個(gè)氨基酸長(zhǎng))。產(chǎn)生多克隆抗體的方法包括用免疫原免疫合適的宿主動(dòng)物，例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并從動(dòng)物的血清中分離免疫球蛋白。因此，可用免疫原接種動(dòng)物，之后從動(dòng)物中取出血液并純化 IgG部分。產(chǎn)生單克隆抗體的方法包括永生化產(chǎn)生期望抗體的細(xì)胞。通過(guò)融合接種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞(Kohler and Milstein (1975) Nature!^, 495-497)?？赏ㄟ^(guò)傳統(tǒng)程序選擇產(chǎn)生期望抗體的永生細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞可經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)或經(jīng)腹腔注射以形成腹水或注射至同種異體宿主或免疫系統(tǒng)受損的宿主的血流中。人抗體可通過(guò)人淋巴細(xì)胞的體外免疫和之后使用埃-巴二氏病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞制備。為產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體二者，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合適地為山羊、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、 雞、綿羊或馬。如果需要，免疫原可以偶聯(lián)物的形式施用，其中免疫原(例如通過(guò)氨基酸殘基之一的側(cè)鏈)與合適的載體偶聯(lián)。載體分子通常為生理上可接受的載體。得到的抗體可為分離的和純化的(如果需要)。檢測(cè)試劑盒
本發(fā)明也提供試劑盒，其包含對(duì)本文定義的一種或多種多態(tài)性分型的裝置。具體來(lái)說(shuō)， 這些裝置可包括特定的結(jié)合劑、探針、引物、引物對(duì)或引物組合、或如本文定義的抗體(包括抗體片段)，其能夠檢測(cè)或輔助檢測(cè)本文定義的多態(tài)性。引物或引物對(duì)或引物組合可為序列特異性引物，其只引起包含如本文討論的待檢測(cè)的多態(tài)性的多核苷酸序列的PCR擴(kuò)增?？蛇x地，引物或引物對(duì)可能不特異針對(duì)多態(tài)核苷酸，而可能特異針對(duì)上游(5’ )區(qū)和/或下游 (3’)區(qū)。這些引物允許包含多態(tài)核苷酸的區(qū)域被拷貝。適用于引物延伸技術(shù)的試劑盒可特別地包括標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)。它們可為例如熒光標(biāo)記的或質(zhì)量修飾的從而能夠檢測(cè)延伸產(chǎn)物和因此測(cè)定在多態(tài)位置存在的核苷酸。試劑盒還可包含特異性結(jié)合試劑、探針、引物、引物對(duì)或引物組合或能夠檢測(cè)多態(tài)性缺乏的抗體。所述試劑盒還可包含緩沖液或水溶液。試劑盒可另外地包含一種或多種其它能夠?qū)嵤┥鲜龇椒ǖ娜我鈱?shí)施方案的試劑或設(shè)備。這些試劑或設(shè)備可包括一種或多種以下試劑或設(shè)備檢測(cè)試劑與多態(tài)性結(jié)合的裝置，可檢測(cè)的標(biāo)記物例如熒光標(biāo)記物，能夠作用于多核苷酸的酶，通常為聚合酶，限制性酶， 連接酶，RNA酶H或可將標(biāo)記物連接至多核苷酸的酶，用于酶試劑的合適緩沖液(一種或多種)或水溶液，與本文討論的多態(tài)性?xún)蓚?cè)的區(qū)域結(jié)合的PCR引物，陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照，凝膠電泳設(shè)備，從樣品中分離DNA的方式，從個(gè)體中取得樣品的方式，例如拭子或包含針的設(shè)備，或包含孔的支持物，在上面可進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。試劑盒可為或包含陣列例如多核苷酸陣列，其包含本發(fā)明的特異性結(jié)合試劑，優(yōu)選探針。試劑盒通常包含一套使用試劑盒的說(shuō)明書(shū)。生物信息學(xué)
多態(tài)性序列可以電子格式儲(chǔ)存，例如在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫(kù)中。由此，本發(fā)明提供了數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性和它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息。本發(fā)明還提供了數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性和它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息。數(shù)據(jù)庫(kù)可包括有關(guān)多態(tài)性的其它信息，例如多態(tài)性與對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系的程度。本文描述的數(shù)據(jù)庫(kù)可用于測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。這樣的測(cè)定可通過(guò)電子方式實(shí)施，例如通過(guò)使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(例如PC)。通常地，測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性將通過(guò)下述進(jìn)行將來(lái)自狗的遺傳數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；比較遺傳數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性和它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；基于此比較測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。然后此信息可用于指導(dǎo)狗的肝銅水平的管理。通常地，測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性將通過(guò)下述進(jìn)行將來(lái)自狗的遺傳數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；比較遺傳數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包含與SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性和它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息；基于此比較測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。本發(fā)明還提供了計(jì)算機(jī)程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，其包含進(jìn)行所有本發(fā)明方法的所有步驟的程序編碼方式。還提供了包含在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上儲(chǔ)存的程序編碼方式的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。另外提供了包含在載波上的程序編碼方式的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，當(dāng)在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)其命令計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明的方法。如圖4中所示，本發(fā)明還提供了被設(shè)置以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的設(shè)備。設(shè)備通常包含計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，例如PC。在一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包含裝置20，用于接收來(lái)自狗的遺傳數(shù)據(jù)；模塊30，用于比較數(shù)據(jù)和包含多態(tài)性相關(guān)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)10 ；和裝置40，用于基于所述比較測(cè)定狗基因組是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。育種工具
定義育種值為個(gè)體作為親本的值，其通常在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用于改善牲畜(life-stock)的期望性狀。為了改善狗的總體銅操縱能力和降低銅相關(guān)疾病例如慢性肝炎的發(fā)生率，選擇受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗用于育種是有利的。此問(wèn)題通過(guò)使用可用于測(cè)定狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性為育種提供資料而解決。例如，親本在ATP7a基因座的基因型可影響2只狗的后代的銅操縱能力。在此基因座的特定變體的轉(zhuǎn)移對(duì)后代將是有益的。通過(guò)測(cè)定在此基因座的基因型，有可能評(píng)估預(yù)期親本的育種值并因此作出特定育種對(duì)是否合適的決定。由此，本發(fā)明提供了選擇用于產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法， 其包括通過(guò)本發(fā)明的方法在候選第一只狗中測(cè)定狗的基因組中是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性；由此測(cè)定候選第一只狗是否適于產(chǎn)生免于肝銅積累的保護(hù)的后代。所述方法可還包括通過(guò)本發(fā)明的方法在第二只與第一只狗性別相反的狗中測(cè)定狗的基因組中是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。如果結(jié)果是第一只和 /或第二只狗具有指示免于肝銅積累的保護(hù)的基因型，之后可將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。例如，方法可包括測(cè)定選自SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性的一種或多種多態(tài)性在候選第一只狗的基因組中的存在或缺乏。更優(yōu)選地，所述方法可包括測(cè)定ATP7a_Reg3_F_6 SNP (SEQ ID NO: 142)的存在或缺乏。本發(fā)明的方法可包括測(cè)定ATP7a_Reg3_F_6 SNP (SEQ ID NO: 142)的T等位基因的存在或缺乏。仍更優(yōu)選地，所述方法可包括測(cè)定狗對(duì)ATP7a SNP的T等位基因是純合的(在雌性狗的情況下)或半合的(在雄性狗的情況下)。所述SNP的存在指示第一只狗受到免于肝銅積累的保護(hù)，因此是與第二只狗交配的良好候選者。優(yōu)選地，第一只和第二只狗對(duì)所述 SNP的T等位基因?yàn)榧兒匣虬牒系?。在第一只?或第二只狗中的純合性是最優(yōu)選的，因?yàn)檫@增加了后代是純合的和因此受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性。候選第一只狗和/或第二只狗可為任意品種。優(yōu)選地，候選第一只狗和/或第二只狗具有選自拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬的品種的遺傳品種特征。更優(yōu)選地，候選第一只狗和/或第二只狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬?？蛇x地，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗的1、2、3或4個(gè)祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少 75%可來(lái)源于拉布拉多尋回犬品種。本發(fā)明還提供了通過(guò)使用本發(fā)明的指示對(duì)銅積累的易感性的多態(tài)性而選擇用于產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法。在狗基因組中缺乏這些多態(tài)性指示所述狗是用于交配的良好候選者。所述方法包括通過(guò)本發(fā)明的方法在候選第一只狗中測(cè)定狗的基因組中是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性；由此測(cè)定候選第一只狗是否適于產(chǎn)生免于肝銅積累的保護(hù)的后代。所述方法可還包括通過(guò)本發(fā)明的方法在第二只與第一只狗性別相反的狗中測(cè)定狗的基因組中是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。如果結(jié)果是第一只和/或第二只狗的基因組中沒(méi)有指示對(duì)肝銅積累的易感性的基因型，之后可將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生對(duì)肝銅積累不敏感的后代。方法可包括測(cè)定選自表III、IV和V中鑒定的SNP的一種或多種多態(tài)性和與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性在候選第一只狗的基因組中的存在或缺乏。一種或多種這些多態(tài)性的存在指示第一只狗對(duì)肝銅積累敏感，因此不是與第二只狗交配以產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的好候選者。候選第一只狗和/或第二只狗可為任意品種。優(yōu)選地，候選第一只狗和/或第二只狗具有選自拉布拉多尋回犬、杜賓犬、德國(guó)牧羊犬、荷蘭獅毛犬、可卡犬、西部高地白梗、 貝靈頓梗和斯凱梗的品種的遺傳品種特征。更優(yōu)選地，候選第一只狗和/或第二只狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬?？蛇x地，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗的1、2、3或4 個(gè)祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來(lái)源于拉布拉多尋回犬品種。通過(guò)評(píng)估遺傳標(biāo)記物(例如SNP或微衛(wèi)星)的等位基因頻率可測(cè)定狗的遺傳品種背景。在狗中不同SNP或微衛(wèi)星的等位基因頻率的組合提供了允許測(cè)定狗品種或產(chǎn)生混種狗的品種的識(shí)別標(biāo)志。這樣的遺傳檢測(cè)可為市售的檢測(cè)?；蛘?，不需要檢測(cè)狗的特定品種遺傳特征，因?yàn)槔绻分魅嘶颢F醫(yī)懷疑其具有特定品種遺傳特征。這可能是由于例如知道狗的祖先或由于其外觀。通過(guò)“封閉的(closed)血統(tǒng)證書(shū)”控制由所有品種的俱樂(lè)部登記驗(yàn)證的大多數(shù)品種純種狗。血統(tǒng)證書(shū)通常是由例如品種協(xié)會(huì)或養(yǎng)犬俱樂(lè)部保存的被認(rèn)可的特定品種狗的官方登記。如果只有其父母均為登記的情況下狗才可加入的話(huà)，通常稱(chēng)為“封閉的”血統(tǒng)證書(shū)。大多數(shù)品種具有封閉的血統(tǒng)證書(shū)，這導(dǎo)致近交，因?yàn)椴荒軓默F(xiàn)有種群以外引入遺傳多樣性。在多個(gè)由養(yǎng)犬俱樂(lè)部認(rèn)可的品種中這已導(dǎo)致遺傳疾病或病的高發(fā)率和其它問(wèn)題例如降低的產(chǎn)仔數(shù)，降低的壽命和不能自然懷孕。為了避免與近交相關(guān)的問(wèn)題，在特定品種中選擇彼此關(guān)系較遠(yuǎn)的狗比起關(guān)系較近的狗進(jìn)行育種是有利的。因此在本發(fā)明的一個(gè)方面，測(cè)定候選第一只狗和候選第二只狗的遺傳品種特征以測(cè)定2只狗的相關(guān)度。在本發(fā)明的此方面，術(shù)語(yǔ)“遺傳品種特征”涉及在特定品種中狗的遺傳祖先。可通過(guò)本文描述的方法測(cè)定狗的遺傳品種特征。通過(guò)測(cè)定狗的遺傳特征，有可能在單一品種中辨別2只狗以測(cè)定它們的關(guān)系有多近。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面測(cè)定候選第一只狗和候選第二只狗的相關(guān)度，其包括比較候選第一只狗和相同品種的候選第二只狗的遺傳品種特征。優(yōu)選地，所述狗為純種狗。 每只狗的遺傳品種特征可通過(guò)例如鑒定在所述狗中的一種或多種品種特異多態(tài)性的存在或缺乏而測(cè)定。可通過(guò)狗共有的品種特異性多態(tài)性的數(shù)目測(cè)定狗的相關(guān)度。例如，相同品種的2 只狗可共有從0至100%的檢測(cè)的品種特異多態(tài)性，例如從10至90%，從20至80%，從30至 70% 或從 40 至 60%。因此，2 只狗可共有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 90% 檢測(cè)的品種特異多態(tài)性?？墒褂?只狗共有的檢測(cè)的品種特異多態(tài)性的比例作為相關(guān)度的衡量。在本發(fā)明的此方面，只有當(dāng)2只狗在遺傳上足夠地不相關(guān)時(shí)才可將其交配在一起。例如，只有當(dāng)它們共有的檢測(cè)的品種特異多態(tài)性低于60%、50%、40%、30%或低于20%時(shí)才可將其交配在一起。
本發(fā)明還提供了選擇用于與受試狗育種的一只或多只狗的方法，所述方法包括
(a)測(cè)定在受試狗和與受試狗性別相反的2只或多只狗組成的實(shí)驗(yàn)組中的每只狗的基因組中是否包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性； 和
(b)從實(shí)驗(yàn)組中選擇1只或多只狗用于與受試狗育種。實(shí)驗(yàn)組可由至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、75、100或200只不同的狗組成，例如從2至100，從5至70或從10至50只狗。通?；谑艿矫庥诟毋~積累的保護(hù)從實(shí)驗(yàn)組中選擇狗。從實(shí)驗(yàn)組中選擇的一只或多只狗可與受試狗具有相同或相似的遺傳品種特征。受試狗和實(shí)驗(yàn)組中的每只狗可為任意品種。優(yōu)選地，受試狗和/或?qū)嶒?yàn)組中的每只狗具有選自拉布拉多尋回犬、杜賓犬、德國(guó)牧羊犬、荷蘭獅毛犬、可卡犬、西部高地白梗、 貝靈頓梗、斯凱梗、金毛尋回犬或迷你貴賓犬的品種的遺傳品種特征。更優(yōu)選地，狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳品種特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬?？蛇x地，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗的1、2、3或4 個(gè)祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來(lái)源于拉布拉多尋回犬品種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，選擇基于對(duì)肝銅積累的易感性或免于肝銅積累的保護(hù)的相關(guān)多態(tài)性的存在或缺乏的、實(shí)驗(yàn)組中最可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗與受試狗育種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇實(shí)驗(yàn)組中可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的幾只狗與受試狗育種。例如，可選擇實(shí)驗(yàn)組中的至少2、3、4、5、10、15或20只狗。可基于其它因素例如地理位置、年齡、育種狀態(tài)、病史、疾病易感性或身體特征從選擇的狗的組中進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。如上面解釋的，交配相同品種中遺傳最不相關(guān)的狗是理想的。這是為了提高或維持品種中的遺傳多樣性和降低在子代中發(fā)生近交相關(guān)問(wèn)題的可能性。因此，從實(shí)驗(yàn)組中進(jìn)一步選擇狗可基于狗與受試狗的遺傳相關(guān)性。由此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法可進(jìn)一步包括
(a)比較受試狗的遺傳品種特征和與受試狗品種相同且性別相反的2只或多只狗組成的實(shí)驗(yàn)組中的每只狗的遺傳品種特征；
(b)根據(jù)受試者和實(shí)驗(yàn)組中每只狗的相關(guān)度的比較測(cè)定；和
(c)從實(shí)驗(yàn)組中選擇用于與受試狗育種的1只或多只狗。可基于其與受試狗(即待育種的狗)的相關(guān)性從實(shí)驗(yàn)組中選擇狗。優(yōu)選地，從實(shí)驗(yàn)組中選擇的一只或多只狗是在狗實(shí)驗(yàn)組中相關(guān)性最遠(yuǎn)的(即具有最低的相關(guān)度)。受試狗和實(shí)驗(yàn)組中的狗的遺傳品種特征可為已知的或可通過(guò)例如市售的品種檢測(cè)法測(cè)定。本發(fā)明因此提供了推薦用于與受試狗育種的1只或多只合適的狗的方法。所述推薦可對(duì)受試狗的主人或照顧者、獸醫(yī)、狗育種家、養(yǎng)犬俱樂(lè)部或品種登記進(jìn)行。本發(fā)明還涉及育種狗的方法，其中測(cè)定性別相反的至少2只狗對(duì)肝銅積累的易感性或受到免于肝銅積累的保護(hù)，任選地在相同的品種中，在它們?cè)谝黄鹩N以前測(cè)定。可以電子格式存儲(chǔ)狗對(duì)肝銅積累的易感性或受到免于肝銅積累的保護(hù)，例如在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫(kù)中。由此，本發(fā)明提供了包含涉及1只或多只狗對(duì)肝銅積累的易感性或受到免于肝銅積累的保護(hù)和性別的信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。所述數(shù)據(jù)庫(kù)可包括有關(guān)狗的進(jìn)一步信息，例如狗的遺傳品種特征、育種狀態(tài)、年齡、地理位置、病史、疾病易感性或身體特征。數(shù)據(jù)庫(kù)通
26常還包含每只狗的唯一標(biāo)識(shí)符，例如狗的登記名。數(shù)據(jù)庫(kù)可通過(guò)遠(yuǎn)程訪問(wèn)，例如使用互聯(lián)網(wǎng)。本發(fā)明的食品
本發(fā)明涉及用于具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗的食品。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在商業(yè)飲食中發(fā)現(xiàn)的銅水平與拉布拉多尋回犬中的肝銅積累相關(guān)，降低飲食中的銅水平令人驚訝地使肝銅水平回到正常水平，比藥物青霉胺更有效。本發(fā)明的食品具有低銅濃度，具體地低于21 mg/kg干物質(zhì)的銅濃度。食品被用于預(yù)防在拉布拉多尋回犬的肝中的銅積累。因此其對(duì)預(yù)防由肝銅積累引起的疾病或病癥有用。因此，本發(fā)明的食品可提供給狗，其中所述狗的基因組已通過(guò)本發(fā)明的方法被測(cè)定為包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。 本文中使用的術(shù)語(yǔ)“食品”包含食品、飲食、食物或補(bǔ)充劑。這些形式中的任一種可為固體、 半固體或液體。更具體地，本發(fā)明的食品包含低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅。優(yōu)選地，銅濃度低于20，低于17，低于15，低于12或低于10mg/kg干物質(zhì)。優(yōu)選地，銅濃度為至少4. 5，至少 4. 75，至少5或至少8mg/kg干物質(zhì)。通常地，銅濃度在4. 5至21 mg/kg, 5至17 mg/kg或 10至15 mg/kg干物質(zhì)的范圍內(nèi)。銅可以任意生理上可接受的形式存在于食品中。因此可以任意生理上可接受的鹽例如硫酸銅提供銅。食品可進(jìn)一步包含至少120 mg/kg干物質(zhì)濃度的鋅。優(yōu)選地，鋅濃度為至少150， 至少180或至少200 mg/kg干物質(zhì)。優(yōu)選地，鋅濃度不超過(guò)食物監(jiān)管機(jī)構(gòu)允許的最大值。 鋅濃度通常低于250，低于M0，低于230或低于220 mg/kg干物質(zhì)。鋅濃度通常在120至 250，150至250或200至250 mg/kg干物質(zhì)的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，食品中的鋅量超過(guò)銅量。應(yīng)當(dāng)理解，狗吸收的食品中的鋅和/或銅的有效濃度受到不可消化物質(zhì)的存在或缺乏的影響。優(yōu)選地，食品中的鋅與銅的比例為5或更多， 例如6、7、8、9、10或更多，按食品的質(zhì)量計(jì)算?？稍诒景l(fā)明的提供銅水平的相同食品中提供鋅。可選地，可以補(bǔ)充劑的形式提供鋅，所述補(bǔ)充劑可加入本發(fā)明的食品。補(bǔ)充劑可為片劑、粉末或液體制劑的形式。鋅可以任意生理上可接受的形式存在于食品中或作為補(bǔ)充劑提供。因此鋅可為任意生理上可接受的鹽，例如醋酸鋅、硫酸鋅、葡萄糖酸鋅、碳酸鋅、氯化鋅或氧化鋅。本文中描述的食品中的銅或鋅濃度是以干物質(zhì)計(jì)，即以不含水的食品計(jì)，從而能夠直接比較可能具有不同含水量的不同食品。為測(cè)量在濕的或半濕的食品中的銅或鋅濃度，首先干燥食品樣品，例如使用烤箱以去除水。之后，可使用任意合適的技術(shù)測(cè)量干燥食品樣品中的銅或鋅濃度。這些技術(shù)的一個(gè)實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的火焰原子吸收光譜法。本發(fā)明的食品可為例如濕寵物食品、半濕寵物食品或干寵物食品的形式。濕寵物食品通常具有高于以重量計(jì)65%的含水量。半濕寵物食品通常具有以重量計(jì)20-65%之間的含水量并可包含保濕劑和其它配料以防止微生物生長(zhǎng)。干寵物食品(又稱(chēng)粗磨粉)通常具有低于以重量計(jì)20%的含水量，其加工過(guò)程通常包括擠壓、干燥和/或高溫烘焙。食品可以濕和干食物的混合物提供。這樣的組合物可預(yù)先混合提供，或以2種或多種單獨(dú)的食品提供，其單獨(dú)、同時(shí)或相繼提供給狗。食品包含任意狗在其飲食中消耗的產(chǎn)品。本發(fā)明包含標(biāo)準(zhǔn)食物產(chǎn)品和寵物食品點(diǎn)心。優(yōu)選地，食品為煮熟的食品。其可包括肉或動(dòng)物來(lái)源的材料(例如牛肉、雞肉、火雞肉、羊肉、魚(yú)肉等等)?？蛇x地，產(chǎn)品可為不含肉的(優(yōu)選地包含肉替代物例如大豆、玉米蛋白或大豆產(chǎn)品以提供蛋白質(zhì)來(lái)源)。產(chǎn)物可還包含淀粉來(lái)源，例如一種或多種谷物(例如玉米、大米、燕麥、大麥等等)，或可為不含淀粉的。干寵物食品的配料可選自谷類(lèi)、谷物、肉、家禽、脂肪、維生素和礦物質(zhì)。配料通常為混合的并經(jīng)擠壓機(jī)/炊具處理。然后產(chǎn)品通常經(jīng)定型和干燥，干燥后，可在干的產(chǎn)品上涂或噴灑調(diào)料和脂肪。所有寵物食品都需要提供一定水平的營(yíng)養(yǎng)素。例如，美國(guó)飼料品管協(xié)會(huì) (Association of American Feed Control Officials) (AAFCO)和寵物食品協(xié)會(huì)(Pet Food hstitute)已基于通常使用的配料建立了狗食品的營(yíng)養(yǎng)素組成(profile)。這些建立的組成被稱(chēng)為“AAFC0狗食品營(yíng)養(yǎng)素組成”。在這些監(jiān)管下，狗食品必須被配制為包含達(dá)到AAFCO 測(cè)定的所有最低水平和不超過(guò)AAFCO測(cè)定的最高水平濃度的營(yíng)養(yǎng)素。狗食品制劑可根據(jù)狗的熱量、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、纖維、維生素或礦物質(zhì)需求定制。例如，狗食品制劑可定制為提供準(zhǔn)確量或比例的必需脂肪酸例如ω-6和ω-3脂肪酸。ω-6脂肪酸的主要來(lái)源為植物，例如向日葵、大豆油、紅花和月見(jiàn)草油，而ω-3脂肪酸主要在亞麻籽和海產(chǎn)來(lái)源中發(fā)現(xiàn)。銅含量高的和可在食品生產(chǎn)中避免的食物配料包括貝類(lèi)、肝、腎、心、肉、堅(jiān)果、蘑菇、谷類(lèi)、可可、豆科植物和軟水(銅管道)。富含鋅和可在制劑中包括的食物配料包括奶、明膠、蛋黃、大米和馬鈴薯。食品優(yōu)選為包裝的。包裝材料可為金屬(通常以錫或flexifoil的形式)、塑料(通常以小袋或瓶子的形式)、紙或卡片。在任意產(chǎn)品中的含水量可影響可使用的或需要的包裝的種類(lèi)。本發(fā)明的食品可與鋅來(lái)源一起包裝。鋅可以任意形式提供。鋅可在一種或多種食品中提供，或以單獨(dú)的補(bǔ)充劑的形式與包含本發(fā)明的最高水平的銅的食品一起包裝。當(dāng)在食品中提供鋅時(shí)，可在包含本發(fā)明的特定水平的銅的相同食品中提供鋅，或可在一種或多種單獨(dú)的食品中提供鋅，或二者都提供鋅。本發(fā)明因此提供了包含具有低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食品和鋅補(bǔ)充劑的包裝。當(dāng)加入食品中時(shí)，鋅補(bǔ)充劑提供至少120mg/kg干物質(zhì)的濃度。食品和鋅補(bǔ)充劑用于同時(shí)、單獨(dú)或相繼使用以在具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。本發(fā)明還提供如本文討論的帶標(biāo)簽的食品。標(biāo)簽可例如指示所述食品適用于拉布拉多尋回犬品種的狗。可提供其它指示或說(shuō)明。例如，可陳述除了其它配料以外，飲食或食品包含的銅和/或鋅的量。此外，可提供喂食說(shuō)明。拉布拉多尋回犬
本發(fā)明的食品適用于在具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗中預(yù)防肝銅積累。狗通常為伴侶狗或?qū)櫸?。狗可為純種拉布拉多尋回犬。狗可為純種拉布拉多尋回犬?？蛇x地， 狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗的1、2、3或4個(gè)祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來(lái)源于拉布拉多尋回犬品種。通過(guò)評(píng)估遺傳標(biāo)記物(例如SNP或微衛(wèi)星)的等位基因頻率可測(cè)定狗的遺傳品種背景。在狗中不同SNP或微衛(wèi)星的等位基因頻率的組合提供了允許測(cè)定狗品種或產(chǎn)生混種狗的品種的識(shí)別標(biāo)志。這樣的遺傳檢測(cè)可為市售的檢測(cè)。或者，可不需要檢測(cè)狗的拉布拉多尋回犬品種特征，因?yàn)槔绻分魅嘶颢F醫(yī)懷疑其具有拉布拉多尋回犬品種特征。這可能是由于例如知道狗的祖先或由于其外觀。食品適用于任意年齡的狗。食品可適用于具有從0至12歲大，例如從1至5歲大， 從2至7歲大或從3至9歲大的年齡的狗。食品通常適用于健康的狗。其適用于沒(méi)有可檢測(cè)出的肝銅積累的狗。食品計(jì)劃用于預(yù)防用途，即預(yù)防在狗肝中的銅積累。食品旨在使狗的銅積累風(fēng)險(xiǎn)最小從而降低狗產(chǎn)生由肝銅積累導(dǎo)致的疾病或病癥例如慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭的可能性。食品通常用于在沒(méi)有異常肝銅濃度和因此不太可能具有患銅相關(guān)肝炎的風(fēng)險(xiǎn)的狗中預(yù)防銅積累。狗也可不具有積累銅的歷史。因此狗優(yōu)選地具有正常水平的在低于約400 mg/kg干肝重范圍內(nèi)的肝銅。然而，在新生的狗中，肝銅的正常水平可被認(rèn)為是低于約600 mg/kg干肝重。為狗提供食品的目的是預(yù)防肝銅濃度達(dá)到顯著高于正常水平的水平。可用于測(cè)定狗肝中的銅濃度的方法是本領(lǐng)域熟知的。在實(shí)施例4中描述了一個(gè)合適的方法。食品可用于預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎。食品優(yōu)選地用于在沒(méi)有可檢測(cè)出的肝疾病的狗中預(yù)防銅積累，目的是預(yù)防這些肝疾病。食品也可用于治療由肝銅積累導(dǎo)致的疾病或病癥，例如慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭。肝疾病的證據(jù)或癥狀包括臨床指征例如嗜睡、腹瀉和黃疸。肝疾病的生化指征包括異常提高的血清膽紅素和血清肝酶活性例如堿性磷酸酶 (ALP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。這些肝疾病指征的生化測(cè)量是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選地，食品計(jì)劃用于的狗沒(méi)有任何臨床問(wèn)題。食品的制造
可通過(guò)將合適的配料混合在一起制造本發(fā)明的食品。制造是受控的以使食品具有所需要的銅濃度?？稍谑称飞a(chǎn)過(guò)程中監(jiān)控銅濃度。本發(fā)明因此提供了制造本發(fā)明的食品的方法，其包括將用于食品的配料混合在一起以使食品具有低于21 mg/kg干物質(zhì)的銅濃度。 待摻入食品的一種或多種成分可提供銅來(lái)源。然而避免使用可能富含銅的成分是重要的。 富含銅的和在食品生產(chǎn)中可能避免的食品配料包括貝類(lèi)、肝、腎、心、肉、堅(jiān)果、蘑菇、谷類(lèi)、 可可、豆科植物和軟水(銅管道)。任選地，一種或多種成分將提供用于本發(fā)明的食品的鋅來(lái)源。富含鋅的和在制劑中可能包括的食品配料包括奶、明膠、蛋黃、大米和馬鈴薯?？稍谑称返闹圃?加工過(guò)程中的任意時(shí)間加入成分/配料。測(cè)量在食品中存在的銅濃度以確定濃度低于根據(jù)本發(fā)明的限度是重要的。也可測(cè)量鋅濃度以檢查其高于根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的最低水平。在食品制造方法的一個(gè)步驟中可包括測(cè)量食品樣品中的銅濃度。在已制備好食品后對(duì)食品樣品至少進(jìn)行一次銅濃度的測(cè)量。 也可在食品的制備過(guò)程中進(jìn)行測(cè)量以監(jiān)控由于更多配料的加入而積累的銅和/或鋅的水平。例如，在加入一種或多種配料后可對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任意合適方法例如火焰原子吸收光譜法對(duì)樣品進(jìn)行銅、鋅和其它元素的測(cè)量。本發(fā)明的制造食品的方法通常包括以下步驟將配料混合在一起并任選地烹調(diào)任意原配料；在食品樣品中測(cè)量銅濃度和任選地測(cè)量鋅濃度；和包裝食品。制造食品的方法可進(jìn)一步包括將食品提供給狗主人、負(fù)責(zé)喂養(yǎng)狗的人或獸醫(yī)和/或?qū)⑹称诽峁┙o狗。雖然食品不含有任何銅是罕見(jiàn)的，可將銅作為補(bǔ)充劑加入食品以獲得在狗飲食中的銅的最低每日需求(例如美國(guó)飼料品管協(xié)會(huì)(AAFCO)推薦的)同時(shí)將銅濃度仍保持在低于本發(fā)明所需的量。本發(fā)明因此也提供了銅在制造用于具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗的食品中的用途，其中所述食品包含低于21 mg/kg濃度的銅并用于預(yù)防在所述狗中的銅積累。銅可以任意合適的形式加入食品。銅補(bǔ)充劑的實(shí)例包括氯化銅和五水合硫酸銅。 在本發(fā)明中使用的制造食物產(chǎn)品的設(shè)備通常包含一種或多種以下組成部分用于干寵物食品配料的容器；用于液體的容器；混合器；成型機(jī)頭和/或擠壓機(jī)；切斷裝置；烹飪裝置(例如烤箱)；冷卻器；包裝裝置；和貼標(biāo)簽裝置。干配料容器通常在底部具有開(kāi)口。此開(kāi)口可被體積調(diào)節(jié)元件例如回轉(zhuǎn)式塞(rotary lock)覆蓋。體積調(diào)節(jié)元件可根據(jù)電子制造指令開(kāi)和關(guān)以調(diào)節(jié)干配料加入寵物食品。在制造寵物食品中通常使用的干配料包括玉米、小麥、肉和/或家禽肉。在制造寵物食品中通常使用的液體配料包括脂肪、動(dòng)物脂和水。液體容器可含有可控的泵，例如通過(guò)電子制造指令在寵物食品中加入測(cè)量過(guò)的量的液體。在一個(gè)實(shí)施方案中，干配料容器(一個(gè)或多個(gè))和液體容器(一個(gè)或多個(gè))與混合器連接并傳遞特定量的干配料和液體至混合器。混合器可受電子制造指令控制。例如，可控制混合的持續(xù)時(shí)間或速度。之后通常將混合的配料傳遞至成型機(jī)頭或擠壓機(jī)。成型機(jī)頭/擠壓機(jī)可為本領(lǐng)域已知的可用于將混合的配料成型為需要的形狀的任意成型機(jī)頭或擠壓機(jī)。 通常混合的配料在壓力下強(qiáng)制通過(guò)受限的開(kāi)口以形成連續(xù)的帶(strand)。當(dāng)帶被擠壓后， 可通過(guò)切斷裝置例如刀將其切成小塊(粗磨粉)。通常對(duì)粗磨粉進(jìn)行烹飪，例如在烤箱中。 可通過(guò)電子制造指令控制烹飪的時(shí)間和溫度。烹飪的時(shí)間可以變化以產(chǎn)生食品的預(yù)期含水量。之后可將烹飪后的粗磨粉轉(zhuǎn)移至冷卻器，例如含有一個(gè)或多個(gè)風(fēng)扇的室。寵物食品制造設(shè)備可包含包裝設(shè)備。包裝設(shè)備通常將寵物食品包裝進(jìn)例如塑料或紙袋或盒的容器。設(shè)備可還包含在寵物食品上貼標(biāo)簽的裝置，通常在已包裝好食品之后。標(biāo)簽可指示食品適用的狗的種類(lèi)(即拉布拉多尋回犬)和/或食品的配料。食品的用途
本發(fā)明的食品可用于預(yù)防狗的肝銅積累。因此，其可用于預(yù)防與高肝銅相關(guān)的疾病或病癥，例如銅相關(guān)慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭。由此，本發(fā)明提供了在具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗中預(yù)防肝銅積累和由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法，其包括對(duì)狗喂食本文中描述的食品。本發(fā)明還提供了在具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗中預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎的方法，其包括對(duì)狗提供本發(fā)明的食品。本發(fā)明的食品通常用于在拉布拉多尋回犬中預(yù)防銅積累的預(yù)防用途。其也通常用于在拉布拉多尋回犬中預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎。本發(fā)明的食品優(yōu)選地用于預(yù)防狗的肝銅積累，通過(guò)本文描述的遺傳檢測(cè)已測(cè)定所述狗的基因組中包含一種或多種指示對(duì)肝銅積累的易感性的多態(tài)性。本發(fā)明的食品的用途可包括對(duì)狗提供鋅來(lái)源。如本文中描述的，可以任意合適的形式將鋅提供給狗。包含低水平的本發(fā)明的銅的食品可進(jìn)一步包含鋅，例如以至少120 mg/ kg干物質(zhì)的濃度。可選地，可以一種或多種單獨(dú)的食品或補(bǔ)充劑的形式提供鋅。本發(fā)明的食品的用途可包括對(duì)狗提供鋅補(bǔ)充劑?？稍谌我鈺r(shí)間提供鋅補(bǔ)充劑，即與本發(fā)明的食品單獨(dú)、同時(shí)或相繼提供。鋅補(bǔ)充劑可在例如將其提供給狗之前與本發(fā)明的食品混合，或可將其置于狗的飲用水中。本發(fā)明的食品可每天一次或多次提供給狗。優(yōu)選地，提供食品代替狗的傳統(tǒng)食品?？稍跓o(wú)限期的時(shí)間內(nèi)(即在狗的一生中)使用預(yù)防銅積累或預(yù)防慢性肝炎的方法。
通過(guò)以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明 實(shí)施例1
與對(duì)銅積累的易感性相關(guān)的SNP的說(shuō)明
對(duì)120只拉布拉多犬的DNA樣品在超過(guò)22000個(gè)SNP上進(jìn)行基因分型。72個(gè)狗樣品來(lái)自高銅狗(高于600 mg/kg的肝銅水平)，48個(gè)狗樣品來(lái)自正常肝銅水平(低于400 mg/kg)。 使用成對(duì)比較在每對(duì)可能的狗之間分析數(shù)據(jù)。根據(jù)疾病信息基因座的支持整理數(shù)據(jù)。使用最佳的3個(gè)基因組位置的數(shù)據(jù)使用布爾算子尋找與高銅水平相聯(lián)系的最佳匹配標(biāo)記。使用 3個(gè)位置的簡(jiǎn)單布爾模型的結(jié)果顯示如下
表1使用基因組位置CFA8、CFA32和CFAX的簡(jiǎn)單布爾模型的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的在G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性和/或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括檢測(cè)至少一種多態(tài)性(a)和至少一種多態(tài)性(b)的存在或缺乏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其包括檢測(cè)選自下述的一種或多種SNP的存在或缺乏 BICF2P506595 (SEQ ID N0:1), BICF2P772765 (SEQ ID NO:2), BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3)， BICF2P1324008 (SEQ ID NO:4)， BICF2P591872 (SEQ ID NO:5)， ATP7a_Reg4_F_9 (SEQ ID NO: 131)，UBL5_ReglF_16 (SEQ ID NO: 132)，golga5_Regl_24 (SEQ ID NO: 133)， golga5_26 (SEQ ID NO: 134)， golga5_27 (SEQ ID NO: 135)， golga5_28 (SEQ ID NO: 136)， golga5_29 (SEQ ID NO: 137)， golga5_30 (SEQ ID NO: 138)， golga5_31 (SEQ ID NO: 139)，atp7aregl7_32 (SEQ ID NO: 140)，atp7aregl7_33 (SEQ ID NO: 141)和與其處于連鎖不平衡的一種或多種SNP。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其包括檢測(cè)SNPBICF2P506595 (SEQ ID NO: 1)、 BICF2P772765 (SEQ ID NO:2)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3)、BICF2P1324008 (SEQ ID NO:4)和 BICF2P591872 (SEQ ID NO:5)的存在或缺乏。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。
7.數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息。
8.一種測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括(a)將與狗基因組中存在或缺乏如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；(b)將所述數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)比較，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；和(c)基于所述比較測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性。
9.一種計(jì)算機(jī)程序，其包含這樣的程序編碼方式，即當(dāng)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行時(shí)，所述程序編碼方式命令計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行權(quán)利要求8的所有步驟。
10.一種計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)介質(zhì)，其包含根據(jù)權(quán)利要求9的計(jì)算機(jī)程序和根據(jù)權(quán)利要求7的數(shù)據(jù)庫(kù)。
11.一種被設(shè)置以進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求8的方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含(a)接收與狗基因組中存在或缺乏如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)的裝置；(b)數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗對(duì)肝銅積累的易感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；(c)用于將所述數(shù)據(jù)與所述數(shù)據(jù)庫(kù)比較的模塊；和(d)基于所述比較測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的裝置。
12.—種檢測(cè)狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括在樣品中檢測(cè)狗基因組中(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的在G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性和/或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏。
13.(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的在狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性和 /或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性在測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性中的用途。
14.一種選擇用于產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法，其包括-根據(jù)權(quán)利要求1至6、8和12中任一項(xiàng)的方法測(cè)定候選的第一只狗的基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累的易感性的一種或多種多態(tài)性和由此測(cè)定候選的第一只狗是否適合產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代；-任選地，根據(jù)權(quán)利要求1至6、8和12中任一項(xiàng)的方法測(cè)定與第一只狗性別相反的第二只狗的基因組中是否包含指示對(duì)肝銅積累易感性的一種或多種多態(tài)性；和-任選地，將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。
16.一種包含低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食品，其用于在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病，其中所述狗通過(guò)權(quán)利要求1至6、8和12中任一項(xiàng)的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的食品，其包含低于17mg/kg干物質(zhì)濃度或低于12 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的食品，其進(jìn)一步包含至少120mg/kg干物質(zhì)濃度的鋅。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的食品，其用于在至少一個(gè)親本是純種拉布拉多尋回犬的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)的食品，其用于在沒(méi)有與肝銅積累相關(guān)的臨床癥狀的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)的食品，其用于在具有低于400mg/kg干肝重的肝銅濃度的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
22.根據(jù)權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)的食品，其用于沒(méi)有可檢測(cè)到的肝疾病的狗。
23.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)的食品，其用于預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎。
24.一種在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法，其中所述狗通過(guò)權(quán)利要求1至6、8和12中任一項(xiàng)的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感， 所述方法包括對(duì)狗喂食如權(quán)利要求16至23中任一項(xiàng)定義的食品。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)狗喂食包含至少120mg/kg濃度的鋅的食品或補(bǔ)充劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或25的方法，其用于在具有低于400mg/kg干肝重的肝銅濃度和 /或沒(méi)有可檢測(cè)到的肝疾病的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
27.銅在制造食品中的用途，所述食品用于具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗，其中所述狗通過(guò)權(quán)利要求1至6、8和12中任一項(xiàng)的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感，其中所述食品包含低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅并用于預(yù)防在所述狗中由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
28.一種包含具有低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食物和提供至少120mg/kg干物質(zhì)濃度的鋅補(bǔ)充劑的套裝，所述食物和鋅補(bǔ)充劑用于同時(shí)、分別或相繼使用以在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病，所述狗通過(guò)權(quán)利要求1至6、8 和12中任一項(xiàng)的方法已被測(cè)定為對(duì)肝銅積累敏感。
29.帶標(biāo)簽的根據(jù)權(quán)利要求16至23中任一項(xiàng)的食品或帶標(biāo)簽的根據(jù)權(quán)利要求觀的套裝。
30.一種測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142) 和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其包括檢測(cè)多態(tài)性(a)和至少一種多態(tài)性(b)的存在或缺乏。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其包括檢測(cè)SNPATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)的存在或缺乏。
33.權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)的方法，其中所述狗具有拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬品種的遺傳特征。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。
35.數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與SNPATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息。
36.一種測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，所述方法包括(a)將與狗基因組中存在或缺乏如權(quán)利要求30定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；(b)將所述數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)比較，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包含與SNPATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息；和(c)基于所述比較測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性。
37.一種計(jì)算機(jī)程序，其包含這樣的程序編碼方式，即當(dāng)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行時(shí)，所述程序編碼方式命令計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行權(quán)利要求36的所有步驟。
38.一種計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)介質(zhì)，其包含根據(jù)權(quán)利要求37的計(jì)算機(jī)程序和根據(jù)權(quán)利要求35的數(shù)據(jù)庫(kù)。
39.一種被設(shè)置以進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求36的方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含(a)接收與狗基因組中存在或缺乏如權(quán)利要求30定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)的裝置；(b)數(shù)據(jù)庫(kù)，其包含與SNPATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 14 和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息；(c)用于將所述數(shù)據(jù)與所述數(shù)據(jù)庫(kù)比較的模塊；和(d)基于所述比較測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的裝置。
40.檢測(cè)狗以測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括在樣品中檢測(cè)狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。
41.(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和 / 或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性在測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性中的用途。
42.一種選擇狗以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的方法，其包括-根據(jù)權(quán)利要求30至34、36和40中任一項(xiàng)的方法測(cè)定候選的第一只狗的基因組中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性，和由此測(cè)定候選的第一只狗是否適合產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代；-任選地，根據(jù)權(quán)利要求30至34、36和40中任一項(xiàng)的方法測(cè)定與第一只狗性別相反的第二只狗的基因組中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性；和 -任選地，將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述狗具有拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬品種的遺傳特征。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。
全文摘要
本發(fā)明提供了測(cè)定狗對(duì)肝銅積累的易感性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)(a)指示對(duì)肝銅積累的易感性的在GOLGA5、ATP7a或UBL5基因中的多態(tài)性和/或(b)與所述多態(tài)性(a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏。本發(fā)明還提供了測(cè)定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括在狗基因組中檢測(cè)選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏(a)SNPATP7a_Reg3_F_6(SEQIDNO:142)和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。
文檔編號(hào)A23K3/00GK102232116SQ200980148119
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2009年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月3日
發(fā)明者A·J·馬丁, P·G·瓊斯 申請(qǐng)人:瑪爾斯有限公司