相關申請的交叉引用

根據美國法典第35部分第119(e)條，本申請要求美國臨時專利申請序列號61/583379、申請日為2012年1月5日的專利申請的優(yōu)先權，其內容通過引用整體并入這里。

技術領域

本發(fā)明涉及慢性腎臟疾病和蛋白尿的治療方法，以及慢性腎臟疾病的診斷方法，和在慢性腎臟疾病和蛋白尿進程中監(jiān)測治療效果的方法。

政府支持

本發(fā)明獲得了美國國立衛(wèi)生研究院頒布的合同號DK078226號的政府支持。政府對本發(fā)明具有一定的權利。

技術實現要素：

本發(fā)明提供治療慢性腎臟疾病和蛋白尿的新方法，以及診斷慢性腎臟疾病的新方法和在慢性腎臟疾病和蛋白尿進程中監(jiān)測治療效果的新方法，這在部分上是基于發(fā)明人發(fā)現的SLIT-ROBO信號通路在調節(jié)腎臟足細胞F-肌動蛋白細胞骨架和足突結構中新的和意想不到的作用。

因此，在一些方面，本發(fā)明提供治療有需要的受治療者的慢性腎臟疾病的方法，該方法包括將治療有效量的含有ROBO2抑制劑的組合物給予患有或具有患慢性腎臟疾病風險的受治療者。

在一些方面，本發(fā)明還提供降低有需要受治療者的蛋白尿的方法，該方法包括將治療有效量的含有ROBO2抑制劑的組合物給予患有或具有患蛋白尿風險的受治療者。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是特異性于ROBO2的封閉抗體或其抗原結合段，特異性于ROBO2的反義分子(antisense molecule)，特異性于ROBO2的短干擾RNA(siRNA)，ROBO2小分子抑制劑，ROBO2抑制性多肽，或ROBO2的結構類似物。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑封閉或降低ROBO2與SLIT、Nck、或兩者的結合。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是特異性的Ig1SLIT結合域，Ig1和Ig2S LIT結合域，Nck胞內結合域，或上述任意組合。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制性多肽是顯性失活ROBO2融合蛋白，含有ROBO2胞外域不含胞內域的多肽，或含有ROBO2胞內域不含胞外域的多肽。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，患有或具有患慢性腎臟疾病的受治療者患有糖尿病腎病和高血壓。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，該方法進一步包括將額外的治療劑給予受治療者。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，該額外治療劑為血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE)或血管緊張素II受體拮抗劑(ARB)。

在一些方面，本發(fā)明還提供方法，該方法包括：

a.分析來自受治療者的生物測試樣本以確定ROBO2多肽或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平；

b.確定生物測試樣本中ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平是否高于參考閾值水平；以及

c.對需要處理或治療慢性腎臟疾病的受治療者進行診斷。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，分析ROBO2多肽的表達水平采用特異性于ROBO2多肽的抗體或其抗原結合段進行。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，分析編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平采用PCR或雜交分析進行。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，生物測試樣本為腎臟活組織切片、尿、血液、血清樣本或來自于尿樣的顆?；毎?/p>

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高20％。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高兩個標準差。

在一些方面，本發(fā)明還提供分析方法，包括：

a.將從受治療者分離的生物測試樣本與檢測ROBO2多肽或編碼ROBO2多肽的RNA的試劑接觸；以及

b.測量ROBO2多肽的水平或編碼ROBO2多肽的RNA的水平；

其中，相對于正常生物樣本，所述ROBO2多肽或所述編碼ROBO2多肽的RNA的水平增強的，鑒定受治療者患有慢性腎臟疾病和/或處于慢性腎臟疾病或蛋白尿的進程中。

在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些具體實施方式中，檢測ROBO2多肽的表達水平采用特異性于ROBO2多肽的抗體或其抗原結合段進行。

在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些具體實施方式中，檢測編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平采用PCR或雜交分析進行。

在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些具體實施方式中，生物測試樣本為腎臟活組織切片、尿、血液、血清樣本或來自于尿樣顆?；毎?。

在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的具體實施方式中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高20％。

在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的具體實施方式中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高兩個標準差。

在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些具體實施方式中，受治療者已經被診斷為患有糖尿病或高血壓。

在一些方面，本發(fā)明提供確定受治療者是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，或確定受治療者是否患有慢性腎臟疾病的系統，該系統包括：

a.確定模塊，其配置用以確定受治療者生物樣本中ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平；

b.比較模塊，其配置用以接收通過確定模塊確定的所述ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平，并進行至少一次分析以確定ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平是否大于預先確定的參考水平，進而提供重新取回內容；以及

c.顯示模塊，其用于顯示基于來自所述比較模塊輸出數據的內容，其中，該內容包括ROBO2多肽或RNA的表達水平或比率大于預先確定的參考水平或比率的指示性信號，或ROBO2的水平或表達比率不大于參考水平或預先確定的比率的指示性信號。

在這些系統和這里描述的所有這些系統的一些具體實施方式中，顯示在顯示模塊上的內容進一步包括推薦受治療者接收具體的治療方案的指示性信號。

在一些方面，本發(fā)明提供確定受治療者是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，或確定受治療者是否患有慢性腎臟疾病的系統，該系統包括：

a.確定模塊，其配置用以接收來自受治療者的至少一個測試樣本，病對至少一個測試樣本進行至少一次分析以確定以下情況中的一種情況的存在或不存在：

i.ROBO2的表達比率大于預先確定比率，或

ii.ROBO2的表達水平大于預先確定水平；

b.存儲設備，其設置用以儲存來自所述確定模塊輸出的數據；以及

c.顯示模塊，其用于顯示基于來自所述確定模塊輸出數據的內容，其中，該內容包括ROBO2的表達比率大于預先確定比率或ROBO2的水平大于預先確定水平的指示性信號，或ROBO2的表達比率不大于預先確定比率或不大于預先確定水平的指示性信號。

在這些系統和這里描述的所有這些系統的一些具體實施方式中，在顯示模塊上顯示的內容進一步包括推薦受治療者接收具體治療方案的指示性信號。

在一些方面，本發(fā)明還提供治療具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的人類受治療者的方法，該方法包括給予處理或治療用以預防人類受治療者慢性腎臟疾病或蛋白尿的發(fā)生，這些人類受治療者被確定為ROBO2蛋白水平高于參考閾值水平。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平至少比參考水平高20％。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平至少比參考水平高兩個標準差。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，預防慢性腎臟疾病或蛋白尿發(fā)生的處理或治療包括ROBO2抑制劑。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是特異性于ROBO2的封閉抗體或其抗原結合段，特異性于ROBO2的反義分子，特異性于ROBO2的短干擾RNA(siRNA)，ROBO2小分子抑制劑，ROBO2抑制性多肽，或ROBO2結構類似物。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑封閉或降低ROBO2與SLIT、Nck、或兩者的結合。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是特異性于Ig1SLIT的結合域，Ig1和Ig2SLIT結合域，Nck胞內結合域，或上述任意組合。

在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制性多肽是顯性失活ROBO2融合蛋白，含有ROBO2胞外域不含胞內域的多肽，或含有ROBO2胞內域不含胞外域的多肽。

在一些方面，本發(fā)明還提供ROBO2抑制劑在治療慢性腎臟疾病中的應用，和ROBO2抑制劑在治療蛋白尿中應用。

在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是特異性于ROBO2的封閉抗體或其抗原結合段，特異性于ROBO2的反義分子，特異性于ROBO2的短干擾RNA(siRNA)，ROBO2小分子抑制劑，ROBO2抑制性多肽，或ROBO2結構類似物。

在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑封閉或降低ROBO2與SLIT、Nck、或兩者的結合。

在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是特異性的Ig1SLIT結合域，Ig1和Ig2SLIT結合域，Nck胞內結合域，或上述任意組合。

在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些具體實施方式中，ROBO2抑制性多肽是顯性失活ROBO2融合蛋白，含有ROBO2胞外域不含胞內域的多肽，或含有ROBO2胞內域不含胞外域的多肽。

在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些具體實施方式中，慢性腎臟疾病和蛋白尿由糖尿病腎病或高血壓引起的。

在這些方面或這里描述的所有這些方面的一些具體實施方式中，ROBO2是指人類ROBO2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，通過mRNA序列SEQ ID NO:2編碼。

定義

為了方便起見，這里收集了說明書、實施例和所附權利要求書中使用的某些術語。除非另有說明或上下文暗示，否則下述術語和短語包括下述提供的含義。除非另有明確說明或從上下文可以明確看出，否則下述術語和短語不排除其所在領域已經獲得的含義。提供這些定義是為了幫助描述具體實施方式，并不是為了限制所要求保護的發(fā)明，因為發(fā)明的范圍只由權利要求書限定。除另有定義外，這里使用的所有技術術語或科學術語具有與其所在技術領域的技術人員通常理解相同的含義。

這里使用的術語“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于涉及的組合物、方法及其各自組分，這些組分是本發(fā)明必要的，然而還開放地含有非指明的成分，無論是否必需。

這里使用的術語“基本包含……”是指給定的具體實施方式所需要的那些成分。該術語允許附加成分的存在，這些附加成分的存在對發(fā)明具體實施方式的基本的和新的或功能性的特征不會有實質性的影響。

術語“由……組成(consisting of)”是指這里描述的組合物、方法及其各自組分，其中不包括未記載在說明書具體實施方式中的任何組分。

在說明書和所附權利要求書中，使用的單數形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括復數形式，除非上下文明確規(guī)定。因此，例如，“該方法”是指包括一種或多種方法，和/或這里描述的該類型的多個步驟和/或在閱讀公開內容等后對本領域技術人員是顯而易見的方法。

除了操作實施例中的或某處另有說明外，在此使用的表達材料成分的量或反應條件的所有數字，在任何情況下應當理解為被術語“約”修飾。當術語“約”與百分比結合使用時，可以指±10％，±5％，或±1％。

除非在此另有定義，使用的與本申請相關的科學術語和技術術語具有的含義是這些公開內容所述技術領域的普通技術人員通常理解的含義。應當理解的是，發(fā)明并不局限于在此描述的具體的方法、方案和試劑等等，而且這些可以改變。在此采用的術語的目的僅是為了描述具體實施方式，而不是為了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只由權利要求書限定。免疫學和分子生物學中普通術語的定義可在下列文獻中找到：默克研究實驗室2006年出版的《默克診療手冊(第18版)》(ISBN 0-911910-18-2)(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,18th Edition,published by Merck Research Laboratories,2006(ISBN 0-911910-18-2))；Robert S.Porter等(編寫)、布萊克韋爾科學有限公司1994年出版的《分子生物學百科全書》(ISBN 0-632-02182-9)(Robert S.Porter et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9))；和Robert A.Meyers(編寫)、VCH出版公司1995年出版的《分子生物學與生物技術：綜合性案頭參考》(ISBN 1-56081-569-8)(Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8))；愛思唯爾2006年出版、Werner Luttmann編著的《免疫學》(Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006)。分子生物學中普通術語的定義可在下列文獻中找到：Benjamin Lewin，瓊斯&巴特利特出版社2007年出版的《基因IX》(ISBN-13:9780763740634)(Benjamin Lewin,Genes IX,published by Jones&Bartlett Publishing,2007(ISBN-13:9780763740634))；Kendrew等(編寫)，布萊克韋爾科學有限公司1994年出版的《分子生物學百科全書》(ISBN 0-632-02182-9)(Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9))；和Robert A.Meyers(編寫)，馬尼亞蒂斯等，《分子克?。簩嶒炛改稀罚淙蹖嶒炇页霭嫔?，冷泉港，紐約，美國(1982)(Robert A.Meyers(ed.),Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982))；Sambrook等，《分子克?。簩嶒炛改?第2版)》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，美國(1989)(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989))；Davis等，《分子生物學的基本方法》，愛思唯爾科學出版公司，紐約，美國(1986)(Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986))；或《酶學方法：分子克隆技術指南》第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmerl編寫，學術出版公司，圣地亞哥，美國(1987)(Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152,S.L.Berger and A.R.Kimmerl Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987))；《現代分子生物學實驗技術(CPMB)》(Fred M.Ausubel等主編，John Wiley和Sons出版公司)(Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel,et al.ed.,John Wiley and Sons,Inc.))，《現代蛋白科學實驗技術(CPPS)》(John E.Coligan等主編，John Wiley和Sons出版公司)(Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan,et.al.,ed.,John Wiley and Sons,Inc.))，和《現代免疫學實驗技術(CPI)》((John E.Coligan等主編，John Wiley和Sons出版公司)(Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,et.al.,ed.John Wiley and Sons,Inc.))，在此通過整體引用將其全部并入本文。

應當理解的是，下面的詳細描述和下述實施例只是示例性的，并不被認為限制本發(fā)明的范圍。對本領域普通技術人員顯而易見的公開的具體實施方式的各種變化和改進，可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內做出。進一步地，出于描述和公開的目的，在此通過引用明確并入了所有專利、專利申請和經鑒定的出版物，例如，這些出版物中描述的可能與本發(fā)明結合使用。這些出版物被單獨提供，因為它們在本申請的申請日之前公開。在這方面，沒有什么應該可解釋為對發(fā)明人無權憑借在先發(fā)明或任何其它原因而先于這些公開的承認。關于日期的所有聲明或關于這些文件內容的陳述是基于申請人可獲得的信息，不構成關于日期和這些文件內容正確性的任何承認。

附圖說明

圖1A-1R顯示了ROBO2表達和定位于足細胞的基底細胞表面。在(圖1A-1Q)：中所有免疫染色于600X放大倍率下在小鼠E16.5天進行(如圖5A-5M顯示的成年小鼠腎小球免疫染色)。(圖1A-1C)：ROBO2與足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin共定位。(圖1D-1F)ROBO2與足細胞裂孔隔膜蛋白podocin共定位。(圖1G-1I)：ROBO2與腎小球中銜接蛋白Nck共定位。(圖1J-1L)：ROBO2表達在與腎小球基底膜巢蛋白(nidogen)相鄰的基底足細胞表面。(圖1M-1O)：ROBO2不與腎小球內皮細胞蛋白標志物血小板內皮細胞粘附分子1(Pecam1)共定位。(圖1P)：(圖1L)中框出的擴大區(qū)域表示ROBO2主要表達在與腎小球基底膜標記物巢蛋白(nidogen)相鄰的足細胞(P)的基底細胞表面(箭頭)。ROBO2在足細胞的頂端和側面的細胞表面(箭頭)弱表達。(圖1Q)：ROBO2主要表達在足細胞(P)基底細胞表面(箭頭)，在頂端和側面的細胞表面(箭頭)弱表達。(圖1R)：免疫膠體金電子顯微鏡顯示在3周齡小鼠足細胞的足突(FP)中的金色部分(gold partials)(箭頭)與ROBO2抗體共軛的位置。GBM：腎小球基底膜。放大倍率50,000X。也參見于圖5A-5M。

圖2A-2J顯示了ROBO2與銜接蛋白Nck相互作用，且與腎臟蛋白形成復合物。(圖2A)：酵母雙雜交分析表明ROBO2胞內域(ROBO2-ICD)和Nck1之間有正的相互作用.LacZ報告子(reporter)(X-gal)：+++，酵母轉暗；++，轉亮；-，在24小時內呈白色。Leu報告子(-Leu)：+，酵母長成；-，酵母未生長。CC，細胞質保守區(qū)。數字表示全長蛋白中的殘基位置。(圖2B)：酵母雙雜交分析表明Nck1的前兩個SH3域對于其與ROBO2-ICD相互作用是必需的。(圖2C)：酵母雙雜交分析顯示了介導ROBO2和Nck1相互作用的潛在結合域。該序列是ROBO2中Nck1的潛在結合域。富含脯氨酸的區(qū)域突出顯示。(圖2D)：ROBO2和Nck的共沉淀。從his-myc-ROBO2轉染的細胞(在通道1和通道2用)中收集通道5的細胞溶解物；從his-myc-ROBO2-ΔNBD轉染細胞(在通道3和通道4用)中收集通道6的細胞溶解物。(圖2E)：ROBO2、Nck和Nephrin的共沉淀。(圖2F)：與(圖2E)相似的共沉淀，除了使用his-myc-Nephrin進行捕獲(pull down)代替his-myc-ROBO2。(圖2G)：腎臟內源性Robo2,Nck,和腎臟蛋白(Nephrin)的免疫共沉淀。(圖2H)：與(圖2G)相似的分析，除了用小鼠抗腎臟蛋白(Nephrin)抗體制備沉淀物。(I)Slit2促進了ROBO2-Nck-Nephrin復合物的形成。His-myc-ROBO2，Nephrin，和Fyn在用Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(通道1，3)或對照條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(通道2，4)刺激的HEK細胞中表達。(圖2J)：(圖2I)的強度量化(intensity quantification)。數據表示為平均值±SEM；n＝7，Student氏配對t-檢驗，與對照組成相比，*P<0.05，**P<0.01。另請參見圖6A-6F’。

圖3A-3G顯示了Slit2-ROBO2信號抑制Nephrin介導的肌動蛋白的聚合。(圖3A)：CD16/7-NCD在Hek細胞中與ROBO2共表達，其在Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(Slit)或對照條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(CTL)存在下用抗-CD16抗體和羅丹明結合的抗-IgG抗體處理。然后將細胞固定并用FITC結合的鬼筆環(huán)肽染色以顯示F-肌動蛋白。比例尺，5μm。NCD：腎臟蛋白(Nephrin)細胞質域。(圖3B)：與(圖3A)相似的分析，除了CD16/7-NCD被CD16/7-HA替換和用作對照分析。(圖3C)：每個組中，具有F-肌動蛋白尾巴的細胞占具有CD16/7簇的總細胞的百分比被定量。數據表示為平均值±SEM，*P<0.01，n＝5。(圖3D)：Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液刺激(通道1和3)或對照條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(通道2和4)后，(圖3A)中CD16/7-NCD被抗-CD16抗體免疫沉淀。注意通道1中減少的F-肌動蛋白。CD16/7-HA用作陰性對照。(圖3E)：(圖3D)的強度量化。數據表示為平均值±SEM；Student氏配對t-檢驗，與對照組相比，n＝4，*P<0.05。(圖3F)：使用抗-Nephrin抗體對來自于ROBO2敲除的純合子(ROBO2-/-)，雜合子(ROBO2+/-)，和野生型(ROBO2+/+)小鼠腎臟的Nephrin的免疫沉淀。注意通道3中增加的F-肌動蛋白。(圖3G)：(圖3F)的強度量化。數據表示為平均值±SEM；ANOVA分析，與野生型和雜合子相比，n＝4，*P<0.05。另請參見圖7A-7C。

圖4A-4W顯示了ROBO2純合缺失(homozygous null)、ROBO2足細胞特異性敲除、和ROBO2和Nphs1雙基因敲除小鼠的足細胞結構表型。(圖4A和4B)：新生兒腎臟的代表圖像顯示野生型(圖4A)和ROBO2純合缺失的小鼠(圖4B)中足細胞體(箭頭)和腎小囊(箭頭)。(圖4C和圖4D)：(圖4A和4B)的高倍率放大圖像顯示新生兒腎臟的足細胞足突(箭頭)。比例尺，1μm。(圖4E和4F)：3周的腎臟在低倍放大鏡下的代表圖像顯示與年齡匹配的對照(圖4E)相比，ROBO2純合缺失小鼠(圖4F)的足細胞細胞體(箭頭)。(圖4G和4H)：(圖4E和4F)的更高倍率圖像顯示3周的ROBO2純合缺失小鼠(圖4H)的無序的較短的曲折的足突(箭頭)，與年齡匹配的對照中有序的拉鏈般的足突(圖4G)進行對比。比例尺：2μm。(圖4I和4J)：代表性的透射電子顯微鏡圖像(放大倍率5000倍)描述一月齡ROBO2足細胞特異性基因敲除小鼠和正常表型對照組(圖4I)中的局灶節(jié)段性足細胞足突消失(focal foot process effacement)(圖4J中箭頭)。簡稱：gc：腎小球毛細血管；us：腎小囊腔。(圖4K和4L)：高倍的透射電子顯微鏡圖像(40000倍)顯示兩個月齡ROBO2足細胞特異性突變小鼠具有與對照組(圖4K)相比更廣泛的足細胞足突(圖4L中箭頭)。簡稱：fp：足細胞足突；GBM：腎小球基底膜。(圖4M)：一月齡Robo2^del5/flox、Tg^Nphs2-Cre+足細胞特異性敲除小鼠(ROBO2KO)和野生型同窩小鼠對照(WT)的足細胞足突寬度的定量。數據表示為平均值±SEM，n＝333，*P<0.01。(圖4N)：酶聯免疫吸附分析尿的斑點顯示在Robo2^del5/flox、NPHS2-Cre+(KO)成年小鼠中白蛋白/肌酐比值與對照組野生型(WT)相比升高。數據表示為平均值±SEM，n＝20，*P<0.01。(圖4O)：蛋白印跡分析表明尿液中存在白蛋白；將各孔中加入1μl尿液，用0.2μg白蛋白作陽性對照。WT，三個野生型同窩小鼠；ROBO2KO，三個獨立的Robo2del5/flox；Nphs2-Cre+小鼠。(圖4P和4Q)：掃描電子顯微鏡的代表圖像顯示破壞的趾狀突的足細胞足突，其類似于Nphs1-/-單純合新生小鼠腎臟的雜亂的細胞突起(箭頭)。比例尺：1μm。(圖4R和4S)：來自于Nphs1-/-Robo2-/-雙純合新生小鼠的腎小球顯示恢復的趾狀突的足突(箭頭)，表明通過敲除ROBO2減少Nephrin缺失表型。(圖4T和4U)：來自于ROBO2-/-單純合新生小鼠的腎小球顯示不規(guī)則的和更寬廣的足突而形成廣泛趾狀突模式(箭頭)。(圖4V和4W)：具有正常整齊趾狀突模式的足突(箭頭)的新生野生型小鼠的腎小球。還參見圖8A-8Z和表1-4。

圖5A-5M顯示ROBO2在發(fā)育中和成熟的腎小球中的表達。(圖5A和5B)：原位雜交分析顯示ROBO2轉錄物在E16.5的正在發(fā)育的腎小球(箭頭)中表達。放大倍數：60X(圖5A)和200X(圖5B)。(圖5C-5F)：免疫組織化學(IHC)研究揭示ROBO2在E14.5到E17.5的正在發(fā)育的腎小球中表達。放大倍率：600X。(圖5G)：IHC顯示ROBO2在5周齡的成年小鼠腎小球中特異性表達(圖5G)。DAPI標記腎臟的細胞核。放大倍率：400X。(圖5H)：5周齡腎臟的IHC共定位染色表明ROBO2在具有足細胞標志物WT1的腎小球中共表達。放大倍率：600X。(圖5I和5K)：ROBO2和WT1在E16.5的小鼠腎小球中共表達。(圖5L和5M)：5周齡腎臟的IHC共定位染色表明ROBO2在具有腎小球系膜細胞標記物Pdgfrb(圖5L)和內皮細胞標記物Pecam1(圖5M)的腎小球中共表達。放大倍率：600X。

圖6A-6F’顯示了ROBO2與Nck相互作用，并形成含有Nephrin的復合物，其是通過Slit2的刺激而增強。(圖6A)：ROBO2和含有內源性Nck的Nephrin的免疫共沉淀。ROBO2、Nephrin和Fyn在Hek細胞中表達，并通過Slit2刺激。內源性Nck由抗-Nck抗體免疫沉淀。以小鼠IgG作為對照。含有Nephrin的復合物的形成通過Slit2和Fyn表達增強。(圖6B和6C)：Slit2通過免疫過氧化物酶染色而在新生小鼠腎小球中表達(圖6B)，并且在腎小球中與足細胞標記物突觸極蛋白(Synaptopodin)共表達(圖6C)。放大倍率：600X。(圖6D和圖6D')：在Slit2存在下，CD16/7-NCD與ROBO2在Hek細胞中共表達，用抗-CD16抗體和羅丹明結合的抗-IgG抗體處理，然后固定并用抗-ROBO2抗體染色。CD16/7-NCD簇與ROBO2共定位(圖6D)、但在對照的CD16/7-HA簇(圖6D')中觀察到未共區(qū)域化的CD16/7-NCD簇。比例尺：5μm。NCD：Nephrin細胞質區(qū)。(圖6E-6E’)：ROBO2中Nck結合域(NBD)的缺失損害了其在Slit2存在下與CD16/7-NCD的共定位。CD16/7-NCD簇與ROBO2共定位(圖6E)、但在ROBO2-ΔNBD簇中觀察到未共區(qū)域化的CD16/7-NCD簇(圖6E')。比例尺：5μm。(圖6F和6F')：Slit2的刺激增強了CD16/7-NCD和ROBO2在Hek細胞中的共定位。CD16/7-NCD簇與ROBO2在Slit2存在下共定位(圖6F)，但不在對照條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液共定位(圖6F')。比例尺：5μm。

圖7A-7C顯示在Robo2中Nck結合域(NBD)的缺失折中了Slit2-ROBO2對Nephrin誘導的肌動蛋白聚合的抑制。(圖7A)：CD16/7-NCD和ROBO2在Hek細胞中共表達，與抗-CD16抗體和羅丹明結合的抗-IgG抗體在Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(Slit2)或對照條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(CTL)存在下聚集。然后將細胞固定，并用FITC結合的鬼筆環(huán)肽染色，以顯示F-肌動蛋白纖維。CD16/7-NCD和F-肌動蛋白纖維的簇通過共聚焦顯微鏡檢查得到的。比例尺，5μm。NCD：Nephrin細胞質區(qū)。(圖7B)：CD16/7-NCD和ROBO2-ΔNBD在Hek細胞中共表達。比例尺，5μm。NBD：Nck結合域。(圖7C)：在每組中，具有F-肌動蛋白尾巴的細胞占具有CD16/7-NCD簇的總細胞的百分比被定量化。數據表示為平均值±SEM，ANOVA.分析*p＝1.436x10^-5，**p＝6.32x10^-5，n＝5。

圖8A-8Z顯示在ROBO2純合缺失、ROBO2足細胞特異性敲除、ROBO2和Nphs1雙敲除小鼠中腎小球的表型，和ROBO2-Nephrin信號的擬建模式。(圖8A-8F)：透射電子顯微鏡分析新生的(NB)Robo2^del5/del5突變小鼠腎臟中腎小球的超微結構。(圖8A，8C，8E)：在低倍率(圖8A，2200X)，中倍率(圖8C，15500X)和高倍率(圖8E，52000X)下的新生雜合的ROBO2對照小鼠的腎小球超微結構。(圖8B，8D，8F)：在低倍率(圖8B，2200X)，中倍率(圖8D，15500X)和高倍率(圖8F，52000X)下新生雜合的ROBO2(-/-)(即Robo2^del5/del5)的突變小鼠的腎小球超微結構。箭頭表示局灶節(jié)段性足細胞足突消失。簡稱：gc：腎小球毛細血管；us：腎小囊腔；GBM：腎小球基底膜。(圖8G-8N)：在ROBO2特異性敲除小鼠中異常的足細胞足突模式。(圖8G-8J)：來自于一月齡Robo2^del5/flox、Nphs2-Cre⁺足細胞特異性敲除小鼠和年齡匹配的Robo2^flox/+對照小鼠的腎小球的代表的掃描電子顯微鏡圖像。在一月齡ROBO2足細胞特異性敲除小鼠中發(fā)現趾狀突足細胞足突的輕度不規(guī)則(圖8K和8N)。當七個月大時，Robo2足細胞特異性敲除小鼠發(fā)生明顯不規(guī)則的足突(圖8L和8N)。比例尺：10微米(圖8G，8H，8K，8L，放大倍率2000X)和2微米(圖8I，8J，8M，8N，放大倍率13000X)。(圖8O-8T)：Robo2足細胞特異性敲除小鼠的腎小球形態(tài)。(圖8O-8R)希夫氏高碘酸(PAS)染色顯示2月齡和6月齡Robo2足細胞特異性敲除小鼠的腎小球的系膜基質擴張(圖8P，8R)，對照為年齡匹配的小鼠(圖8O，8Q)。(圖8S)：腎小球的定量分析表明12月齡Robo2足細胞特異性敲除小鼠(MU)的腎小球系膜基質擴張，與年齡匹配的野生型(WT)對照相比。數據表示為平均值±SEM，n＝5，*P<0.01。(T)：Robo2足細胞特異性敲除不影響足細胞的數量。使用WT-1染色鑒定足細胞。計算4個一年齡Robo2^del5/flox、Tg^Nphs2-Cre+足細胞特異性敲除小鼠(MU)中的每個腎小球橫截面的足細胞數量，對照為4個年齡匹配的野生型小鼠(WT)。數據表示為平均值±SEM，p＝0.645，t-檢驗；突變體：n＝165腎小球；對照：n＝166腎小球。(圖8U-8Y)：Robo2和Nphs1雙敲除小鼠中腎小球的表型。(圖8U)：H&E染色顯示在Nphs1^-/-單純合新生小鼠中腎小球具有膨脹鮑曼腔(星號)的特性，放大倍率400倍。(圖8V)：Robo2^-/-單純合新生小鼠的腎小球顯示沒有鮑曼腔的膨脹，放大倍率400倍。(圖8W)：在Robo2^-/-、Nphs1^-/-雙純合新生小鼠中顯示、正常沒有鮑曼腔膨脹(箭頭)的腎小球樣貌，其表明Nphs1^-/-腎小球表型的減輕，放大倍率400倍。(圖8X)：作為對照的年齡匹配的野生型新生小鼠的正常腎臟和腎小球的H&E染色，放大倍率400倍。(圖8Y)：新生小鼠中具有膨脹鮑曼腔的腎小球的定量分析表明Robo2^-/-、Nphs1^-/-雙純合中具有膨脹表型鮑曼腔特性的腎小球顯著減少，對照為ROBO2-/-單個純合(Robo2^+/-、Nphs1^-/-)。數據表示為平均值±SEM，*p<0.01。(圖8Z)：Slit2-Robo2信號對Nephrin的抑制效應以影響足細胞足突結構的模型：在生理條件下(例如，在足突發(fā)育期間)，Nephrin細胞內磷酸化酪氨酸結構域(YDxV-P)通過其與SH2結構域的相互作用結合Nck。反過來，Nck通過其SH3結構域與細胞骨架調節(jié)器結合，以促進肌動蛋白聚合。Slit2與Robo2結合，用以增加Robo2胞內域與Nck的SH3結構域的相互作用，這可防止Nck結合至細胞骨架調節(jié)器，并導致對Nephrin誘導的肌動蛋白聚合的抑制。在足細胞發(fā)育為正常足突結構期間可維持均衡的肌動蛋白聚合。在沒有Slit2-Robo2信號(例如，當Robo2被敲除時)時，Robo2對Nephrin誘導聚合的抑制作用消失。Nck的SH3結構域可與下游的細胞骨架調節(jié)器相互作用，以增加肌動蛋白聚合，其可以解釋在Robo2突變小鼠中足細胞足突結構的改變。簡稱：Ig：免疫球蛋白域；FN3：纖連蛋白3型結構域；SH2：Src同源2結構域；SH3：Src同源3結構域；CC0、CC1、CC2、CC3：細胞質保守區(qū)0、1、2、3。

具體實施方式

以前已經證明Robo2是推進導向暗號Slit(repulsive guidance cue Slit)的細胞表面受體，并參與神經系統的軸突導向和神經元遷移。Nephrin是一種足細胞狹縫隔膜蛋白，其在腎臟的腎小球過濾屏障中起作用。在此我們證明Robo2在足細胞基面上表達，例如小鼠足細胞，并與Nephrin共定位。生物化學研究表明，通過銜接蛋白Nck，Robo2與Nephrin在腎臟中形成復合物。與Nephrin促進肌動蛋白聚合的作用形成對照，在此我們顯示了Slit2-Robo2信號抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合。例如，與Nephrin相關聯的F-肌動蛋白的數量在Robo2敲除小鼠中增加，其形成改變的足細胞足突結構及微蛋白尿。遺傳相互作用的研究進一步揭示Robo2缺失減輕Nephrin缺失小鼠的異常足細胞表型。在此提供的結果顯示Robo2信號作為Nephrin的負調節(jié)因子以影響足細胞足突結構。

另外，已經證明，患有膀胱輸尿管返流(VUR)的病人有染色體易位，其可破壞ROBO2基因，并產生可終止SLIT2-ROBO2信號通路的顯性失活ROBO2融合蛋白。通常地，VUR是一種尿液從膀胱逆流至輸尿管和腎臟的疾病，VUR患者可出現反流性腎病，這個狀態(tài)伴有嚴重蛋白尿。已經顯示，由VUR患者產生的顯性失活ROBO2融合蛋白封閉SLIT2-ROBO2信號通路，并保護患者免于反流性腎病和蛋白尿，從而確認并進一步支持發(fā)明人的結果，該結果是在以SLIT2-ROBO2信號通路為目標治療慢性腎臟疾病產生的治療價值的動物模型中得到的。

正常腎臟中，三層的腎小球毛細血管壁包含網狀內皮細胞、基底膜和足細胞其限制了血漿蛋白的滲透性。足細胞是專門的上皮細胞，其延伸初級和次級突觸以覆蓋腎小球基底膜的外表面。相鄰足細胞中富含肌動蛋白的趾狀突的次級突觸或足突，通過半滲透狹縫隔膜橋連建立了過濾縫，從而形成蛋白滲透的最終屏障。鑒于足細胞狹縫隔膜蛋白如Nephrin和其它的基因突變性與蛋白尿腎臟疾病的遺傳形式相關(特里格瓦松(Tryggvason)等，2006)(Tryggvason et al.,2006)，構成狹縫隔膜蛋白和與狹縫隔膜蛋白相關的蛋白不只是簡單的結構屏障，這已經是明顯的。這些蛋白形成一種均衡的信號網絡，其通過與F-肌動蛋白細胞骨相互作用可影響足細胞足突結構和功能(福勒等，2007；瓊斯Jones等，2006；維爾馬等，2006)(Faul et al.,2007；Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)。

迂回(roundabout)(Robo)家族蛋白，Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，是分泌性配體Slit(secreted ligand Slit)的細胞表面受體(迪克遜(Dickson)和Gilestro，2006)(Dickson and Gilestro,2006)。最初發(fā)現，Slit1、Slit2和Slit3在神經系統發(fā)育過程中是作為軸突導向和神經元遷移的推進導向暗號(關(Guan)和饒(Rao)，2003)(Guan and Rao,2003)。跨膜蛋白Robo含有五個Ig基序，三個III型纖連蛋白(FNIII)，在其胞外域中重復(迪克遜(Dickson)和Gilestro，2006)(Dickson and Gilestro,2006)。雖然這兩種免疫球蛋白(Ig)基序1和2與Slit相互作用，Robo的第一Ig1基序是Slit的主要結合位點(迪克遜(Dickson)和Gilestro，2006)(Dickson and Gilestro,2006)。Robo的胞內域有四個細胞質保守(CC)序列，名為CC0，CC1，CC2和CC3(伯肖(Bashaw)等，2000；基德(Kidd)等，1998；漠爾洛(Morlot)等，2007，艾倫(Zallen)等，1998)(Bashaw et al.,2000；Kidd et al.,1998；Morlot et al.,2007；Zallen et al.,1998)。CC0和CC1含有酪氨酸，而CC2和CC3是富含脯氨酸的延伸。Slit-Robo信號的推進活性抑制肌動蛋白的聚合(關(Guan)和饒(Rao)，2003)(Guan and Rao,2003)或者誘導的F-肌動蛋白解聚(派珀(Piper)等，2006)(Piper et al.,2006)。

Slit-Robo信號在早期腎臟感應和輸尿管萌芽生長過程中也起著至關重要的作用。缺少Slit2或Robo2的小鼠突變體生長出多余的輸尿管芽，從而產生廣譜的尿路表型，包括雙腎、輸尿管膀胱畸形連接和腎積水(Grieshammer等，2004；陸(Lu)等，2007)(Grieshammer et al.,2004；Lu et al.2007)。人類ROBO2的破壞引起腎臟和尿路的先天異常(CAKUT)，膀胱輸尿管返流(VUR)患者已經確定有Robo2點突變(陸(Lu)等，2007)(Lu et al.,2007)。我們最近的研究表明，Robo2對正常輸尿管口的形成和是維持有效的抗返流機制身至關重要的(王(Wang)等人，2011)(Wang et al.,2011)。

在此我們證明，Robo2是在腎臟中腎小球足細胞基底表面表達的新型足細胞蛋白，并與Nephrin和podocin共定位。Robo2直接與銜接蛋白Nck SH3域相互作用，并與Nephrin形成復合物。鑒于Robo2敲除小鼠長出的改變的足細胞足突，Robo2的缺失減輕了Nephrin缺失小鼠的足突結構的畸形。在此描述的這些結果表明，Robo2信號作為Nephrin信號的負調節(jié)器以影響足細胞足突結構。另外，如本文所證明的，業(yè)已發(fā)現，患者產生的顯性失活ROBO2融合蛋白封閉Slit2-Robo2信號通路，保護患者免于返流性腎病和蛋白尿，從而確認并進一步支持發(fā)明人的結果，該結果在以SLIT2-ROBO2信號通路為目標治療慢性腎臟疾病產生的治療價值的動物模型中得到的。

因此，在一些方面，在此提供治療有需要的受治療者慢性腎臟疾病的方法，這樣的方法包括將治療有效量的含有Slit2-ROBO2信號通路抑制劑的組合物給予患有或具有患慢性腎臟疾病風險的受治療者。

在一些方面，在此還提供降低有需要受治療者蛋白尿的方法，該方法包括將治療有效量的含有Slit2-ROBO2信號通路抑制劑的組合物給予患有或具有患蛋白尿風險的受治療者。

在另一些方面，在此還提供預防或促進預防治療有需要的受治療者的腎臟疾病的方法，該方法包括將治療有效量的含有Slit2-ROBO2信號通路抑制劑的組合物給予受治療者，以預防或促進預防治療受治療者的腎臟疾病。

在一些方面，在此還提供在有需要受治療者中減輕腎臟疾病影響、降低腎臟疾病嚴重性、降低腎臟疾病發(fā)展的可能性和/或減慢腎臟疾病進程的方法。

如在此所用，“ROBO2”是指具有如下氨基酸序列的多肽：MARRHERVTRRMWTWAPGLLMMTVVFWGHQGNGQGQGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTGEL(智人迂回家族同族體2亞型ROBO2a；SEQ ID NO:1),例如通過NP-001122401.1描述的和通過NM-001128929.2(SEQ ID NO:2)編碼；或MSLLMFTQLLLCGFLYVRVDGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTGEL(智人同族體2亞型ROBO2b；SEQ ID NO:3)，例如通過NP_002933.1描述和通過NM_002942.4(SEQ ID NO:4)編碼的，以及與任何自然發(fā)生的等位基因，接合變體及其處理后的形式一起。代表性地，ROBO2是指人類ROBO2。ROBO2基因在黑猩猩、獼猴、狗、奶牛、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、果蠅、蚊子和線蟲中是保守的。ROBO2特定的殘基被稱為，例如“ROBO2(30)”。

ROBO2的特定結構域也可以通過這些術語被提及。包含5個免疫球蛋白基序和3個III型纖連蛋白(FNIII)重復序列的N-端或“ROBO2的胞外域”，例如，可被稱為SEQ ID NO：1的ROBO2(46-848)或SEQ ID NO：3的ROBO2(30-832)。與Slit2相互作用的免疫球蛋白(Ig)基序1和2，或“Ig SLIT結合域”可被稱為SEQ ID NO：1分別的ROBO2(46-145)和ROBO2(151-237)，和SEQ ID NO：3分別的ROBO2(30-129)和Robo2(135-221)。同樣地，在此描述的包括“Nck胞內結合域”的“胞內域”，其包括4個細胞內富含脯氨酸基序，可被稱為SEQ ID NO：3的ROBO2(881-1378)。

在此使用的術語“ROBO2抑制劑”、“ROBO2拮抗劑”、“ROBO2抑制劑藥劑”和“ROBO2拮抗劑藥劑”是指具有顯著封閉、抑制、降低或妨礙ROBO2(哺乳動物，如人類ROBO2)的體外、原位和/或體內生物活性的分子或藥劑，所述生物活性包括由ROBO2信號介導的下游通路的活性，例如ROBO2與銜接蛋白Nck的相互作用和/或與Nephrin形成的復合物，介導的Nephrin介導的肌動蛋白聚合的抑制的SLIT2-ROBO-2，和/或誘導ROBO2的細胞應答。在此使用的關于ROBO2抑制劑的術語“藥劑”，意思是任何化合物或物質，例如但不限于，小分子、核酸、多肽、肽、藥物、離子等?！八巹笨蔀槿魏位瘜W的、實體、或部分，包括但不限于，合成的和自然產生的蛋白實體和非蛋白實體。在此描述的方面的一些具體實施方式中，藥劑為核酸、核酸類似物、蛋白質、抗體、肽、適體、核酸低聚物、氨基酸或碳水化合物，以及包括但不限于，蛋白質、寡核苷酸、核酶、脫氧核酶(DNAzymes)、糖蛋白、反義RNA、小干擾RNA(siRNAs)、脂蛋白、適體以及上述的變型和組合?？梢灾?，在此描述的用于治療組合物和方法的化合物具有期望的活性和/或性質，或采用本領域普通技術人員知道的篩選方法可以從各種化合物的化合物可庫中進行選擇。

在此描述的各種方面和具體實施方式預期使用的示例性ROBO2抑制劑包括，但不限于，與ROBO2特異性結合的抗ROBO2抗體或其抗原結合片段；定向編碼ROBO2的核酸的反義分子(例如，ROBO2a或ROBO2b或兩者)；定向編碼ROBO2的核酸的短干擾RNA(“siRNA”)(例如，ROBO2a或ROBO2b或兩者)；結合到ROBO2并且抑制/降低/封閉ROBO2介導信號的RNA或DNA適體；ROBO2結構類似物；和可溶性ROBO2蛋白質，抑制多肽，如顯性失活的多肽，或其融合多肽。在此描述的這些方面和所有這些方面的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑(例如抗體或其抗原結合片段)與ROBO2結合(物理上與其相互作用)，以下游的ROBO2信號為目標，和/或抑制(減少)ROBO2合成、產生或釋放。在此描述的這些方面和所有這些方面的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑結合和抑制其與SLIT蛋白配體，如SLIT2的結合。在此描述的這些方面和所有這些方面的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑特異性地減少或消除一種或多種ROBO2亞型的表達(例如轉錄或轉化)。

在此使用的ROBO2抑制劑或拮抗劑能夠降低在細胞(例如足細胞)中ROBO2的活性和/或表達至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或更多，與沒有ROBO2抑制劑存在的活性或表達水平相比。

因此，在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，Robo2抑制劑抑制Robo2介導的信號傳導。在在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，Robo2抑制劑以與銜接蛋白Nck相互作用的Robo2為目標和/或與Nephrin、Nephrin介導肌動蛋白聚合的SLIT2-Robo-2介導的抑制劑、和/或對Robo2細胞反應的誘導的絡合生成。

在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的結合位點，例如抗體或其抗原結合片段，是針對ROBO2配體的相互作用位點，例如SLIT2配體相互作用位點。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的結合位點，例如抗體或其抗原結合片段，是針對ROBO2適配體結合位點，例如Nck相互作用位點或包括四個ROBO2的細胞內富含脯氨酸基序的NCK胞內結合域。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的結合位點是針對配體相互作用位點附近的一個位點目標，以便于為受體(例如ROBO2)和其配體(例如SLIT2)的相互作用提供空間障礙。通過與ROBO2配體相互作用位點結合，在此描述的ROBO2抑制劑可減少或抑制ROBO2的活性或表達，以及下游ROBO2信號結果(例如ROBO2與銜接蛋白Nck相互作用和/或與Nephrin形成復合物，介導Nephrin介導的肌動蛋白聚合的SLIT2-ROBO-2的抑制，和/或對ROBO2細胞應答的誘導)。例如，在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的結合位點封閉或靶向于ROBO2上至少Ig1，并優(yōu)選Ig1和Ig2位點，即，例如各自SEQ ID NO:1的BO2(46-145)和ROBO2(151-237)，以及各自SEQ ID NO:3的ROBO2(30-129)和ROBO2(135-221)。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的結合位點封閉或靶向于含有Nck胞內結合域的ROBO2胞內域，即SEQ ID NO:3的ROBO2(818-1378)。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的結合位點封閉或靶向于含有四個ROBO2的細胞內富含脯氨酸基序的ROBO2Nck胞內結合域。這可由本領域已知的多種方式完成，例如抗體和其抗原結合片段，抑制劑RNA，等，以及如在此描述的。因此，在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是抗體或其抗原結合片段，其與ROBO2選擇性結合或與其物理上相互作用。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑是抗體或其抗原結合片段，其與ROBO2結合并抑制和/或封閉和/或阻止與Nck的相互作用和/或與Nephrin復合物的生成。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，抗體或其抗原結合片段與ROBO2的Ig SLIT結合域結合。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，抗體或其抗原結合片段與ROBO2的Ig 1SLIT結合域結合，或同時與ROBO2的Ig 1和Ig2SLIT結合域結合，即，各自SEQ ID NO:1的ROBO2(46-145)和ROBO2(151-237)，以及各自SEQ ID NO:3的ROBO2(30-129)和ROBO2(135-221)。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合到或封閉ROBO2的胞內域，即，SEQ ID NO:3的ROBO2(818-1378)。在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合到或封閉含有四個ROBO2的細胞內富含脯氨酸基序的Nck胞內結合域。

適用于在此描述的組合物和實施在此描述的方法的ROBO2的特異性的抗體或選擇性結合ROBO2的抗體，優(yōu)選為單克隆的，且可包括但不限于，人類抗體，人源化抗體或嵌合抗體，含有單鏈抗體，Fab片段，F(ab’)片段，由Fab表達庫產生的片段，和/或上述任意的結合片段?？贵w也可指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有抗原的分子或靶向結合位點或“抗原結合片段”的分子。這里描述的免疫球蛋白分子可為本領域技術人員理解的免疫球蛋白分子的任意類型(IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。

因此，在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，在此描述的ROBO2抑制劑為單克隆抗ROBO2抗體或抗原結合片段。

在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，在此描述的ROBO2抑制劑是ROBO2抗體片段或抗原結合片段。在此所用的術語“抗體片段”、“抗體結合片段”和“抗體衍生物”是指僅含有完整抗體的部分的蛋白質片段，通常包括完整抗體的抗原結合點，并且因此保留了與抗原結合的能力。該術語抗體片段包括的抗體片段或抗原結合片段的實例包括：(i)Fab片段，具有V_L、C_L、V_H和C_H1結構域；(ii)Fab’片段，其是一種Fab片段，在C_H1結構域的C-端具有一個或多個半胱氨酸殘基；(iii)Fd片段，具有V_H、C_H1域；(iv)Fd’片段，具有V_H和C_H1結構域，以及在C_H1結構域的C-端具有一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，具有單臂抗體V_L和V_H結構域；(vi)dAb片段(沃德等，自然雜志，1989(341)：544-546)(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))，由V_H或V_L結構域組成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab’)₂片段，其為二價片段，包含兩個通過二硫橋鍵在鉸鏈區(qū)連接的Fab’片段，(ix)單鏈抗體分子(如單鏈Fv、scFv)(伯德等，科學雜志，1998，242：423-426，和休斯頓等，美國國家科學院院刊(美國)，1988，85：5879-5883)(Bird et al.,Science 242:423-426(1988)；and Huston et al.,PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)具有兩個抗原結合點的“雙體”，在相同多肽鏈中包括與輕鏈可變區(qū)(V_L)相連的重鏈可變區(qū)(V_H)(見，例如，EP404097；WO 93/11161；霍林格等，美國國家科學協會公報，美國，1993，90：6444-6448)(EP 404,097；WO 93/11161；and Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；(xi)“線性抗體”，包括一對串聯的Fd片段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，其與互補的輕鏈多肽形成一對抗原結合域(薩帕塔等。蛋白質工程，1995，8(10)：1057-1062；美國專利5641870)(Zapata et al.Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；and U.S.Pat.No.5,641,870)；以及前述任意的修飾版本(通過聚二醇(聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它適當聚合物的共價結合的修飾)。

在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑或拮抗劑為ROBO2拮抗劑抗體或其抗原結合片段的嵌合抗體衍生物。

在此所述的ROBO2抑制劑或拮抗劑抗體及其抗原結合片段，在一些具體實施方式中，也可為人源化抗體衍生物。

在一些具體實施方式中，在此所述的ROBO2抑制劑或拮抗劑抗體及其抗原結合片段，包括修飾的衍生物，如被任意類型的分子通過的共價連接與抗體結合，條件是共價結合不會阻止抗體與目標抗原的結合，如ROBO2。

在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，使用完整的人類抗體，其對人類患者的治療處理是尤為令人滿意的。

在此描述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑包括至少一種通過靶向于編碼ROBO2的核酸能夠封閉或減少特定功能ROBO2的表達的反義分子，例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4，或兩者，或其相關的結構域。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種反義分子靶向于編碼ROBO2的Ig SLIT結合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種反義分子靶向于編碼ROBO2的Ig1SLIT結合域或ROBO2的Ig1和Ig2SLIT結合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種反義分子靶向于編碼ROBO2胞內域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種反義分子靶向于編碼包含四個ROBO2的細胞內富含脯氨酸基序的Nck胞內結合域的核酸。反義寡核苷酸的制備方法為本領域普通技術人員已知的，所述的反義寡核苷酸不與其它多核苷酸交叉反應即可特異性地與ROBO2mRNA結合。靶向位點的示例包括但不限于，起始密碼子；5’調節(jié)區(qū)，包括啟動子或增強子編碼序列，包括任意保守的共識區(qū)；和3’非翻譯區(qū)。在此所述的這些方面和這些所有方面的具體實施方式中，所述反義寡核苷酸的長度約為10至約100個核苷酸，約15至約50個核苷酸長度，約18至約25個核苷酸長度或更多。在某些具體實施方式中，反義寡核苷酸進一步包括化學修飾以提高抗核酸酶等諸如此類，例如，本領域普通技術人員已知的硫代磷酸酯鍵和2’-O-糖基修飾。

在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制劑包括至少一種小干擾RNA(siRNA)分子，該小干擾RNA能夠封閉或減少功能性ROBO2表達的其是通過靶向于編碼ROBO2的核酸或靶向于ROBO2的兩種亞型如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其相關域的核酸實現的。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種siRNA分子靶向于編碼ROBO2的Ig SLIT結合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種siRNA分子靶向于編碼ROBO2的Ig1SLIT結合域或ROBO2的Ig1和Ig2SLIT結合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種siRNA分子靶向于編碼ROBO2胞內域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述至少一種siRNA分子靶向于編碼包含四個ROBO2的細胞內富含脯氨酸基序的Nck胞內結合域的核酸。制備siRNA分子是常規(guī)的，不與其它多核苷酸交叉反應可特異性地靶向于ROBO2mRNA。用于在此所述的組合物和方法的siRNA分子可由本領域已知方法制成，例如采用典型的固相合成寡核苷酸，并且與化學修飾結合用以提高siRNA藥劑的半衰期和/或功效，和/或產生更多的強的遞送制劑。做為選擇地，siRNA分子通過編碼細胞內轉錄siRNA的表達盒的載體進行遞送。

在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制劑為RNA或DNA適體，其與一種或多種ROBO2亞型結合。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑或拮抗劑為RNA或DNA適體，其與ROBO2結合或與其進行物理上的相互作用，并且封閉ROBO2與配體分子或銜接分子之間的相互作用，諸如分別為SLIT2或Nck。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑或拮抗劑為RNA或DNA適體，其與ROBO2結合或與其物理上相互作用，并且降低、阻止或封閉下游的ROBO2信號，例如Nephrin介導肌動蛋白聚合的抑制介導的SLIT2-ROBO-2，和/或誘導對ROBO2的細胞應答。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述為RNA或DNA適體與ROBO2的Ig SLIT結合域進行結合或與其進行物理上相互作用。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述RNA或DNA適體與ROBO2的Ig1SLIT結合域或與ROBO2的Ig1和Ig2SLIT結合域結合或與其物理上相互作用，即SEQ ID NO:1各自的ROBO2(46-145)和ROBO2(151-237)，以及SEQ ID NO:3各自的ROBO2(30-129)和ROBO2(135-221)。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述RNA或DNA適體與ROBO2胞內域例如SEQ ID NO:3的ROBO2(881-1378)結合或與其物理上相互作用。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述RNA或DNA適體與Nck胞內結合域結合或與其物理上相互作用或封閉Nck胞內結合域，所述Nck胞內結合域含有四個ROBO2細胞內富含脯氨酸基序。

在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制劑為靶向于ROBO2或與其結合的小分子化合物或藥劑，包括但不限于，小肽或肽類分子，可溶性肽，以及合成的非肽基有機化合物或合成的非肽基無機化合物。這里使用的術語“小分子”是指以一種化學的藥劑，可包括但不限于，肽、擬肽物、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、適體、核苷酸、核苷酸類似物、分子量小于約10000g/mol的有機或無機化合物(例如，包括雜有機化合物(heterorganic compoundd)和有機金屬化合物)、分子量小于約5000g/mol的有機或無機化合物、分子量小于約1000g/mol的有機或無機化合物、分子量小于約500g/mol的有機或無機化合物、以及這些化合物的鹽、酯和其它藥學上可接受的形式。小分子結合位點的示例包括但不限于，與SLIT2或適體Nck結合的ROBO2的部分，即，ROBO2的Ig SLIT結合域或ROBO2的Ig1和Ig2SLIT結合域，ROBO2胞內域或含有四個ROBO2細胞內富含脯氨酸基序的Nck胞內結合域。

在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制劑或拮抗劑含有與ROBO2結合或抑制ROBO2生物活性的小分子。

在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制劑或拮抗劑含有至少一種ROBO2結構類似物，諸如顯性失活ROBO2多肽。這里使用的術語ROBO2結構類似物是指具有與ROBO2的部分的三維結構相似的化合物，并且其與SLIT2和/或Nck在生理條件下在體內或體外結合，其中，結合至少部分地抑制ROBO2生物活性，例如Nephrin介導肌動蛋白聚合的抑制介導的SLIT2-ROBO2，和/或誘導ROBO2細胞應答。例如，可通過SLIT2-ROBO2結合的分子模型設計和合成合適的ROBO2結構類似物。ROBO2結構類似物可為單體、二聚體或以相同或不同結構任意希望組合的高階多聚體以獲得改進的親和力和生物效應。

在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制劑或拮抗劑含有至少一種可溶性ROBO2受體或其融合多肽，例如，ROBO2抑制性多肽。在一些這樣的具體實施方式中，所述ROBO2抑制性多肽為顯性失活的ROBOR2融合蛋白質。在此所述的組合物和方法的一些具體實施方式中，所述ROBO2抑制性多肽含有ROBO2胞外域，例如ROBO2的Ig1SLIT結合域或ROBO2的Ig1和Ig2SLIT結合域，沒有ROBO2胞內域。

在此所述的組合物和方法中使用的ROBO2抑制劑或拮抗劑可采用本領域已知的方法識別或表征，例如，蛋白質-蛋白質結合分析，生化篩選分析，免疫分析和基于細胞的分析，這些是本領域眾所周知的，包括但不限于實施例中描述的那些。

例如，為了鑒定抑制ROBO2與其配體如SLIT2相互作用的分子，可使用結合分析。例如，通過共價連接或非共價連接，將ROBO2或SLIT固定在微量滴定板上。該分析通過將可被檢測標簽標記的非固定化組分(配體或受體)加入固定化組分中，在存在或不存在檢測試劑的情況下。當反應完全時，移出未反應的組分并檢測結合復合物。例如，如果結合復合物的形成被存在的檢測試劑抑制，那么可認為檢測試劑是抑制ROBO2與SLIT之間結合的候選的拮抗劑?；诩毎姆治龌蚧谀さ姆治鲆部捎糜阼b定ROBO2抑制劑。在其它具體實施方式中，通過檢測和/或測量ROBO2基因的表達水平，可檢測出抑制ROBO2基因表達的ROBO2抑制劑分子。可通過多種方法檢測和/測量ROBO2基因表達，例如實時逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，酶聯免疫吸附分析(ELISA)，RNA印跡分析(Northern blotting)或流式細胞術以及本領域普通技術人員已知的方法。

這些被鑒定的ROBO2抑制劑可采用慢性腎臟疾病的體內動物模型進一步測試，例如腎小球和間質損傷模型(例如，狼瘡性腎炎的動物模型，包括新西蘭黑鼠(NZB)，(NZB x NZW)第一代雜交體(稱為NZB/W)，及其同類系衍生物，MRL/lpr和BXSB菌株)，衰老動物模型(例如，老年雄性遠交群大鼠和老年C57BL/6小鼠)；自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)；Buffalo/mna大鼠，其是人類原發(fā)性腎病綜合征的模型；Munich Wistar(MWF)大鼠，其為與先天性腎單元數目缺陷有關的遺傳模型，腎單元數目缺陷可使成人有發(fā)展為高血壓和鹽敏感的傾向；原發(fā)性足細胞特異性遺傳性FSGS模型；HIV相關腎病轉基因小鼠模型；Alport綜合征動物模型，其包括IV型膠原(COL4A3、COL4A4和COL4A5)的α3、α4或α5鏈的突變體；免疫誘導模型，例如Thy-1腎炎模型，其為系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)的大鼠實驗模型，抗腎小球基底膜(GBM)模型；和非免疫誘導模型。

關于ROBO2抑制劑，在此使用的“選擇性結合”或“特異性結合”或“特異性于”是指在此描述的ROBO2抑制劑的能力，例如，ROBO2拮抗劑抗體或其ROBO2抗原結合片段，與靶標如ROBO2結合的K_D為10^-5M(10000nM)或更小，例如10^-6M或更小，10^-7M或更小，10^-8M或更小，10^-9M或更小，10^-10M或更小，10^-11M或更小，或10^-12M或更小。例如，如果在此描述的ROBO2抑制劑/拮抗劑與ROBO2結合的K_D為10^-5M或更低，而不與相關分子如ROBO家族的其它成員結合，則可以說該藥劑是可特異性結合ROBO2。例如，特異性結合可受親和力和親合性(affinity and的影響，例如ROBO2抑制劑/拮抗劑抗體或其抗原結合片段和多肽試劑的濃度。本領域普通技術人員可確定適當的條件，在該條件下，在此描述的多肽試劑采用適當的方法選擇性地與靶標結合，例如在細胞結合分析中多肽試劑的滴定。

關于通過抑制ROBO2活性治療慢性腎臟疾病的方法，術語“慢性腎臟疾病”或CKD是指腎臟疾病，其由于腎單位逐步缺失以及隨后的腎功能缺失，隨時間緩慢和逐步惡化的。在開始階段可能沒有癥狀。功能喪失通常需要幾個月或幾年才會發(fā)生?？赡苁翘徛灾劣谥钡侥I功能不足正常的十分之一時癥狀才會出現。慢性腎臟疾病的最終階段稱為終末期腎病(ESRD)。在這個階段，腎臟不再能夠清除體內足夠的廢物和多余的液體?；颊咝枰肝龌蚰I臟移植?？梢鹛悄虿∧I病的糖尿病和高血壓是慢性腎臟疾病的兩種最常見原因，并占大多數。其它可損害腎臟并引起慢性腎臟疾病的疾病和狀態(tài)包括：自身免疫性紊亂(如系統性紅斑狼瘡和硬皮病)，腎臟先天缺陷(如多囊性腎病)，某些有毒化學物質，腎小球性腎炎，損傷或創(chuàng)傷，腎結石和感染，通向腎臟或腎臟中的動脈相關問題，一些止痛藥或其它藥物(如抗癌藥物)，返流性腎病(其中尿液逆流至腎臟而損害腎臟)，等等。在此使用的“蛋白尿”是指尿液中存在過量的血清蛋白。在一些具體實施方式中，蛋白尿是腎臟疾病的象征，但其本身并不是決定性的。

因此，在此所述的這些方面和所有這些方面的一些具體實施方式中，患有或具有患慢性腎臟疾病風險的受治療者患有糖尿病腎病。

在慢性腎臟疾病和蛋白尿的治療方法方面，在此描述的“減少”或“抑制”意思是對于慢性腎臟疾病給定的參數或癥狀整體上降低的能力，所述“減少”或“抑制”是指優(yōu)選可整體下降20％或更多，30％或更多，40％或更多，45％或更多，更優(yōu)選地50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，最優(yōu)選75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，或95％或更多。例如，減少或抑制可以是指被治療的疾病的癥狀，例如高血壓、尿中的蛋白等。

高血壓幾乎一直存在于慢性腎臟疾病的各個階段。神經系統檢查可顯示神經損傷的跡象。在用聽診器聽的時候，醫(yī)療服務人員可能會聽到不正常的心臟或肺部聲音。慢性腎臟疾病的早期癥狀也有其它疾病的癥狀。這些癥狀在病癥更進一步發(fā)展之前可能是腎臟疾病的唯一跡象。慢性腎臟疾病的癥狀可包括：食欲不振，一般不適和疲勞，頭痛，癢(瘙癢)和皮膚干燥，惡心，不嘗試減肥而體重減少，等等。特別是當腎功能惡化時，可發(fā)展的其它癥狀包括：皮膚異常暗或亮；骨痛；腦和神經系統癥狀；昏睡和困惑；集中或思考的問題；手腳或其它部分麻木；肌肉抽搐或痙攣；口臭；易瘀傷，出血或便血；煩渴；經常打嗝；性欲低下和陽痿；月經周期停止(閉經)；氣息不足；睡眠問題，如失眠，不寧腿綜合征和阻塞性睡眠呼吸暫停；手腳浮腫(水腫)；嘔吐，特別是在上午。

因此，在此所述方法的一些具體實施方式中，有效量的含有在此描述的ROBO2抑制劑的組合物給予受治療者以減輕慢性腎臟疾病的癥狀。在此所用的“減輕慢性腎臟疾病的癥狀”為改善與慢性腎臟疾病相關的任何狀態(tài)或癥狀?？蛇x地，減輕慢性腎臟疾病可包括，減少受治療者的一種或多種慢性腎臟疾病癥狀，相對于未處理的患有慢性腎臟疾病的對照或相對于受治療者治療前。與相當的未處理對照相比，或與用ROBO2抑制劑處理前的受治療者相比，這些減少或預防程度為至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或更多，通過任何標準技術測量。理想的是，采用本領域已知的任意標準方法檢測，慢性腎臟疾病顯著降低或檢測不到，這種情況下認為慢性腎臟疾病得到了治療。正在接受治療慢性腎臟疾病的患者是醫(yī)師已經診斷為具有這種狀態(tài)的人。本領域普通技術人員已知的任何合適的方法均可用于診斷。例如，診斷和監(jiān)控包括檢測尿液、血液或血清樣本中特異性蛋白質或分子的水平，例如白蛋白，鈣，膽固醇，全血計數(CBC)，電解質，鎂，磷，鉀，鈉，或上述任意組合；例如檢測分析肌酐清除率，肌酐水平，BUN(血尿素氮)；通過使用特異性的技術或程序，例如腹部CT掃描、腹部MRI、腹部超音波、腎臟活組織切片、腎臟掃描、腎臟超音波；通過分析或測試紅細胞生成素、甲狀旁腺素(PTH)的結果變化的檢測；骨密度檢測或維生素D；或其它這些檢測方法和分析的任意組合。

關于在此所述任一方法使用的術語“受治療者”和“個體”在此中可交換使用，并且是指動物，如人類，是在此所述ROBO2抑制劑的接受者。為了治療對特定動物如人類受治療者特定的病態(tài)，術語“受治療者”是指特定的動物。術語“非人類動物”和“非人類哺乳動物”在此中可交換使用，包括哺乳動物如大鼠、小鼠、兔子、羊、貓、狗、牛、豬和非人靈長類動物。術語“受治療者”也包括任何脊椎動物，包括但不限于，哺乳動物、爬行動物、兩棲類動物和魚。然而，有利的是，受治療者是哺乳動物如人類，或其它哺乳動物例如家養(yǎng)的哺乳動物，如狗、貓、馬等等。

在此描述的這些方法和所有這些方法的一些具體實施方式中，該方法進一步包括，除ROBO2抑制劑外，給予受治療者額外的治療劑。這種額外的治療劑可與ROBO2抑制劑共同給藥。如在此使用的短語“共同給藥(co-administering)”或“共同給予(co-administer)”是將在此所述的ROBO2抑制劑和另一種化合物如治療劑單獨地、同時地和/或經過一段由有資格的護理人員確定的時間連續(xù)地給藥。

在一些這樣的具體實施方式中，額外的治療劑為血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑，血管緊張素II受體拮抗劑(ARB)或鹽皮質激素受體(MR)拮抗劑。

在此所述的與ROBO2抑制劑使用的ACE抑制劑包括但不限于，貝那普利(benazepril)(在美國以Lotensin^TM銷售)，卡托普利(captopril)(在美國以Capoten^TM銷售)，依那普利(enalapril)/依那普利拉(enalaprilat)(在美國以口服和注射的Vasotec^TM銷售)，福辛普利(fosinopril)(在美國以Monopril^TM銷售)，賴諾普利(lisinopril)(在美國以Zestril^TM或Prinivil^TM銷售)，莫西普利(moexipril)(在美國以Univasc^TM銷售)，培哚普利(perindopril)(在美國以Aceon^TM銷售)，喹那普利(quinapril)(在美國以Accupril^TM銷售)，雷米普利(ramipril)(在美國以Altace^TM銷售)和群多普利(trandolapril)(在美國以Mavik^TM銷售)。與在此所述的ROBO2抑制劑使用的ARB類包括：坎地沙坦(candesartan)(在美國以ATACAND^TM銷售)，厄貝沙坦(irbesartan)(在美國以AVAPRO^TM銷售)，奧美沙坦(olmesartan)(在美國以BENICAR^TM銷售)，洛沙坦(losartan)(在美國以COZAAR^TM銷售)，纈沙坦(valsartan)(在美國以DIOVAN^TM銷售)，替米沙坦(telmisartan)(在美國以MICARDIS^TM銷售)，依普沙坦(eprosartan)(在美國以TEVETEN^TM銷售)。

在此所述這些方法和所有這些方法的一些具體實施方式中，該方法進一步包括，除ROBO2抑制劑外，給予受治療者有效量的利尿劑。利尿劑包括但不限于：托拉塞米(torsemide)(在美國以DEMADEX^TM銷售)，呋塞米(furosemide)(在美國以LASIX^TM銷售)，布美他尼(bumetanide)(在美國以BUMEX^TM銷售)，依他尼酸(ethacrynic acid)(在美國以EDECRIN^TM銷售)，托拉塞米(torsemide)(在美國以DEMADEX^TM銷售)，阿米洛利(amiloride)(在美國以MIDAMOR^TM銷售)，乙酰唑胺(acetazolamide)(在美國以DIAMOX^TM銷售)，帕馬溴(pamabrom)(在美國以AQUA-BAN^TM銷售)，甘露醇(mannitol)(在美國以ARIDOL^TM或OSMITROL^TM銷售)，氨苯蝶啶(traimterene)(在美國以DYRENIUM^TM銷售)，螺內酯(spironolactone)(在美國以ALDACTONE^TM銷售)，阿米洛利(amiloride)(在美國以MIDAMOR^TM銷售)，吲達帕胺(indapamide)(在美國LOZOL^TM銷售)，氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)(在美國以HYDRODIURIL^TM銷售)，美托拉宗(metolazone)(在美國以ZAROXOLYN^TM或MYKROX^TM銷售)，甲氯噻嗪(methylclothiazide)(在美國以AQUATENSEN^TM或ENDURON^TM銷售)，氫氯噻嗪(hydrocholorthiazide)(在美國以AQUAZIDE H^TM或ESIDRIX^TM或MICROZIDE^TM銷售)，氯噻嗪(chlorothiazide)(在美國以DIURIL^TM銷售)，芐氟噻嗪(bendroflumethiazide)(在美國以NATURETIN^TM銷售)，泊利噻嗪(polythiazide)(在美國以RENESE^TM銷售)，氫氟甲噻嗪(hydroflumethiazide)(在美國以SALURON^TM銷售)，氯噻酮(chlorthalidone)(在美國以THALITONE^TM銷售)。為了獲得完整的列表，還參見例如《醫(yī)生案頭參考》(Physician’s Desk Reference)，2012編著，PDR，Network，(2011)。

如在此所用，關于在此所述包括ROBO-2抑制劑或其聯合治療的任意組合物和方法，術語“治療(treat)”、“療法(treatment)”、“治療(treating)”或“改善(amelioration)”是指治療方法，其中，目的是逆轉、減輕、改善、抑制、減慢或停止與疾病或失調有關的狀態(tài)的進程或嚴重程度。術語“治療(treating)”包括減少或緩解與慢性腎臟疾病有關的狀態(tài)、疾病或失調的至少一種不利的效果或癥狀，例如，但不限于，糖尿病腎病。如果一種或多種臨床癥狀減少，治療通常是“有效的”。可選地，如果疾病的進程被縮減或停止，則治療是“有效的”。也就是說，“治療(treatment)”不只包括癥狀或標記的改善，也包括中斷在預期沒有治療的情況下發(fā)生的至少緩慢進程或癥狀惡化。有益的或期望的臨床結果包括，但不限于，一種或多種癥狀緩和，疾病程度減小，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)，疾病進程的推遲或減慢，疾病狀態(tài)的改善或減輕，以及緩解(無論是部分或全部)，無論是可檢測的或不可檢測的。術語疾病的“治療(treatment)”還包括提供疾病的癥狀或副作用安慰(包括緩和治療)。

在此使用的術語“有效量”是指減輕至少一種或多種需要治療的疾病或失調的癥狀所需要的在此所述ROBO-2抑制劑的量，并與為了提供期望的效果使用的足夠量的藥理成分相關。因此，術語“治療有效量”是指在此描述的ROBO-2抑制劑的量，采用在此公開的方法，當給予典型的受治療者時足以提供特殊效果。在此所用的有效量也包括足以推遲疾病癥狀發(fā)展、改變疾病癥狀進程(例如，但不限于，減慢疾病癥狀進程)或逆轉疾病癥狀的量。因此，不可能指定精確的“有效量”。然而，對于任何給定的情況，適當的“有效量”可由本領域普通技術人員僅僅通過常規(guī)實驗確定。

有效量、毒性和治療效果可通過標準制藥程序在細胞培養(yǎng)和試驗用動物中確定，例如，確定LD50(半數致死量)和ED50(半數有效量)。這些劑量可根據所采用的劑型和所用給藥途徑而變化。毒性效應和治療效果的劑量比為治療指數，其可以用LD50/ED50的比值表達。呈現大的治療指數的組合物和方法是優(yōu)選的。治療有效劑量最初可根據細胞培養(yǎng)試驗分析估算。另外，劑量可以在動物模型中配制，以獲得包括在細胞培養(yǎng)或適當的動物模型中確定的IC 50(即，獲得測量功能或活性的半數最大抑制的在此描述的ROBO-2抑制劑的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。例如，血漿中的水平可通過高效液相色譜法測量。任何具體劑量的效果可以通過由合適的生物試驗監(jiān)控到。必要時，劑量可由醫(yī)師為適應治療的觀察效果進行調整而確定。根據慢性腎臟疾病的類型和嚴重程度，在此描述的約1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的ROBO-2抑制劑的量是給予受治療者的最初候選劑量范圍，例如，無論是一個或多個分開給藥或是連續(xù)輸注。

給藥模式

在此所述ROBO2抑制劑或其聯合治療可通過任意合適途徑給予受治療者，使受治療者得到有效治療。如在此所用的術語“給予(administering)”和“采用(introducing)”可交換使用，并且是指將ROBO2抑制劑配置給受治療者，其通過可使這些藥劑至少部分定位在期望位點的方法或途徑進行配置，以產生期望效果。

在一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑通過任意給藥模式給予給患有慢性腎臟疾病的受治療者，所述給藥模式可全身性遞送藥劑或將藥劑遞送至所需表面或目標，并包括但不限于，注射給藥、輸注給藥、滴注給藥和吸入給藥。為了保護多肽藥劑不在腸道中失活，也可以考慮口服給藥形式?！白⑸洹卑ǖ幌抻?，靜脈內注射、肌肉注射、動脈內注射、鞘內注射、室內注射、囊內注射、眶內注射、心內注射、皮內注射、腹膜內注射、經氣管注射、皮下注射、表皮下注射、關節(jié)內注射、子囊注射、蛛網膜下腔注射、椎管內注射、內腦脊髓注射以及胸骨內注射和灌輸。在一些具體實施方式中，用于在此所述方法的ROBO2抑制劑是通過靜脈灌輸或注射給藥的。

在此所用短語“腸胃外給藥”和“非腸道給藥”是指與腸內或局部給藥不同的給藥模式，通常通過注射給藥。在此所用短語“全身用藥”、“全身給藥”、“全身地給予”和“外周給藥”是指ROBO-2抑制劑的給藥而不是直接給予靶點、組織或器官，例如腫瘤部位，而是ROBO-2抑制劑可進入受治療者的循環(huán)系統，并因此經歷代謝和其它相似過程。

對于在此所述方法的臨床使用，在此ROBO-2抑制劑的給藥包括配制成藥物組合物或用于腸胃外給藥的藥物制劑，例如靜脈內的，粘膜的如鼻內的，眼睛的或其它給藥模式。在一些具體實施方式中，在此描述的ROBO-2抑制劑可以連同任何藥學上可接受的載體化合物、材料或組合物給藥，其可使受治療者得到有效治療。因此，在此所述方法使用的藥物制劑可包含在此描述的ROBO-2抑制劑，與一種或多種藥學上可接受的成分的組合。

短語“藥學上可接受的”是指那些化合物、材料、組合物和/或劑型，它們在合理的醫(yī)學判斷范圍內，適用于與人類或動物的組織接觸而沒有過多的毒性、刺激性、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥，具有相當的的利益/風險比。在此所用短語“藥學上可接受的載體”意為藥學上可接受的材料、組合物或載體，如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑、媒介、封裝材料、制造助料(如潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅或硬脂酸)或溶劑封裝材料，它們參與維持ROBO-2抑制劑的穩(wěn)定性、溶解性或活性。每種載體必須是“可接受的”的意思是與制劑中的其它成分相容并不會傷害病人。可作為藥學上可接受的載體的材料的一些示例包括：(1)糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素和醋酸纖維素；(4)黃蓍膠粉末(powdered tragacanth)；(5)麥芽糖；(6)明膠；(7)賦形劑，如可可油和栓狀蠟(suppository waxes)；(8)油類，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(9)二醇類，如丙二醇；(10)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(11)酯類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(12)瓊脂；(13)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(14)海藻酸；(15)無熱原水；(16)等滲鹽水；(17)林格氏溶液；(19)pH緩沖溶液；(20)多元酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(21)膨脹劑，如多肽和氨基酸；(22)血清成分，如血清白蛋白，高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)；(23)C2-C12的醇，如乙醇；以及(24)藥物制劑中使用的其它無毒相容物質。脫模劑、被膜劑、防腐劑和抗氧化劑也可用于該制劑。如“賦形劑”、“載體”、“藥學上可接受的載體”或類似的術語在此中可交換使用。

在此描述的ROBO-2抑制劑可專門制成用于以固體、液體或凝膠形式的化合物給予受治療者，包括以下適用的形式：(1)腸胃外給藥，例如通過皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射如無菌溶液或懸浮液，或緩釋制劑；(2)局部給藥，如乳膏、油膏或控釋貼劑或應用于皮膚的噴霧；(3)陰道內或直腸內，如陰道藥栓、乳膏或泡沫；(4)通過眼睛；(5)透皮；(6)粘膜；以及(7)鼻。此外，ROBO-2抑制劑可通過藥物遞送系統植入或注射給受治療者。例如，可參見厄克特(Urquhart)等，《藥理學與毒理學年度回顧》(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)24：1984：199-236；路易斯編輯，《農藥和醫(yī)藥的控釋》(普雷納姆出版社，紐約，1981)；美國專利申請NO.3773919，和美國專利申請NO.353270960。

可用于在此描述的方法的、包括在此描述的ROBO-2抑制劑的該組合物的制劑和給藥模式的進一步的具體實施方式，描述如下。

腸胃外劑型。ROBO-2抑制劑的腸胃外劑型也可通過多種途徑給予患有慢性腎臟疾病的受治療者，包括但不限于，皮下、靜脈內(包括彈丸注射)、肌肉內和動脈內。由于腸胃外劑型給藥一般繞過了受治療者對污染物的天然防御屏障，所以腸胃外劑型優(yōu)選無菌或能夠在給藥于受治療者前滅菌。腸胃外劑型的示例包括但不限于，隨時可以注射的溶液，隨時可以溶解或懸浮在藥學上可接受的載體中用于注射的干燥產品，隨時可以注射的懸浮液，控釋腸胃外劑型以及乳劑。

可用于提供公開的腸胃外劑型的合適的載體是本領域技術人員眾所周知的。示例包括但不限于，無菌水；USP注射用水；鹽水；葡萄糖溶液；水性載體例如但不限于氯化鈉注射液，林格注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化鈉注射液和乳酸鈉林格注射液；水混溶載體，例如但不限于，乙醇，聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水溶性載體，例如但不限于，玉米油，棉籽油，花生油，芝麻油，油酸乙酯，肉豆蔻酸異丙酯和苯甲酸芐酯。

在一些具體實施方式中，含有有效量ROBO-2抑制劑的組合物可適合于口服給藥，如離散劑型，例如，但不限于，片劑(包括但不限于刻痕片劑或包衣片劑)，丸劑，囊片，膠囊，咀嚼片，粉末包，扁囊劑，錠劑，糯米紙囊劑，噴霧劑，或液體例如但不限于，以水液體、非水液體、水包油乳劑或油包水乳劑形式的糖漿劑、酏劑、溶液或懸浮液。這些組合物含有預定量的所公開的化合物的藥學上可接受鹽，并可通過本領域技術人員公知的制造方法制成。一般可參考，雷明頓制藥科學，第18版，麥出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1990(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing,Easton,Pa.(1990))。

由于其易于給藥，使用固體藥物賦形劑的片劑和膠囊劑代表最有利的固體口服單位制劑。如果需要，可通過標準的水或非水化技術將片劑包衣。這種劑型可通過任意制藥方法制成。一般而言，藥物組合物和劑型這樣制得：將活性成分與液體載體、良好分散的固體載體或兩者均勻地并充分地混合，然后如果需要的話，將產品成型為所需形式。在一些具體實施方式中，口服劑型不適用于抗生素藥劑。

含有有效量ROBO2抑制劑的組合物的典型的口服劑型可根據傳統制藥復合技術制成，將緊密混合物(intimate admixture)中ROBO2抑制劑的藥學上可接受的鹽與至少一種賦形劑結合制成。賦形劑可根據給藥所需組合物的形式而采取各種各樣的形式。例如，適用于口服液體或氣霧劑劑型的賦形劑包括，但不限于，水、二醇類、油類、醇類、調味劑、防腐劑和著色劑。適用于固體口服劑型(例如散劑、片劑、膠囊劑和囊片)的賦形劑的示例包括，但不限于，淀粉、糖、微晶纖維素、高嶺土、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑。

適用于在此所述的藥物制劑的粘合劑包括，但不限于，玉米淀粉、土豆淀粉或其它淀粉，明膠，天然或合成的樹膠例如阿拉伯樹膠，藻酸鈉，海藻酸，其它藻酸鹽，黃蓍膠粉末，瓜爾膠，纖維素及其衍生物(如乙基纖維素、醋酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉)，聚乙烯吡咯烷酮，甲基纖維素，預糊化淀粉，羥丙基甲基纖維素(如編號2208、2906、2910)，微晶纖維素，以及上述混合物。

適用于在此所述的藥物制劑的填充劑包括，但不限于，滑石，碳酸鈣(例如顆?；蚍勰?，微晶纖維素，粉末纖維素，葡萄糖結合劑，高嶺土，甘露醇，硅酸，山梨醇，淀粉，預糊化淀粉，以及上述混合物。在此所述藥物組合物中的粘合劑或填充劑通常占藥物組合物重量的約50％至約99％。

用在在此的口服藥物制劑中的崩解劑是當片劑暴露于含水環(huán)境時，使其碎裂。既不是太少也不是太多以致破壞性地改變活性成分釋放的有效量的崩解劑可用于形成在此描述的ROBO2抑制劑的固體口服劑型。所用崩解劑的量根據制劑的類型而不同，其是易被本領域普通技術人員辨別?？捎糜谛纬煽诜幬镏苿┑谋澜鈩┌?，但不限于，瓊脂、海藻酸、碳酸鈣、微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、波拉克林鉀、羧基乙酸淀粉鈉、土豆或木薯淀粉、其它淀粉、預糊化淀粉、黏土、其它藻膠、其它纖維素、樹膠，以及上述混合物?？梢杂糜谛纬稍诖嗣枋龅腞OBO2抑制劑的藥物制劑的潤滑劑包括，但不限于，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，礦物油，輕礦物油，甘油，山梨醇，甘露醇，聚乙二醇，其它二醇，硬脂酸，月桂基硫酸鈉，滑石，氫化植物油(如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油)，硬脂酸鋅，油酸乙酯，月桂酸乙酯，瓊脂，以及上述混合物。其他的潤滑劑，包括，例如，syloid硅膠(200，由馬里蘭州巴爾的摩的W.R.Grace Co.生產)，合成二氧化硅的凝聚型氣溶膠(由德克薩斯州普萊諾的Degussa Co.銷售)，CAB-O-(一種由馬薩諸塞州波士頓的Cabot Co.銷售的熱解二氧化硅產品)，以及上述混合物。如果使用的話，潤滑劑通常以小于其所摻入的藥物組合物或劑型重量的約1％的量使用。

在其它具體實施方式提供了不含乳糖的藥物制劑和劑型，其中，這些組合物優(yōu)選含有少量，如果有的話，乳糖或其它單糖或二糖。如在此所用的術語“不含乳糖”是指乳糖的存在量，如果有的話，不足以實質上增加活性成分的降解速率。在此公開的不含乳糖的組合物可包含本領域公知的賦形劑，以及被引入在此作為參考的USP(XXI)/NF(XVI)所列舉的賦形劑。

在一些具體實施方式中，ROBO2抑制劑的口服制劑進一步涵蓋含有以在此的ROBO2抑制劑為活性成分的無水藥物組合物和劑型，因為水可以促進某些化合物降解。例如，為了確定制劑隨時間變化的性質，如保質期或穩(wěn)定性，加入水(例如5％)作為一種模擬長期貯存的方式在制藥領域是被廣泛接受的。參見例如延斯T.卡斯滕森(Jens T.Carstensen)，《藥物穩(wěn)定性：原則和實踐》(Drug Stability:Principles&Practice)：379-380(第二版，馬塞爾德克爾出版社(Marcel Dekker)，紐約州紐約，1995)(2nd ed.,Marcel Dekker,NY,N.Y.:1995)。在此描述的無水藥物組合物和劑型可采用無水或低水分材料在低水分或低濕度條件下制成。如果預計在生產、包裝和/或儲存期間會與水分和/或濕氣發(fā)生大量接觸，那么包含乳糖和至少一種含有伯胺或仲胺的活性成分的藥物組合物和劑型優(yōu)選是無水的。無水組合物優(yōu)選用已知可防止暴露于水的材料來包裝，因此可將它們裝在合適的制劑盒中。合適的包裝的例子包括但不限于密封的薄膜、塑料、帶有干燥劑或沒有干燥劑的單位劑量容器(如藥瓶)、水泡包裝和窄條包裝。

氣溶膠劑型。ROBO-2抑制劑可與合適的推進劑一起裝在加壓氣溶膠容器中，推進劑例如碳氫化合物推進劑，如丙烷、丁烷或異丁烷與常規(guī)助劑。ROBO-2抑制劑也可在非加壓形式下如噴霧器或霧化器中給藥。ROBO-2抑制劑也可以干粉形式直接給予呼吸道，例如，通過使用吸入器。

通過舉例說明的方式，合適的粉末組合物包括ROBO-2抑制劑與乳糖或其它適于支氣管給藥的惰性粉末充分混合的粉末制劑。粉末組合物可通過氣溶膠分配器給藥或裝在易碎膠囊中，受治療者可以插入裝置，該裝置可刺穿膠囊并將粉末源源不斷吹出以適于吸入。該組合物可能包括推進劑、表面活性劑和共溶劑，并裝入傳統氣溶膠容器中，其上有適當的計量閥關閉。

遞送至呼吸道的氣溶膠是本領域已知的。參見例如阿杰伊，A.和格連J.，《藥學與臨床研究》，1:565-569(1990)(Adjei,A.and Garren,J.Pharm.Res.,1:565-569(1990))；扎嫩P.和拉姆，J.-W.J.，《國際藥學雜志》，114:111-115(1995)(Zanen,P.and Lamm,J.-W.J.Int.J.Pharm.,114:111-115(1995))；貢達I.，“用于遞送治療劑和診斷劑至呼吸道的氣溶膠”在治療性藥物載體系統中的關鍵回顧，6:273-313(Gonda,I."Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract,"in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,6:273-313(1990))；安德森等，《美國呼吸疾病評論》，140：1317-1324(1989)(Anderson et al.,Am.Rev.Respir.Dis.,140:1317-1324(1989))并具有肽和蛋白質全身遞送潛能(巴頓和普拉茨，《高等藥物輸送評論》，8:179-196(1992))(Patton and Platz,Advanced Drug Delivery Reviews,8:179-196(1992))；Timsina等，《國際藥學雜志》，101:1-13(1995)(Timsina et.al.,Int.J.Pharm.,101:1-13(1995))；以及坦西I.P.，《噴霧技術市場》，4:26-29(1994)(Tansey,I.P.,Spray Technol.Market,4:26-29(1994))；弗倫奇D.L.，愛德華D.A.和尼文R.W.，《氣溶膠科學與技術》，27:769-783(1996)(French,D.L.,Edwards,D.A.and Niven,R.W.,Aerosol Sci.,27:769-783(1996))；維薩J.，《粉體工程》，58:1-10(1989)(Visser,J.,Powder Technology 58:1-10(1989))；路德S.和R.H.穆勒，《控釋雜志》，22:163-172(1992)(Rudt,S.and R.H.Muller,J.Controlled Release,22:263-272(1992))；塔巴達Y.和Y.Ikada，《生物醫(yī)學材料研究雜志》，22:837-858(1988)(Tabata,Y,and Y.Ikada,Biomed.Mater.Res.,22:837-858(1988))；沃爾D.A.，《給藥雜志》，2:101-120，1995(Wall,D.A.,Drug Delivery,2:10 1-20 1995))；巴頓和普拉茨，《先進藥物輸送評論》，8:179-196(1992)(Patton,J.and Platz,R.,Adv.Drug Del.Rev.,8:179-196(1992))；布里翁P.，《先進藥物輸送評論》，5:107-132(1990)(Bryon,P.,Adv.Drug.Del.Rev.,5:107-132(1990))；巴頓J.S.，等，《控釋雜志》，28:1579-1585(1994)(Patton,J.S.,et al.,Controlled Release,28:15 79-85(1994))；達蒙B.和貝恩斯W.，《生物自然技術》(1996)(Damms,B.and Bains,W.,Nature Biotechnology(1996))；尼文R.W.等，《藥學與臨床研究》，12(9)：1343-1349(1995)(Niven,R.W.,et al.,Pharm.Res.,12(9)；1343-1349(1995))；以及小林S.等，《藥學與臨床研究》，13(1)：80-83(1996)(Kobayashi,S.,et al.,Pharm.Res.,13(1):80-83(1996))，在此通過引入將其整體作為參考并入本文。

在此所述ROBO-2抑制劑制劑進一步涵蓋包括以公開的化合物作為活性成分的無水藥物組合物和劑型，因為水可以促進某些化合物降解。例如，為了確定制劑隨時間變化的性質，如保質期或穩(wěn)定性，加入水(例如5％)作為一種模擬長期貯存的方式在制藥領域是被廣泛接受的。參見例如延斯T.卡斯滕森(Jens T.Carstensen)，《藥物穩(wěn)定性：原則和實踐》(Drug Stability:Principles&Practice)：379-380頁(第二版，馬塞爾德克爾出版社(Marcel Dekker)，紐約州紐約，1995)(2nd ed.,Marcel Dekker,NY,N.Y.:1995)。在此描述的無水藥物組合物和劑型可采用無水或低水分材料在低水分或低濕度條件下制成。如果預計在生產、包裝和/或儲存期間會與水分和/或濕氣發(fā)生大量接觸，那么包含乳糖和至少一種含有伯胺或仲胺的活性成分的藥物組合物和劑型優(yōu)選是無水的。無水組合物優(yōu)選用已知可防止暴露于水的材料來包裝，因此可將它們裝在合適的制劑盒中。合適的包裝的例子包括但不限于密封的薄膜、塑料、帶有干燥劑或沒有干燥劑的單位劑量容器(如藥瓶)、水泡包裝和窄條包裝。

控制釋放劑型和延遲釋放劑型。在在此所述方面的一些具體實施方式中，ROBO-2抑制劑可通過控制或延遲釋放的形式給予受治療者。理想地，在醫(yī)療中使用最優(yōu)設計的控釋制劑的特征在于：采用最少藥物，在短時間內治愈或控制病癥?？蒯屩苿┑膬?yōu)點包括：1)延長藥物活性；2)降低給藥頻率；3)提高受治療者依從性；4)使用更少的總藥物；5)減少局部或全身副作用；6)最小化藥物積累；7)減少血液水平波動；8)提高療效；9)減少增強作用或藥物活性損失；以及10)改善的疾病或狀態(tài)的控制速度(吉姆，朱成，《控釋劑型設計》(Technomic出版，蘭開斯特，賓夕法尼亞州，2000年))(Kim,Cherng-ju,Controlled Release Dosage Form Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000))?？蒯屩苿┛捎糜诳刂剖?I)化合物的起始作用、作用持續(xù)時間、治療窗內的血漿水平和峰值血液水平。特別地，控制或延遲釋放劑型或制劑可用于保證實現式(I)化合物的最大效果，同時最小化潛在的負面影響和安全隱患，這可以在從劑量下給藥的藥物(即，低于最小治療水平)以及超過該藥物毒性水平時發(fā)生。

各種已知的控制或延遲釋放劑型、制劑或裝置適于與在此所述ROBO-2抑制劑共同使用。示例包括但不限于以下文件中描述的那些：美國專利號3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566和6,365,185B1，每一個文件通過引入作為參考將其整體并入本文。例如通過使用例如羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質、凝膠、可滲透性膜、等滲系統(例如(阿爾扎公司，山景城，加利福尼亞州，美國))、多層包衣、微顆粒、脂質體或微球體或其組合來產生不同比例的理想釋放效果，這些劑型可用于緩釋或控釋一種或多種活性成分。另外，離子交換材料可用于制備所公開化合物的固定化形式、吸附鹽形式，從而實現藥物的控制遞送。特異性的離子交換材料的示例包括但不限于， A568和 AP143(羅門哈斯公司，春之樓，賓夕法尼亞州，美國)(Rohm&Haas,Spring House,Pa.USA)。

在此所述方法的一些具體實施方式中，用于在此描述方法的ROBO-2抑制劑通過持續(xù)釋放或脈沖形式給予受治療者。脈沖療法不是一種相同量組合物隨時間推移的不連續(xù)給藥的形式，而是包括在降低頻率或降低給藥劑量時進行相同劑量組合物的給藥。當受治療者持續(xù)發(fā)生失調時，持續(xù)釋放或脈沖給藥是特別優(yōu)選的，例如，當受治療者患有慢性腎臟疾病?？梢詼p少每個脈沖的劑量，并且在此所述給予的ROBO-2抑制劑的總量隨著受治療者或患者治療過程中減至最小。

必要時候，脈沖之間的間隔可由本領域普通技術人員確定。經常地，脈沖間的間隔一般可通過在下一脈沖遞送之前，受治療者體內不再檢測到組合物或該組合物的活性組分時，給予組合物的另一劑量計算。間隔也可根據組合物在體內的半衰期計算。間隔可以計算為大于體內的半衰期，或2、3、4、5甚至10倍以上的該組合物的半衰期。美國專利號4,747,825、4,723,958、4,948,592、4,965,251和5,403,590公開了用于脈沖組合物通過輸注或其它形式遞送至受治療者的多種方法和裝置。

在一些具體實施方式中，可制備包含ROBO-2抑制劑的持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適示例包括含有抑制劑的固體疏水性聚合物的半滲透基質，其中基質以成型制品如膜或微膠囊存在。持續(xù)釋放基質的示例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚乳酸(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸(y ethyl-L-glutamate)共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如醋酸亮丙瑞林(LUPRON DEPOT)(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

用于體內給藥的含有ROBO-2抑制劑的制劑優(yōu)選是無菌的。例如，采用無菌過濾膜過濾或其它本領域技術人員已知的方法可輕易實現無菌。

在此一些方面還提供了分析方法、方法和系統，其依照指示慢性腎臟疾病的生物標志物或慢性腎臟疾病或蛋白尿的預傾向，基于ROBO2的表達譜或序列信息，確定個體是否具有慢性腎臟疾病或慢性腎臟疾病或蛋白尿的預傾向。如在此所示，ROBO2作為生物標志物對鑒定受治療者是否患有慢性腎臟疾病或是否具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的高風險，或監(jiān)控慢性腎臟疾病或蛋白尿進程的治療效果是有用的。

如在此所用的“生物標志物”是指一種有機生物分子，其區(qū)別地存在于樣品中使一種表型狀態(tài)(phenotypic status)受治療者(例如患有一種疾病)與另一種表型狀態(tài)受治療者(例如沒有患病)區(qū)分開。如果計算得到的不同群組中的生物標志物的平均或中位表達水平具有統計顯著性，則生物標志物區(qū)別存在于不同表型狀態(tài)中。統計顯著性一般檢驗，除其它外還包括，t-檢驗、方差分析(ANOVA)、Kruskal-Wallis秩和檢驗、Wilcoxon秩和檢驗、曼-惠特尼U檢驗和機率比。生物標志物，單獨或組合，提供受治療者屬于一種表型狀態(tài)或另一種的相對風險的測量。照這樣，它們作為標志物對疾病(診斷)、藥物和藥物毒性的治療效果(診療)是有用的。

用于在此所述分析方法的ROBO2表達可由任何合適方法檢測，包括蛋白質水平檢測或mRNA表達水平檢測。ROBO2多肽可以以任何可從受治療者獲得的生物樣本中找到的形式檢測，或者任何操縱生物樣本引起的形式(例如樣本處理引起的)。ROBO2修飾形式可包括如下方式獲得的產品：等位基因變異體、剪接變異體、翻譯后修飾(例如糖基化、溶蛋白質水解裂解(如母本蛋白質片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、半胱氨?；?cysteinylation)、磺化、乙?；鹊?、低聚反應、解低聚反應(以使單體從蛋白質多聚體形式中分離)、變性作用等等。

設計的在此所述分析方法用以檢測ROBO2的所有形式或特殊形式。在需要時，不同形式ROBO2之間進行區(qū)分，例如不同亞型，可通過使用基于區(qū)分不同形式的物理特性的檢測方法完成，物理特性例如，不同分子量、不同分子大小、存在/不存在不同表位等等。

因此，在此一些方面提供了用于診斷受治療者患有慢性腎臟疾病或具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的分析方法，該分析方法包括：測量從受治療者獲得的生物樣本中ROBO2蛋白質或核酸水平，其中，如果從受治療者取得的生物樣本中ROBO2的水平等于或高于(例如統計量上明顯高于)ROBO2閾值參考水平，受治療者極有可能具患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，或具有慢性腎臟疾病。例如，ROBO2水平增加大于約10％，或大于約20％，或大于約30％，或大于約40％，或大于約50％，或大于約60％，或更多，與ROBO2閾值參考水平相比。在一些具體實施方式中，ROBO2水平的增加高于中值或平均ROBO2閾值參考水平至少一個標準偏差或至少兩個標準偏差，或更多。例如，所述中值或平均ROBO2閾值參考水平可從5個或更多個沒有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的受治療者取得的樣本、或5個或更多個從相同受治療者在不同時間點取得的樣本中獲得。

在這些分析方法的一些具體實施方式中，將生物樣本中測得的ROBO2的量與參考閾值水平或參考生物樣本進行相比，參考生物樣本例如從年齡匹配的正常對照(例如不具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的年齡匹配的受治療者)得到的生物樣本，或健康的受治療者，例如健康個體。

在的一些具體實施方式中，在此公開的分析方法、系統和試劑盒可也可用于監(jiān)測給予受治療者的治療進程。例如，可以測量受治療者的生物樣本中第一時間點(如t1)的ROBO2的水平，并與ROBO2生物標志物參考閾值水平相比，如果測得的ROBO2水平等于或高于參考閾值水平，可以給予受治療者合適的治療性療法或養(yǎng)生法，以延遲或降低慢性腎臟疾病或蛋白尿的發(fā)生，例如，如在此公開方法的增加鍛煉，降低心臟壓力，調整飲食等等，然后，ROBO2的生物標志物蛋白質面板水平可在第二時間點(如t2)和隨后時間點(如t3、t4、t5等等)測得，并與一個或多個時間點(如t1或任何隨后時間點)的tROBO2水平或ROBO2的參考閾值水平相比，以確定治療性治療或藥物治療或養(yǎng)生法對于降低慢性腎臟疾病或蛋白尿風險、延遲或減少慢性腎臟疾病或蛋白尿發(fā)生的是否有效。在一些這樣的具體實施方式中，在此公開的分析方法、系統或試劑盒可能用于監(jiān)測有癥狀的受治療者(例如，已知患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的受治療者)的治療性治療，這里有效的治療是可以減少受治療者的ROBO2，可選擇地，在此公開的分析方法、系統或試劑盒可能用于監(jiān)測有癥狀的受治療者的預防性治療(例如，用于預防受治療者慢性腎臟疾病或蛋白尿的發(fā)生)效果，例如，根據在此公開的方法，或其它本領域已知的方法或因為遺傳原因，已經鑒定這里的受治療者具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險。

在此使用的術語“樣本”一般是指含有核酸、DNA或RNA，或氨基酸的任何材料。一般而言，這樣的材料會以下面的形式存在：血液樣本、大便樣本、組織樣本、細胞、細菌、組織切片或口腔抹試。樣本是可以被制備的，例如樣本可以是新鮮的、固定的、冷凍的或嵌入石蠟中。在此使用的術語“生物樣本”是指從受治療者取得的細胞或細胞群或一些組織或液體。最經常的是，樣本可以脫離受治療者，但術語“生物樣本”也可是指體內分析的細胞或組織，即不需要脫離受治療者。經常地，“生物樣本”含有來自動物的細胞，但該術語也可是指非細胞生物材料，例如血液、唾液或尿液中的非細胞組分，其可用于測量基因表達水平。生物樣本包括但不限于，活組織切片、刮片(scrapes)、全血、血漿、血清、尿液、唾液、細胞培養(yǎng)或腦脊液。生物樣本還包括活組織切片、細胞培養(yǎng)液。生物樣本或組織樣本可以是指脫離個體的組織或液體樣本，例如包括但不限于，尿液、血液、血漿、血清、腎臟活組織切片、大便、痰液、脊髓液、胸膜液、乳頭吸出物(nipple aspirates)、淋巴液、皮膚外部、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、淚水、唾液、奶、細胞(包括但不限于血細胞)、腫瘤、器官以及體外細胞培養(yǎng)物組分的樣本。在一些具體實施方式中，當獲得尿液樣本時，離心尿液樣本以沉淀任何腎臟細胞，基于此可進行在此所述的分析方法和方法。在一些具體實施方式中，樣本來自腎臟活組織切片，例如腎臟或其部分的芯針活組織切片，例如足細胞樣本。另外，使用細針抽吸樣本。在一些具體實施方式中，生物樣本是可以制備的，例如生物樣本可以是新鮮的、固定的、冷凍的或嵌入石蠟中?？赏ㄟ^將細胞樣本脫離受治療者而得到樣本，但也可以通過使用預先分離的細胞(例如，由另一人分離)來完成，或在此描述的體內的方法。

如在此使用的術語“表達”可交換地是指多肽或蛋白質的表達或多核苷酸的表達或基因的表達。表達也指預轉譯修飾蛋白的表達和翻譯后修飾的蛋白質的表達，以及前體mRNA分子，或者剪接或成熟的mRNA分子的表達。例如，多核苷酸的表達可通過測量RNA轉錄分子的產生來確定，如信使RNA(mRNA)轉錄水平。例如，蛋白質或多肽的表達可采用與多肽結合的抗體通過免疫分析確定。應用于多核苷酸的術語“編碼”是指一種可以“編碼”多肽或蛋白質的多核苷酸，如果以其天然狀態(tài)或當采用本領域技術人員公知的的方法進行操作時，它可以被轉錄以產生可以被翻譯成氨基酸序列而生成多肽和/或其片段的RNA。反義鏈是這些核酸的補體，由此可推導出編碼序列。術語“內源性地表達”或“內源性表達”是指基因產物在正常水平和在正常調節(jié)該細胞類型中的表達。

可以用于在此所述分析方法、方法和系統的用于測量樣本或生物樣本中ROBO2蛋白質或核酸水平的檢測方法，包括光學方法，電化學方法(伏安法和電流分析技術)，原子力顯微鏡技術和射頻方法，例如多級共振光譜。光學方法包括顯微鏡檢查，包括共焦和非共焦兩者，熒光檢測，發(fā)冷光，化學發(fā)光，吸光度，反射比，透射比，雙折射或折射率(例如表面等離子體共振，橢圓測量術，共振鏡法，光柵耦合器波導法或干涉量度法)。

在此所述分析方法、方法和系統的這些具體實施方式中，其中，ROBO2蛋白質水平是可以測量的，例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的蛋白質水平，人們可以使用任何本領域普通技術人員公知的蛋白質組學方法來測量生物樣本中生物標志物蛋白的水平。測量可以是定量的或定性的，只要測量能夠確定或指示生物樣本中ROBO2蛋白質的水平是否等于、高于或低于ROBO2蛋白的參考閾值水平。

在一些具體實施方式中，測得的ROBO2蛋白質水平可以是測定ROBO2蛋白質本身數量的ROBO2蛋白質水平的初始測量，例如，通過測量樣本中ROBO2蛋白質分子數量)，或者在一些具體實施方式中，它可以是ROBO2蛋白質二級測量(從該測量可以，但不必然，推導出ROBO2蛋白質的數量，例如功能活性的測量或核酸的測量，如編碼ROBO2蛋白質的mRNA)。可從初始測量導出或得到定性數據。

在此所述分析方法和方法的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白質水平可采用基于親和力的測量技術測得。與抗體相關的“親和力”是本領域很好理解的術語，且意思是抗體與結合伴侶結合的程度或強度，結合伴侶例如在此所述的生物標志物(或其抗原決定部位)。親和力可通過本領域已知的多種方法測量和/或表達，包括但不限于，平衡解離常數(K_D或K_d)，表觀平衡解離常數(K_D或K_d)，以及IC₅₀(競爭分析方法中實現50％抑制的所需量，與在此的“I50”可交換使用)。可以理解的是，基于本發(fā)明的目的，親和力是結合至表位的給定數量的抗體的平均親和力。

基于親和力的測量技術利用特異性結合至測量中的生物標志物蛋白質(一種“親和試劑”，例如抗體或適體)的分子，雖然也可使用其它技術，如基于光譜的技術(例如基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法，MALDI-TOF光譜)，或測量生物活性的分析方法(例如測量生長因子絲裂原活性的分析方法)。用于在此所述分析方法和方法的基于親和力的測量技術可包括基于抗體的分析方法(免疫分析法)和利用適體(與其它分子特異性結合的核酸分子)的分析方法，例如酶聯寡聚核苷酸吸附試驗(ELONA)。此外，利用抗體和適體兩者的分析方法預期也是可以的(例如利用抗體捕獲和適體檢測的夾心格式分析)。各種各樣基于親和力的試驗也是本領域公知的。

基于親和力的分析方法使用至少一種源于生物標志物蛋白質的表位，即ROBO2，且多種基于親和力的分析方法的格式使用一種以上的表位(即“夾心”格式分析方法涉及兩種或多種表位；至少一種表位用于捕獲生物標志物蛋白質，和至少一種不同表位用于檢測標志物)。

基于親和力的分析方法可以是競爭或直接反應格式，使用夾心型格式，且可進一步是多相的(如利用固體支持物)或同質的(如在單相中發(fā)生)，和/或使用免疫沉淀反應。多種分析方法包括使用標記親和試劑(例如抗體、多肽或適體)；該標簽可以是，例如，酶的、熒光的、化學發(fā)光的、放射性的或染料分子。放大探針信號的分析方法也是已知的，這些分析方法的示例為利用生物素和抗生物素蛋白的分析方法，以及酶標記和介導的免疫分析方法，例如酶聯免疫吸附測定方法(ELISA)和ELONA分析方法。例如，生物液體樣本的生物標記物濃度可由分析方法或ELISA測量。生物標志物或特異性于生物標志物的試劑可附于表面，并可直接或間接測量水平。

在此所述分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白質水平可采用基于親和力的免疫分析測定技術測量。

免疫分析技術可包括任何定性或定量測量生物樣本中ROBO2蛋白質水平的免疫分析技術。合適的免疫分析技術包括但不限于，放射免疫檢定法，ELISA(酶聯免疫吸附分析)，“夾心”免疫分析法，免疫放射測定法，免疫擴散分析法，原位免疫分析法(例如采用膠體金、酶或放射性同位素標記)，Western印跡分析，免疫沉淀反應法，免疫熒光分析法，免疫電泳分析法，熒光免疫分析(FIA)，免疫放射測定法(IRMA)，免疫酶測定法(IEMA)，免疫發(fā)光測定法以及免疫熒光測定法(Madersbacher S.，伯杰P.，《抗體與免疫確定法》，方法，21:41-50，2000年)(Madersbacher S,Berger P.Antibodies and immunoassays.Methods 2000；21:41-50)，化學發(fā)光法，免疫-PCR技術和Western印跡分析。同樣地，可定性或定量測量生物樣本中生物標志物水平的基于適體的分析方法可用于在此所述的分析方法、方法和系統中。通常，在免疫分析幾乎所有格式中，抗體可代替適體，盡管適體允許額外的分析方法格式(例如采用核酸放大技術如PCR(美國專利號4,683,202)的結合適體的放大)或與合成引物的等溫放大(美國專利號6,251,639和6,692,918)。

在此所述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白水平可采用基于親和力的免疫分析技術進行測量，免疫分析法可通過測量生物標志物/抗體相互作用的蛋白質/抗體相互作用程度完成。可使用任何已知的免疫分析方法。

在一些具體實施方式中，結合伴侶，如在結合分析方法中結合至ROBO2蛋白的抗體或配體，優(yōu)選標記的特異性結合伴侶，但不一定是抗體。結合伴侶通常標記本身，但可替換地，其可通過產生信號的二次反應而被檢測到，信號例如是從另一標記的物質產生的。

因此，特異性結合至ROBO2蛋白的抗體可用于在此的分析方法、方法和系統中，用于確定生物樣本中ROBO2蛋白的存在和/或其量，其可用于檢測診斷樣本中存在的ROBO2蛋白濃度的增加或降低。這樣的抗體可通過任何免疫診斷領域熟知的方法找到?？贵w可以是蛋白質生物學相關狀態(tài)的任何抗ROBO2蛋白抗體。因此，例如，它們可以針對ROBO2蛋白的以糖基化形式存在于人體中的非糖基化形式而被找到，或針對攜帶ROBO2蛋白相關表位的縮氨酸。

在此的這些分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，可使用放大的分析方法格式，由此檢測的相對低的蛋白質水平的可產生增強的“信號”。放大的免疫分析法的一種具體格式是增強的化學發(fā)光法。例如，抗體用辣根過氧化物酶標記，參與與魯米諾、過氧化物底物和增強發(fā)射光強度和持續(xù)時間的化合物的化學發(fā)光反應，特別是4-碘苯酚或4-羥基肉桂酸。

在此的這些分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，可使用包括免疫-PCR的放大的免疫分析法。在這個技術中，抗體與任意含有PCR引物的DNA分子共價連接，由此，連接有抗體的DNA用聚合酶鏈反應進行放大。參見E.R.亨德里克森等，《核酸研究》，23:522-529(1995)(E.R.Hendrickson et al.,Nucleic Acids Research 23:522-529(1995))。

因此，在此描述的分析方法、方法和系統的所有具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用蛋白結合劑確定，在此也可稱為“蛋白質結合實體”或“親和試劑”，具體來說，是抗體。例如，具體來說是抗體如抗-生物標志物抗體的親和試劑可用于免疫分析法中，特別是ELISA(酶聯免疫吸附分析法)。在具體實施方式中，生物標志物蛋白的水平可在生物樣本中采用本領域公知的方法測量，例如包括但不限于，同種型蛋白質的同種型特異性化學或酶分解，免疫印跡法，免疫組織化學分析，ELISA以及質譜分析法。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用“酶聯免疫吸附分析法(ELISA)”測量。ELISA是一種采用標記(如酶聯)形式的抗體檢測和測量抗原濃度的技術。本領域技術人員公知的ELISA有不同形式。以下文獻中描述了本領域已知的ELISA標準技術：《免疫診斷方法》，第二版，羅斯和比格茨編輯，約翰威利&傘斯，1980(Methods in Immunodiagnosis",2nd Edition,Rose and Bigazzi,eds.John Wiley&Sons,1980)；坎貝爾等，《方法與免疫學》，W.A.本杰明公司，1964(Campbellet al.,"Methods and Immunology",W.A.Benjamin,Inc.,1964)；和Oellerich M.1984，《臨床化學和臨床生物化學》，22：895-904(Oellerich,M.1984,J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,22:895-904.)。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用夾心ELISA分析方法測量?！皧A心ELISA”中，抗體(例如抗-酶)連接至固相(即微量滴定板)，并暴露在含有抗原(例如酶)的生物樣本中。然后清洗固相以除去未結合的抗原。隨后標記的抗體(例如酶聯)結合至結合抗原(如果存在)以形成抗體-抗原-抗體的夾心。因此，采用這種方法，ROBO2的第一抗體與例如塑料微量滴定板的孔的固相結合，并與樣本一起培養(yǎng)，分析ROBO2蛋白特異性的標記第二抗體。與抗體連接的酶的示例為堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光素酶，脲酶和β-半乳糖苷酶。連接抗體的酶與底物反應，生成可以測量的有色反應產物。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平采用抗體捕獲分析方法或競爭ELISA測量。在“競爭ELISA”中，抗體與含有抗原(即酶)的樣本一起培養(yǎng)。然后抗原-抗體混合物與覆蓋抗原(即酶)的固相(例如微量滴定板)接觸。樣本中存在的抗原越多，可用于與固相結合的自由抗體就越少。然后將標記的(例如酶聯)第二抗體加至固相中，以確定與固相結合的初始抗體的量。因此，在一些這樣的具體實施方式中，生物測試樣本可以與固相結合，并且可添加抗ROBO2蛋白抗體(例如與ROBO2特異性結合的抗體)并使其結合。清洗未結合材料后，與固相結合的抗體的量可采用與第一抗體相反的標記的第二抗體確定。

在這些分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，標記物優(yōu)選酶。例如，酶的底物可為顯色的、熒光的或化學發(fā)光的。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用免疫組織化學法測量。在“免疫組織化學法”中，通過將組織暴露在被檢測蛋白特異性的抗體中，將組織切片用于測試特異性蛋白。然后，通過多種方法中的任一種將抗體可視化，以確定蛋白的存在和存在蛋白的量。用于可視化抗體的方法的示例，例如，通過將連接至抗體的酶(例如熒光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或β-半乳糖苷酶)，或化學方法(例如DAB/底物發(fā)色體)。然后將樣本經顯微鏡分析，優(yōu)選采用光學顯微鏡分析被可在可見光譜中檢測的著色劑染色的樣本，采用本領域技術人員已知的多種染色方法和試劑中的任一種方法。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用放射免疫檢定法測量。放射免疫檢定法是一種采用抗原的標記(如放射性或熒光性標記)形式檢測和測量抗原即ROBO2濃度的技術。抗原的放射性標記物的示例包括3H、14C和125I。生物樣本中ROBO2的濃度通過將生物樣本中的ROBO2與標記(例如放射性)的ROBO2競爭地與ROBO2抗體結合。為了保證標記的ROBO2和未標記的ROBO2之間的競爭性結合，標記的ROBO2存在的濃度足以使抗體的結合位點飽和。樣本中ROBO2濃度越高，結合至抗體的標記的ROBO2的濃度越低。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用免疫放射測定法(IRMA)測量。IRMA是一種免疫分析方法，其中，抗體試劑被放射性地標記。IRMA需要多價抗原綴合產物，采用技術與蛋白質綴合，所述蛋白質例如兔血清白蛋白(RSA)。多價抗原綴合物的每個分子必須具有至少2個抗原殘基，并且抗原殘基必須有足夠的分開距離，以使至少2個抗體結合至抗原。例如，在IRMA中，多價抗原綴合物可與固體表面如塑料球相連。與放射性標記的抗原結合的未標記的抗原和抗體“樣本”被加至含有多價抗原綴合物覆蓋的球的試管中。樣本中的抗原與多價抗原綴合物競爭抗原抗體結合位點。適當的潛伏期后，清洗掉未結合的反應物，并確定固體球表面的放射性量。結合的放射性抗體的量與樣本中抗原的濃度成反比。

其它用于檢測生物樣本中ROBO2蛋白水平的技術可依據醫(yī)生喜好進行，并根據在此的公開內容和生物樣本種類(即，血漿、尿液、組織樣本等)進行。Western印跡(托賓等，《美國國家科學院學報》，76:4350(1979))(Towbin et at.,Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))是這種技術中的一種，其中，適當處理的樣本在SDS-PAGE凝膠中運行，之后轉移至固體支持物載體上，如硝化纖維濾器?？蓹z測地標記的抗ROBO2抗體或蛋白結合分子用于評定ROBO2蛋白水平，可檢測標記物的信號強度與ROBO2蛋白的量對應。存在的ROBO2蛋白的量的水平也可被量化，例如通過光密度測定法。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的水平可采用質譜分析法如MALDI/TOF(飛行時間)，SELDI/TOF，液相色譜-質譜法聯用(LC-MS)，氣相色譜-質譜法聯用(GC-MS)，高效液相色譜-質譜法聯用(HPLC-MS)，毛細管電泳-質譜法聯用，核磁共振譜或串聯質譜(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)測量。參見例如美國專利申請?zhí)?0030199001、20030134304、20030077616，通過引用將其整體并入本文中。

在一些這樣的具體實施方式中，這些方法可與機器、計算機系統和媒體結合，以產生用于測量和分析生物樣本中ROBO2蛋白水平的自動化系統，并產生識別生物樣本中ROBO2蛋白的水平的可打印報告。在一些實例中，ROBO2水平的測量是通過確定模塊和比較模塊遠程完成的。

質譜法是本領域眾所周知的，并用于定量和/或鑒定生物分子，例如蛋白質(參見例如，Li等(2000)，Tibtech，18：151-160；Rowley等(2000)，方法，20:383-397；和Kuster和Mann(1998)，《結構生物學當代進展》，8:393-400)(see,e.g.,Li et al.(2000)Tibtech 18:151-160；Rowley et al.(2000)Methods 20:383-397；and Kuster and Mann(1998)Curr.Opin.Structural Biol.8:393-400)。此外，質譜技術已經發(fā)展至能夠對分離蛋白質的至少部分的從頭測序。Chait等，《科學》，262:89-92(1993)；Keough等，《美國科學院院刊》，96:7131-6(1999)(Chait et al.,Science 262:89-92(1993)；Keough et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:7131-6(1999))；Bergman評論，EXS 88:133-44(2000)(reviewed in Bergman,EXS 88:133-44(2000))。

在某些具體實施方式中使用氣相離子分光光度法。在其它具體實施方式中，采用激光解吸/電離質譜分析樣本?，F代激光解吸/電離質譜(“LDI-MS”)可以以兩種主要變型實施：基質輔助激光解吸/電離(“MALDI”)質譜和表面增強激光解吸/電離(“SELDI”)。在MALDI中，分析物與含有基質的溶液混合，并將一滴液體放在底物表面。然后將基質溶液與生物分子共結晶。將底物放入質譜儀中。激光能直接作用于底物表面，在此吸收和電離生物分子，沒有將其明顯分散。參見例如，美國專利號5,118,937(Hillenkamp等)和美國專利號5,045,694(Beavis&Chait)，通過引用將其整體并入本文中。

在SELDI中，修飾底物表面以使其成為解吸過程的積極參與者。一種變體的表面用吸附劑和/或捕獲試劑衍生化以使其選擇性地結合至感興趣的蛋白。另一種變體的表面用能量吸收分子衍生化，當用激光照射時，能量吸收分子不被吸收。另一種變體的表面用結合有感興趣蛋白和含有激光應用時斷裂的光解鍵的分子進行衍生化。在這些方法的每一種方法中，衍生劑定一般位于底物表面的特異性位置，其上施加樣本。參見例如美國專利號5,719,060和WO 98/59361，通過引用將其整體并入本文中。例如，這兩種方法可以組合，通過使用SELDI親和表面來捕獲分析物，以及將含有基質的液體加入捕獲的分析物中以得到能量吸收材料。

關于質譜的更多信息，參見例如《儀器分離原理(第3版)》，Skoog，桑德斯學院出版，費城，1985；和《化學技術柯克奧斯莫默百科全書(第4版)》，第15卷(John Wiley&Sons，紐約，1995)，第1071-1094頁(Principles of Instrumental Analysis,3rd edition.,Skoog,Saunders College Publishing,Philadelphia,1985；and Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,4th ed.Vol.15(John Wiley&Sons,New York 1995),pp.1071-1094)。

ROBO2蛋白水平的檢測通常取決于信號強度的檢測。反過來，這可以反映出結合至底物的多肽的數量和特征。例如，在某些具體實施方式中，比較第一樣本和第二樣本的光譜中峰值的信號強度(例如視覺上地、通過計算機分析等)，以確定具體生物分子的相對量?？墒褂密浖绦?，例如生物標記向導程序(賽弗吉生物系統公司，弗里蒙特，加利福尼亞州)，幫助分析質譜圖。質譜儀及其相關技術是本領域技術人員是熟知的。

在此所述分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白水平可采用凝膠電泳技術測量，具體為SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)，特別是二維PAGE(2D-PAGE)，優(yōu)選二維SDS-PAGE(2D-SDS-PAGE)。根據具體實施例，該分析方法是基于2D-PAGE，具體采用優(yōu)選4-9的pH范圍的固相pH梯度(IPGs)。

在此描述的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白水平可采用凝膠電泳技術測量，具體地，上述提到的技術與其它蛋白質分離方法組合，特別是本領域技術人員已知的方法，具體為色譜分析和體積排阻法。

在此所述分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白水平可采用共振技術測量，具體為表面等離子體共振。

在此所述分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，ROBO2蛋白水平可采用蛋白質生物芯片測量。生物芯片一般包括具有基本平坦表面的固體底物，其上連接有捕獲試劑(例如，一種吸附劑或親和劑)。通常，生物芯片表面包括多個結合有捕獲試劑的可尋址位置。生物芯片還可包括作為對照的結合捕獲試劑。蛋白質生物芯片是可適用于捕獲多肽的生物芯片。本領域中有多種蛋白質生物芯片。例如，這些包括以下公司生產的蛋白質生物芯片：賽弗吉生物系統公司(弗里蒙特，加利福尼亞)，Zyomyx(海沃市，加利福尼亞)，英杰公司(卡爾斯巴德，加利福尼亞)，Biacore(烏普薩拉，瑞典)和通用電器醫(yī)療生物學有限公司(伯克郡，英國)(Ciphergen Biosystems,Inc.(Fremont,Calif.),Zyomyx(Hayward,Calif.),Invitrogen(Carlsbad,Calif.),Biacore(Uppsala,Sweden)and Procognia(Berkshire,UK))。以下專利或公開的專利申請中描述了這些蛋白質生物芯片的示例：美國專利號6,225,047(Hutchens&Yip)，美國專利號6,537,749(Kuimelis and Wagner)，美國專利號6,329,209(Wagner等)，PCT國際公開號WO00156934(Englert等)，PCT國際公開號WO031048768(Boutell等)和美國專利號5,242,828(Bergstrom等)。

用于與來自受治療者ROBO2蛋白水平對比的ROBO2蛋白水平的參考閾值水平或數值，根據在此實施的方面或具體實施方式可以變化，通過本說明書和下述內容可理解。參考閾值取決于單個樣本值，例如從測試受治療者取得的生物樣本得到的值，但在較早的時間點(例如在第一時間點(t1)，例如測量的第一生物標志物水平，或在第二時間點(t2))。參考閾值也可能取決于樣本組，例如從測試受治療者樣本組中得到的值。例如，在一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的參考閾值取決于已知患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的受治療者中測量的ROBO2蛋白值的50％的值(例如，中值)。例如，ROBO2蛋白在50％以上(例如等于或高于中值水平)的受治療者可能具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險。參考閾值也可能取決于包括或排除待測樣本的樣本組。參考值可能取決于大量樣本，例如來自按時間順序排列的年齡匹配組的健康受治療者人群的樣本，或來自那些有或沒有具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的受治療者的樣本。在一些具體實施方式中，參考值比任何分析方法的平均值或中值，或預定的平均值或中值高至少一個，多個通常是至少兩個標準差。

通過在此所述分析方法、方法和系統用于評估受治療者極有可能經歷或患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，“參考閾值”通常是預先確定的參考閾值水平，例如，從與測試受治療者時間順序年齡匹配的時間順序年齡組的健康受治療者人群獲得的尿液、血清或血液的中值ROBO2蛋白。如前面指出的，在一些情況下，參考樣本也可以是性別匹配和/或基于種族匹配的。在一些具體實施方式中，ROBO2蛋白的參考閾值是一種生物樣本中生物標志物的中值水平，例如相同種族受治療者組的尿液、血液、血清，例如白種人，黑種人，西班牙人，亞洲人，以及亞洲-印第安人，巴基斯坦人，中東和/或太平洋島民。

通過在此所述分析方法、方法和系統用于評估受治療者極有可能經歷或患有的慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，ROBO2蛋白的參考閾值水平可能是預先確定的水平，例如從與測試受治療者時間順序年齡匹配的時間順序年齡組的健康受治療者人群獲得的平均或中值水平?？蛇x地，ROBO2蛋白的參考閾值水平可以是特定受治療者的歷史參考水平，其是從相同受治療者的樣本中得到的，但在早些時間點，和/或當受治療者沒有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的時候。在一些例子中，ROBO2蛋白的參考閾值水平可以是特定受治療者群組的歷史參考水平，這些受治療者均具有例如糖尿病引起的慢性腎臟疾病或蛋白尿。

在一些具體實施方式中，選擇健康受治療者作為對照受治療者。在一些具體實施方式中，對照組為年齡匹配的對照組。健康受治療者可用于獲得例如尿液樣本或血清樣本中ROBO2蛋白的參考閾值水平。在此所用“健康”受治療者或從“健康”受治療者或個體中獲得的樣本與本領域技術人員通常理解的相同。例如，如在此描述的，人們可以使用公知的方法評估腎臟功能，選擇健康受治療者為對照組受治療者，用于在此描述的診斷和治療方法。在一些具體實施方式中，身體健康、沒有慢性腎臟疾病跡象或癥狀的受治療者可作為健康對照受治療者。通過臨床醫(yī)生、實驗室測試進行的廣泛測試評價這些受治療者，包括病史、家族病史、身體和腎臟測試。慢性腎臟疾病和/或蛋白尿的分析示例包括但不限于，檢測尿液、血液或血清樣本中的特異性蛋白質和/或分子，如白蛋白、鈣、膽固醇、全血計數(CBC)、電解質、鎂、磷、鉀、鈉或其任意組合；檢測的分析方法，例如檢測肌酐清除率的分析方法；肌酐水平；BNU(尿素氮)；通過使用特異性的技術或程序，例如腹部CT掃描，腹部MRI，腹部超聲波，腎臟活組織切片，腎臟掃描，腎臟超聲波；通過檢測紅細胞生成素、PTH的分析方法或測試結果的變化；骨密度測試或維生素D；或這些檢測方法和分析方法的任意組合。

理想的年齡匹配的人群(從中可以得到參考值)是與測試受治療者或個體具有相同年齡順序，但相近年齡匹配的人群也是可以接受的。相近年齡匹配的人群可能是測試受治療者年齡順序的1、2、3、4或5年內，或可以是包括測試個體年齡順序的不同年齡順序群組。

與其“年齡順序匹配組”相比的受治療者通常是指，與年齡順序匹配在5-20年范圍內的受治療者相比。相近的年齡匹配的人群可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20年增量(例如“5年增量”組可以是，62歲受治療者的參考值的來源可能包括58-62歲個體、59-63歲個體、60-64歲個體、61-65歲個體或62-66歲個體)。在更廣泛的定義中，不同年齡順序群組間存在較大差異，例如，當存在用于參考值的少數不同年齡順序群組和不同年齡順序群組間的差異超過在此所述2、3、4、5、6、7、8、9、10或15或20年時，“年齡順序匹配組”是指年齡組接近匹配受治療者的年齡順序(例如用于較高年齡組(例如80-90歲)和較低年齡組(例如20-30歲)的參考值時，51歲的年齡順序匹配組可使用較低年齡組(20-30歲)作為參考水平，其更接近測試受治療者的年齡順序)。

選擇對照組受治療者需要考慮的其它因素，包括但不限于，物種，性別，種族等等。因此，在一些具體實施方式中，參考水平可以是預先確定的參考水平，例如從健康對照組受治療者組得到的平均或中值水平，這些受治療者的性別與測試受治療者的性別是性別匹配的。在一些具體實施方式中，參考水平可以是與先確定的參考水平，例如從健康對照組受治療者組得到的平均或中值水平，這些受治療者的種族與測試受治療者的種族是種族匹配的(例如白種人，黑種人，西班牙人，亞洲人，以及亞洲-印第安人，巴基斯坦人，中東和/或太平洋島民)。在其它具體實施方式中，健康受治療者組的年齡順序和性別與測試受治療者的年齡順序和性別是分別匹配的。在其它具體實施方式中，健康受治療者組的年齡順序和種族與測試受治療者的年齡順序和種族是分別匹配的。在其它具體實施方式中，健康對照受治療者組的年齡順序、性別和種族與測試受治療者的年齡順序、性別和種族是分別匹配的。

受治療者生物樣本中ROBO2蛋白水平與ROBO2參考閾值水平的比較過程可采用本領域技術人員已知的任何和任何適當的方便方式進行。通常，采用在此所述分析方法、方法和系統確定的ROBO2蛋白水平值可以上定量值(例如濃度定量值，如每升樣本中ROBO2蛋白的毫克數(如mg/L)，或絕對量)。選擇地，ROBO2蛋白水平值可以根據測量技術可以是定性的，因此，從受治療者得到的值與參考值的比較的模式可以根據所用測量技術而變化。例如，該比較可通過檢測數值數據，通過檢測該數據的表達(例如檢測圖形表示如條形圖或線形圖)而進行，并使用例如標準差中至少一個或至少兩個標準差。在一個實施例中，當定性分析用于測量ROBO2蛋白水平時，該水平可通過可視比較有色反應產物的強度，或通過比較密度計數值或有色反應產物的光譜測量(例如比較來自測量裝置中的數值數據或例如條形圖的圖解數據)而被比較。

如在此所述，ROBO2蛋白水平可定量(絕對值)或定性(相對值)測量。在一些具體實施方式中，生物樣本中ROBO2蛋白水平的定量值可以表明慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的特定水平(或等級)。

在一些具體實施方式中，進行比較以確定受治療者數值與參考值之間區(qū)別的大小(例如比較測得的受治療者ROBO2蛋白水平與ROBO2蛋白參考閾值之間的“倍數”或百分比不同)。倍數差異可通過測量ROBO2蛋白水平的絕對濃度確定，并將其與ROBO2蛋白的水平的參考閾值的絕對值進行比較而確定，或者，倍數差異可通過參考值和樣本值之間的相對差異確定，其中這兩個值都不是絕對濃度的測量，和/或兩個值可以同時測量。例如，ELISA測量蛋白質的絕對含量或濃度，其與參考的相同蛋白質的絕對濃度相比可確定倍數變化。如另一實施例，抗體陣列測量相對濃度，從而可確定倍數變化。因此，暗示或指示具體診斷的測量值和參考值之間區(qū)別的大小取決于所用的方法。

本領域技術人員顯而易見的是，當采用重復測量法測量ROBO2蛋白水平時，測得的受治療者的值可與ROBO2蛋白水平參考閾值比較，并考慮重復測量法。通過使用測量值中的均值或中值中的一個考慮重復測量法。

在一些具體實施方式中，比較方法可以是手動的，或者也可以優(yōu)選為自動的。例如，分析裝置(如測量化學發(fā)光信號的光度計)可能含有可比較受治療者ROBO2蛋白值與參考ROBO2蛋白值的電路和軟件。可選地，分開的裝置(如數字電腦)可用于比較測得的受治療者的ROBO2蛋白水平和ROBO2蛋白參考閾值水平。用于比較的自動裝置可包括存儲的ROBO2蛋白參考值，或可比較測得的受治療者ROBO2蛋白水平和同時測得的參考樣本得到的ROBO2蛋白參考閾值水平。

在一些具體實施方式中，基于在此所述分析方法、方法和系統的結果，測試ROBO2蛋白水平的受治療者被分配至兩組或多組(情況)中的一組。在此所述的診斷分析方法、方法和系統可用于在多種不同狀態(tài)間進行分類。

因此，在一些具體實施方式中，采用在此所述診斷分析方法、方法和系統可確定受治療者是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的高風險。可鑒別以如高、中、低的不同風險狀態(tài)為特征確定的ROBO2蛋白的生物標識物量和形式。發(fā)展為慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險通過測量單獨ROBO2蛋白或與其它已知標志物的結合而確定，然后，或將其提交給分類算法或將其和與特定風險水平相關的參考量(如在此公開的分離參考量)比較。

在一些具體實施方式中，在此提供了用于確定受治療者患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的嚴重性、階段或風險的診斷分析方法、方法和系統。例如，慢性腎臟疾病的每一階段具有特征性的ROBO2蛋白量或ROBO2蛋白相對量。疾病的階段通過測量單獨ROBO2蛋白或測量與其它標志物的結合而確定，然后或將其提交到分類算法或將其與特定階段相關生物標志物的參考量和/或模式比較，例如受治療者有多久將會發(fā)展成慢性腎臟疾病或蛋白尿。例如，人們可以對一年內極有可能患有的慢性腎臟疾病或蛋白尿(不良預后)，或在接下來的5年受治療者極有可能患有慢性腎臟疾病或蛋白尿分類。

診斷分析方法、方法和系統的其他具體實施方式與結果或診斷或兩者對技術人員、醫(yī)生或受治療者的交流相關。在某些具體實施方式中，使用計算機以將分析方法結果或診斷結果或兩者的結果交流給感興趣的方面，例如醫(yī)生或他的患者。在一些具體實施方式中，例如，在一個國家或地區(qū)進行的分析方法或分析的分析方法結果，不同于與其溝通的國家或地區(qū)得到的結果或診斷。在一些具體實施方式中，基于受治療者生物樣本中ROBO2蛋白水平的患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，在獲得水平或預后后交流給受治療者。受治療者的治療醫(yī)生將預后或診斷交流給受治療者?？蛇x地，預后和診斷可通過電子郵件或電話交流給受治療者。計算機通過電子郵件或電話用于交流預后或診斷，或通過互聯網使用安全網關患者登錄服務。在某些的具體實施方式中，含有預后或診斷測試結果的信息，通過聯合使用通訊領域技術人員熟悉的計算機硬件和軟件，自動產生并遞送給受治療者。在此所述的分析方法、方法和系統的某些具體實施方式中，所有或部分方法步驟，包括樣本分析方法、疾病診斷和分析方法結果或診斷的交流，可在不同地區(qū)(例如國外)進行。

用于確定或評估在此描述的慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的診斷分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，所述分析方法、方法和系統進一步包括基于患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的確定的管理受治療者的治療。這種管理包括醫(yī)生或臨床醫(yī)生在確定受治療者患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險后的行為。例如，如果醫(yī)生診斷受治療者具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，則接下來會給出一個特定的養(yǎng)生治療方案。合適的養(yǎng)生治療方案包括但不限于，監(jiān)督下的鍛煉計劃，血壓的控制、糖攝入量和/或體液水平，以及藥物治療。在一些具體實施方式中，患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的診斷后，還要進一步測試以確定病人是否患有慢性腎臟疾病，或患者是否患有相關疾病。另外，如果診斷測試對主要不良事件狀態(tài)風險的結果是不確定，則需要進一步測試。在在此所述用于確定或評估慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的分析方法、方法和系統的一些具體實施方式中，如果醫(yī)生診斷受治療者不具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，則不提供治療。

在此所述分析方法和ROBO2的檢測方法可采用機器人和計算機指揮系統自動化實現。可將生物樣本，如尿液、血清或血液樣本注入系統中，如微流體裝置，從樣本輸入至結果輸出完全由自動工作站運行。

因此，在此提供在一些方面進一步提供了系統(和用于計算機系統的計算機可讀介質)，其基于表達譜或序列信息，執(zhí)行檢測個體是否患有慢性腎臟疾病或蛋白尿或是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的傾向的方法。

在一些方面，在此提供系統，用于評估受治療者患有或具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的增加的風險，該系統包括：(a)確定模塊，其配置用于接收至少一種生物樣本并針對所述生物樣本進行至少一次分析，以測量生物樣本中ROBO2水平或確定相對于預先確定或參考閾值水平的ROBO2的表達比率，并輸出所述測量水平或表達比率；(b)存儲設備，其配置用于儲存確定模塊輸出的數據信息；(c)比較模塊，適合用于接收存儲設備的輸入，并將存儲在存儲設備的數據與至少一個ROBO2水平的參考閾值進行比較，其中，如果測量的ROBO2蛋白水平至少等于或高于參考閾值水平，比較模塊提供信息給輸出模塊，生物樣本與偏離參考閾值生物標志物水平的受治療者相關；以及(d)輸出模塊，用于將信息顯示給用戶。

在發(fā)明的所有方面中，確定ROBO2蛋白水平的方法可采用自動化機器或系統進行。所述機器和系統產生報告，例如在可見屏幕中顯示報告或打印的報告，所述報告表明了ROBO2蛋白的水平，和/或報告了與ROBO2蛋白參考閾值相同或增加，和/或獲得樣本的受治療者是否具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險。

因此，在此所述的一些具體實施方式也提供機器、計算機系統和計算機可讀媒介，用于進行以下步驟：(i)確定ROBO2蛋白水平；以及(2)表明或報告受治療者是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險。

這些方面的具體實施方式通過功能模塊進行描述，這些具體實施方式由記錄在計算機可讀媒介上的計算機可執(zhí)行指令定義，并在執(zhí)行時使計算機進行方法步驟。出于清晰性的考慮，模塊按功能進行分離。然而應該理解的是，模塊不必對應嚴格的代碼塊，并且所述功能可以通過存儲在不同媒介中的不同代碼部分的執(zhí)行，以及在不同時間執(zhí)行來完成。另外，應當理解的是，模塊可執(zhí)行其它功能，因此，模塊并不限于具有具體的功能或功能集。

計算機可讀媒介可為任何可被計算機存取的有形媒介。計算機可讀媒介包括易失性的或非易失性的、可移動的或不可移動的有形媒介，其通過用于存儲信息的任何方法或技術實施，例如計算機可讀指令，數據結構，程式模塊或其它數據。計算機可讀媒介包括但不限于，RAM(隨機存取存儲器)，ROM(只讀存儲器)，EPROM(可擦可編程只讀存儲器)，EEPROM(電可擦可編程只讀存儲器)，閃存存儲器，和其他的存儲技術，CD-ROM(只讀壓縮光盤存儲器)，DVDs(數字全能磁盤)或其它光存儲媒介，磁帶盒，磁帶，磁盤存儲器或其它磁存儲器媒介，其它易失或非易失性存儲器，以及其它用于存儲所需信息的有形媒介，其可通過包括前述任何合適組合的計算機進行存取。

呈現在一個或多個計算機可讀媒介或計算機可讀介質的計算機可讀數據，例如可定義指令作為一個或多個程序的一部分作為計算機執(zhí)行的結果，指令指導計算機執(zhí)行在此所述的一種或多種功能(例如與系統、或計算機可讀媒介有關的)，和/或不同具體實施方式、變形或其組合。這些指令可用多種編程語言中的任意一種編寫，例如Java，J#，Visual Basic，C，C#，C++，Fortran，Pascal，Eiffel，Basic，COBOL匯編語言等等，或這些多種組合中的任何一種。呈現這些指令的計算機可讀媒介可駐留在一個或多個在此所述系統或計算機可讀媒介的組件中，可分布在一個或多個這樣的組件中，并可在它們之間轉變。

計算機可讀媒介可以是可傳輸的，從而存儲其中的指令可被加載至任何計算機資源，以實施本發(fā)明所討論的方面。另外，需要理解的是，存儲在上述計算機可讀介質或計算機可讀媒介中的指令并不限于作為主機上運行的應用程序中的一部分呈現的指令。當然，指令可作為任何一種用于編制計算機完成在此方面的電腦編碼(例如軟件或微碼)呈現。計算機可執(zhí)行指令可以以合適的計算機語言或幾種語言的組合進行編寫。小面參考資料中描述了本領域普通技術人員已知的基本計算生物學方法：例如Setubal and Meidanis等，《計算生物學方法介紹》(PWS出版公司，波士頓，1997)(Setubal and Meidanis et al.,Introduction to Computational Biology Methods(PWS Publishing Company,Boston,1997))；Salzberg、Searles、Kasif，(編)，《分子生物學計算方法》，(愛思唯爾，阿姆斯特丹，1998)(Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998))；Rashidi和Buehler，《生物信息學基礎知識：應用生物科學與醫(yī)學》(CRC出版，倫敦，2000)(Rashidi and Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRC Press,London,2000))以及Ouelette和Bzevanis，《生物信息學：基因和蛋白質分析實用指南》(Wiley&Sons公司，第2版，2001)(Ouelette and Bzevanis Bioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley&Sons,Inc.,2nd ed.,2001))。

在此所述方面的某些具體實施方式的功能模塊包括確定模塊，存儲設備，比較模塊和顯示模塊。功能模塊可通過一個或多個計算機完成，或通過使用一個或多個計算機網絡或計算機系統完成。

在一些方面，在此提供了計算機系統，其可用于確定受治療者是否極有可能患有或具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險。在一些具體實施方式中，計算機系統與確定模塊連接，其配置用于獲得確定模塊關于生物樣本的輸出數據，在此確定模塊配置用于檢測從受治療者獲得的生物樣本中ROBO2蛋白水平；并且這里計算機系統包括：(a)存儲設備，其配置用以儲存確定模塊的信息輸出和參考數據，其中，存儲設備連接至(b)比較模塊，在一些具體實施方式中，其用于比較在存儲設備中的輸出數據和存儲的參考數據，并且在可選的具體實施方式中，其適合用于將輸出數據與其自身比較，在此比較模塊生成報告數據，并連接至(c)顯示模塊，其用于向用戶的客戶端計算機顯示重新取回內容的頁面(即比較模塊生成的報告數據)，其中重新取回內容可以顯示Robo2的水平，和/或受治療者在將來經歷慢性腎臟疾病或蛋白尿的可能性。

在一些具體實施方式中，確定模塊具有計算機可執(zhí)行指令，以提供表達數據、序列信息、與計算機可讀形式信息有關的信息。如在此所用的“序列信息”是指任何核苷酸和/或氨基酸序列，包括但不限于，全長核苷酸和/或氨基酸序列，部分核苷酸和/或氨基酸序列，或突變序列。另外，與序列信息“相關的”信息包括存在或不存在的序列的檢測(例如突變或缺失的檢測)，樣本中序列濃度的確定(如氨基酸序列表達水平，或核苷酸(RNA或DNA)表達水平)，等等。術語“序列信息”意在包括存在或不存在的翻譯后修飾(例如磷酸化作用，糖基化作用，仿真化(summylation)，法尼基化，等等)。

例如，用于確定ROBO2序列或核酸表達信息的確定模塊包括自動序列分析的已知系統，包括但不限于，日立和日立 II熒光掃描儀(購買于日立遺傳系統公司，阿拉米達，加利福尼亞州)(available from Hitachi Genetic Systems,Alameda,California)； SCE 9610全自動96-毛細管電泳遺傳分析系統(購買于SpectruMedix LLC，州立學院，賓夕法尼亞州)(available from SpectruMedix LLC,State College,Pennsylvania)；ABI377DNA測序儀，ABI373DNA測序儀，ABI310遺傳分析儀，ABI3100遺傳分析儀以及ABI3700DNA分析儀(購買于美國應用生物系統公司，福斯特城，加利福尼亞州)(available from Applied Biosystems,Foster City,California)；分子動力學FluorImager^TM575，SI熒光掃描儀，和分子動力學FluorImager^TM595熒光掃描儀(購于英國安瑪西亞生物科學有限公司，白金漢郡，英格蘭)(available from Amersham Biosciences UK Limited,Little Chalfont,Buckinghamshire,England)；GenomyxSC^TMDNA測序儀(購于Genomyx公司(福斯特城，加利福尼亞州))；以及Pharmacia ALF^TM DNA測序儀和Pharmacia ALFexpress^TM(購于英國安瑪西亞生物科學有限公司，小都，白金漢郡，英格蘭)(available from Amersham Biosciences UK Limited,Little Chalfont,Buckinghamshire,England)。

在用于確定序列或蛋白質信息的一些具體實施方式中，確定模塊包括用于蛋白質和DNA分析的系統。例如，質譜系統，包括基質輔助光解電離-飛行時間(MALDI-TOF)系統；SELDI-TOF-MS蛋白芯片陣列分析系統，例如具有賽弗吉蛋白生物系統II^TM(CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM II^TM)軟件的機器；分析基因表達數據的系統(參見例如US2003/019711)；基于數組的表達分析，例如HT數組系統和墨盒陣列系統，購于美國昂飛公司(圣克拉拉，加拿大95051)(see for example U.S.2003/0194711)；systems for array based expression analysis,for example HT array systems and cartridge array systems available from Affymetrix(Santa Clara,CA 95051)，自動裝卸機，COMPLETE 儀表系統，孵育裝置450，雜交箱645，QC工具箱軟件工具包，掃描儀3000 7G，掃描儀3000 7G靶向基因分型系統，掃描儀3000 7G全基因組關聯系統，GENETITAN^TM儀器，組合測站，HT數組；自動化ELISA系統(例如Dynax的或form，尚蒂伊，維吉尼亞，或ENEASYSTEMTHE Plus)；光密度計(例如X-Rite-508-SpectroThe HYRYS^TM2光密度計)；自動化熒光原位雜交系統(參見例如美國專利6,136,540)；耦合2-D成像軟件的2D凝膠成像系統；微量盤式光譜儀，熒光激活細胞分選器(FACS)(例如流式細胞儀FACS Vantage SE，美國BD公司)；放射性同位素分析儀(如閃爍計數器)，或上述組合。

在本發(fā)明的該方面或所有其它方面的一些具體實施方式中，各種軟件程序和格式可用于儲存存儲設備中的生物標志物蛋白水平信息。任何數量的數據處理器的結構化格式(如文本文件或數據庫)可用于獲取或創(chuàng)建具有記錄在其上的序列信息或表達水平信息的媒介。

確定模塊上確定的ROBO2表達信息或與ROBO2表達信息相關的信息可被存儲設備讀取。如在此使用的“存儲設備”意在包括任何計算或處理設備或其它配置并適合用于存儲數據或信息的裝置。適合用于本發(fā)明的電子設備的示例包括單機計算設置；數據通信網絡，包括局域網(LAN)，廣域網(WAN)，云存儲系統，因特網，內聯網和外聯網；以及局部或分布式計算機處理系統。存儲設備還包括但不限于，磁存儲介質，例如軟盤、硬盤存儲介質，磁帶，光存儲介質如CD-ROM、DVD，電子存儲介質如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等等，云存儲系統，一般硬盤和這些種類如磁/光存儲介質的混合。存儲設備適合于或配置其用于記錄其上的序列信息或表達水平信息。這些以數字形式提供的信息可被電子地傳輸和讀取，例如通過因特網，通過云系統，在磁盤上通過USB(通用串行總線)或通過其它合適的通信方式。

如在此使用的“表達水平信息”是指任何核苷酸和/或氨基酸表達水平信息，包括但不限于，全長核苷酸和/或氨基酸序列，部分核苷酸和/或氨基酸序列，或突變序列。另外，與序列信息“相關的”信息包括存在或不存在序列的檢測(例如存在或不存在的氨基酸序列、核苷酸序列或翻譯后修飾)，樣本中序列濃度的確定(如氨基酸序列水平，或核苷酸(RNA或DNA)表達水平，或翻譯后修飾水平)，以及等等。

如在此使用的“存儲”是指在存儲設備上編碼信息的過程。本領域技術人員可以容易想到采用任何本領域已知的方法在已知媒介上編碼信息，以產生包含序列信息或表達水平信息的制成品。

各種軟件程序和格式可用于存儲存儲設備中的序列信息或表達水平信息。任何數量的數據處理器的結構化格式(如文本文件或數據庫)可用于獲取或創(chuàng)建具有記錄在其上的序列信息或表達水平信息的媒介。

通過提供計算機可讀形式的序列信息或表達水平信息，人們可以在比較模塊中使用計算機可讀形式的序列信息或表達水平信息，以在存儲設備中將特異序列或表達譜與參考數據進行比較。例如，搜索程序可用于識別序列的片段或區(qū)域，該序列與特定序列(參考數據，例如從對照樣本中獲得的序列信息)匹配，或將測得的表達水平的直接對比與參考數據表達水平(例如從對照樣本中獲得的表達水平信息)對比。以計算機可讀形式進行的對比提供了計算機可讀對比結果，該結果可由多種方法進行處理?；趯Ρ冉Y果的內容可以從比較模塊重新取回，用以指示特定疾病或病癥，如慢性腎臟疾病或蛋白尿。

在一些具體實施方式中，存儲在存儲設備中、由比較模塊讀取的參考數據是從與待測生物樣本類型相同的對照生物樣本獲得的ROBO2序列或表達信息數據?？蛇x地，參考數據是數據庫，例如生物體全基因組序列的部分，或蛋白質家族的序列，或表達水平譜(RNA，蛋白質或肽)。在一些具體實施方式中，參考數據是序列信息或表達水平譜，其指示特定疾病或病癥，如慢性腎臟疾病或蛋白尿。

在一些具體實施方式中，參考數據被電子地或數字地記錄，并從數據庫中標明，包括但不限于，基因庫(NCBI)蛋白質或DNA數據庫如基因組，ESTs，SNPS，Traces，Celara，Ventor Reads，Watson reads，HGTS等等；生物信息學數據庫瑞士研究所(Swiss Institute of Bioinformatics databases)，例如ENZYME，PROSITE，SWISS-2DPAGE，Swiss-Prot和TrEMBL數據庫；梅蘭妮軟件包或ExPASy WWW服務器等等；SWISS-MODEL，Swiss-Shop和其它基于網絡的計算工具；綜合微生物資源數據庫(購于基因組研究學院)(available from The Institute of Genomic Research)。由此產生的信息可存儲在相關數據庫中，用于確定其中蛋白質或基因的參考數據與基因組間的同源性。

通過在比較模塊提供可讀形式的ROBO2水平，其可用于比較在存儲設備中的ROBO2參考閾值水平。以計算機可讀形式進行的對比提供計算機可讀內容，其可由多種方法處理。

“比較模塊”可使用多種可用的軟件程序和格式的比較操作，以比較確定模塊確定的ROBO2序列或表達水平信息與參考ROBO2序列或表達水平數據。在一些具體實施方式中，配置比較模塊用于采用模式識別技術，以比較一個或多個記錄的ROBO2序列或表達水平數據與一個或多個參考數據模式。比較模塊可使用現有市售的或者可免費獲得的對比模式軟件進行配置，并可以為所進行的比較特定數據進行優(yōu)化。比較模塊提供與序列信息相關的計算機可讀信息，包括例如，存在或不存在序列的檢測(突變或缺失(蛋白質或DNA)的檢測，關于不同等位基因的信息，翻譯后修飾檢測，或序列的遺漏或重復)；樣本中序列濃度的確定(如氨基酸序列/蛋白質表達水平，或核苷酸(RNA或DNA)表達水平，或翻譯后修飾水平)，或表達譜確定。

在一些具體實施方式中，比較模塊對確定模塊輸出數據的ROBO2水平與每一個ROBO2參考閾值水平間進行對比。

在一些具體實施方式中，比較模塊進行質譜對比，例如肽片段序列信息的對比可通過采用具有腳本稱為“Qpeaks”(參見例如WO2007/022248，本發(fā)明引用作為參考)或“Qpeaks”(光譜聯營公司，伊薩卡島，紐約)或CiphergenPeaks 2.1^TM軟件的MATLAB處理的光譜進行。處理后的光譜隨后使用比對算法比對，比對算法利用最小熵法，通過取基線校正數據，將樣本數據與對照數據進行比對(參見例如WIPO公開專利WO2007/022248，本發(fā)明引用作為參考)。對比結果可由計算比率進一步處理?？梢钥闯龅鞍踪|表達譜。

任何可利用的對比軟件均可使用，包括但不限于，賽弗吉表達(Ciphergen Express)(CE)和生物標志模型軟件(BPS)包，賽弗吉生物系統公司，美國(Ciphergen Biosystems,Inc.,CA,USA)。對比分析可以用蛋白質芯片系統軟件(例如Bio-Rad實驗室的蛋白質芯片套件)完成。

比較模塊，或其它在此所述的模塊，可包括操作系統(例如UNIX)，其上運行相關的數據庫管理系統，萬維網應用程序，以及萬維網服務器。萬維網應用程序包括數據庫語言語句產生所需的可執(zhí)行代碼(例如結構化查詢語言(SQL)語句)。通常，可執(zhí)行文件包括嵌入式SQL語句。另外，萬維網應用程序包括配置文件，配置文件含有組成服務器以及各種內部和外部數據庫的各種軟件實體的指針和地址，各種內部和外部數據庫是對服務用戶請求可訪問。配置文件還指示請求服務器資源到相應的硬件-如是必要的，服務器可被分布在兩個或多個獨立的計算機。在一些具體實施方式中，萬維網服務器支持TCP/IP協議。這種局域網有時被稱為“企業(yè)內部網”。這種局域網的優(yōu)勢是它們允許與駐留在萬維網(例如基因數據庫或瑞士專業(yè)萬維網站點)(e.g.,the GenBank or Swiss Pro World Wide Web site)上的公共領域數據庫進行簡單交流。因此，在一些優(yōu)選的具體實施方式中，用戶可通過采用Web瀏覽器和網絡服務器提供的HTML界面，直接訪問駐留在網絡數據庫上的數據。

在一些具體實施方式中，比較模塊對基因表達譜進行比較。例如，基因表達譜的確定可使用美國昂飛公司的微陣列套件軟件5.0版(MAS 5.0)(購于美國昂飛公司，圣克拉拉，加利福尼亞)(available from Affymetrix,Santa Clara,California)檢測，基于來自探針組的信號強度分析基因或基因組的相對豐度，并且MAS 5.0數據文件可轉移至數據庫，并用Microsoft Excel和GeneSpring 6.0軟件(購于安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞)(available from Agilent Technologies,Santa Clara,California)分析。MAS 5.0軟件的檢測算法可用于獲得給定樣本中多少個轉錄本被檢測到的全面概述，并且可進行兩個或多個微陣列數據集的比較分析。

在一些具體實施方式中，比較模塊對蛋白質表達譜進行比較。任何可利用的對比軟件均可使用，包括但不限于，賽弗吉表達(Ciphergen Express)(CE)和生物標志模型軟件(BPS)包(購于賽弗吉生物系統公司，美國(available from Ciphergen Biosystems,Inc.,Freemont,California))。對比分析可以用蛋白質芯片系統軟件(例如蛋白質芯片套件(購于Bio-Rad實驗室，大力神，加利福尼亞州))(e.g.,The Proteinchip Suite(available from Bio-Rad Laboratories,Hercules,California)完成。識別表達譜的算法可包括使用優(yōu)化算法，如均方差算法(例如JMP基因組學算法，購于JMP軟件，北卡羅來納州)(e.g.JMP Genomics algorithm available from JMP Software Cary,North Carolina)。

比較模塊提供計算機可讀的比對結果，其可通過預定義的標準或用戶定義的標準以計算機可讀形式進行處理，以提供部分基于比較結果的內容，比較結果可以利用顯示模塊根據用戶請求進行存儲和輸出。顯示模塊能夠為用戶提供給基于對比結果的內容的顯示部分，其中，所述內容為慢性腎臟疾病或蛋白尿的指示性信號。這些信號，例如可以是電腦顯示器上指示存在或不存在慢性腎臟疾病或蛋白尿的內容的顯示，打印機中指示存在或不存在慢性腎臟疾病或蛋白尿的內容的打印頁面，或存在或不存在慢性腎臟疾病或蛋白尿的光的或聲音的指示。

基于對比結果的內容可包括一種或多種蛋白質的表達譜，或一種或多種基因的表達譜。在一些具體實施方式中，基于對比結果的內容僅僅是存在或不存在基于ROBO2蛋白水平的慢性腎臟疾病或蛋白尿的指示性信號。

在一些具體實施方式中，基于對比結果的內容顯示在電腦顯示器上。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，基于對比結果的內容通過打印媒介顯示。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，基于對比結果的內容作為指示燈或指示聲音進行顯示。顯示模塊可為任何合適裝置，配置其以接受來自計算機并向用戶顯示計算機可讀信息。非限制性示例包括，例如，通用計算機如那些基于因特爾奔騰處理器，蘋果電腦和平板設備，摩托羅拉PowerPC，SunUltraSPARC，惠普PA-RISC處理器，多種購于加利福尼亞州森尼維爾市超微半導體公司(AMD)的處理器中的任何一種，或其它類型的處理器，視頻顯示設備如平板設備，智能手機移動設備，平板顯示器，陰極射線管等等，以及各種類型的電腦打印機。

在一些具體實施方式中，萬維網瀏覽器用于向用戶提供基于對比結果的內容的顯示界面。應當理解的是，本發(fā)明的其它模塊可以適于具有Web瀏覽器的界面。通過Web瀏覽器，用戶可以構造來自比較模塊中重新取回數據的請求。因此，該用戶通常會指向和點擊用戶界面元素，如圖形用戶界面常規(guī)使用的按鈕，下拉菜單，滾動條之類。用戶Web瀏覽器制定的請求傳輸至網絡應用程序，其將請求格式化以生成用于提取與序列信息相關的相關信息的查詢，例如指示存在或不存在突變或缺失(DNA或蛋白質)的顯示；氨基酸序列(蛋白質)表達水平的顯示；核苷酸(RNA或DNA)表達水平的顯示；表達、SNP或突變譜或單倍型的顯示，或基于上述的信息的顯示。在一個具體實施方式中，參考樣本數據的序列信息也可以顯示。

在一些具體實施方式中，顯示模塊顯示比較結果和比較結果是否指示疾病，例如ROBO2表達譜是否指示慢性腎臟疾病或蛋白尿。

在一些具體實施方式中，基于顯示的比較結果的內容是指示存在或不存在慢性腎臟疾病或蛋白尿的信號(如正或負信號)，因此只顯示正或負指示。

因此，在此提供的系統(和計算機可讀媒介而產生的計算機系統)，其是基于表達譜或序列信息，用以確定個體是否具有慢性腎臟疾病或蛋白尿或具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿傾向的分析方法和方法。

系統和計算機可讀媒介僅是本發(fā)明示例性的具體實施方式，其是基于表達譜或序列信息，用以確定個體是否具有特定疾病或失調，或具有患特定疾病或失調傾向的分析方法和方法，并不限制本發(fā)明的保護范圍。系統和計算機可讀媒介的變型是可能的，并落入本發(fā)明的保護范圍。

系統的模塊或用于計算機可讀媒介的模塊可以設想多種配置。例如，功能的提供可以是一臺機器，或分布于多臺機器。

Robo2是定位于小鼠足細胞基底細胞表面的足細胞蛋白

腎臟發(fā)育過程中，Robo2mRNA表達于圍繞分叉輸尿管芽的后腎間質，隨后表達于S形主體的近端(Piper等，2000)(Piper et al.,2000)，原始足細胞位置。為了研究Robo2是否參與足細胞的成熟，除了其在早期腎感應中的作用，我們進行了原位雜交，并發(fā)現Robo2mRNA表達于胚胎第16.5天(E16.5)的小鼠胚胎腎小球發(fā)育中的毛細血管袢階段(圖5A和圖5B)。通過E14.5左右對發(fā)育中腎小球進行免疫熒光染色使Robo2蛋白成為可檢測到的，在E16.5達到峰值表達(圖5C-5E)。雖然表達在發(fā)育期的E17.5后降低(圖5F)，特異性的Robo2表達一直保持到出生后的腎小球，并在5周齡的成年小鼠可檢測到(圖5G、5H、5L-5M)。

為了確定Robo2在發(fā)育的腎小球中的細胞定位，我們用腎小球細胞類型特異性標志物進行了雙標記免疫組織化學。我們發(fā)現Robo2蛋白與Nephrin(圖1A-1C)和podocin(圖1D-1F)共定位，兩種足細胞縫隔膜相關的蛋白質。Robo2與Nephrin相互作用的銜接蛋白共表達于腎小球中，Nck和WT1是足細胞細胞核的組成成分(圖5H-5K)。采用抗巢蛋白(nidogen)(圖1J-1L和1P)和Pecam1(圖1M-1O，5M)的抗體進行雙標記顯示Robo2定位于靠近腎小球基底膜外表面，不存在內皮細胞，其中巢蛋白(nidogen)是一種基底膜標志物，Pecam1是一種內皮細胞標志物。高分辨率共焦顯微鏡進一步顯示在足細胞基底面具有最豐富的亞細胞的Robo2(圖1Q)。具有胞漿結合域抗體的出生后小鼠腎臟的免疫膠體金電鏡顯示，Robo2定位于接近狹縫隔膜胞質面的足細胞足突(圖1R)。這些結果顯示，Robo2為足細胞蛋白，且其在足突中的基底亞細胞定位表面，其在調節(jié)足細胞足突結構中發(fā)揮作用。

Robo2胞內域與銜接蛋白Nck的SH3域的直接相互作用

Nephrin胞外域的銜接導致其通過Src激酶對其胞內域的酪氨酸磷酸化，和銜接蛋白Nck的SH2域的引入，這反過來又引起肌動蛋白聚合(Jones等，2006；Verma等，2006)(Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)。Nck在C-端具有一個SH2域，在鄰近N-端具有三個SH3域。肌動蛋白通過Nck的SH3結合域進行介導的(Rivera等，2004)(Rivera et al.,2004)，這可以引入含有N-WASP和Pak的各種細胞骨架調節(jié)劑(Jones等，2006)(Jones et al.,2006)。先前的研究表明，果蠅同族體Dreadlock的Nck的SH3域也可與Robo胞內域直接相互作用，以抑制肌動蛋白的聚合(Fan等，2003；Yang和Bashaw，2006)(Fan et al.,2003；Yang and Bashaw,2006)。

我們測試哺乳動物Nck是否也可以與足細胞中的Robo2直接相互作用以調節(jié)F-肌動蛋白細胞骨架。為了回答這個問題，我們采用酵母雙雜交分析以檢測Robo2是否與Nck相互作用。由于兩種哺乳動物Ncks(即Nck1，Nck2)在腎臟發(fā)育中具有相同的結構和功能(Jones等，2006)(Jones et al.,2006)，在此時研究中我們使用Nck1，觀察到Robo2胞內域可與Nck1直接相互作用(圖2A-2C)。Robo2和Nck1的結合位點圖表明，含有4個富含脯氨酸基序的氨基酸序列1085-1301，對相互作用是至關重要的(圖2A和2C)。這種富含脯氨酸基序的缺失阻止其與Nck的相互作用(圖2A)。Robo2和Nck1的結合位點圖表明，前兩個SH3域在其與Robo2的相互作用中是必需的，因為刪除它們中的一個或兩個都會使相互作用消失(圖2B)。因此，Robo2與Nck1的相互作用可通過兩個非常有特點的蛋白結構域SH3域和富含脯氨酸的基序介導的圖2C)。CD2AP，另一種足細胞銜接蛋白，也在其N-端具有三個SH3域(Shih等，2001)(Shih et al.,2001)，但我們沒有檢測到CD2AP與Robo2在酵母雙雜交或共沉淀分析中有任何相互作用。這些觀察結果表明，足細胞中Robo2和Nck1之間的結合是特異性的相互作用。

全長Robo2通過Nck與Nephrin形成復合物

我們通過體外結合捕獲試驗(pull down)和共沉淀分析確認了Robo2與Nck之間的相互作用。將His-和myc-標記的人類全長Robo2(His-myc-Robo2)或his-和myc-標記的Nck1結合域缺失的人類Robo2(His-myc-Robo2-ΔNBD)在HEK細胞中表達。轉染的HEK細胞在Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液(從Slit2穩(wěn)定轉染的細胞制備的)刺激，以激活Robo2并增加Nck結合(Fan等，2003)(Fan et al.,2003)。利用Ni-NTA磁珠，將Nck與His-myc-Robo2從HEK細胞裂解物拉出，而不是與His-myc-Robo2-ΔNBD(圖2D)。因為Nck的SH2域與Nephrin細胞質區(qū)(NCD)中的磷酸絡氨酸相互作用(Jones等，2006；Verma等，2006)(Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)，我們利用共沉淀分析檢查Robo2是否通過Nck與Nephrin形成復合物。為了建立原理性的證明，我們利用Fyn激酶將Robo2與Nephrin在HEK細胞中共表達，以增加Nephrin磷酸化。當Fyn被表達時，利用Ni-NTA磁珠從HEK細胞裂解物中拉出與Nck和Nephrin共沉淀的His-myc-Robo2(圖2E)。以相反的順序，當Fyn被表達時，拉出與Nck和Robo2共沉淀的His-myc-nephrin(圖2F)。此外，當Fyn被過表達時，用抗Nck抗體制備的沉淀物含有Robo2和Nephrin兩者(圖6A)。這些數據表明Nephrin、Nck和Robo2在體外形成復合物。為了在體內證實這些發(fā)現，我們從新生小鼠腎臟溶解物免疫沉淀Robo2，并且發(fā)現Nck與Nephrin是共沉淀的(圖2G)。相反地，用抗Nephrin抗體制備的沉淀物也含有Nck和Robo2(圖2H)。由于Nephrin獨特地表達在足細胞中，Nck和Robo2也定位在腎臟的這些細胞中，這些結果表明，Nephrin、Nck和Robo2能夠在足細胞中形成復合物。

為了確定Slit2在Robo2-Nck-Nephrin蛋白復合物形成中的作用，將His-myc-Robo2、Nephrin和Fyn在HEK細胞中共表達，其中HEK細胞在共沉淀前通過Slit2條件培養(yǎng)液或不含Slit2的對照條件培養(yǎng)液刺激(圖2I)。我們觀察到，Slit2的刺激增加了Robo2與Nck的結合及與Nephrin復合物的形成。Nck1對Robo2的比值以及Nephrin對Robo2的比值均在Slit2刺激后增加(圖2J)。與該發(fā)現一致的是，我們觀察到Slit2在新生小鼠腎小球中強烈表達(圖6B、6C)。

Slit2-Robo2信號抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合

由于Slit與Robo結合引入Dock和srGAPs，從而抑制肌動蛋白聚合(Fan等，2003)(Fan et al.,2003)，我們希望測試哺乳動物細胞中Robo2是否也能引入Nck以抑制肌動蛋白聚合，與Nephrin促進肌動蛋白聚合的作用相反。為了說明這個問題，如前所述，我們通過分析表達CD16/7-NCD嵌合蛋白的細胞中的肌動蛋白尾巴研究了肌動蛋白聚合(Jones等，2006；Verma等，2006)(Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)。該模型利用與Nephrin細胞質區(qū)(NCD)融合的人類免疫球蛋白Fc受體CD16和CD17的細胞外結構域和跨膜結構域。CD16/7-HA，其中的NCD用HA標簽蛋白替代，用作負控制。這些嵌合蛋白在HEK細胞中與Robo2共表達，用抗-CD16抗體和與若丹明結合的第二抗體處理后成簇。我們首先檢查Nephrin細胞質結構域的成簇是否可以引入Robo2。我們觀察到，CD16/7-NCD的參與將Robo2帶入該簇中，因為大多數Robo2與CD16/7-NCD簇共定位(圖6D-6F)。然而，沒有觀察到Robo2與CD16/7-HA對照(圖6D’)或與Robo2-ΔNBD構建體(圖6E’)的共定位，其中Robo2Nck結合域(NBD)被刪除。有趣的是，在沒有Slit2情況下，CD16/7-NCD和Robo2的共定位顯著減少(圖6F’)。這些數據提供了進一步的證據證明，Nephrin細胞質結構域是能夠在Slit2存在下與Robo2胞內域復合的，并驗證該模型以確認Robo2-Nck-Nephrin復合物的形成是否影響肌動蛋白聚合。

表達CD16/7-NCD和Robo2的HEK細胞用Slit2或不含Slit2的條件培養(yǎng)液刺激，而通過抗CD-16抗體成簇。肌動蛋白聚合通過定量具有可見F-肌動蛋白尾巴的HEK細胞數量來評價(Rivera等，2004)(Rivera et al.,2004)。我們觀察到，～80％的CD16/7-NCD簇細胞形成F-肌動蛋白尾巴，如先前報道，其可以通過鬼筆環(huán)肽染色顯現(Jones等，2006；Verma等，2006)(Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)。然而，由于Slit2刺激，具有F-肌動蛋白尾巴的細胞數目顯著減少至約40％(圖3A和3C)。當對照CD16/7-HA蛋白聚合時，觀察到只有少量細胞含有較短F-肌動蛋白尾巴(圖3B和3C)。為了進一步研究肌動蛋白聚合的這種抑制是否需要Nck，我們采用沒有Nck結合域的Robo2(Robo2-ΔNBD)重復該試驗，以確定封閉結合至Robo2的Nck是否可以阻止Slit2-Robo2對Nephrin誘導的肌動蛋白聚合的抑制。CD16/7-NCD與全長Robo2(圖7A)或Robo2-ΔNBD(圖7B)在HEK細胞中共表達。我們觀察到，Robo2中Nck結合域的刪除顯著折中了Slit2-Robo2對Nephrin誘導的肌動蛋白聚合的抑制(圖7C)。

前期研究已經表明，Nephrin連接至F-肌動蛋白細胞骨架(Yuan等，2002)(Yuan et al.,2002)。為了確定Slit2-Robo2信號是否能抑制與Nephrin相關的F-肌動蛋白，我們采用抗CD-16抗體對CD16/7-NCD和CD16/7-HA進行免疫沉淀反應，并用蛋白質印跡法檢查沉淀物中F-肌動蛋白的數量。我們觀察到，當Slit2刺激時，與Nephrin相關的F-肌動蛋白的豐度顯著降低(圖3D和3E)。相反地，體內免疫沉淀反應分析顯示，與野生型或Robo2雜合小鼠腎臟獲得的F-肌動蛋白相比，通過從無Robo2新生小鼠腎臟取得的抗-Nephrin抗體進行免疫沉淀的Nephrin相關F-肌動蛋白顯著增加(圖3F和3G)。綜合起來，這些結果表明，Slit2-Robo2信號抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合。

足細胞中Robo2的缺失引起小鼠足突結構改變

我們和其他人以前已經證實幾乎所有混合遺傳背景的Robo2純合缺失小鼠在出生不久后死亡，歸因于嚴重的CAKUT表型(Grieshammer等，2004；Lu等，2007；Wang等，2011)(Grieshammer et al.,2004；Lu et al.,2007；Wanget al.,2011)。用Robo2^del5突變等位基因飼養(yǎng)小鼠五代至具有C57BL/6遺傳背景后，與Robo2^del5/+雜合父母交配可產生三個存活3周的Robo2^del5/del5純合缺失小鼠(在斷奶分析總的160小鼠中)。為了確定發(fā)育過程中足細胞足突形成中對Robo2是否必需，我們檢查了剛出生和3周齡Robo2缺失小鼠的腎小球超微結構。雖然足細胞本體、足突和Slit-隔膜在出生時形成，但透射電子顯微鏡顯示，新生Robo2^del5/del5純合缺失小鼠中局灶性足突消失(圖8A-8F)。使用掃描電鏡，我們觀察到剛出生和3周齡Robo2^del5/del5純合缺失小鼠中的不規(guī)則趾狀突足突(圖4A-4H)。這些發(fā)現表明，Robo2中腎臟發(fā)育過程中對正常足細胞足突圖案是必需。

為了檢測成熟腎小球中Robo2在足突結構保持中的作用，通過雜交具有Robo2^del5/+的條件Robo2^flox/flox小鼠和攜帶膜蛋白-Cre(podocin-Cre)轉基因的Tg^Nphs2-Cre/+雜合小鼠，我們產生足細胞特異性Robo2敲除小鼠。具有Robo2^del5/flox、Tg^Nphs2-Cre/+的20只足細胞特異性Robo2突變小鼠與20只同窩出生對照小鼠被分析至1歲齡。足細胞特異性Robo2敲除小鼠是可存活的并是可育的。然而，在一個月時，它們異乎尋常地表現出寬的足細胞足突和局灶節(jié)段性足突消失(圖4I-4M)。6周齡時，突變小鼠形成顯著的微白蛋白尿，由ELISA和蛋白質印跡分析法檢測(圖4N和圖4O)。另外，掃描電鏡顯示，在Robo2足細胞特異性敲除小鼠中出現足突圖案缺陷。與野生型有序拉鏈狀趾狀突的二次足突不同，Robo2足細胞特異性敲除小鼠在一個月時顯示不規(guī)則和紊亂的足突趾狀突圖案(圖8G-8J)。隨時間推移，這些缺陷越來越明顯。在7個月齡時，Robo2足細胞特異性敲除小鼠中明顯觀察到紊亂的、較短的和曲折的足突(圖8K-8N)，這與3周齡Robo2缺失小鼠的表型相似。雖然Robo2足細胞特異性敲除小鼠顯示了正常的足細胞數量，但腎小球中基質沉積顯著增加(圖8O-8T，表1和表2)。這些形態(tài)變化表明，Robo2在調節(jié)和維持腎小球足細胞足突結構中的作用。

Robo2的缺失減輕Nephrin缺失小鼠中足細胞結構缺陷

Nephrin純合小鼠形成特有的表型，其具有擴張腎小囊腔的異常寬的足突，腎小球slit-隔膜缺失，和顯著蛋白尿(Done等，2008；Hamano等，2002)(Done et al.,2008；Hamano et al.,2002)。由于Robo2與Nephrin形成復合物，以及Slit2-Robo2信號抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合，我們懷疑Robo2的缺失是否會修飾Nephrin缺失小鼠的足細胞表型。為了檢驗Robo2和Nephrin之間存在可能的基因相互作用這個假設，我們生成Robo2^-/-種系；Nphs1^-/-和足細胞特異性Robo2^flox/flox，Tg^Nphs2-Cre/+，Nphs1^-/-雙Robo2-Nephrin缺失小鼠。與Nphs1^-/-單一純合類似，Robo2^-/-；Nphs1^-/-(4/4；100％)以及Robo2^flox/flox；Tg^Nphs2-Cre/+；Nphs1^-/-(3/3,100％)雙敲除小鼠均在出生后10小時內死亡。然而，組織學分析揭示Robo2^-/-；Nphs1^-/-雙純合小鼠中腎小球的形態(tài)，與Nphs1^-/-單一Nephrin純合小鼠的表型相比，看起來相對正常，其具有擴大的腎小囊腔(圖8U-8X)。具有擴大腎小囊腔的腎小球的數量，與Nephrin單一缺失小鼠(31/122，25.4％)相比，在Robo2^-/-；Nphs1^-/-雙純合小鼠(2/55，3.6％)中顯著減少(圖8Y和表3)。另外，掃描電鏡顯示的腎小球超微結構分析表明，與Robo2^-/-單一純合(圖4T和4U)和野生型控制組(圖4V和4W)的100％相比，只在來自Nephrin單一純合小鼠的1/15(6.67％)的腎小球觀察到趾狀突足細胞足突結構(圖4P和4Q)。顯著地，足細胞足突的趾狀突圖案在Robo2^-/-；Nphs1^-/-雙合新生小鼠腎臟的12/16(75％)的腎小球中恢復(圖4R和4S，表4)，表明Robo2和Nephrin同時缺失減輕這些小鼠中足細胞足突結構的表型。這些發(fā)現表明，當Robo2和Nephrin的表達水平被從遺傳上改變時，上述的Robo2-Nck-Nephrin物理相互作用對體內足細胞足突形態(tài)具有巨大影響。

足細胞顯示了相當大程度的適應性。在發(fā)育發(fā)過程中，它們區(qū)分簡單立方上皮細胞進入到我們認為是成熟足細胞復雜的軸突細胞(Reeves等，1978)(Reeves et al.,1978)。該適應性被保留到成熟后。用硫酸魚精蛋白進行表面電荷中和和用肝素恢復試驗后(Seiler等，1975)(Seiler et al.,1975)，以及在患有微小病變的蛋白尿兒童的復發(fā)期和緩解期(Nachman等，2008)(Nachman et al.,2008)內，它被認為是最生動的可逆足突消失。足突中更細微的變化可能會發(fā)生用以在生理條件下響應以血液動力學、激素或旁分泌刺激形式的正和負信號?？紤]到足突中F-肌動蛋白的豐度，不希望受到理論的約束或限制，這些刺激引起那些細微變化以響應轉換到F-肌動蛋白細胞骨架的正和負信號是有可能的。過多和不平衡的正信號可能導致疾病表型。事實上，雖然尚未確定生理性配體，很顯然，Nephrin的成簇和磷酸化作用通過引入Nck誘導肌動蛋白聚合，機制是通過致腎炎單克隆抗體引入到Nephrin胞外域誘導大鼠的蛋白尿有關(Topham等，1999)(Topham et al.,1999)，以及在腎移植后先天性腎病綜合征情況下發(fā)展成抗Nephrin同種抗體的(Patrakka等，2002)(Patrakka et al.,2002)。

在此我們的研究顯示了足細胞肌動蛋白聚合的負調控的另一個水平，其中，當Robo2與Slit結合時，Robo2抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合。不希望被理論束縛或限制，我們認為Slit-Robo2信號可以抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合，以維持如下正常的足細胞足突結構：在生理條件下(例如足突發(fā)育過程中)，Nephrin參與引起細胞內的Y1191/1208/1232磷酸化，Nck的SH2結合域與其結合(Jones等，2006；Verma等，2006)(Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)。Nck反過來引入如N-WASP的細胞骨架調節(jié)器中，通過其SH3域促進肌動蛋白聚合，以使足突擴展或延伸(圖8Z)。局部分泌的Slit和結合的Slit通過其富含脯氨酸區(qū)域和Nck的前兩個SH3域增加Robo2與Nck的相互作用。用Robo2分離Nck的前兩個SH3域可抑制Nephrin-Nck介導的肌動蛋白聚合，并且降低與Nephrin相關的F-肌動蛋白以保持動態(tài)的和平衡的F-肌動蛋白細胞骨架和正常足細胞足突結構(圖8Z)。除了通過Nck直接抑制Nephrin誘導肌動蛋白聚合外，Slit-Robo2信號可通過其它途徑滅活肌動蛋白的聚合，例如，如前述報道，引入Ena、Abl、srGAPs以負向地調節(jié)F-肌動蛋白細胞骨架(Bashaw等，2000；Wong等，2001)(Bashaw et al.,2000；Wong et al.,2001)。在沒有Slit-Robo2信號情況下(例如當Robo2被敲除時)，Robo2對Nephrin誘導的聚合的抑制作用消失。Nck的SH3域能夠與下游的細胞骨架調節(jié)劑相互作用，以增加肌動蛋白聚合(圖8Z)，這可解釋在Robo2突變小鼠中確認的足細胞足突結構的改變。因此，在此我們的所述的結果支持這樣一個機制：Slit-Robo2信號可通過負調節(jié)F-肌動蛋白細胞骨架而調節(jié)足細胞適應性，這與Slit-Robo2信號在軸突生長錐尋路(axon growth cone pathfinding)中的作用相似(Guan和Rao，2003)(Guan and Rao,2003)。在Robo2突變小鼠腎小球中增加基質沉積的病理發(fā)現極有可能顯示了再次應答。

雖然從在此描述的我們的研究中，清楚的得出Robo2定位于足細胞的基底面，并通過其胞內域與其它既定的足突Slit-隔膜蛋白質形成復合物，但其本身實際上是否形成部分的Slit-隔膜仍是不確定的。有趣的是，Robo2的胞外域與Nephrin相似，其具有8種類免疫球蛋白(Ig)基序和1個纖連蛋白域，而Robo2具有5個類Ig基序和3個纖連蛋白域(圖8Z)(Tryggvason等，2006)(Tryggvason et al.,2006)。我們在酵母雙雜交試驗中檢測到Robo2胞內域和Nephrin細胞質域之間的相互作用。我們得到的生物化學數據(圖2E和2F)也不支持體外這兩個受體的直接相互作用。然而，這是可能的，Robo2胞外域可在相鄰足突細胞膜上通過Slit-隔膜中的反式相互作用與體內Nephrin胞外域關聯。

我們發(fā)現Robo2純合缺失和足細胞特異性敲除小鼠形成改變的足突趾狀突圖案，表型不同于Nephrin缺失小鼠的表型(Hamano等，2002；Done等，2008)(Hamano et al.,2002；Done,2008)。這并不奇怪，因為Nephrin和Robo2在調節(jié)足細胞F-肌動蛋白細胞骨架中的作用相反。在Nephrin信號誘導局部肌動蛋白的聚合時，而Slit-Robo2信號作為肌動蛋白聚合的負調節(jié)劑，以維持足細胞足突的適應性和動態(tài)。值得注意的是，在小鼠中觀察到類似的足突組織缺陷，這些小鼠缺少肌動蛋白解聚因子Cofilin-1，足細胞中另一種F-肌動蛋白細胞骨架負調節(jié)劑(Garg等，2010)(Garg et al.,2010)。這表明，肌動蛋白聚合促進因子如Nephrin信號或抑制因子如Robo2信號兩個中任何一個的缺失都會影響足細胞的正常結構。因此，足細胞中正和負F-肌動蛋白細胞骨架調節(jié)劑間的平衡對維持正常足突結構是重要的。通過同時敲除正(Nephrin)和負(Robo2)信號獲得這種平衡可以解釋在Robo2-Nephrin雙缺失小鼠中足細胞足突交錯結合的恢復和更輕微的腎小球表型。在此描述的我們的研究證明Nephrin的雙重作用，一方面，其作為Slit2-隔膜控制腎小球選擇滲透性的主要組分(Tryggvason等，2006)(Tryggvason et al.,2006)，另一方面，通過其與肌動蛋白細胞骨架的相互作用作為足突形態(tài)調節(jié)器(Jones等，2006；Verma等，2006)(Jones et al.,2006；Verma et al.,2006)。雖然Robo2信號可以明顯抵制Nephrin對足突的正信號影響，但仍然要確定其是否也影響slit-隔膜的完整性。

因此，如在此所述，我們已經確認Robo2作為一種腎臟中足細胞的細胞間結合的新組分。我們采用生物化學、泛函和基因技術已經證明Robo2和Nephrin間的相互作用，并表明Slit-Robo2信號抑制Nephrin誘導的肌動蛋白動態(tài)。我們的結果表明Robo2信號作為Nephrin的負調節(jié)劑用以調節(jié)足細胞足突結構。該結果延伸了我們對Slit-Robo信號作用的理解，并確定一種新型的串擾機制，通過這種機制，導向暗示受體Robo可能會影響F-肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)。

除非在此另有定義，使用的與本申請相關的科學術語和技術術語具有的含義是這些公開內容所述技術領域的本領域普通技術人員通常理解的含義。應當理解的是，發(fā)明并不局限于在此描述的具體方法、方案和試劑等等，并且這些可以變化。在此采用的術語的目的僅是為了描述具體實施方式，而不是為了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只由權利要求書限定。免疫學和分子生物學中普通術語的定義可在下列文獻中找到：默克研究實驗室2006年出版的《默克診療手冊(第18版)》(ISBN 0-911910-18-2)(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,18th Edition,published by Merck Research Laboratories,2006(ISBN 0-911910-18-2))；Robert S.Porter等(編寫)、布萊克韋爾科學有限公司1994年出版的《分子生物學百科全書》(ISBN 0-632-02182-9)(Robert S.Porter et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9))；和Robert A.Meyers(編寫)、VCH出版公司1995年出版的《分子生物學與生物技術：綜合性案頭參考》(ISBN 1-56081-569-8)(Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8))；愛思唯爾2006年出版、Werner Luttmann編著的《免疫學》(Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006)。分子生物學中普通術語的定義可在下列文獻中找到：Benjamin Lewin，瓊斯&巴特利特出版社2007年出版的《基因IX》(ISBN-13:9780763740634)(Benjamin Lewin,Genes IX,published by Jones&Bartlett Publishing,2007(ISBN-13:9780763740634))；Kendrew等(編寫)，布萊克韋爾科學有限公司1994年出版的《分子生物學百科全書》(ISBN 0-632-02182-9)(Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9))；和Robert A.Meyers(編寫)，馬尼亞蒂斯等，《分子克?。簩嶒炛改稀?，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，美國(1982)(Robert A.Meyers(ed.),Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982))；Sambrook等，《分子克隆：實驗指南(2版)》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，美國(1989)(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989))；Davis等，《分子生物學的基本方法》，愛思唯爾科學出版公司，紐約，美國(1986)(Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986))；或《酶學方法：分子克隆技術指南》第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmerl編寫，學術出版公司，圣地亞哥，美國(1987)(Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152,S.L.Berger and A.R.Kimmerl Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987))；《現代分子生物學實驗技術(CPMB)》(佛Fred M.Ausubel等主編，John Wiley和Sons出版公司)(Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel,et al.ed.,John Wiley and Sons,Inc.))，《現代蛋白科學實驗技術(CPPS)》(John E.Coligan等主編，John Wiley和Sons出版公司)(Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan,et.al.,ed.,John Wiley and Sons,Inc.))，和《現代免疫學實驗技術(CPI)》((John E.Coligan等主編，John Wiley和Sons出版公司)(Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,et.al.,ed.John Wiley and Sons,Inc.))，在此通過整體引用將其全部并入本文。

在此使用的術語“包含(comprising)”是指除了存在的定義的組分外，也可存在的其它組分。使用“包括”表明包含而不限于。

在此使用的術語“基本包含……”是指給定具體實施方式所需要的那些組分。該術語允許附加元素存在，這些附加組分對本發(fā)明具體實施方式的基本的和新的或功能性的特征不會產生實質性影響。

在此使用的術語“由……組成(consisting of)”是指在此描述的組合物、方法及其各自組分，其中不包括未記載在說明書具體實施方式中的任何組分。

另外，除非上下文另有要求，單數術語可包括復數，復數術語可包括單數。如在說明書和所附權利要求書中使用的單數形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”，除非上下文明確規(guī)定，否則均包括復數形式。因此，例如，“該方法”是包括一種或多種方法，和/或在此所述的該類型的多個步驟和/或在閱讀公開內容等后對本領域技術人員是顯而易見的方法。

除了操作實施例中的或某處另有說明外，在此使用的表達材料成分的量或使用的反應條件的所有數字，在任何情況下應當理解為被術語“約”修飾。當術語“約”與百分比結合使用時，術語“約”可以指±1％。

應當理解的是，本發(fā)明并不局限于本發(fā)明描述的具體方法、方案和試劑等等，并因此可以變化。在此采用的術語僅是為了描述具體實施方式，不是為了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只由權利要求書限定。

出于描述和公開的目的，在此通過引用明確并入了所有專利和經鑒定的其它出版物，例如，這些出版物中描述的方法可以與本發(fā)明結合使用。這些出版物被單獨提供，因為它們在本申請的申請日之前公開。在這方面，沒有什么可解釋為對發(fā)明人無權憑借在先發(fā)明或任何其它原因而先于這些公開的承認。關于日期的所有聲明或關于這些文件內容的陳述是基于申請人可獲得的信息，不構成關于日期和這些文件內容正確性的任何承認。

在此所述不同方面的具體實施方式可由以下編號的段落說明：

2.一種治療有需要受治療者慢性腎臟疾病的方法，該方法包括將治療有效量的含有ROBO2抑制劑的組合物給予患有或具有患慢性腎臟疾病風險的受治療者。

3.一種降低有需要受治療者蛋白尿的方法，該方法包括將治療有效量的含有ROBO2抑制劑的組合物給予患有或具有患蛋白尿風險的受治療者。

4.根據段1或2任一項的方法，其中，ROBO2抑制劑是特異性于ROBO2的封閉抗體或其抗原結合段，特異性于ROBO2反義分子，特異性于ROBO2小干擾RNA(siRNA)，ROBO2的小分子抑制劑，ROBO2抑制性多肽，或ROBO2結構類似物。

5.根據段1-3任一項的方法，其中，ROBO2抑制劑封閉或降低ROBO2與SLIT、Nck、或兩者的結合。

6.根據段1-4任一項的方法，其中，ROBO2抑制劑是特異性的Ig1SLIT結合域，Ig1和Ig2SLIT結合域，Nck胞內結合域，或上述任意組合。

7.根據段3的方法，其中ROBO2抑制性多肽是ROBO2顯性失活融合蛋白，含有ROBO2胞外域不含胞內域的多肽，或含有ROBO2胞內域不含胞外域的多肽。

8.根據段1-6任一項的方法，其中，患有或具有患慢性腎臟疾病的受治療者患有糖尿病腎病和高血壓。

9.根據段1-7任一項的方法，該方法進一步包括將額外的治療劑給予受治療者。

10.根據段8的方法，其中，所述額外的治療劑為血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑或血管緊張素II受體拮抗劑(ARB)。

11.一種方法，包括：

a.分析受治療者的生物測試樣本以確定ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平；

b.確定生物測試樣本中ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平是否高于參考閾值水平(reference threshold level)；以及

c.對需要處理或治療的慢性腎臟疾病的受治療者進行診斷。

12.根據段10的方法，其中，ROBO2多肽的表達水平的分析采用ROBO2多肽抗體或其抗原結合段進行。

13.根據段10的方法，其中，編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平的分析采用PCR或雜交分析進行。

14.根據段10-12任一項的方法，其中，生物測試樣本為腎臟活組織切片、尿、血液、血清樣本或尿樣顆?；毎?/p>

15.根據段10-13任一項的方法，其中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高20％。

16.根據段10-13任一項的方法，其中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高兩個標準差。

17.一種分析方法，包括：

a.將從受治療者分離的生物測試樣本與檢測ROBO2多肽或編碼ROBO2多肽的RNA的試劑接觸；以及

b.測量ROBO2多肽的水平或編碼ROBO2多肽的RNA的水平；

其中，相對于正常生物樣本，所述ROBO2多肽或所述編碼ROBO2多肽的RNA的水平增強的，鑒定受治療者患有慢性腎臟疾病和/或處于慢性腎臟疾病或蛋白尿的進程中。

18.根據段16的分析方法，其中，檢測ROBO2多肽的表達水平采用特異性于ROBO2多肽的抗體或其抗原結合段進行。

19.根據段16的分析方法，其中檢測編碼為ROBO2多肽的RNA的表達水平采用PCR或雜交分析進行。

20.根據段16-18任一項的分析方法，其中，生物測試樣本為腎臟活組織切片、尿、血液、血清樣本或來自于尿樣顆?；毎?。

21.根據段16-19任一項的分析方法，其中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高20％。

22.根據段16-19任一項的分析方法，其中，ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平至少高于考閾值水平的兩個標準差。

23.根據段16-21任一項的分析方法，其中，受治療者被診斷為患有糖尿病或高血壓。

24.一種確定受治療者是否具有患上慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，或確定受治療者是否患有慢性腎臟疾病的系統，該系統包括：

a.確定模塊，其配置用以確定受治療者生物樣本中ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平；

b.比較模塊，其配置用以接收通過確定模塊確定的所述ROBO2多肽的表達水平或編碼ROBO2多肽的RNA的表達水平，并進行至少一次分析以確ROBO2多肽的表達水平或編碼為ROBO2多肽的RNA的表達水平是否大于預先確定的參考水平，進而提供重新取回內容；以及

c.顯示模塊，其用于顯示基于來自所述比較模塊輸出數據的內容，其中，該內容包括ROBO2多肽或RNA的表達水平或比率大于預先確定的參考水平或比率的指示性信號，或ROBO2的水平或表達比率不大于參考水平或預先確定的比率的指示性信號。

25.根據段23的系統，其中，顯示在顯示模塊上的內容進一步包括推薦受治療者接收的具體的治療方案的指示性信號。

26.一種確定受治療者是否具有患上慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險，或確定受治療者是否患有慢性腎臟疾病的系統，該系統包括：

a.確定模塊，其配置用以接收來自受治療者的至少一個測試樣本，并對至少一個測試樣本進行至少一次分析以確定以下情況中的一種情況的存在或不存在：

i.ROBO2的表達比率大于預先確定比率，或

ii.ROBO2的表達水平高于預先確定水平；

b.存儲設備，其設置用以儲存所述確定模塊輸出的數據；以及

c.顯示模塊，用于顯示基于來自所述確定模塊輸出數據的內容，其中，該內容包括ROBO2的表達比率大于預先確定比率或ROBO2的水平大于預先確定水平的指示信號，或ROBO2的表達比率不大于預先確定比率或不大于預先確定水平的指示性信號。

27.根據段25的系統，其中，顯示在顯示模塊上的內容進一步包括推薦受治療者接收的具體的治療方案的指示性信號。

28.一種治療具有患上慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的人類受治療者的方法，該方法包括給予處理或治療以預防人類受治療者慢性腎臟疾病或蛋白尿的發(fā)生，這些人類受治療者被確定為ROBO2蛋白水平高于參考閾值水平。

29.根據段27的方法，其中，ROBO2蛋白的水平至少比參考水平高20％。

30.根據段27的方法，其中，ROBO2蛋白的水平至少比參考水平高兩個標準差。

31.根據段27-29任一項的方法，其中，用于預防慢性腎臟疾病或蛋白尿發(fā)生的處理或治療包括ROBO2抑制劑。

32.根據段30的方法，其中ROBO2抑制劑是特異性于ROBO2的封閉抗體或其抗原結合段，特異性于ROBO2的反義分子，特異性于ROBO2的小干擾RNA(siRNA)，ROBO2小分子抑制劑，ROBO2抑制性多肽，或ROBO2結構類似物。

33.根據段30-31任一項的方法，其中，ROBO2抑制劑封閉或降低ROBO2與SLIT、Nck、或兩者的結合。

34.根據段30-32任一項的方法，其中，ROBO2抑制劑是特異性于Ig1SLIT結合域，Ig1和Ig2SLIT結合域，Nck胞內結合域，或上述任意組合。

35.根據段31的方法，其中，ROBO2抑制性多肽是顯性失活ROBO2融合蛋白，含有ROBO2胞外域不含胞內域的多肽，或含有ROBO2胞內域不含胞外域的多肽。

36.ROBO2抑制劑在治療慢性腎臟疾病中的應用。

37.ROBO2抑制劑在治療蛋白尿中的應用。

38.根據段35或36任一項的應用，其中，ROBO2抑制劑是特異性于ROBO2的封閉抗體或其抗原結合段，ROBO2的反義分子，ROBO2的小干擾RNA(siRNA)，ROBO2小分子抑制劑，ROBO2抑制性多肽，或ROBO2結構類似物。

39.根據段35-37任一項的應用，其中，ROBO2抑制劑封閉或降低ROBO2與SLIT、Nck、或這兩者的結合。

40.根據段35-38任一項的應用，其中，ROBO2抑制劑是特異性的Ig1SLIT結合域，Ig 1和Ig2SLIT結合域，Nck胞內結合域，或上述任意組合。

41.根據段37的應用，其中，ROBO2抑制性多肽是顯性失活ROBO2融合蛋白，含有ROBO2胞外域不含胞內域的多肽，或含有ROBO2胞內域不含胞外域的多肽。

42.根據段35-40任一項的應用，其中，慢性腎臟疾病和蛋白尿由糖尿病腎病或高血壓引起。

本發(fā)明由以下實施例進一步說明，這些實施例不應該解釋對本發(fā)明的限制。

實施例

組織的原位雜交，免疫組織化學和免疫膠體金電鏡

如前所述，用地高辛標記的Robo2核糖核酸探針(riboprobes)完成原位雜交分析(Grieshammer等，2004)(Grieshammer et al.,2004)。免疫組織化學法在固定在4％多聚甲醛的小鼠胚胎腎組織上和在固定在甲醇中的成年小鼠腎組織中進行的。為了進行免疫膠體金電鏡，野生型小鼠腎臟被解剖并固定于多聚甲醛-賴氨酸-高碘酸鹽(PLP)中。制備小鼠腎臟超薄切片，并用山羊抗-Robo2抗體(DAKO公司)并結合10nm膠體金的第二抗體進行培養(yǎng)(Ted Pella)。

酵母的雙雜交，共沉淀和肌動蛋白聚合分析

根據制造商的說明書，用DUPLEX-A^TM酵母雙雜交系統(OriGene Tech)來表征Robo2和Nck1的相互作用。細胞的培養(yǎng)，His-標記蛋白的共沉淀，以及免疫共沉淀是依據前述報道進行(Fan等，2003)(Fan et al.,2003)。利用新生腎臟進行內源性免疫沉淀反應。CD16抗體介導CD16/7融合蛋白的交聯與肌動蛋白聚合分析師根據前述進行的(Jones等，2006；Rivera等，2004；Verma等2006)(Jones et al.,2006；Rivera et al.,2004；Verma et al.,2006)。

缺失小鼠研究，透射電鏡和掃描電鏡以及腎臟腎小球分析

小鼠方案獲得在波士頓大學醫(yī)學中心(#14388)的實驗動物管理委員會(IACUC)的批準。Robo2^flox條件等位基因、Robo2^del5(在本文中也可交換地稱為Robo2^-)生殖細胞系突變等位基因和Robo2⁺野生型等位基因的產生和基因分型在前面已經描述(Lu等，2007；Wang等，2011)(Lu et al.,2007；Wang et al.,2011)。為了產生Robo2-Nephrin雙敲除小鼠，以前使用Robo2^+/-小鼠與Nphs1^+/-小鼠雜交(Hamano等，2002)(Hamano et al.,2002)。為了進行透射電鏡分析，腎臟被固定并在含有2％戊二醛的0.15M二甲砷酸鈉中培養(yǎng)，乙醇梯度脫水，嵌入環(huán)氧樹脂(Epon)中，切片，并用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。用JEM-1011電鏡檢測超薄腎臟切片。為了進行掃描電鏡分析，用下述標準方案準備腎臟。為了進行腎臟病理研究，腎臟固定在4％多聚甲醛中，嵌入石蠟中，切片，并用標準的希夫氏高碘酸(PAS)或蘇木精伊紅(H&E)方法染色。為了量化足細胞數量，WT1被用作足細胞的核標記物，根據標準方法對腎切片進行免疫過氧化物酶染色。對每個腎小球截面中的WT1陽性足細胞核進行計數。為了分析蛋白尿，采用鼠科動物尿蛋白ELISA定量試劑盒(Exocell)根據制造商的指導對從6周齡小鼠取得的“現貨的”尿液樣本進行檢查，并用尿液試紙(Multistix，拜耳，IN)作為篩選方法。

組織的原位雜交和免疫組織化學法

如前所述，用地高辛標記的Robo2核糖核酸探針完成原位雜交分析(Grieshammer等，2004)(Grieshammer et al.,2004)。Robo2cDNA用NotI線性化，并使用DIG DNA標記和檢測試劑盒(羅氏應用科學部)(Roche Applied Science)生成探針。雜交在由4％多聚甲醛固定的OCT嵌入的小鼠胚胎腎臟冰凍切片上進行。免疫組織化學法在經過4％多聚甲醛固定后用30％蔗糖抗凍劑處理的小鼠胚胎腎臟組織，以及在甲醇中固定的成年小鼠腎臟組織上進行(Mugford等，2008)(Mugford et al.,2008)。OCT化合物嵌入的小鼠腎臟被凍結，并在低溫恒溫器切成8-10微米切片。切片用第一抗體和隨后用適當的FITC或Cy3共軛第二抗體染色。用于該研究的第一抗體包括抗Robo2抗體(研發(fā)體系，Abnova，圣克魯茲生物技術公司)(R&D System,Abnova,Santa Cruz Biotechnology)，Nephrin(定制合成)(Topham等，1999)(Topham et al.,1999)，Nck(北部/密理博)(Upstate/Millipore)，podocin(西格瑪)(Sigma)，nidogen(圣克魯茲生物技術公司)(Santa Cruz Biotechnology)，Pecam1(BD生物科學)(BD Biosciences)，WT1(圣克魯茲生物技術公司)，SLIT2(圣克魯茲生物技術公司)，PDGFR beta(細胞信號)(Cell Signaling)，突觸極蛋白(圣克魯茲生物技術公司)。用Perkin Elmer公司UltraView LCI多點旋轉光盤激光掃描共聚焦顯微鏡和具有60倍油浸物鏡的Zeiss LSM 510共聚焦激光掃描顯微鏡獲得圖像。

免疫膠體金電鏡

切開野生型小鼠腎臟，并固定在多聚甲醛-賴氨酸-高碘酸鹽(PLP)中4℃條件下過夜。該組織在1x PBS中洗滌，梯度乙醇脫水并嵌入LR白樹脂中(電子顯微鏡科學)。準備小鼠腎臟超薄切片并轉移至聚醋酸甲基乙烯酯包覆的金格中，在1x PBS中用1％牛血清白蛋白和5％正常山羊血清封閉。然后將切片用山羊抗Robo2抗體1:50稀釋液在DAKO(DAKO公司)4℃條件下過夜培養(yǎng)。未免疫的血清用作對照。用1x PBS清洗3次后，切片用連接有10nm膠體金(Ted Pella)的IgG第二抗體在室溫下培養(yǎng)2小時。最后，將切片用1％戊二醛后固定，與乙酸鈾酰對比。用JEM-1011透射電鏡(JEOL，東京，日本)在80kV下檢查切片，用AMT數字成像系統(先進顯微鏡技術，丹弗斯，馬薩諸塞州)(Advanced Microscopy Techniques,Danvers,MA.)獲得圖像，并輸入Adobe Photoshop。與用未免疫血清染色的對照顯微圖相比，用金色顆粒染色的Robo2在腎小球中的亞細胞定位顯示在數字電子顯微圖中。

酵母的雙雜交分析

用DUPLEX-A^TM酵母雙雜交系統(OriGene Tech，羅克維爾市，馬里蘭州)表征Robo2和Nck1的相互作用。編碼人類Robo2胞內域的cDNA及其截短形式被克隆至EcoRI/XhoI位點的pJG4-5載體中，將它們融合到B42的轉錄激活域。人類Nck1的cDNA及其截短形式被克隆至EcoRI/XhoI的pEG202載體，以將它們融合到LexA蛋白的DNA結合域中。構建體pSH18-34的lacZ基因和EGY48菌株酵母基因組中的LEU2基因被用作報告基因。pEG202、pSH18-34和pJG4-5構建體被共轉化至酵母EGY48細胞中。如果酵母細胞在X-gal存在下變成藍色并在缺乏亮氨酸時生長，該相互作用被認為是陽性的。

細胞培養(yǎng)，DNA構建體，轉染，共沉淀以及分子印跡分析

使用磷酸鈣轉染HEK(239T)細胞為60％匯合(confluency)轉染。為了得到C-端his-和myc-標記的的融合蛋白，全長的人類Nephrin和Robo2被分別克隆到HindIII/ECORI和EcoR1/Xho1限制性位點的pSecTag載體(英杰公司)(Invitrogen)。根據制造商的說明，使用QuikChange位點定向誘變試劑盒(Strategene)刪除Nck結合域(圖2C)從而獲得Robo2-ΔNBD。非標記的Robo2和Nck1被克隆到EcoR1/Xho1位點的PCS2載體(Addgene)，HindIII/EcoR1位點的Nephrin。先前已經報道人類Fyn-和myc-標記的Slit2構建體(Li等，2008；Wong等，2001)(Li et al.,2008；Wong et al.,2001)。先前也已有報道CD16/7-NCD和CD16/7-HA構建體(Verma等，2006)(Verma et al.,2006)。為了檢測Robo2和Nck1的相互作用，將C-端His-和myc-標記的人Robo2或Robo2-ΔNBD在HEK細胞表達。轉染后48小時，將細胞裂解在裂解緩沖液中(50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，10mM咪唑，0.5％TX100，1x蛋白酶抑制劑[pH8.0])。細胞裂解物在4℃下離心10分鐘；上清液用Ni-NTA樹脂(Qiagen)在4℃下培養(yǎng)2小時以沉淀His-Robo2，用無Ni的NTA樹脂作對照。用洗滌緩沖液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM的咪唑，0.5％TX100[pH8.0])洗滌該樹脂三次，并加熱至95℃保持10分鐘。將沉淀物溶解在SDS-PAGE凝膠上，并用1:1000稀釋的兔抗myc、兔單克隆抗Nck1(Cell Signaling公司)的抗體印跡。為了檢查Robo2，Nck1和Nephrin三者的相互作用，將his-myc-Robo2或His-myc-Robo2-ΔNBD與人類Nephrin和人類Fyn共表達于HEK細胞。如上所述，用Ni-NTA微珠沉淀His-myc-Robo2。為了確認該三者相互作用，His-myc-Nephrin與Robo2和Fyn在HEK細胞中共表達，His-myc-Nephrin被Ni-NTA微珠拉出。沉淀物用1:1000稀釋的兔多克隆抗-myc、兔單克隆抗-Nck1，兔多克隆抗-Nephrin，小鼠單克隆抗-Robo2(R&D Systems公司)和兔多克隆抗-Fyn(圣克魯茲生物技術公司)(Santa Cruz Biotechnology)抗體進行印跡。對于內源性蛋白質的免疫共沉淀，新生小鼠腎臟均質在冰上的RIPA緩沖液中(50mM的Tris[pH 7.4]，150mM NaCl，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，1mM Na₃VO₄，1mM NaF，1x蛋白酶抑制劑)。將樣本在4℃下離心10分鐘，并將上清液與1μg小鼠單克隆抗-Robo2抗體(R&D Systems公司)在4℃下培養(yǎng)1小時?？瞻咨窖騃gG(圣克魯茲生物技術公司)(Santa Cruz Biotechnology)作為對照。然后將樣本與30μl蛋白A/G Plus瓊脂糖微珠漿液(圣克魯茲生物技術公司)(Santa Cruz Biotechnology)混合，并進一步在4℃下培養(yǎng)12小時。然后將微珠在RIPA緩沖液中洗滌三次，通過加熱至95℃保持10分鐘，將蛋白質洗脫在1x蛋白載樣緩沖液中。將沉淀物溶解在SDS-PAGE凝膠上，如上所述，并用小鼠抗-Robo2，兔抗-Nephrin和兔抗-Nck1抗體進行印跡。肌動蛋白用Sigma的抗-β-肌動蛋白小鼠抗體進行印跡。條帶的強度使用ImageJ進行測量。為了蛋白尿的檢測，收集小鼠現尿，并以1：100的稀釋比例用1x蛋白載樣緩沖液稀釋。然后，將尿蛋白溶解在SDS-PAGE凝膠上，純化白蛋白用作對照(MP Biomedicals公司)。凝膠用兔抗白蛋白多克隆抗體(MP Biomedicals公司)進行印跡。

CD16/7-NCD交聯和肌動蛋白聚合分析

先前已經描述過CD16抗體介導的CD16/7融合蛋白的交聯(Jones等，2006；Rivera等，2004；Verma等2006)(Jones et al.,2006；Rivera et al.,2004；Verma et al.,2006)。簡單地說，CD16/7-NCD或CD16/7-HA與Robo2在HEK細胞中共表達。24小時后，將細胞轉移并接種在涂有聚賴氨酸的玻璃蓋玻片上過24小時。然后將細胞用1μg/ml的小鼠單克隆抗-CD16(Beckman Coulter公司)在37℃下培養(yǎng)30分鐘，用DMEM洗滌一次，在稀釋在Slit2條件培養(yǎng)液(Wong等，2001)或空白條件培養(yǎng)液中與羅丹明共軛的第二抗體(Thermo Scientific)培養(yǎng)30分鐘，并用4％多聚甲醛的1xPBS固定。根據制造商的說明，用FITCF-偶聯的鬼筆環(huán)肽(Invitrogen)染色肌動蛋白。新形成的F-肌動蛋白束粘在成簇的Nephrin(CD16/7-NCD)上，在熒光顯微鏡下看起來像彗星尾巴(即正文中的肌動蛋白尾巴)。在這個實驗中，我們只分析了通過CD16/7-NCD簇而形成的并附著在該簇的F-肌動蛋白束。計數具有F-肌動蛋白尾巴的細胞，并與總CD16/7-NCD轉染細胞進行比較。量化公式為：百分比(％)＝(具有F-肌動蛋白尾巴的轉染細胞數量/總轉染細胞數)×100。采用具有60倍油浸物鏡的LSM510共聚焦顯微鏡獲得圖像。

Robo2足細胞特異性敲除小鼠以及Robo2-Nephrin雙敲除小鼠的產生和表征

先前已經描述過Robo2^flox條件等位基因，Robo2^del5(在本文中也可互換地稱為Robo2^-)生殖細胞系的突變等位基因和Robo2⁺野生型等位基因的產生和基因分型(Lu等，2007；Wang等，2011)(Lu et al.,2007；Wang et al.,2011)。根據標準育種方案產生Robo2足細胞特異性Robo2^del5/FLOX；Tg^Nphs2-Cre/+敲除小鼠，其攜帶一個Robo2^del5等位基因和一個Robo2^flox等位基因。在這種化合物突變體中，由podocin啟動子驅動的足細胞特異性Cre重組酶僅刪除Robo^2flox等位基因，以促進表型的外顯，因為其它等位基因，Robo2^del5，已從生殖細胞系的表達中全部刪除。Robo2^del5/FLOX；Tg^Nphs2-Cre/+小鼠的真實性通過存在Robo2^del5和Robo2^flox等位基因以及Tg^Nphs2-Cre轉基因的尾部DNA的基因分型確定。以不具有Robo2^del5等位基因和Tg^Nphs2-Cre轉基因的F2同窩出生Robo2^flox/+小鼠作為對照。為了得到Robo2-nephrin的雙敲除小鼠，將先前已經產生Robo2^+/-雜合小鼠與Nphs1^+/-的雜合小鼠雜交(Hamano等，2002)(Hamano et al.,2002)。在Robo2^+/-；Nphs1^+/-雙雜合小鼠產生后，進行雙雜合小鼠的雜交以產生Robo2^-/-；Nphs1^-/-雙純合小鼠以及Nphs1^-/-單純合，Robo2^-/-單純合，和Robo2^+/+；Nphs1^+/+野生型對照。小鼠方案獲得在波士頓大學醫(yī)學中心(#14388)的實驗動物管理委員會(IACUC)的批準。

透射電鏡和掃描電鏡

為了進行透射電鏡分析，切開Robo2純合缺失小鼠和足細胞特異性敲除小鼠的腎臟，固定在多聚甲醛-賴氨酸-高碘酸鹽(PLP)中在4℃條件下過夜，并在含有2％戊二醛的0.15M二甲砷酸鈉中培養(yǎng)6小時。在1x PBS中洗滌后，對固定的腎臟用梯度乙醇進行脫水，嵌入Epon中，切片，并用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。制備得到超薄腎臟切片，并用JEM-1011電鏡檢查。野生型同窩出生小鼠用作對照。為了進行掃描電鏡分析，根據以前(Friedman和Ellisman，1981)(Friedman and Ellisman,1981)描述的方法稍作修改后的方法，從Robo2純合缺失小鼠，足細胞特異性敲除小鼠，Nephrin純合缺失小鼠和Robo2-Nephrin雙純合小鼠制備腎臟樣本。簡單的說，腎臟用2.5％的戊二醛和2％多聚甲醛溶液在0.1M二甲砷酸鹽緩沖液(Karnovsky固定劑，電子顯微鏡科學)(Karnovsky’s fixative,Electron Microscopy Sciences)中灌注，隨后用Karnovsky固定劑固定24小時，然后在2％四氧化鋨溶液中進行后固定(電子顯微鏡科學)。使用六甲基二硅氮烷對腎臟樣本低溫破碎、脫水和干燥(電子顯微鏡科學)。使用Amray 1000A和Jeol 6340F掃描電鏡對腎臟樣本成像。檢查從每個動物取得的三個腎小球以提供有代表性的圖像。

小鼠腎臟的病理學研究，足細胞數量的定量，以及蛋白尿分析

為了進行腎臟的病理學研究，將腎臟切開，并固定在4％多聚甲醛中過夜，然后用梯度乙醇處理后用嵌入石蠟。使用MT-920切片機(MICROM)將腎蠟塊切成4μm切片，并使用標準的希夫氏高碘酸(PAS)或伊紅蘇木精(H&E)的方法進行染色。使用配備SPOT數碼相機系統的Olympus BHT光學顯微鏡檢查和評估腎小球基質沉積，節(jié)段性腎小球硬化，以及腎小囊腔的擴張。為了定量足細胞的數量，WT1被用作足細胞的核標記物，按照以前的方法(Sanden等，2003)(Sanden et al.,2003)對腎臟切片進行免疫過氧化物酶染色。簡單來講，將從4個1歲齡的Robo2^del5/FLOX；Tg^Nphs2-Cre+足細胞特異性敲除小鼠和4個年齡匹配的野生型對照小鼠取得的嵌入石蠟的腎臟切成4μm切片，并在微波抗原修復后用WT1抗體(圣克魯茲生物技術公司)(Santa Cruz Biotechnology)染色。用生物素化的第二抗體和Vectastain ABC試劑盒(載體實驗室)(Vector Laboratories)檢測WT1信號。對來自于4個突變小鼠的共165個腎小球和4個對照組小鼠的166個腎小球中每個腎小球橫截面的WT1陽性足細胞細胞核計數。為了進行蛋白尿分析，根據制造商的說明，使用靈敏的鼠蛋白尿ELISA定量試劑盒(Exocell)檢查6周齡小鼠的“現貨”尿標本，以尿液試紙(MULTISTIX，來自拜耳，IN)(Multistix from Bayer,IN)作為篩查方法。尿白蛋白用肌酸酐標準化，以提供白蛋白/肌酸酐比值。根據制造商的說明，使用肌酸酐檢測試劑盒(Sigma公司)確定尿液中的肌酸酐。也采用12％SDS-PAGE檢查尿白蛋白，并用抗白蛋白抗體印跡尿白蛋白(MP生物醫(yī)學)。突變體和對照組的數據采用單因素ANOVA、Student氏t-檢驗和卡方檢驗進行分析。

表1在2-9月齡Robo2足細胞特異性敲除小鼠(突變體)中具有增加的基質擴張的腎小球的定量分析與對照組(野生型)對比

*p<0.01，n＝5，t-檢驗。

表2在12月齡Robo2足細胞特異性敲除小鼠(突變體)中具有增加的基質擴張的腎小球的定量分析與對照組(野生型)對比

*p<0.01，n＝5，t-檢驗。

表3通過組織學對中Nphs1^-/-單純合(Robo2^+/-；Nphs1^-/-)小鼠中具有擴張的腎小囊腔的腎小球進行形態(tài)分析與Robo2^-/-；Nphs1^-/-雙純合新生小鼠對比

注：如果觀察到腎小球顯示與圖S4U顯示相似的表型，則具有擴張的腎小囊腔的腎小球被記錄為陽性，如果觀察到如圖8V-8X顯示相似的腎小球則記錄為陰性。分析各基因型的三只小鼠。Robo2^-/-單純合(Robo2^-/-；Nphs1^+/-)和野生型(Robo2^+/+；Nphs1^+/+)用作對照。

表4用掃描電鏡對Nphs1^-/-單純合(Robo2^+/-；Nphs1^-/-)小鼠的腎小球足細胞趾狀突足突(FP)表型進行形態(tài)分析與Robo2-/-；Nphs1-/-雙純合新生小鼠對比

參考文獻

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