本發(fā)明屬于動物醫(yī)學動物疫病分子生物學診斷技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，主要用于鑒別Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒4重聚合酶鏈式反應。

背景技術(shù)：

自2015年下半年以來，在我國部分省份如河南、安徽、遼寧、河北、北京、山東、山西、江蘇、廣東等地雞場中出現(xiàn)了一種新發(fā)疾病，該病以心包積液和肝臟腫大為特征，被稱為“心包積液-肝炎綜合征”，目前認為其病原為Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)。FAdV粒子直徑為70-90nm，無囊膜，呈正二十面體對稱結(jié)構(gòu)，核酸為雙股DNA。Ⅰ群禽腺病毒分為A、B、C、D、E共5個禽腺病毒種，每個種內(nèi)的病毒主要根據(jù)交叉中和試驗結(jié)果進一步分為不同的血清型。本病既能水平傳播，又能垂直傳播，種雞群感染會造成商品雞群質(zhì)量嚴重下降，死淘率上升，經(jīng)濟損失巨大。

馬立克病(Marek′s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)引起雞的一種高度接觸傳染性淋巴組織增生性腫瘤性疾病，以內(nèi)臟器官、外周神經(jīng)、性腺、虹膜、肌肉和皮膚單獨或多發(fā)的淋巴樣細胞浸潤為特征。MD存在于世界上所有的養(yǎng)禽國家和地區(qū)，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，在使用疫苗免疫以前，產(chǎn)蛋雞死亡率可高達60％，而肉雞的的淘汰率高達10％。馬立克病在養(yǎng)禽業(yè)中仍需得到高度的重視，主要源于疾病爆發(fā)的不可預測性、疫苗免疫的失敗以及馬立克病毒毒力的不斷增強，以此，世界各國均把馬立克病視為養(yǎng)禽業(yè)重要的傳染病之一。近年來，世界各地相繼報道馬立克病毒出現(xiàn)新變異，毒力進一步增強，出現(xiàn)特超強毒株，給本病的預防和控制帶來了新的問題。

雞白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起的雞多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。以在成年雞中產(chǎn)生淋巴樣腫瘤和產(chǎn)蛋量下降為特征。臨診上有多種表現(xiàn)形式，主要是淋巴細胞白血病。禽白血病病毒(ALV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒科，C型腫瘤病毒屬禽白血病/肉瘤病毒群。并分為A、B、C、D和E5個亞群。A亞群是最常見的，并且與淋巴白血病最密切相關(guān)。自1868年首次報道淋巴白血病以來，一直被認為是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的最重要的禽病之一。該病幾乎波及所有商品雞群。盡管該病呈漸進性發(fā)生和持續(xù)的低死亡率，但由于它以垂直傳播為主，使該病難以控制，使雞群在增重和產(chǎn)蛋方面受嚴重影響。尤其是患雞抵抗力下降，容易感染多種疾病，給雞群的飼養(yǎng)管理帶來極大困難。雞白血病是一種世界性分布的疾病，我國也普遍存在，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成的損失是巨大的。因此，控制和消滅雞白血病是我國當前非常重要和十分迫切的問題。

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis,RE)是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起雞、鴨、鵝、火雞及其他禽類，以急性網(wǎng)狀細胞腫瘤形成、矮小綜合征、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合征。REV感染不僅能引起腫瘤，還可引起感染雞胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮，使雞的免疫功能下降、甚至喪失，導致免疫抑制，使感染雞極易繼發(fā)感染其他病毒病和細菌病。在我國，REV感染及在雞群中造成的危害已相當普遍并且愈發(fā)嚴重。

目前，對以上4種傳染病的檢測診斷手段主要有病毒分離鑒定，血清學技術(shù)如瓊脂擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、間接免疫熒光，聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)等，其中以PCR技術(shù)最為靈敏和快速。現(xiàn)在對Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒均有建立相應PCR檢測方法的報道，翟新驗等利用雙重PCR技術(shù)對REV和MDV感染細胞以及臨床樣品進行檢測，認為所建立的方法是常規(guī)血清學、病理組織學方法所不能比擬的，可用于REV和MDV鑒別診斷。何秀苗等研制出了三重PCR方法，用以區(qū)別鑒定MDV、ALV和REV，方便和簡化了腫瘤病料的實驗室檢測。

但目前為止，通過一次PCR檢測就能直接診斷Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染的技術(shù)仍未見報道。針對以上4種病毒性傳染病在臨床上均引起肝脾腫大的病理特征，能引起嚴重的免疫抑制，有一定的相似性，因此發(fā)明一種一次檢測就能診斷清楚這一類疾病的診斷試劑盒，顯得十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV 4重PCR檢測試劑盒，主要用于鑒別Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒4重聚合酶鏈式反應，可一次檢測就能診斷出是否為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染。該試劑盒具有操作簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高、特異性好、大幅縮短檢測時間，能直接用于臨床樣品檢測的特點。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

一種用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，用于鑒別Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒4重聚合酶鏈式反應，其特征在于，包括裂解液、擴增反應混合液、陰性對照物和陽性對照物。

所述裂解液的成分為DNAiso Reagent；所述擴增反應混合液的原料成分包含滅菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1FADV-F上游引物、25μmol·L^-1FADV-R下游引物、25μmol·L^-1MDV-F上游引物、25μmol·L^-1MDV-R下游引物、25μmol·L^-1ALV-F上游引物、25μmol·L^-1ALV-R下游引物、25μmol·L^-1REV-F上游引物、25μmol·L^-1REV-R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶；所述陰性對照物為滅菌三蒸水；所述陽性對照物為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的陽性質(zhì)粒混合物。

所述FADV-F上游引物的序列為：5’-ATGACTGCGCTTACTCCCGA-3’；

所述FADV-R下游引物的序列為：5’-ACCCAGATAGTTGGTACC-3’；

所述MDV-F上游引物的序列為：5’-CAGCTGCGTATTTTCCCCG-3’；

所述MDV-R下游引物的序列為：5’-AATTACTTGGTCTTTAACC-3’；

所述ALV-F上游引物的序列為：5’-TGTAGTGTTATGCAATACTC-3’；

所述ALV-R下游引物的序列為：5’-GGGTATGTTGGCTCCCTGCA-3’；

所述REV-F上游引物的序列為：5’-AATGTGGGAGGGAGCTCCGG-3’；

所述REV-R下游引物的序列為：5’-ACATTTTCCCTCATTGGA-3’。

優(yōu)選地，所述擴增反應混合液中的各原料成分的體積比為14.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5。

上述用于鑒別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒對Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒4重聚合酶鏈式反應的檢測方法，包括以下步驟：

1)吸取100μL疑似病例樣品置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數(shù)為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到疑似病例樣品的DNA溶液，備用；

2)吸取100μL陰性對照物置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數(shù)為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用；

3)取擴增反應混合液23μL，加入疑似病例樣品的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到疑似病例樣品擴增反應產(chǎn)物，備用；

4)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產(chǎn)物，備用；

5)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產(chǎn)物，備用；

6)分別將疑似病例樣品擴增反應產(chǎn)物、陰性對照樣品擴增反應產(chǎn)物和陽性對照物擴增反應產(chǎn)物在10g·L^-1瓊脂糖凝膠中電泳。

電泳結(jié)果為陰性對照不出條帶，陽性對照出1085bp、750bp、508bp、312bp共4個條帶，說明所述4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒有效；如果樣品中出現(xiàn)1085bp一個條帶，即為單一馬立克氏病病毒感染；樣品出現(xiàn)750bp一個條帶，即為單一Ⅰ群禽腺病毒感染；樣品出現(xiàn)508bp一個條帶，即為單一禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染；樣品出現(xiàn)312bp一個條帶，即為單一雞淋巴細胞白血病病毒感染。如果出現(xiàn)2條、3條或4條特異性條帶，即為相應病毒的2重、3重或4重混合感染。

本發(fā)明的用于鑒別診斷FAdV/MDV/ALV/REV 4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒的驗證性試驗，包括特異性試驗、靈敏度試驗、穩(wěn)定性試驗以及田間試驗，具體試驗如下：

①特異性試驗

使用本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，按照以上說明，提?、袢呵菹俨《?、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等DNA病毒的DNA作為模板，同時將這4種病毒混合作為1個樣品提取DNA作為模板，用擴增混合液進行多重PCR，擴增完畢后電泳觀察。按照RNAiso Reagent試劑說明提取新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、H9禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，用本發(fā)明的用于鑒別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒的擴增混合液進行多重PCR，擴增完畢后電泳觀察。

結(jié)果顯示：馬立克氏病病毒出現(xiàn)1085bp一個條帶，Ⅰ群禽腺病毒出現(xiàn)750bp一個條帶，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒出現(xiàn)508bp一個條帶，雞淋巴細胞白血病病毒出現(xiàn)312bp一個條帶，以上4種病毒混合樣品出現(xiàn)1085bp、750bp、508bp、312bp共4個條帶，新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、H9禽流感病毒、傳染性法氏囊炎病毒均沒有出現(xiàn)條帶(見圖1)?；厥崭麝栃詷颖镜臈l帶，純化后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞，取PCR鑒定為陽性得菌液，提取質(zhì)粒進行測序，將測得的序列與所用毒株基因序列進行比較，發(fā)現(xiàn)序列完全一致。

結(jié)果證實本發(fā)明的一種用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法具有很高的特異性，能準確擴增Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒基因片段，并能直觀區(qū)分這4種病毒的感染情況。

②靈敏度試驗

使用本發(fā)明提供的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒，提?、袢呵菹俨《?、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒DNA，紫外分光光度計測定濃度后稀釋調(diào)整各病毒DNA濃度為200pg·L^-1，混合4種病毒DNA作為模板，按照10倍濃度梯度稀釋至10^-9，用本發(fā)明的用于鑒別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒提供的擴增混合液進行多重PCR，擴增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示，本發(fā)明的用于鑒別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒能檢測的極限為2.0×10^-5pg·L^-1，提示本方法靈敏度高(見圖2)。

③穩(wěn)定性試驗

本發(fā)明提供的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒保存條件為-20℃，每月1次用Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒及對照進行檢測試驗，連續(xù)檢測6個月，檢測試劑盒存放的穩(wěn)定性。

結(jié)果顯示，6個月內(nèi)試劑盒檢測結(jié)果完全一致，說明本發(fā)明提供的用于鑒別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒有良好的穩(wěn)定性。

④田間試驗

采集了陜西省雞場臨床肝脾腫大的組織病料和血清共50份，用本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法進行診斷，發(fā)現(xiàn)臨床存在多種感染現(xiàn)象，有單一的Ⅰ群禽腺病毒感染，有馬立克氏病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒雙重混合感染，有Ⅰ群禽腺病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒雙重混合感染，有馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒3重混合感染現(xiàn)象(見圖3)。

田間試驗證明本發(fā)明提供的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒的實用性和適用性良好。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明采用多重PCR擴增，4種病變相似且同為DNA病毒的病毒病一次檢測，檢測總時間控制在3小時左右，達到了易于操作、方便快捷、快速檢測的目的。本發(fā)明能徹底解決這4種病變相似且同為DNA病毒的病毒病診斷問題，快速、靈敏，特異性好，能在3小時診斷清楚4種病毒病，非常適合大面積快速檢測普查，適用于各實驗室、動物疫病預防控制中心以及條件具備的大中型養(yǎng)殖場。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

圖1為本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法的特異性試驗電泳圖；

圖中M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標準，1為馬立克氏病病毒，2為Ⅰ群禽腺病毒，3為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒，4為雞淋巴細胞白血病病毒，5為以上4種病毒混合液，6為新城疫病毒，7為傳染性支氣管炎病毒，8為H9禽流感病毒，9為傳染性法氏囊炎病毒；

圖2為本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒及檢測方法的靈敏度試驗電泳圖；

圖中M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標準，1～9為馬立克氏病病毒、Ⅰ群禽腺病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒和雞淋巴細胞白血病病毒DNA梯度稀釋，濃度范圍為200×10^-1pg·L^-1～200×10^-9pg·L^-1；

圖3為本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒對部分臨床樣品的檢測結(jié)果圖；

圖中M為DL2000 DNA分子質(zhì)量標準，1-16為部分組織病料檢測結(jié)果。其中1為馬立克氏病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒雙陽性結(jié)果；2、7、8、13分別為馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒和雞淋巴細胞白血病病毒三陽性結(jié)果；5為Ⅰ群禽腺病毒陽性結(jié)果；10為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒和雞淋巴細胞白血病病毒雙陽性結(jié)果；3、4、6、9、11、12、14、15、16為陰性結(jié)果。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

(1)引物的設計與制備

參考GenBank上公布的Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒基因組序列，結(jié)合本課題組數(shù)年研究測定的相關(guān)病毒基因序列，用DNAStar生物軟件綜合分析比對，針對以上4種病毒基因設計了8條引物，引物的序列如下：

FADV-F上游引物：5’-ATGACTGCGCTTACTCCCGA-3’；

FADV-R下游引物：5’-ACCCAGATAGTTGGTACC-3’；

MDV-F上游引物：5’-CAGCTGCGTATTTTCCCCG-3’；

MDV-R下游引物：5’-AATTACTTGGTCTTTAACC-3’；

ALV-F上游引物：5’-TGTAGTGTTATGCAATACTC-3’；

ALV-R下游引物：5’-GGGTATGTTGGCTCCCTGCA-3’；

REV-F上游引物：5’-AATGTGGGAGGGAGCTCCGG-3’；

REV-R下游引物：5’-ACATTTTCCCTCATTGGA-3’。

(2)陰性對照物和陽性對照物的制備

陰性對照物為滅菌三蒸水，陽性對照物為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的陽性質(zhì)粒混合物。

(3)用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒的制備

本實施例的用于鑒別4重聚合酶鏈式反應診斷試劑盒由以下組分組成：

1)裂解液：成分為DNAiso Reagent，20個反應共計20mL，裝成1瓶；

2)擴增反應混合液：由滅菌三蒸水、10倍稀釋的(10×)PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1FADV-F上游引物、25μmol·L^-1FADV-R下游引物、25μmol·L^-1MDV-F上游引物、25μmol·L^-1MDV-R下游引物、25μmol·L^-1ALV-F上游引物、25μmol·L^-1ALV-R下游引物、25μmol·L^-1REV-F上游引物、25μmol·L^-1REV-R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶組成，每個反應的體積比為14.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共計23μL，20個反應共計460μL，裝成1管；

3)陰性對照物為滅菌三蒸水，20個反應共計2.0mL，裝成1瓶；陽性對照物為Ⅰ群禽腺病毒、馬立克氏病病毒、雞淋巴細胞白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒陽性質(zhì)?；旌衔?，20個反應共計40.0μL，裝成1管；

本發(fā)明試劑盒裂解液保存條件為常溫，擴增反應混合液、陰性對照物和陽性對照物的保存條件為-20℃。

實施例2

(1)引物的設計與制備

同實施例1。

(2)組織病料樣品的處理與DNA溶液的提取

1)取疑似病例組織病料如腫大的肝臟、脾臟3～5g，剪碎成糊狀，加5倍無菌PBS，用組織研磨器充分研磨，收集懸液，4℃、12 000r/min離心10min，吸取上清液，備用。

2)吸取100μL疑似病例組織病料的上清液置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數(shù)為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管空氣中自然干燥，用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得疑似病例組織病料的DNA溶液，備用。

3)同時進行陰性對照樣品溶液的處理：吸取100μL陰性對照物滅菌三蒸水置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數(shù)為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用。

(3)用本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒檢測MDV、FAdV、REV和ALV

4)取擴增反應混合液23μL，加入疑似病例組織病料的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次進行95℃預變性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，并依此進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，得到疑似病例組織病料擴增反應產(chǎn)物，備用。

5)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產(chǎn)物，備用。

6)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產(chǎn)物。

實施例3

(1)引物的設計與制備

同實施例1。

(2)血清樣品的處理與DNA溶液的提取

1)對疑似病例雞進行翅靜脈采血，自然凝固，待血清析出后分離血清，備用。

2)吸取100μL待檢分離血清置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用75％乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管空氣中自然干燥，用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到待檢分離血清的DNA溶液，備用。

3)同時進行陰性對照樣品溶液的處理：吸取100μL陰性對照物滅菌三蒸水置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數(shù)為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用。

(3)用本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒檢測MDV、FAdV、REV和ALV

4)取擴增反應混合液23μL，加入待檢分離血清的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次進行95℃預變性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，并依此進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，得到待檢分離血清擴增反應產(chǎn)物，備用。

5)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產(chǎn)物，備用。

6)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產(chǎn)物。

實施例4

(1)引物的設計與制備

同實施例1。

(2)全血樣品的處理與DNA提取

1)注射器中加入肝素鈉抗凝劑，對疑似病例雞進行翅靜脈采血，混勻后即得抗凝血，備用。

2)吸取100μL待檢抗凝血置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用75％乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管空氣中自然干燥，用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得待檢抗凝血的DNA溶液，備用。

3)同時進行陰性對照樣品溶液的處理：吸取100μL陰性對照物滅菌三蒸水置入1.5mL無菌EP管，加入800μL裂解液，顛倒混勻，靜置裂解10min，加入600μL的-20℃的無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用體積分數(shù)為75％的乙醇洗滌1次，棄去乙醇，倒置EP管，在空氣中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到陰性對照樣品溶液，備用。

(3)用本發(fā)明的用于診斷FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR檢測試劑盒檢測MDV、FAdV、REV和ALV

4)取擴增反應混合液23μL，加入待檢抗凝血的DNA溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次進行95℃預變性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，并依此進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，得到待檢抗凝血的擴增反應產(chǎn)物，備用。

5)取擴增反應混合液23μL，加入陰性對照樣品溶液2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陰性對照樣品擴增反應產(chǎn)物，備用。

6)取擴增反應混合液23μL，加入陽性對照物2μL，混合均勻進行PCR擴增，反應條件為：依次在95℃條件下預變性5min、94℃條件下預變性50s、55℃條件下預變性60s、72℃條件下預變性60s，依次進行35個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min，得到陽性對照物擴增反應產(chǎn)物。

結(jié)果判定

(1)稱取1.0g瓊脂糖，加入100mL 1×TAE緩沖液中，微波爐中加熱融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙錠，混勻，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為5mm，待冷卻凝固后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1×TAE緩沖液淹沒膠面；

(2)分別取5μL上述實施例2～4所得的各個擴增產(chǎn)物和上樣緩沖液混勻，加入加樣孔中，同時加5μL DL2000 DNA分子量標準；

(3)電壓80V～100V，或電流40mA～50mA，電泳30min；

(4)取出凝膠，置入紫外分析儀中觀察，或置入凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相；

(5)以DL2000 DNA分子質(zhì)量標準作為參照，陰性對照不出條帶，陽性對照出1085bp、750bp、508bp、312bp共4個條帶，說明對照成立。樣品中出現(xiàn)1085bp一個條帶，即為單一馬立克氏病病毒感染；樣品出現(xiàn)750bp一個條帶，即為單一Ⅰ群禽腺病毒感染；樣品出現(xiàn)508bp一個條帶，即為單一禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染；樣品出現(xiàn)312bp一個條帶，即為單一雞淋巴細胞白血病病毒感染。如果出現(xiàn)2條、3條或4條特異性條帶，即為相應病毒的2重、3重或4重混合感染。

雖然，本說明書中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。