本發(fā)明涉及一種新的肝臟枯否氏(Kuppfer)細(xì)胞吞噬納米藥物粒子抑制劑組合物及其在納米藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大多數(shù)納米遞藥系統(tǒng)(Nano-scale Drug Delivery System,NDDS)進(jìn)入體內(nèi)后，在實(shí)現(xiàn)藥效、減少毒副作用的同時(shí)，體內(nèi)單核吞噬系統(tǒng)(Mononuclear Phagocyte System，MPS)主要包括肝臟枯否氏細(xì)胞(Kupffer Cell,KC)和脾臟的巨細(xì)胞等會(huì)引起大量納米粒子在非靶組織尤其是肝臟和脾臟蓄積(參考文獻(xiàn)[1-2])，既大大減少了藥物在靶組織的分布，也極可能引起相應(yīng)臟器毒性，限制了靶向藥物載體的應(yīng)用。如何減少載藥納米粒子被肝臟等單核吞噬系統(tǒng)清除，實(shí)現(xiàn)納米粒子在靶組織更有效地分布是納米遞藥系統(tǒng)研究中亟待解決的關(guān)鍵問題之一(參考文獻(xiàn)[3-4])。這對(duì)于提高靶向納米藥物生物利用度、增強(qiáng)藥物對(duì)病變部位的靶向性，進(jìn)而提高療效和降低毒副作用具有重要意義。

納米粒子被免疫細(xì)胞識(shí)別并吞噬，嚴(yán)重影響其有效性和毒性，雖然目前還不十分清楚機(jī)體對(duì)納米粒子免疫識(shí)別以及在生物溶酶中穩(wěn)定的機(jī)制，但對(duì)其識(shí)別機(jī)制的認(rèn)識(shí)將成為納米粒子設(shè)計(jì)的重要部分(參考文獻(xiàn)[5])。設(shè)計(jì)非球形的載體材料是一種十分有潛力的逃逸MPS的方法(參考文獻(xiàn)[6])。周志敏助理研究員先后報(bào)道了聚乳酸(PLA)非球形藥物(表阿霉素)載體(參考文獻(xiàn)[7])和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)纖維狀和棒狀非球形微粒(參考文獻(xiàn)[8])，以期設(shè)計(jì)出更有利于逃逸MPS的載體。

影響納米粒子被內(nèi)吞的因素還有納米粒子尺寸以及表面理化特征如電荷、親疏水性和表面功能基團(tuán)等(參考文獻(xiàn)[9])。粒徑在200nm以下的納米粒子容易逃避MPS的識(shí)別，粒徑減小，MPS的吞噬作用減弱；表面電荷也可影響MPS的攝取，表面電荷絕對(duì)值減小，其吞噬也減少；將材料中連接具有親水性的物質(zhì)如 聚乙二醇(PEG)(參考文獻(xiàn)[10])等，能提高疏水性物質(zhì)的溶解性，將特異性吸附減到最少，很大程度上減少M(fèi)PS吞噬，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，并且提高腫瘤特異性靶向作用。

另外，從免疫細(xì)胞吞噬機(jī)制角度通過合理調(diào)控細(xì)胞行為無疑對(duì)于解決NDDS的MPS問題也具有十分重要的意義。越來越多的研究者正在關(guān)注納米遞藥系統(tǒng)與吞噬系統(tǒng)的相互作用(參考文獻(xiàn)[11-12])，納米粒子的吞噬途徑、被攝取過程的數(shù)學(xué)模型及相關(guān)參數(shù)均正逐漸被認(rèn)識(shí)和建立(參考文獻(xiàn)[13])。納米粒子的攝取主要通過內(nèi)吞(endocytosis)途徑進(jìn)行，內(nèi)吞是一類受到精密調(diào)控的復(fù)雜過程，其入胞機(jī)制目前尚無一致結(jié)論。納米粒子的尺寸、形狀、電荷、所組成的材料以及表面的修飾基團(tuán)等均影響納米粒子進(jìn)入吞噬細(xì)胞?？赡艿膬?nèi)吞途徑包括以下幾種：巨胞飲(macropinocytosis)、胞飲(pinocytosis)、網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞(clathrin-dependent endocytosis)、小凹蛋白依賴性內(nèi)吞(caveolin-dependent endocytosis)以及依賴肌動(dòng)蛋白的吞噬途徑(phagocytosis)等。谷婧麗等(參考文獻(xiàn)[14])研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的內(nèi)吞信號(hào)通路都參與了超順磁性鐵納米粒子(SPION)進(jìn)入RAW264.7巨噬細(xì)胞的過程，包括吞噬和吞飲的多條信號(hào)通路。Lunov課題組(參考文獻(xiàn)[13])研究表明超小順磁性氧化鐵(USPIO)和超順磁性氧化鐵(SPIO)納米粒子是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和清道夫受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入人巨細(xì)胞的。理解細(xì)胞內(nèi)吞(endocytosis)的機(jī)制和粒子進(jìn)入細(xì)胞的途徑等問題有助于預(yù)測(cè)粒子在細(xì)胞中的位置和分布，為限制吞噬細(xì)胞內(nèi)吞提供了思路，也為設(shè)計(jì)出更有效的載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

另一方面，研究表明巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒子的吞噬和炎癥細(xì)胞因子分泌具有一定關(guān)系(參考文獻(xiàn)[15])，納米粒子作為“異物”進(jìn)入機(jī)體，激活炎癥反應(yīng)途徑，引起炎癥細(xì)胞因子分泌。炎癥反應(yīng)與NF-kB信號(hào)通道激活的關(guān)系已經(jīng)得到證明(參考文獻(xiàn)[16])，NF-kB信號(hào)通道前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1均可被微生物產(chǎn)物脂蛋白LPS激活，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生，因此從NF-kB信號(hào)通道進(jìn)行調(diào)控，為納米粒子逃逸吞噬提供了可能。

多糖材料良好的生物安全性使得該類納米遞藥系統(tǒng)在藥物傳輸領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景(參考文獻(xiàn)[17])。普魯蘭多糖(pullulan)是一種水溶、中性直鏈多糖，其獨(dú)特的連接方式賦予了普魯蘭一些獨(dú)特的理化性質(zhì)，在醫(yī)藥方面受到越 來越多研究者的關(guān)注(參考文獻(xiàn)[18])。申請(qǐng)者前期工作中以普魯蘭多糖為原料，合成了乙酰普魯蘭(PA)及其葉酸偶合體(FPA)，制備了形態(tài)規(guī)則、性質(zhì)穩(wěn)定的自組裝納米粒子和載藥納米粒子，探討了載體對(duì)所包載藥物表阿霉素(EPI)的緩釋作用(參考文獻(xiàn)[19-20])，并應(yīng)用人宮頸癌Hela裸鼠動(dòng)物模型，考察了FPA載藥納米粒子(FPA/EPI)的體內(nèi)分布特征。前期研究顯示：此類納米粒子制備過程簡(jiǎn)單，方法可靠，納米粒子在水溶液中至少可以保持兩個(gè)月粒徑和表面電位未見明顯改變，具有較好的穩(wěn)定性；大鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)PA對(duì)所包載藥物EPI具有明顯的緩釋作用，并明顯改變EPI體內(nèi)分布特征，F(xiàn)PA/EPI對(duì)動(dòng)物的胃腸毒性減小，其抗腫瘤作用時(shí)間延長(zhǎng)，具有一定的腫瘤靶向作用，但由于肝臟Kupffer細(xì)胞的吞噬作用，肝臟中的EPI含量明顯高于游離藥物組(見圖1)，使之應(yīng)用受到限制。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中，同時(shí)應(yīng)用吞噬途徑抑制劑和核因子-kB(NF-kB)信號(hào)通道抑制劑使載藥納米粒子逃逸吞噬的方法尚未見報(bào)道。發(fā)明人在前期研究基礎(chǔ)上，同時(shí)應(yīng)用炎癥細(xì)胞因子和吞噬途徑抑制劑使FPA/EPI避免肝臟KC細(xì)胞吞噬，以實(shí)現(xiàn)納米粒子在體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)，增加藥效，減少毒副作用，為實(shí)現(xiàn)納米藥物逃逸免疫細(xì)胞吞噬提供科學(xué)依據(jù)，以上研究未見任何文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。

以下文獻(xiàn)部分或者整體引入本專利說明書，作為其組成部分。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的抑制肝臟枯否氏細(xì)胞吞噬納米藥物粒子的組合抑制劑，同時(shí)包括炎癥細(xì)胞因子抑制劑和吞噬途徑抑制劑。

本發(fā)明的另一目的是，提供一種肝臟枯否氏細(xì)胞吞噬納米粒子的組合抑制劑在制備相應(yīng)納米藥物粒子中的用途，所述組合抑制劑同時(shí)包括有效量的炎癥細(xì)胞因子抑制劑和吞噬途徑抑制劑。

通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的。本發(fā)明所述的新的抑制肝臟枯否氏細(xì)胞吞噬納米藥物粒子的組合抑制劑，包括炎癥細(xì)胞因子抑制劑和吞噬途徑抑制劑。具體來說：

(1)所述的吞噬途徑抑制劑是以下抑制劑中的一種或多種：巨胞飲(macropinocytosis)抑制劑如阿米洛利(Amiloride,AMR)、胞飲(pinocytosis)、網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞(clathrin-dependent endocytosis)抑制劑氯丙嗪(chlorpromazine，CPZ)、小凹蛋白依賴性內(nèi)吞(caveolin-dependent endocytosis)以及依賴肌動(dòng)蛋白的吞噬途徑(phagocytosis)抑制劑。

(2)所述的炎癥細(xì)胞因子抑制劑是以下抑制劑中的一種或多種：NF-kB信號(hào)通道特異抑制劑為四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)以及其他炎癥因子抑制劑地塞米松等。

(3)所述納米藥物粒子由以下納米粒子包載藥物：乙酰普魯蘭葉酸偶合體 納米粒子、乙酰普魯蘭納米粒子以及其他以多糖為原料合成制備的納米粒子。

本發(fā)明思維獨(dú)特，加入的各項(xiàng)試劑易得，對(duì)于實(shí)現(xiàn)納米粒子在體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)，更好地實(shí)現(xiàn)藥效，減少毒副作用具有重要的意義。

在給予納米藥物的同時(shí)，同時(shí)應(yīng)用炎癥因子抑制劑和納米粒子被肝臟細(xì)胞吞噬的吞噬途徑抑制劑，可望實(shí)現(xiàn)減少納米藥物被肝臟KC吞噬，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，更好地實(shí)現(xiàn)藥效，減少毒副作用，具有臨床應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1所示為靜脈注射5mg/kg EPI及FPA/EPI后各肝、脾、肺和腎的表阿霉素含量(n＝5,ng/g)

具體實(shí)施方式

將NF-kB信號(hào)通道特異抑制劑和吞噬途徑抑制劑同時(shí)應(yīng)用于KC攝取納米粒子，考查炎癥細(xì)胞因子的分泌情況，驗(yàn)證本發(fā)明的雙向作用抑制劑的效果。采用體外試驗(yàn)方法，細(xì)胞培養(yǎng)板包括96孔板和/或6孔板，將炎癥細(xì)胞因子抑制劑和吞噬途徑抑制劑與細(xì)胞共孵育一段時(shí)間，加入載藥納米粒子，應(yīng)用ELISA方法考察肝臟KC分泌炎癥細(xì)胞因子的情況。

[實(shí)施例1]從NF-kB信號(hào)通道和吞噬途徑同時(shí)抑制KC細(xì)胞分泌炎癥因子

根據(jù)參考文獻(xiàn)提取原代KC，培養(yǎng)細(xì)胞48h，用0.25％胰酶/EDTA消化后，調(diào)細(xì)胞密度接種于96孔板中，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞充分貼壁融合率達(dá)80％時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入抑制劑，抑制劑劑量如下：氯丙嗪(CPZ)7μg/mL，阿米洛利(AMR)50μM/mL，制霉素(NY)50μg/mL，四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)10μM/mL。37℃孵育24h，吸棄抑制劑溶液后用PBS洗3次，加入FPA/EPI納米粒子懸液(根據(jù)參考文獻(xiàn)20制備)，37℃孵育2h，各孔取上清100ul加入酶標(biāo)板，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞因子水平；破碎細(xì)胞，萃取后，熒光定量法測(cè)納米粒子吞噬EPI含量，根據(jù)OD比值(抑制百分率＝(1-ODt/ODc)×100％)判斷抑制劑的抑制吞噬作用。

由表1和表2可見，NF-kB信號(hào)通道抑制劑PDTC可顯著減少炎癥因子的分泌和納米粒子的攝取。由此說明，NF-kB信號(hào)通道抑制劑能夠有效抑制肝臟枯否 氏細(xì)胞吞噬納米藥物粒子。當(dāng)同時(shí)加入PDTC和CPZ、AMR或者NY兩種抑制劑時(shí)，細(xì)胞因子水平進(jìn)一步降低，KC吞噬FPA/EPI攝取抑制百分率進(jìn)一步增加，最高可達(dá)85.39％，顯著減少納米粒子被吞噬進(jìn)入枯否氏細(xì)胞，由此說明，同時(shí)應(yīng)用NF-kB信號(hào)通道抑制劑PTDC和吞噬途徑抑制劑氯丙嗪、阿米洛利或制霉素產(chǎn)生了協(xié)同抑制效應(yīng)。

表1NF-kB信號(hào)通道抑制劑和吞噬抑制劑對(duì)KC炎癥因子水平的影響(pg/mL，)

表2NF-kB信號(hào)通道抑制劑和吞噬抑制劑對(duì)KC吞噬FPA/EPI攝取抑制百分率的影響(％)

基金信息

北京市自然科學(xué)基金，靶向性納米遞藥系統(tǒng)FPA/EPI逃逸Kupffer細(xì)胞吞噬的作用及機(jī)制研究(7132064)