專利名稱：用于診斷IgA和IgM介導(dǎo)的腎臟疾病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及關(guān)于腎臟疾病的診斷方法以及在此類疾病診斷中有用的組合物和試劑盒的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
IgA腎病(IgAN、貝格爾氏(BergeW s)病)的特征在于IgAl沉積在腎臟皮質(zhì)的腎小球系膜中，且是全世界最普遍的腎小球腎炎。IgA沉積通常在人生的第二個(gè)或第三個(gè)10年時(shí)自發(fā)地出現(xiàn)，且被認(rèn)為是免疫復(fù)合物?？乖粗?；IgA自身可能是抗原。該病的流行率在美國(guó)和歐洲很高，但在亞洲最高。在日本的發(fā)病率可能是所有腎活檢的40-50 %。多年持續(xù)或間歇性檢測(cè)到的顯微鏡性血尿和蛋白尿是這種疾病的臨床特征，且超過50%的患者還發(fā)展為高血壓。這不是曾經(jīng)認(rèn)為的良性病，約15-40%的患者最終發(fā)展成腎衰竭。事實(shí)上，IgA腎病是原發(fā)性腎小球疾病最終達(dá)到腎臟移植的患者中腎終末期疾病的主因。過敏性紫癜(Henoch-Sch0nleinpurpura, HSP)是另一種IgAl介導(dǎo)的感染后血管炎，在年齡2-11歲的兒童中最常見，而腎損害非常類似于IgAN。流行率在14歲以下是22/100, 000,且在年齡4-6歲的群體中是70/100，000。HSP是如此類似于IgAN，以致于認(rèn)為IgAN是病變局限于腎臟形式的HSP的觀念近來已獲得接受(Smith和Feehally, SpringerSemin.1mmunopatho1. 24 :477-493,2003)。IgM腎病(IgMN)引起腎病綜合征且特征在于IgM的腎小球系膜沉積。推測(cè)這些沉積來源于循環(huán)IgM聚集物或免疫復(fù)合物，類似于IgAN。IgMN通常見于兒童中，且IgMN的臨床特征非常類似于微小病變疾病(MCD)，其中腎病綜合征是主要臨床表型，但I(xiàn)gMN導(dǎo)致明顯高于MCD的高血壓發(fā)病率。在本發(fā)明之前，這些疾病的診斷通過取出腎組織樣品用于病理學(xué)檢查的腎活檢來進(jìn)行。腎臟病理學(xué)家進(jìn)行腎組織的免疫熒光染色。這需要連續(xù)應(yīng)用抗人IgA抗體，隨后用熒光染料綴合的第二抗體顯色，以定位基于IgA的抗體-抗原復(fù)合物用于診斷IgAN和HSP。在IgMN的診斷中，可以應(yīng)用相同操作，但使用的抗體特異性是結(jié)合人的IgM。如果測(cè)試檢測(cè)到比共存的IgG更高的高水平的腎小球IgA，以及不同程度存在的補(bǔ)體組分，則可進(jìn)行IgA腎病的診斷。對(duì)于IgMN也是如此，其中腎小球中的IgM沉積定義該疾病?；顧z時(shí)，患者通常取俯臥位躺著時(shí)進(jìn)行，其腎臟已經(jīng)過超聲或CAT掃描定位。在局部麻醉下，在皮膚上制造小切口。使用合適的憋氣規(guī)程，使用活檢針獲取大小1-1. 5cm X2mm的樣品，隨后再取出活檢針?；颊吡粼卺t(yī)院里，仰臥12-24小時(shí)，伴隨監(jiān)測(cè)以檢測(cè)并發(fā)癥，所述并發(fā)癥可以包括出血、疼痛、動(dòng)靜脈瘺、泌尿道感染、以及罕見情況下的死亡。出血是腎活檢最常見的并發(fā)癥。盡管在活檢前，患者被測(cè)試凝血能力，但大多數(shù)患者經(jīng)歷短時(shí)間的顯微鏡性血尿。罕見地，出血嚴(yán)重得足以需要輸血或手術(shù)。估計(jì)在經(jīng)皮腎活檢中，有O. 1-0. 4%的病人需要經(jīng)過手術(shù)才能控制出血，且在所有采用針吸活檢的病人中，大約有O. 06% (6/10, 000)需要切除腎以控制出血。疼痛是常見問題且是短暫的。持續(xù)超過12小時(shí)的疼痛在大約4%的活檢中發(fā)生。在血塊阻塞輸尿管之一或在大包膜下血腫的情況下，可能發(fā)生嚴(yán)重或延長(zhǎng)的疼痛。2根血管之間的動(dòng)靜脈瘺可能起因于由活檢針引起的鄰近動(dòng)脈和靜脈壁的損害。此類瘺是罕見的且通常在I到2年內(nèi)自發(fā)地關(guān)閉。
死亡在大約O.1 %的腎活檢情況下發(fā)生。腎活檢并非對(duì)于所有患者都是合適的。禁忌癥包括無法補(bǔ)救的出血病癥、小腎、無法在醫(yī)學(xué)上控制的嚴(yán)重高血壓、多重雙側(cè)腎囊腫或腎腫瘤、腎積水(尿流被阻塞導(dǎo)致腎損害的病癥)、腎臟或周圍組織的活動(dòng)性感染、患者不能配合、和先天性單腎。經(jīng)皮活檢的可替代方法是開放性手術(shù)活檢和經(jīng)頸靜脈腎活檢。正因?yàn)橐陨细鞣N原因，臨床上需求更安全、更可靠和侵襲性更少的方法用于診斷IgA腎病、HSP和IgM腎病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征是用于診斷哺乳動(dòng)物(例如，人)中的IgA或IgM腎臟疾病的方法，所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用(例如，靜脈內(nèi))特異性結(jié)合IgA或IgM的化合物，和檢測(cè)哺乳動(dòng)物腎中的該化合物，其中，所述哺乳動(dòng)物腎中的該化合物的量相對(duì)于沒有腎臟疾病的哺乳動(dòng)物腎臟中的該量的增加有助于診斷哺乳動(dòng)物中的IgA或IgM腎臟疾病?；衔锟梢园?例如，人Fca Rl (SEQ ID N0:2)、人Fca/μ受體(SEQ IDNO 6)、多聚 Ig 受體(SEQ ID NO 7)、Sir22(SEQ ID NO 3)、鏈球菌 IgA 結(jié)合肽(Sap ；SEQID NO :4)、修飾的 Z-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 12)和 YDWIPSSAW(SEQ ID N0:9)、或這些肽的IgA或IgM結(jié)合片段)。肽可以包括N末端帽、C末端帽、D氨基酸、氨基酸替代物、擬肽序列或間隔物的修飾?；衔锟梢园贵w、或抗體的IgA或IgM結(jié)合片段(例如，抗人IgA或抗人IgM)。化合物可以含有量子點(diǎn)?；衔镆部梢耘c放射性標(biāo)記(例如，99mTc、111 In、66Ga、67Ga、68Ga、86Y、90Y、201T1、55Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、82Rb、18V187Re 和 1867l88Re)連接。連接可以通過雙功能螯合劑，這可以包括N3S、N2S2、PnAO、HYNIC、[M (CO) 3 (H2O) 3] +、PADA、DTPA> D0TA、組氨酸、三肽(例如，Lys-Gly-Cys> Cys-Gly-Cys 和 Gly-Gly-Cys)和四肽(例如,Gly-Ala-Gly-Gly或Cys-Gly-Cys-Gly)?；衔锟梢耘c順磁物質(zhì)(例如，禮)連接。檢測(cè)可以通過成像技術(shù)(SPECT、PET、平面掃描和MRI)來進(jìn)行。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化合物包括半乳糖和結(jié)合對(duì)的第一個(gè)成員(例如，鏈霉親和素)?；衔锏氖┯每梢赃M(jìn)一步包括半乳糖-菲柯爾(Ficoll)的施用。檢測(cè)隨后可以通過下列來進(jìn)行給哺乳動(dòng)物施用與結(jié)合對(duì)的第二個(gè)成員(例如，生物素)以及半乳糖綴合的放射性標(biāo)記(例如，99mTC、mIn、66Ga、67Ga、68Ga、86YJqY^iTu55Cck6qCiu61Ciu62Cu、64Ciu67Cu^82Rb, 1857l87Re或186/188Re標(biāo)記)化合物(例如，人血清白蛋白)，隨后檢測(cè)哺乳動(dòng)物腎中的該放射性標(biāo)記化合物。本發(fā)明的第二個(gè)方面是包括IgA或IgM結(jié)合化合物、雙功能螯合劑和在藥學(xué)可接受載體中的可檢測(cè)標(biāo)記的組合物，其中IgA或IgM結(jié)合化合物通過雙功能螯合劑與可檢測(cè)標(biāo)記連接?；衔锟梢园?例如，人Fca Rl (SEQ ID NO :2)、人Fe α/μ受體(SEQ IDNO :6)、多聚 Ig受體(SEQ ID NO :7)、Sir22 (SEQ ID NO :3)、鏈球菌 IgA結(jié)合肽(Sap ;SEQ IDNO 4)、修飾的 Z-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :12) YDffIPSSAff (SEQ ID NO :9)、或這些肽之一的IgA或IgM結(jié)合片段)。肽可以包括N末端帽、C末端帽、D氨基酸、氨基酸替代物、擬肽序列或間隔物的修飾。該化合物還可以包括抗體(例如，抗人IgA或抗人IgM)、或抗體的IgA 或 IgM 結(jié)合片段。雙功能螯合劑可以是 N3S、N2S2、PnAO、HYNIC、[M(CO)3 (H2O) 3]+、PADA、DTPA、D0TA、組氨酸、三肽(例如，Lys-Gly-Cys、Cys-Gly-Cys 或 Gly-Gly-Cys)或四肽(例如，Gly-Ala-Gly-Gly 或 Cys—Gly—Cys—Gly)。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括IgA或IgM結(jié)合化合物、雙功能螯合劑、在藥學(xué)可接受載體中的可檢測(cè)標(biāo)記和用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的IgA或IgM腎臟疾病的使用說明的試劑盒。該化合物可以包括半乳糖和結(jié)合對(duì)的第一個(gè)成員(例如，鏈霉親和素)；并且該可檢測(cè)標(biāo)記可以包括放射性標(biāo)記肽(例如，人血清白蛋白)，該放射性標(biāo)記(例如，99mTc、mIn、66Ga、67Ga、68Ga、86Y、90Y、201T1、55Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、82Rb、1857l87Re 或 186/188Re 標(biāo)記)肽包括半乳糖和結(jié)合對(duì)的第二個(gè)成員(例如，生物素)?！癐gA或IgM腎臟疾病”意指由IgA或IgM在腎中沉積介導(dǎo)的腎臟病癥。這些病癥包括例如IgA腎病、過敏性紫癜和IgM腎病?！疤禺愋越Y(jié)合”意指識(shí)別且結(jié)合例如IgA或IgM等化合物，但基本上不識(shí)別且不結(jié)合樣品例如生物樣品中天然地包括的其他化合物。在一個(gè)例子中，與IgAl(SEQ ID NOI)特異性結(jié)合的抗體識(shí)別IgAl中存在但I(xiàn)gA2中不存在的13個(gè)氨基酸的區(qū)域。希望地，化合物與目的化合物例如IgA的結(jié)合比它與樣品中其他組分的結(jié)合強(qiáng)至少5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或1000倍?！癗末端帽”意指對(duì)于肽或蛋白質(zhì)氨基末端的任何化學(xué)修飾。在本發(fā)明中，給肽或蛋白質(zhì)添加N末端帽希望與未加帽的蛋白質(zhì)比較減少肽或蛋白質(zhì)的體內(nèi)降解率。N末端帽的例子包括乙?；碗沫h(huán)化。“C末端帽”意指對(duì)于肽或蛋白質(zhì)羧基末端的任何化學(xué)修飾。在本發(fā)明中，給肽或蛋白質(zhì)添加C末端帽希望與未加帽的蛋白質(zhì)比較減少肽或蛋白質(zhì)的體內(nèi)降解率。C末端帽的例子包括使C末端酰胺化或還原，和肽環(huán)化?！皵M肽”意指模擬肽特征包括識(shí)別生物分子的能力的分子。在本發(fā)明中，將擬肽插入肽或蛋白質(zhì)內(nèi)以防止經(jīng)由肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈端解酶的體內(nèi)降解?！伴g隔物”意指在內(nèi)部或N或C末端處插入的代替肽序列中的氨基酸的小分子。間隔物的例子包括氨基己酸。與擬肽類似，間隔物在本發(fā)明中用于防止肽降解?！鞍被崽娲铩币庵缚梢灾糜陔幕虻鞍踪|(zhì)內(nèi)代替氨基酸的任何化學(xué)化合物。氨基酸替代物的例子包括間隔物、擬肽、亞氨基酸、以及具有甲基化酰胺和/或甲基化側(cè)鏈氮的氨基酸?！捌巍币庵赴^大肽或多核苷酸的任何部分的至少4、5、6、8、10、15、20或25個(gè)
氨基酸或核苷酸的鏈?！半摹币庵赴被峄蚱漕愃莆锏娜魏捂?，任何長(zhǎng)度或翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)均可。“量子點(diǎn)”意指熒光半導(dǎo)體納米晶體。制備量子點(diǎn)的材料的例子包括CdS、CdSe,CdTe、CdHgTe/ZnS、InP、InAs和 PbSe。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過下列詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求將顯而易見。


圖1 是二聚 IgAl(SEQ ID NO :1)、其鉸鏈區(qū)(SEQ ID NO : 14)和 O-聚糖位點(diǎn)(Thr225、Thr228、Ser230、Ser232、Thr236)的圖示。圖2是IgA的Fe受體(Fe a R1/CD89 ；SEQ ID NO :2)的結(jié)構(gòu)和特征圖示。描述了細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域I和3(EC-1和EC-2)以及Y鏈關(guān)聯(lián)對(duì)與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ITAM)基序。此外概括了⑶89的特征、其細(xì)胞分布及其已知功能。(來自Westerhuis,Pathogenetic Aspectsof IgA-Nephropathy 200IPrintPartners Ipskamp, Enschede)圖3是鏈球菌Sir22(M22 ;SEQ ID NO :3)蛋白質(zhì)和來源于這種蛋白質(zhì)的Sap肽(SEQ ID N04)序列的圖示。Sap肽包括29個(gè)殘基的IgA結(jié)合區(qū)域(水平箭頭標(biāo)記“IgA”)和這個(gè)區(qū)域兩側(cè)的各10個(gè)殘基。另外，Sap包括促進(jìn)其二聚作用但Sir22中不存在的C末端半胱氨酸殘基。指出了 Sir22中已知包括對(duì)于C4BP(人補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑)、IgA和IgG的結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域。C4BP結(jié)合區(qū)域是高變結(jié)構(gòu)域。(名稱“C4BP”和“IgG”下的水平箭頭指出了用于結(jié)合C4BP和IgG的相應(yīng)區(qū)域。對(duì)于這3個(gè)結(jié)合區(qū)域中的每一個(gè)均存在某些序列重疊)。還指出了保守的C重復(fù)區(qū)域的位置。Sir22的C末端與細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖共價(jià)結(jié)合。圖4是完整Ig連同F(xiàn)ab和Fv片段以及單個(gè)V(有色的橢圓形；點(diǎn)表示抗原結(jié)合位點(diǎn))和C結(jié)構(gòu)域(未著色的)的圖示。工程化的重組抗體顯示為scFv單體、二聚體(雙價(jià)抗體)、三聚體(三價(jià)抗體)和四聚體(四價(jià)抗體)，而連接物由黑線表示。微型抗體顯示為由2個(gè)C結(jié)構(gòu)域連接的2個(gè)scFv模塊。還顯示了 Fab 二聚體(由粘性多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域綴合)和Fab三聚體(化學(xué)綴合)。顏色表示雙特異性scFv 二聚體(雙價(jià)抗體)以及Fab 二聚體和三聚體的不同特異性。圖5是關(guān)于99mTc的雙功能螯合劑(BFCA)的結(jié)構(gòu)圖示。顯示了三酰胺硫醇(Triamidethiols) (N3S)、二酸胺二硫醇(diamidedithiols) (N2S2)、丙胺廂(PnAO)和餅基煙酸(HYNIC)。圖6是甲氨基吡啶-N，N_ 二乙酸(PADA)及其與Tc的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)圖示。顯示了PADA及其與水合離子[Tc (CO) 3 (H2O) 3] +反應(yīng)后的復(fù)合物。圖7是關(guān)于111In的BFCA的結(jié)構(gòu)圖示。顯示了二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)。圖8是氨基酸和核酸序列表，包括IgAlC區(qū)(SEQ ID NO 1)、⑶89 (SEQ ID NO 2)、Sir22(SEQ ID NO 3), Sap (SEQ ID NO :4)、可溶性 CD89 (SEQ ID NO :5)、人 Fe α / μ R(SEQID NO :6)、pIgR(SEQ ID NO :7)、CD71 (SEQ ID NO :8)、IgM結(jié)合肽(SEQ ID NO :9)、葡萄球菌A 蛋白(SEQ ID NO :10)、Z-結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :11)、修飾的 Z-結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :12)、B-結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :13)、IgAl 鉸鏈區(qū)(SEQ ID NO :14)、IgMy 鏈氨基酸序列(SEQ IDNO 15)、IgMy 鏈核酸序列(SEQ ID NO :16)和 IgM 鉸鏈序列(SEQ ID NO :17)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用放射學(xué)掃描鑒定具有基于腎小球的腎臟病的患者，所述腎臟病例如是IgA腎病(IgAN)、過敏性紫癜(HSP)和IgM腎病(IgMN)。IgAN的特征在于和時(shí)間(年)有關(guān)的IgAl免疫球蛋白(SEQ ID NO :1)沉積在腎皮質(zhì)的腎小球內(nèi)。HSP與IgAN緊密相關(guān)，具有相同模式的IgAl沉積和腎損傷。IgMN的特征在于IgM沉積在腎小球的腎小球系膜中。為了鑒定具有IgAl或IgM沉積的腎臟病的那些患者，需要進(jìn)行腎的閉合性針吸活檢，獲取用于病理學(xué)檢查的組織核塊、這是具有中等危險(xiǎn)的、并且會(huì)帶給病人痛苦的操作。使用本發(fā)明，IgAl或IgM沉積可以使用放射學(xué)成像法進(jìn)行診斷，其中腎皮質(zhì)中的IgAl或IgM沉積使用注入的、標(biāo)記的IgA結(jié)合或IgM結(jié)合分子進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)腎活檢以便進(jìn)行腎臟疾病診斷時(shí)，用于診斷IgAN、HSP和IgMN的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是在作為IgA或IgM沉積的唯一位點(diǎn)的腎小球中存在顯著的IgAl或IgM沉積。因?yàn)檎Ｈ撕途哂蟹荌gAN、非IgMN腎臟疾病的那些人在其腎小球中沒有顯著量的IgAl或IgM，所以本發(fā)明提出了用于腎皮質(zhì)中的IgA或IgM的宏觀、非侵入性檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是掃描提供了關(guān)于2個(gè)腎中的完整腎皮質(zhì)的信息，因此減少了針吸活檢方法中固有的取樣誤差(Sund 等人，Nephrol. Dial. Transplant. 14 :2445-2454,1999)。
本發(fā)明的特征在于靶向IgAl的幾種IgA特異性結(jié)合肽、可以標(biāo)記肽的可用放射性同位素、和用于這種標(biāo)記的連接物。在一個(gè)實(shí)施方案中，放射性核素標(biāo)記的IgA結(jié)合肽或蛋白質(zhì)用作診斷放射性藥物以檢測(cè)腎中的IgA沉積物。注入的放射標(biāo)記的IgA結(jié)合肽與遍及全身的IgA結(jié)合。因?yàn)榻】的I的腎小球中沉積的IgA很少，所以具有IgAN的患者腎小球中的IgA沉著物導(dǎo)致從腎小球所在的腎皮質(zhì)發(fā)出高濃度的輻射。這種輻射可以通過各種核成像技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，因此可以用于診斷IgAN。對(duì)于腎臟疾病的診斷，人來源的抗體、或人源化的抗體、或具有對(duì)人IgAl的特異性的動(dòng)物單克隆抗體非常適合作為IgA結(jié)合化合物，且還可以用于檢測(cè)腎小球中的IgAl沉著物。另外類型的腎病包括IgM腎病可以類似地進(jìn)行診斷。例如用抗人IgM抗體或其片段替換IgA結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體，IgM可以在IgM腎病中被檢測(cè)。IgA 結(jié)構(gòu)人免疫球蛋白A(IgA)合成超過所有其他免疫球蛋白種類的總和(Rifai等人，J. Exp. Med. 191 :2171-2181，2000)。與 34mg IgG 和 7. 9mg IgM 比較，估計(jì)每天產(chǎn)生 66mgIgA/kg體重。存在2種IgA同種型-1gAl (SEQ ID NO 1)和IgA2。在粘膜表面(例如腸、呼吸道、生殖道)上存在由局部B細(xì)胞合成的IgAl和IgA2。然而，在血液中由骨髓、淋巴結(jié)和脾中的 B 細(xì)胞產(chǎn)生的 IgAl 占優(yōu)勢(shì)(Donadio 和 Grande, N. Engl. J. Med. 347 :738-748,2002)。IgAl (SEQ ID NO :1)和IgA2亞類之間的主要差異是IgA2鉸鏈區(qū)中的13個(gè)氨基酸缺失。IgAl中的這個(gè)區(qū)段包含幾個(gè)O-糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基。IgA2中這個(gè)區(qū)域的缺失解釋了 IgA2上O-聯(lián)寡糖的缺乏(圖1)。IgM 結(jié)構(gòu)IgM(SEQ ID NO :15)可以在B淋巴細(xì)胞表面上作為單體找到，但在循環(huán)中在由漿細(xì)胞分泌后它主要作為五聚體存在。IgM五聚體具有 850-1，OOOkDa的分子量，而每個(gè)單體為 180kDa。IgM代表 10%的總血清Ig，且是初次體液應(yīng)答時(shí)合成的第一種抗體同種型。成人中的正常血衆(zhòng)IgM水平是約lmg/ml,而半衰期為約5天。這與12mg/ml的IgG水平、25天的半衰期和1. 8mg/ml的IgA、6天的半衰期形成對(duì)比。碳水化合物構(gòu)成了 IgM蛋白質(zhì)的約12重量％。IgM的μ重鏈由4個(gè)CH結(jié)構(gòu)域組成(只有μ和ε (IgE)重鏈各自具有4個(gè)恒定重區(qū)結(jié)構(gòu)域-CH1、CH2、CH3和CH4，而Y (IgG)、a (IgA)和δ (IgD)各自具有3個(gè)恒定重區(qū)結(jié)構(gòu)域。)由于在五聚體上存在10個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所以IgM是極佳的凝集抗體。另夕卜，IgM在補(bǔ)體激活方面也是有效的。IgM單體通過鏈間二硫鍵以及通過J鏈連接在一起形成五聚體，所述J鏈?zhǔn)歉郊又罥gM的2個(gè)單體且使五聚體處于閉合的、外觀環(huán)狀的構(gòu)象的15kDa肽。(J鏈還用于將IgA單體連接在一起,形成二聚體。)診斷組合物用于在本文使用的診斷放射性藥物的組分包括(I)特異性結(jié)合人IgA或IgM的化合物、肽、或蛋白質(zhì)，和(2)在藥學(xué)可接受載體中、能夠通過放射學(xué)成像技術(shù)(例如，SPECT) 檢測(cè)的、與化合物、肽、或蛋白質(zhì)螯合的化合物(例如，放射性同位素)。優(yōu)選試劑包括雙功能螯合劑(BFCA)，它用于螯合⑴和(2)。盡管任何IgA結(jié)合或IgM結(jié)合化合物、蛋白質(zhì)、或肽都可以作為生物分子而用于診斷，但優(yōu)選候選物符合下述標(biāo)準(zhǔn)中的幾個(gè)或全部對(duì)人IgA或IgM的高特異性和親和力；對(duì)于IgA介導(dǎo)的腎病，要有區(qū)分IgAl與IgA2的能力；小分子，因?yàn)檫@樣免疫原性更小；人源的蛋白質(zhì)；容易表達(dá)或化學(xué)合成；易于產(chǎn)生和修飾；和適當(dāng)糖基化，包含用于無唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)清除的半乳糖，由此使腎小管滯留減到最小。I gA和I gM結(jié)合化合物/肽IgA和IgM結(jié)合蛋白質(zhì)或肽可以包括細(xì)胞上的天然人IgA結(jié)合受體；識(shí)別IgA和IgM的受體；細(xì)菌IgA結(jié)合蛋白質(zhì)及其衍生的肽；抗人IgA或IgM抗體及其較小的衍生物(例如，F(xiàn)ab);和使用例如噬菌體展示法發(fā)現(xiàn)的結(jié)合IgA和IgM的特異性肽。IgA特異性受體IgA特異性受體的天然功能包括募集炎癥細(xì)胞和調(diào)節(jié)物至炎癥位點(diǎn)(⑶89 ；SEQ IDNO 2)，以及使IgA在身體的分布，例如讓IgA進(jìn)入分泌液的受體(pIgR ；SEQ ID NO 7)。人Fca R1(CD89 ;SEQ ID NO :2 ;參見圖2)是包含2個(gè)細(xì)胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域(206個(gè)氨基酸)、跨膜區(qū)(19個(gè)氨基酸)和胞質(zhì)尾區(qū)(31個(gè)氨基酸)的膜糖蛋白。在跨膜區(qū)，帶正電荷的精氨酸殘基是CD 89與FcRy鏈結(jié)合所必須的。如同缺乏細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序的其他Fe受體，F(xiàn)e a R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)經(jīng)由其與FcR Y鏈的關(guān)聯(lián)開始。FcRy鏈?zhǔn)谴笮镮OkDa的同型二聚體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。與CD89結(jié)合導(dǎo)致Y鏈上的細(xì)胞內(nèi)、基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游至細(xì)胞內(nèi)。FcaRl結(jié)合單體和二聚形式的IgAl和IgA2。白細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染研究顯示Fca Rl不結(jié)合IgG。Fe a Rl只由髓樣細(xì)胞包括嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞表達(dá)。有學(xué)者提出FcaRl在循環(huán)中有去除IgA抗原復(fù)合物的作用(Mattu等人，J. Bio. Chem. 273 =2260-2272,1998 ；Leung等人，J. Am. Soc. Nephrol. 11 :241-249, 2000 ；ffesterhuis, Pathogenetic Aspects ofIgA-Nephropathy 2001,第 I 章，第 IV 節(jié)IgA receptors and IgAN,2001, PrintParters,Ipskamp, Enschede)。重組⑶89(SEQ ID NO :5)的206個(gè)氨基酸的可溶部分已在幾個(gè)研究實(shí)驗(yàn)室中成功表達(dá)，并且此類可溶受體具有用作IgA檢測(cè)肽用于診斷IgAN的潛力。盡管存在可溶性⑶89可能加重IgAN的一些有爭(zhēng)議的報(bào)道(Pierre Launay等人,J. Exp. Med. 191 :1999-2009),但由于其高特異性和親和力，這種片段對(duì)于與IgA的結(jié)合是優(yōu)選的。這種蛋白質(zhì)是糖基化的，這可能加速其經(jīng)由無唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的清除。這使循環(huán)中的未結(jié)合配體的本底噪聲減到最小，且可能使經(jīng)由腎降解系統(tǒng)清除放射性核素的量減到最小，這也就減少了本底噪聲。更優(yōu)選地，使用保留IgA結(jié)合活性的這種肽的較小片段。特異性結(jié)合IgA和IgM的受體人Fca/μ受體(Fca/μ R ;SEQ ID NO :6)以中到高親和力結(jié)合IgA和 IgM15Fc a /μ R在大多數(shù)B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上組成型表達(dá)(Sakamoto等人，Eur. J.1mmunol. 31 1310-1316,2001 ;Shibuya 等人，Nat.1mmunol.1 :441-446,2000) 多聚Ig受體(plgR ；SEQ ID NO :7)是位于分泌性上皮細(xì)胞基底外側(cè)表面上的完整膜組分。它介導(dǎo)多聚Ig，主要是二聚IgA和五聚IgM的跨上皮運(yùn)輸。plgR位于大多數(shù)的人體分泌性上皮細(xì)胞上，包括腸、支氣管、唾液腺、腎小管和子宮，并且它與多聚免疫球蛋白上 的J鏈結(jié)合。IgA的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)通過上皮細(xì)胞從粘膜固有層轉(zhuǎn)移到腸腔(或其他IgA分泌位點(diǎn))以達(dá)到沐浴粘膜的無細(xì)胞流體。分泌型IgA(SlgA)負(fù)責(zé)中和微生物和毒素且阻止不需要的抗原通過粘膜屏障(Mattu等人，J. Bio. Chem. 273 =2260-2272,1998 ；Leung等人，J. Am. Soc. Nephrol. 11 :241-249, 2000)。近來，其他IgA受體已被提議，包括在腎小球系膜細(xì)胞上表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71 ；SEQ ID NO 8) (Haddad 等人，J. Am. Soc. Mphrol. 14 :327_337，2003)。盡管這種蛋白質(zhì)在IgAl沉積疾病中的作用未知，但它也可以在本發(fā)明中使用。細(xì)菌IgA結(jié)合肽結(jié)合人IgA-Fc的細(xì)菌表面蛋白質(zhì)已在A組鏈球菌(化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes))和 B 組鏈球菌(無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)；Sandin 等人，J.1mmunol. 169 :1357-1364，2002 ;Pleass 等人，J. Biol. Chem. 276 :8197-8204，2001 Johnsson 等人，J. Biol. Chem. 274 :14521-14524,1999 ；Stenbere 等人，J. Biol. Chem. 269 :13458-13464，1994)中得到描述?；撔枣溓蚓腎gA結(jié)合蛋白質(zhì)是M蛋白家族成員，所述M蛋白家族是重要的毒力因子的二聚蛋白質(zhì)的異質(zhì)家族。所有M蛋白結(jié)合一種或多種人血漿蛋白，且所有化膿性鏈球菌株中約50%表達(dá)結(jié)合IgA-Fc的M蛋白。M蛋白具有促進(jìn)IgA結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征，例如，在幾種情況下，七個(gè)重復(fù)模式形成卷曲螺旋二聚體，所述卷曲螺旋二聚體與IgA上的特異性位點(diǎn)結(jié)合。已由Sandin等人(J.1mmunol. 2002,169 =1357-1364)詳細(xì)研究的蛋白質(zhì)Sir22 (也稱為蛋白質(zhì)M22，因?yàn)樗贛蛋白家族中；SEQID NO :3)，在其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)由29個(gè)氨基酸組成的片斷，足以用于IgA的結(jié)合。已設(shè)計(jì)了 50個(gè)殘基的合成肽(SEQ ID NO 4)，它包括29個(gè)殘基的IgA結(jié)合區(qū)域且與人IgA特異性結(jié)合。這種命名為鏈球菌IgA結(jié)合肽或Sap (SEQ ID NO 4)的50聚體，具有分離IgA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特性，并且它在IgA上的結(jié)合位點(diǎn)已知在Fe區(qū)中，與結(jié)合人CD89的位點(diǎn)相同。Sap是Sir22的氨基酸35-83的同系物，且被設(shè)計(jì)為包括Sir22中不存在的C末端半胱氨酸殘基。引入半胱氨酸以引起Sap肽二聚化，這個(gè)過程可以通過與CuCl2 —起培養(yǎng)得到加強(qiáng)。由Lindahl等人進(jìn)行的IgA結(jié)合測(cè)試指出Sap 二聚化對(duì)于IgA結(jié)合是必需的。固定在固體載體上的Sap肽已顯示能夠完全吸收來自人血清的所有IgA同種型、單體和聚合體，且來自Sap色譜柱的洗脫物只包含IgA。因此，二聚化Sap代表用于IgAN診斷的優(yōu)選IgA結(jié)合肽，具有IgA結(jié)合特異性和顯然的高親和力。另外，Sap可以通過固相肽合成(SPPS)方法進(jìn)行合成，且使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法在殘基仍在樹脂上的固相中時(shí)，可以向N或C末端添加雙功能螯合劑(BFCA ;關(guān)于細(xì)節(jié)參見下文)。Sap類似物很小(對(duì)于單體為約5. 5kDa且在二聚化時(shí)為IlkDa)，因此使抗原性減到最小。在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A 蛋白(SPA ;SEQ ID NO :10)中，可以發(fā)現(xiàn)5個(gè)Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SPA與免疫球蛋白的Fe區(qū)強(qiáng)烈結(jié)合。Z結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:
11)是來源于SPA中這5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域之一(B結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO :13)的58個(gè)氨基酸殘基的重組蛋白質(zhì)。Z結(jié)構(gòu)域最初通過改變B結(jié)構(gòu)域的少數(shù)氨基酸而形成，以增強(qiáng)后者作為基因融合配偶體的穩(wěn)定性，用于通過使用包含IgG的樹脂的重組蛋白質(zhì)的親和提純。使用噬菌體展示技術(shù)，瑞典卡羅林斯卡研究所(Karolinska Institute)的研究者將IgG結(jié)合Z結(jié)構(gòu)域修改成命名為親和體IgA1或修飾Z結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 12)的IgA結(jié)合肽。(Graille等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 97 :5399-5404, 2000 ；ffahlberg 等人，Proc. Natl. Acad.Sc1. U. S. A. 100 :3185-3190, 2003 ;Ronnmark等人，Eur. J. Biochem. 269 :2647-2655, 2002 ； Braisted 和 Wells, Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 93 :5688-5692,1996)。這種修飾后的肽具有結(jié)合人IgAl和IgA2的高特異性和親和力。由于這些修飾，最初的IgG結(jié)合親和力完全喪失。IgA上的結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為在Fe區(qū)中?？紤]到其結(jié)合人的IgA的能力，這種肽對(duì)于IgAN診斷也是優(yōu)選的?？谷薎gA或IgM抗體或其抗原結(jié)合片段多克隆或單克隆抗人IgA或IgM抗體也可用于診斷IgA或IgM腎臟疾病。這些抗體可以來源于許多來源包括免疫動(dòng)物，或者它們可以被制備為動(dòng)物/人嵌合蛋白質(zhì)或人源化嵌合蛋白質(zhì)，或人來源蛋白質(zhì)；所有這些都是本領(lǐng)域已知的用于進(jìn)行蛋白質(zhì)輸注療法和/或制備診斷劑的策略。這些抗體的完整分子和Ag結(jié)合片段都可以在本發(fā)明的診斷方法和組合物中使用。然而，優(yōu)選試劑是人來源的單克隆抗體，且在IgAN或HSP的情況下，優(yōu)選的抗體能夠區(qū)分IgAl與IgA2。而且，優(yōu)選保留IgA或IgM識(shí)別特異性的抗體蛋白質(zhì)亞單位，所述亞單位優(yōu)先于全長(zhǎng)抗體(Reff等人，Cane. Control 9 :152-166, 2002 ；Gorman和 Clark, Semin. Tmmunol. 2 :457-66,1990 ；Antibodies as Medicines 2000 by BiotechAnalytics)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用抗人IgAl或抗人IgM的小抗體片段(例如，人來源片段、人源化嵌合片段、嵌合片段、和動(dòng)物來源片段)。保留抗原結(jié)合活性的抗體片段可以是單價(jià)Fab、Fv或s cFv ;或二價(jià)F(ab) ' 2或雙價(jià)抗體。(參見下圖4中的示意圖(Hudson和 Souriau, Nat. Med. 9 :129-134，2003)。優(yōu)選地，F(xiàn)e 區(qū)從分子中刪除。在一個(gè)具體例子中，抗人IgAl抗體指向鉸鏈區(qū)中的表位，因?yàn)槿缟纤?，這個(gè)區(qū)域是IgAl獨(dú)有的。此類人來源的抗人IgAl鉸鏈區(qū)Fab可以通過噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)由商業(yè)供應(yīng)者例如Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK)開發(fā)的大卩遼菌體抗體文庫容易地制備。這種技術(shù)能夠快速做出抗體，并能方便進(jìn)入基因進(jìn)行修飾，所以具有遠(yuǎn)超過常規(guī)產(chǎn)生單克隆抗體方法的許多優(yōu)點(diǎn)。在另一例子中，使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，本文描述的那些)產(chǎn)生的抗IgM單克隆抗體用于診斷IgMN。這些抗體可以使用獨(dú)特的μ鏈鉸鏈序列作為靶抗原(PLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNP ；SEQ ID NO :17)而產(chǎn)生，所述鉸鏈序列橋接恒定區(qū)的CHl和CH2結(jié)構(gòu)域。另外，IgM特異性抗體可以針對(duì)IgM蛋白質(zhì)的分離的完整Fe區(qū)產(chǎn)生，此類Fe通過高溫下胰蛋白酶切割產(chǎn)生(Plaut 和 Tomasi，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 65 :318-322,1970)。IgM結(jié)合化合物借助于噬菌體展示技術(shù)，已鑒定了以高親和力與鼠類IgM結(jié)合的肽YDffIPSSAKSEQ ID NO :9)。這種肽還抑制人類風(fēng)濕因子(RF，主要是抗IgG自·身免疫抗體的IgM類)誘導(dǎo)的IgG包被乳膠珠凝集，且顯示缺乏與其他免疫球蛋白結(jié)合的能力(PatiM. Glee 等人 J Immunol, 1999，163 :826-833)。新型IgA或IgM結(jié)合化合物的鑒定本發(fā)明的方法和組合物還可以采用新型IgA結(jié)合或IgM結(jié)合化合物，所述化合物可以經(jīng)過使用例如噬菌體展示技術(shù)得以鑒定。噬菌體展示是組合性的篩選技術(shù)，允許通過使用來自基因庫的多重基因開發(fā)和表征與所需靶相互作用的蛋白質(zhì)(George P. Smith,Science 228:1335,1985)。這些基因代表通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的所需多樣性；因此，每個(gè)噬菌體展示獨(dú)特的隨機(jī)肽。這些基因通過替代先前存在的基因插入噬菌體內(nèi)，從而制備曬菌體文庫。預(yù)先制備的文庫用伴隨試劑盒是容易獲得的(例如，Novagen T7Select)。Novagen的T7系統(tǒng)是cDNA文庫優(yōu)選的裂解性卩遼菌體展示(J.1mm. Meth. 231 39 ；NatureBiotech. 19 :1193)，但也可以使用其他噬菌體，例如基于與表面外殼蛋白pill和pVIII的N末端融合的非裂解性M13細(xì)菌絲狀噬菌體。修飾的噬菌體隨后將表達(dá)由其表面外殼上的插入DNA編碼的蛋白質(zhì)。在M13的情況下，pill展示具有較低的效價(jià)(1_5/病毒體)且因此可以用于發(fā)現(xiàn)高親和力化合物，而PVIII具有高效價(jià)( 200/病毒體)因此可以用于發(fā)現(xiàn)親和力非常低的結(jié)合化合物。曬菌體展示服務(wù)是通過公司包括Dyax Corp. of Cambridge,Mass.商購(gòu)可得的，所述公司提供4種噬菌體文庫人抗體、蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)肽、和線性肽。來自整個(gè)噬菌體文庫的噬菌體與靶蛋白(例如，IgA的α鏈或IgM的μ鏈)一起培養(yǎng)。隨后可以挑選出對(duì)IgA或IgM具有高親和力和特異性的肽的噬菌體。繼而鑒定和檢測(cè)出編碼這些肽的多核苷酸序，從而產(chǎn)出更多這些肽用于進(jìn)一步分析。隨后選擇最高親和力和特異性連同其他性質(zhì)例如免疫原性的蛋白質(zhì)，作為在本發(fā)明的方法或組合物中使用的最終候選物。噬菌體展示基因庫或文庫可以包括數(shù)百萬的相關(guān)基因，且因此可以用于鑒定對(duì)本發(fā)明的診斷方法和組合物有用的IgA或IgM結(jié)合化合物。多肽表達(dá)一般而言，在本發(fā)明中使用的多肽可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生；例如，通過用在合適的表達(dá)媒介物中的全部或部分多肽編碼多核苷酸分子或其片段轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。分子生物學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解廣泛多樣的表達(dá)系統(tǒng)中的任何一種都可以用于提供重組多肽。使用的確切宿主細(xì)胞對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵的。在本發(fā)明中使用的多肽可以在原核宿主(例如大腸桿菌)或真核宿主(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，昆蟲細(xì)胞例如Sf21細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如NIH 3T3、海拉、或優(yōu)選COS細(xì)胞)中產(chǎn)生。此類細(xì)胞來源廣泛(例如American Type Culture Collection (美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，Rockland, Md.;還參見例如 Current Protocols in Molecular Biology,Eds. Ausubel等人,John Wiley and Sons)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法以及表達(dá)媒介物的選擇將取決于所選宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法在例如Ausubel等人(同上)中描述；表達(dá)媒介物可以選自例如在 Cloning Vectors A Laboratory Manual (Pouwels, P. H.等人，1985, Supp. 1987)中提供的那些。用于多肽生產(chǎn)的一種具體細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌pET表達(dá)系統(tǒng)(Novagen,Inc.，Madison, ffis.)。根據(jù)這種表達(dá)系統(tǒng)，將編碼多肽的DNA以設(shè)計(jì)為允許表達(dá)的方向插入PET載體內(nèi)。因?yàn)榫幋a此類多肽的基因在T7調(diào)節(jié)信號(hào)的控制下，所以多肽的表達(dá)通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的T7RNA聚合酶表達(dá)來完成。這一般通過使用響應(yīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)T7RNA聚合酶的宿主菌株來完成。一旦產(chǎn)生，重組多肽隨后根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如本文描述的那些來分離。用于多肽生產(chǎn)的另一種細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)是pGEX表達(dá)系統(tǒng)(Pharmacia)。這個(gè)系統(tǒng)使用GST基因融合系統(tǒng)，所述系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于高水平表達(dá)作為融合蛋白的基因或基因片段，并能快速純化和回收功能基因產(chǎn)物。目的多肽與來自日本血吸 蟲(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的羧基末端融合，且通過親和色譜法使用GlutathioneSepharose 4B從細(xì)菌溶解產(chǎn)物很容易地純化。融合蛋白可以在溫和條件下通過用谷胱甘肽洗脫進(jìn)行回收。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域從融合蛋白的切割通過這個(gè)結(jié)構(gòu)域上游的位點(diǎn)特異性蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)的存在得到促進(jìn)。例如，在PGEX-2T質(zhì)粒中表達(dá)的多肽可以用凝血酶切割；在PGEX-3X中表達(dá)的那些可以用因子Xa切割。一旦重組多肽被表達(dá)，就使用例如親和色譜法將其進(jìn)行分離。在一個(gè)例子中，針對(duì)用于本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的抗體(例如，如本文所述產(chǎn)生的)抗體可以與柱附著，且用于分離重組多肽。在親和色譜法之前多肽錨著細(xì)胞的裂解和分餾可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(參見，例如，Ausubel等人，同上)ο一旦被分離，必要時(shí)，重組多肽就可以通過例如高效液相色譜進(jìn)一步純化(參見例如，F(xiàn)isher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, eds.,Work and Burdon, Elsevier,1980)。用于本發(fā)明的多肽，特別是短肽片段還可以通過化學(xué)合成來產(chǎn)生(例如，通過Solid Phase Peptide Synthesis,第2版，1984The Pierce Chemical Co.,Rockford, 111.中描述的方法)。多肽表達(dá)和純化的這些一般技術(shù)還可以用于生產(chǎn)和分離有用的肽片段或類似物(本文描述的)。短肽例如50聚體鏈球菌I gA結(jié)合肽(Sap)和58聚體修飾的Z結(jié)構(gòu)域還可以被化學(xué)合成?？贵w產(chǎn)生為了產(chǎn)生抗體，也可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，IgAl、IgM、或其片段的編碼序列(例如，IgAl鉸鏈區(qū)，氨基酸217-241)可以作為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的C末端融合進(jìn)行化學(xué)合成或表達(dá)(Smith和Johnson, Gene67 :31-40,1988)。融合蛋白在谷胱甘肽-Sepharose珠上進(jìn)行純化、用谷胱甘肽洗脫、用凝血酶切割(在工程化的切割位點(diǎn)處)、且純化至用于免疫接種小鼠或兔所需的程度。初次免疫接種使用弗氏完全佐劑或類似佐劑來進(jìn)行，且后續(xù)免疫接種使用弗氏不完全佐劑?？贵w滴度使用凝血酶切割的GST融合蛋白多肽片段，通過ELISA或蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀分析來監(jiān)控。免疫血清使用CNBr-S印harose-偶聯(lián)多肽進(jìn)行親和提純?？寡逄禺愋允褂靡唤M無關(guān)GST蛋白質(zhì)來測(cè)定。作為GST融合蛋白的可替代物或附加免疫原，可以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)IgA或IgM的相對(duì)獨(dú)特免疫原性區(qū)域的肽，且通過引入的C末端賴氨酸與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)。針對(duì)這些肽中每一種的抗血清在與BSA綴合的肽上類似地親和提純，且通過使用肽綴合物的ELISA和蛋白質(zhì)印跡，以及通過使用作為GST融合蛋白表達(dá)的多肽的蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀進(jìn)行特異性測(cè)試?？商娲兀禺愋越Y(jié)合IgA或IgM的單克隆抗體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行制備(參見，例如，Kohler 等人，Nature 256 :495,1975 ；Kohler 等人，Eur. J.1mmunol. 6 511,1976 ；Kohler 等人，Eur. J. Tmmunol · 6 :292,1976 ；Hammerling 等人，在 MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas 中，Elsevier, N. Y. , 1981 ；Ausubel 等人，同上)。一旦被產(chǎn)生，單克隆抗體就同樣通過蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀分析(通過Ausubel等人，同上中描述的方法)測(cè)試特異性。特異性識(shí)別IgA特別是IgAl同種型、或IgM的抗體被認(rèn)為 在本發(fā)明中有用?？商娲兀瑔慰寺】贵w可以使用IgA或IgM和噬菌體展示文庫進(jìn)行制備(Vaughan 等人，Nat. Biotechnol. 14 :309-314,1996)。優(yōu)選地，抗體使用IgA或IgM片段產(chǎn)生，所述片段位于一般保守區(qū)域以外(例如，在IgA2中缺乏但I(xiàn)gAl具有的13個(gè)氨基酸的區(qū)域；參見圖1)或是IgM鉸鏈區(qū)中的獨(dú)特序列；參見SEQ ID NO : 14，且通過例如高頻率的帶電殘基的標(biāo)準(zhǔn)看來可能是抗原。在一個(gè)具體例子中，此類片段通過標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)產(chǎn)生且克隆到pGEX表達(dá)載體內(nèi)(Ausubel等人，同上)。融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，且如Ausubel等人(同上)中所述使用谷胱甘肽瓊脂糖親和基質(zhì)進(jìn)行純化。為了嘗試使抗血清低親和力或特異性的潛在問題減到最小，對(duì)于每種多肽產(chǎn)生2種或3種此類融合物，且將每種融合物注入至少2只兔中?？寡逋ㄟ^系列注射產(chǎn)生，優(yōu)選包括至少3次加強(qiáng)注射。針對(duì)IgAl產(chǎn)生的抗體可以用于診斷IgAN和HSP，且抗體抗IgM可以用于診斷IgMN0肽的修飾可能希望修飾在本發(fā)明方法和組合物中使用的肽，因?yàn)檫M(jìn)入循環(huán)的肽在血漿中被快速降解。因此需要修飾以延長(zhǎng)其半衰期而不降低生物活性和結(jié)合親和力。例如，十四肽生長(zhǎng)抑素在人血漿中的半衰期只有3分鐘，太短而不能在癌癥診斷中用作放射性藥物。因此，開發(fā)了在人循環(huán)中具有90分鐘半衰期的其類似物善得定(Langer和Beck-Sickinger,Curr. Med. Chem. Ant1-Canc. Agents1:71-93, 2001)。為了抵抗經(jīng)由肽鏈端解酶的降解,肽可以在N和/或C末端進(jìn)行加帽。這包括例如N末端乙?；?、C末端酰胺化或還原、以及N至C的環(huán)化。這些方法是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法。為了減少對(duì)肽鏈內(nèi)切酶的敏感性，肽可以通過引入D氨基酸、氨基酸替代物、或擬肽序列和間隔物進(jìn)行修飾。改善穩(wěn)定性的其他方法包括肽鍵的修飾、用亞氨基替換氨基、酰胺氮的甲基化、和縮短天然氨基酸序列。再一次，這些方法是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法。放射性金屬如上所述，診斷劑進(jìn)一步包括可檢測(cè)標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記如放射性金屬。各種放射性金屬在閃爍掃描中使用，且其用途隨閃爍掃描類型、嘗試進(jìn)行的診斷、以及同位素的成本和可用性而變。同位素選擇中的關(guān)鍵決定因素是閃爍掃描類型，和需要的放射性衰變。SPECT和PET使用不同的同位素，因?yàn)镾PECT使用、發(fā)射體，而PET使用正電子發(fā)射體。同位素可以以4種不同方式產(chǎn)生，這與成本有關(guān)聯(lián)。在發(fā)生器中產(chǎn)生的那些來自長(zhǎng)半衰期放射性同位素轉(zhuǎn)變成較短半衰期的同位素。這使得它們能夠?qū)嶋H用于甚至在小醫(yī)院中的使用，并且它們的成本較低。其他放射性金屬更昂貴，因?yàn)樗鼈冊(cè)诤朔磻?yīng)器、回旋加速器、和線性加速器中產(chǎn)生，并且這可能限制其在較小型醫(yī)院以及較偏僻地區(qū)中的醫(yī)院的使用。就診斷而言，使用的放射性金屬部分也受限于什么時(shí)候能送達(dá)到使用場(chǎng)地和與靶結(jié)合的時(shí)間的快慢。在IgA結(jié)合肽的情況下，4-80小時(shí)的較長(zhǎng)半衰期可能是優(yōu)選的。亞穩(wěn)的锝-99m(99mTc)在85 %的掃描中使用，這僅在美國(guó)每年就是約7百萬例。"mTc的特性對(duì)于診斷成像是非常理想的；140keV的Y輻射在今天的Y射線成像機(jī)的理想范圍內(nèi)，且6小時(shí)半衰期的長(zhǎng)度足以合成標(biāo)記放射性藥物、進(jìn)行質(zhì)量控制、將其注入患者內(nèi)、且進(jìn)行成像。但半衰期短得足以使得能夠施用具有最低限度的患者風(fēng)險(xiǎn)的足夠高劑量，且在使用的濃度水平(< 10_6M)下，所產(chǎn)生的Y輻射和"Tc的軟β衰變都不危險(xiǎn)。99mTc以低成本在99Mo/99mTc發(fā)生器中可由其親本核素"Mo (t1/2 66小時(shí))容易地獲得。
γ發(fā)射的銦-111 (111In)已廣泛用于標(biāo)記單克隆抗體和肽。由FDA批準(zhǔn)用于臨床使用的第一種肽放射性藥物是111In標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類似物OctreoScan (Mallinckrodt,St. Loius,Mo)。這種同位素的化學(xué)和半衰期(67. 9小時(shí))使得它對(duì)于標(biāo)記免疫球蛋白是理想的，而成像可以在初次注射后數(shù)天進(jìn)行。mIn在回旋加速器中由鎘-111產(chǎn)生，且因此與"mTc比較而言它較難獲得。離子交換和溶劑萃取是通常用于分離銦-111與親本鎘的方法。然而，為了放射性標(biāo)記IgA結(jié)合肽的目的，與99mTc比較111In更長(zhǎng)的半衰期提供了 IgA結(jié)合肽更多的時(shí)間達(dá)到IgA在腎中沉積，且提供了更多的時(shí)間用于清除循環(huán)的標(biāo)記IgA。鎵-67 (67Ga)在回旋加速器中由鋅_68 (68Zn)產(chǎn)生，且是于1953年生產(chǎn)的用于人使用的第一種核素。分離技術(shù)可以包括溶劑萃取和離子交換、或兩者。67Ga的半衰期超過78小時(shí)，且其能量衰變特征使得其適合于Y閃爍掃描或PET成像。銅的放射性核素提供了診斷表位的選擇，包括6°CU、61CU、62CU和64Cu。正電子發(fā)射的64Cu是回旋加速器產(chǎn)生的。64Cu優(yōu)選用于標(biāo)記蛋白質(zhì)、肽和具有長(zhǎng)血液清除率的試劑，所述較長(zhǎng)時(shí)間的血液清除率可能是IgA結(jié)合蛋白質(zhì)的有利特性。64Cu具有12. 7小時(shí)的半衰期。下表I和2顯示用于診斷用途的許多Y和發(fā)射正電子的放射性金屬、其衰變特征、半衰期和生產(chǎn)方法(Anderson和Welch，Chem. Rev. 99 :2219-2234,1999)。這些放射性金屬中的任何一種都可以在本文描述的方法和組合物中使用。表1. Y和β發(fā)射放射性核素
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)診斷試劑盒，應(yīng)用于診斷哺乳動(dòng)物包括人類中的IgA或IgM腎臟疾病，所述體內(nèi)診斷試劑盒主要包含A、B 二個(gè)靜脈注射制劑的成份A制劑主要包含特異性結(jié)合IgA或IgM的單克隆抗體，或抗體中的抗原結(jié)合段， 例如抗體的Fab段，使用的單克隆抗體的來源是鼠類，或者是人鼠嵌合抗體(Chimeric Antibody),或者是人源化抗體,或者是人類的抗體，A制劑中的抗體將被生物素(biotin)或具有特殊抗原性的短肽鏈標(biāo)記，帶有特殊抗原性的短肽鏈?zhǔn)?His-Tag(HHHHHH) ;Myc_Tag (EQKLISEEDL) ；HA-Tag (YPYDVPDYA)； FLAG-Tag(DYKDDDDK)等，B制劑主要含有以下三種成分(a)能夠識(shí)別A制劑中抗體所帶標(biāo)記的蛋白，例如鏈霉親和素(Streptavidin)或親和素(Avidin);或特異性結(jié)合抗原短肽鏈的單克隆抗體或抗體中的抗原結(jié)合片段，如使用抗體，其來源是鼠類抗體，人鼠嵌合抗體，人源化抗體，或人類抗體，(b)雙功能螯合劑，選自N3S、N2S2' PnAO, HYNIC, [M(CO)3(H2O)3]+' PADA、DTPA、DOTA、 組氨酸、三肽(Lys-Gly-Cys、Cys-Gly-Cys 或 Gly-Gly-Cys)或四肽(Gly-Ala-Gly-Gly 或 Cys-Gly-Cys-Gly),(c)放射性同位素或可用于磁共振成像的釓元素(gadolinium)，放射性同位素選自 99mTc、111 In、66Ga、67Ga、68Ga、86Y、90Y、201T1、55Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、82Rb、1857l87Re 和 1867l88Re 中的一項(xiàng)。
2.一種使用權(quán)利要求1所述的體內(nèi)診斷試劑盒的方法，分為以下二個(gè)步驟(二步法)(a)首先經(jīng)靜脈注射將A制劑注入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，A制劑中的特異性結(jié)合IgA或IgM的抗體，將與血液中的IgA或IgM結(jié)合，如果哺乳動(dòng)物患有IgA或IgM腎病，則A制劑中的抗體也同時(shí)將與沉積在腎小球的IgA或IgM結(jié)合，與血液中結(jié)合的抗IgA或IgM抗體的復(fù)合物，經(jīng)過2-5天以后將會(huì)通過流動(dòng)性和自身代謝或經(jīng)過淋巴免疫系統(tǒng)被清除；但是在IgAN或IgMN疾病中，在腎臟中沉積的IgA或IgM 是不流動(dòng)的，因此與之結(jié)合后的復(fù)合物也滯留在腎小球內(nèi)，無法清除，(未患有IgAN或IgMN 的哺乳動(dòng)物，因?yàn)樵瓉頉]有IgA或IgM的沉積，故不會(huì)有抗體與IgA或IgM的復(fù)合物存在)，(b)2-5天以后，再注射B制劑，患有IgAN或IgMN的哺乳動(dòng)物的腎臟中，因含有抗體與 IgA或IgM的復(fù)合物存在，B制劑中的識(shí)別蛋白將與之結(jié)合，通過雙功能螯合劑鏈接的放射性元素將信號(hào)從腎臟內(nèi)傳遞出來，經(jīng)目前臨床常用的放射性成像技術(shù)(SPECT、PET、平面掃描)收集信號(hào)和成像，做出診斷，如果經(jīng)雙功能螯合劑鏈接的是釓元素，則可通過磁共振掃描(MRI)進(jìn)行成像診斷。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于用非侵入性方法診斷哺乳動(dòng)物中的IgA或IgM腎臟病癥，例如IgA腎病、過敏性紫癜和IgM腎病。本發(fā)明的特征還在于在這些病癥診斷中有用的組合物和試劑盒。
文檔編號(hào)A61K49/16GK102989018SQ20121013917
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月3日
發(fā)明者羅伯特·思東·仇, 仇家舟, 安德魯·G··普勞特 申請(qǐng)人:Rq生物科技有限公司, 新英格蘭醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院有限公司