本發(fā)明涉及一種食品中諾如病毒檢測(cè)方法，具體涉及三種食品諾如病毒洗脫和吸附的方法，同時(shí)又采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)濃縮病毒量(PCRU/mL)，以提高檢測(cè)食品中病毒污染的靈敏度。

(二)

背景技術(shù)：

近年來，全球食源性疾病和惡性食品污染事件頻頻的發(fā)生，使食品安全已成為一個(gè)嚴(yán)重并不斷擴(kuò)大的世界衛(wèi)生問題，并日益成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著當(dāng)前國際貿(mào)易、國際旅游業(yè)的快速增長，食品市場(chǎng)的全球化引發(fā)了食品的高風(fēng)險(xiǎn)性，并使食源性疾病有在全球蔓延的趨勢(shì)。作為食品安全的頭號(hào)問題，食源性疾病的發(fā)生中超過半數(shù)是由病毒引起的。諾如病毒(noroviruse,NoV)是世界范圍內(nèi)引起人類急性胃腸炎的最常見食源性病毒之一，該病毒主

要傳播途徑為食用受污染的食品、水及生活接觸,其中食用受污染的食品是重要途徑之一。

隨著發(fā)達(dá)國家對(duì)諾如病毒的日益關(guān)注和研究的日趨深入，近年來國內(nèi)對(duì)諾如病毒的研究已開始重視。諾如病毒(Norovirus,NoV)屬于杯狀病毒科(Caliciviruses)的諾瓦克病毒屬，是1972年由Kapikian等學(xué)者首次用電鏡的方法發(fā)現(xiàn)的。諾如病毒基因組分子大小為7.3-7.6Kb，通常根據(jù)NV病毒RNA聚合酶編碼區(qū)核苷酸或外殼蛋白區(qū)氨基酸序列的差異，可將NV分為5個(gè)不同的基因型(GGI、GGII、GGIII、GGIV和GGV)，其中GGI和GGII為常見的致病型。諾如病毒對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)，通常能引起自限性、輕中度的胃腸道感染癥，其特點(diǎn)是高發(fā)病率、低致病劑量。諾如病毒目前被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)流行性、非細(xì)菌胃腸炎暴發(fā)的主要原因。2006年11月，日本、新加坡、意大利等地相繼發(fā)生了與食品有關(guān)的諾如病毒集體感染事件，特別是日本，不到兩個(gè)月累計(jì)發(fā)生了35.76萬人感染了諾如病毒。中國自1995年報(bào)告首例諾如病毒感染病例后，國內(nèi)許多地區(qū)多次暴發(fā)諾如病毒感染性急性胃腸炎(疫情主要集中在廣東和浙江省)。諾如病毒已日益成為重要的公共衛(wèi)生問題。

日常生活中，在許多食物的表面或者內(nèi)部都有各種各樣病毒的分布。長期以來，由于食品中病毒的含量低、檢測(cè)技術(shù)落后等因素，人們對(duì)于病毒污染食物未能得到應(yīng)有的重視。食源性諾如疾病的暴發(fā)大多與食用受污染的水及食品有關(guān)。目前絕大多數(shù)有關(guān)食品中有毒有害物質(zhì)的研究主要集中于重金屬、致病菌、農(nóng)殘獸殘及其食品自身產(chǎn)生的神經(jīng)毒素等，對(duì)以其為載體的食源性病毒尤其是諾如病毒檢測(cè)技術(shù)的研究還不多。我國及世界上大多數(shù)國家除貝類以外的食品中病毒的檢測(cè)均沒有較為成熟的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可以執(zhí)行。因此，迫切需要發(fā)展有效的貝類中病毒的快速檢測(cè)方法及溯源技術(shù)，以保障食品安全及民眾健康。

食品的病毒檢測(cè)過程主要包括樣品預(yù)處理、病毒洗脫、病毒濃縮、核酸提取、PCR檢測(cè)等。鑒于食品成分復(fù)雜，可能富含各種PCR抑制劑，同時(shí)在實(shí)際操作中，食品樣本量大而病毒含量低，因此病毒洗脫和濃縮是食品中諾如病毒檢測(cè)的關(guān)鍵步驟。病毒洗脫和濃縮就是通過適當(dāng)?shù)木彌_液將病毒顆粒從食物表面洗脫下來再進(jìn)一步濃縮的一種方法。洗脫溶液的酸堿度通常對(duì)病毒顆粒的洗脫效果影響非常大。在大多數(shù)情況下，用pH9至10.5的堿性緩沖液來洗脫食品表面病毒。因?yàn)閴A性環(huán)境可以使病毒顆粒從食品基質(zhì)中分離。然而，在酸性環(huán)境中，病毒粒子結(jié)合到食品表面的能力則會(huì)得到加強(qiáng)。所以酸性環(huán)境會(huì)影響病毒洗脫的效力，從而降低檢測(cè)的靈敏度。由于許多食物(尤其是果蔬類食品)中酸性成分含量較高，所以通常使用Tris-為基礎(chǔ)的堿性緩沖液來進(jìn)行洗脫。除此之外，其他類型的洗脫緩沖液的使用也有報(bào)道。如碳酸氫鈉緩沖液被用于漿果和涼拌菜中的脊髓灰質(zhì)炎病毒的獲取。磷酸緩沖液(pH7.6)被用于生菜和新鮮的草莓中甲肝病毒的洗脫等。病毒洗脫之后，在濃縮步驟中可采用的方法則非常多，它們包括聚乙二醇(PEG)沉淀，超離心，超濾，免疫濃縮和濾膜吸附等方法。聚乙二醇(PEG)沉淀法，超離心法，超濾法是目前食品中病毒濃縮采用的較多的方法，然而它們同樣存在著耗時(shí)、高成本和操作要求高等缺點(diǎn)。濾膜吸附以往常用于水體中病毒的濃縮，近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道在對(duì)食品的洗脫和濃縮過程經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚碇?，采用濾膜吸附的方法也能達(dá)到較好的濃縮效果，同時(shí)該方法還具有省時(shí)、高效和檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

由于病毒在污染的食品含量往往較低，且病毒個(gè)體較小(直徑約為50-300nm)，難于直接檢測(cè)，常規(guī)核酸PCR和半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)是食品中病毒的主要檢測(cè)方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相對(duì)于常規(guī)核酸PCR而言，新出現(xiàn)的熒光定量PCR技術(shù)使得病毒的整個(gè)檢測(cè)過程具有了實(shí)時(shí)檢測(cè)、定量準(zhǔn)確、靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，由于諾如病毒還不能夠完全在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng)，熒光定量PCR技術(shù)已成為諾如病毒的主要檢測(cè)方法。發(fā)達(dá)國家應(yīng)用該技術(shù)對(duì)諾如病毒檢測(cè)研究已從貝類食品發(fā)展到其他食品，而我國對(duì)諾如病毒檢測(cè)技術(shù)研究起步較晚，目前的零星報(bào)道也僅限于牡蠣等貝類中。熒光定量PCR技術(shù)的引入，將進(jìn)一步增強(qiáng)食品中諾如病毒檢測(cè)的范圍、高效性和靈敏度。

綜上所述，盡管目前國際上關(guān)于不同食品中諾如病毒濃縮檢測(cè)的方法已有不少報(bào)道，但由于各種濃縮方法中材料和材質(zhì)的理化性質(zhì)、吸附-洗脫條件、操作流程不同，導(dǎo)致不同濃縮方法結(jié)果也相差懸殊，各國也不具可比性。因此，對(duì)于食品中諾如病毒的整個(gè)濃縮過程進(jìn)行優(yōu)化，提高病毒的濃縮效率，在我國建立一種對(duì)食品中諾如病毒高效、快速的濃縮和檢測(cè)方法對(duì)于保障食品安全，減少諾如病毒感染，保障人民生命健康，以及對(duì)諾如病毒的檢測(cè)和控制具有重要的理論和實(shí)踐意義。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種高效、快捷的食品中諾如病毒的濃縮方法，它以即食性食品中污染的諾如病毒(NoV GI和NoV GII)為對(duì)象，利用較簡便的濃縮方法，實(shí)現(xiàn)了即食性食品中諾如病毒的濃縮，為即食性食品中諾如病毒高效快速的檢測(cè)以及食源性腹瀉病例的溯源提供技術(shù)支持。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種基于負(fù)電荷膜濃縮檢測(cè)食品中諾如病毒的方法，所述方法為：(1)病毒洗脫：將待測(cè)樣品用洗脫液浸泡，室溫振蕩洗脫(優(yōu)選10-30min)，離心(優(yōu)選8000-10000rpm離心15-30min)，獲得上清液；所述待測(cè)樣品為蔬菜、水果、沙拉或肉類熟食，若待測(cè)樣品為水果，則向洗脫液中加入果膠酶和纖維素酶；所述洗脫液為下列之一：洗脫液BE、洗脫液ALK、洗脫液SPE或洗脫液GE；所述洗脫液BE組成為：三羥甲基氨基甲烷12.11g/L，甘氨酸3.75g/L，牛肉浸膏10-30g/L，溶劑為ddH₂O，pH＝9.5；所述洗脫液GE組成為：甘氨酸3.75g/L，NaCl 8.775g/L，溶劑為ddH₂O，pH＝9.5；所述洗脫液ALK組成為：KH₂PO₄6.8g/L，NaCl 58.5g/L，Trinton X-100 1mL/L，溶劑為ddH₂O，pH＝9.2；所述洗脫液SPE組成為：NaHCO₃ 84g/L，大豆蛋白10-20g/L，溶劑為ddH₂O，pH＝9.3；(2)病毒濃縮：取上清液調(diào)節(jié)pH值至2～4，采用孔徑為0.45μm負(fù)電荷濾膜抽濾(優(yōu)選Milliflex PLUS真空泵S-Pak，0.45μm×47mm，Millipore，Germany)，獲得抽濾后的濾紙；(3)病毒濃度檢測(cè)：將抽濾后的濾紙剪碎，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，獲得待測(cè)樣品Ct值，根據(jù)諾如病毒NoV GI標(biāo)準(zhǔn)曲線和諾如病毒NoV GII標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終獲得待測(cè)樣品中諾如病毒含量；所述諾如病毒NoV GI標(biāo)準(zhǔn)曲線以1.27～1.27×10⁵PCRU/mL諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值為橫坐標(biāo)制作而成，所述諾如病毒NoV GII標(biāo)準(zhǔn)曲線以0.86～0.86×10⁸PCRU/mL諾如病毒NoV GII標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值為橫坐標(biāo)制作而成。

進(jìn)一步，步驟(1)所述待測(cè)樣品為新鮮蔬菜或水果時(shí)，所述洗脫液為洗脫液BE；所述洗脫液BE組成為：三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.11g/L，甘氨酸(Glycine)3.75g/L，牛肉浸膏(Beef extract)10g/L，溶劑為ddH₂O，pH＝9.5；所述待測(cè)樣品為沙拉時(shí)，所述洗脫液為洗脫液GE，所述洗脫液GE組成為：甘氨酸3.75g，NaCl 8.775g，ddH₂O 1L，pH＝9.5。

進(jìn)一步，所述果膠酶添加量以洗脫液體積計(jì)為1-18U/mL，所述纖維素酶添加量以洗脫液體積計(jì)為1-5.6U/mL。

進(jìn)一步，所述待測(cè)樣品為沙拉時(shí)，室溫振蕩洗脫獲得的上清液以體積比2：1添加試劑Vertrel XF，振蕩萃取(優(yōu)選振蕩1-5min，靜置15min)，收集水相用于病毒濃縮。

進(jìn)一步，步驟(1)所述待測(cè)樣品為肉類熟食，所述洗脫液為洗脫液ALK或洗脫液SPE；所述洗脫液SPE組成為：NaHCO₃ 84g/L，大豆蛋白10g/L，溶劑為ddH₂O，pH＝9.3。

進(jìn)一步，所述待測(cè)樣品為肉類熟食，洗脫液振蕩洗脫后的上清液若含有油脂狀漂浮物，則將上清液用體積比1:1的氯仿和正丁醇混合液(上清液與混合液體積比為3:1)萃取，收集水相用于病毒濃縮。

進(jìn)一步，步驟(2)所述上清液調(diào)節(jié)pH值至3-3.5。

進(jìn)一步，步驟(2)所述抽濾后，再加入0.1mol/L、pH＝3.5的PBS緩沖液二次抽濾(該步驟可有效減少濾膜中吸附的RNA抑制劑)，獲得抽濾后的濾紙。

進(jìn)一步，步驟(3)所述濾紙剪碎后加入AVL裂解液(Qiagen，Germany)(該步驟省去了常規(guī)膜濃縮病毒后的二次洗脫和濃縮過程)，渦旋振蕩器上劇烈振蕩5-8min或高速擊打2-3min后，提取RNA。

本發(fā)明濃縮裝置包括Milliflex PLUS真空泵、無菌過濾漏斗和濾膜，其中濾膜放置于Milliflex PLUS真空泵的過濾支架處(濾膜下方可墊上同樣大小的濾紙片)，固定好過濾支架與漏斗后，啟動(dòng)開關(guān)即可進(jìn)行過濾。

本發(fā)明各洗脫液經(jīng)高溫高壓滅菌處理(115℃,15min)，無需進(jìn)行離心去除雜質(zhì)，可存放于4℃一周以內(nèi)，如需長期(3-6個(gè)月)保存也可凍存于-20℃。

本發(fā)明所述諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法為：取1份NoV GI標(biāo)準(zhǔn)品，按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取RNA，以一步法RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)(引物及探針見表1)，將標(biāo)準(zhǔn)樣本的RNA進(jìn)行1:10梯度稀釋后作為檢測(cè)模板，通過判斷以最低檢測(cè)稀釋度作為病毒的PCRU，并根據(jù)病毒原液不同稀釋度(即病毒濃度1.27～1.27×10⁵PCRU/mL)與其對(duì)應(yīng)的PCRU(即Ct值)之間的關(guān)系建立NoV GI標(biāo)準(zhǔn)曲線；同樣方法制作NoV GII標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明中的所有步驟所用的食品采集容器、病毒濃縮容器進(jìn)行消毒滅菌處理。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

(1)采用了堿性洗脫液和負(fù)電荷膜濃縮食品中病毒的技術(shù)，堿性洗脫液洗脫病毒可有效減少病毒對(duì)食品基質(zhì)的吸附，負(fù)電荷膜濃縮可減少病毒提取時(shí)的PCR抑制劑，突出操作簡、分離速度快、可重復(fù)性好、成本低和不需要大型昂貴儀器適合現(xiàn)場(chǎng)作業(yè)等優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明果蔬食品(即食性)洗脫處理中加入果膠酶和纖維素酶大大提高了病毒洗脫效率；肉類熟食(即食性)洗脫液上清中按一定比例(上清：混合液＝3：1)加入氯仿-正丁醇(氯仿：正丁醇＝1:1)混合液，能夠有效減少脂類和蛋白等成份，提高了病毒的檢測(cè)靈敏度。沙拉食品(即食性)洗脫處理中加入果膠酶和纖維素酶，洗脫后濾液中按一定比例(濾液：Vertrel XF＝2：1)加入清潔劑Vertrel XF，使病毒洗脫率和檢測(cè)率都有所提高。

(3)本發(fā)明使用濃縮病毒的微孔濾膜為孔徑0.45μm負(fù)電荷S-PAK濾膜，膜表面與病毒結(jié)合率高，便于病毒的濃縮吸附，體積濃縮大大增強(qiáng)。同時(shí)孔徑適中，可以過濾食品中的PCR抑制成份，便于核酸提取，提高檢測(cè)的靈敏度。

(4)本次發(fā)明采用的負(fù)電荷濾膜吸附病毒，直接加入AVL裂解液在濾膜上提取病毒核酸，省去了加入洗脫劑洗脫病毒二次洗脫和加入絮凝劑沉淀病毒的二次濃縮。

(5)本發(fā)明基于以上洗脫液和濃縮方法的優(yōu)勢(shì)，諾如病毒NoV GII分別在生菜、藍(lán)莓、沙拉和火腿中的檢出限為6.5、65、650和650PCRU/15g，平均濃縮效率可達(dá)69.54、22.43、13.64和7.76％；而諾如病毒NoV GI分別在生菜、藍(lán)莓、沙拉和肉類即時(shí)性食品中的檢出限為7.8、78、780和780PCRU/15g，平均濃縮效率可達(dá)57.23、28.35、11.87％和4.56％。本發(fā)明與現(xiàn)有地方標(biāo)準(zhǔn)(DBS13/001-2015)相比不僅省時(shí)、高效；而且病毒濃縮率也可提高5-10％。

(四)附圖說明

圖1諾如病毒(NoV GI和GII)濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，A為諾如病毒GII型；B為諾如病毒GI型。

圖2即食性食品中病毒提取流程圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：生菜樣品中諾如病毒濃縮和檢測(cè)方法的建立

在濃縮生菜樣品中病毒之前，先對(duì)病毒濃縮容器等進(jìn)行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。

1.利用BE洗脫液洗脫生菜樣品中的諾如病毒

新鮮蔬菜(生菜)每份15g分裝。每份蔬菜中加入140μL諾如病毒陽性糞便上清，點(diǎn)狀涂布于菜葉上(5μl每點(diǎn))，置于二級(jí)生物安全柜中30min。待風(fēng)干后，剪碎菜葉，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液BE(tris 12.11g，glycine 3.75g，beef extract 10g，ddH₂O 1L，pH＝9.5)，室溫下漩渦振蕩30min，10000rpm離心15min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管中。

2.利用負(fù)電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒

用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清使pH＝3.5，將調(diào)整后的上清移入超濾杯中，采用0.45μm負(fù)電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵(S-Pak，0.45μm×47mm，Millipore，Germany，購于德國MILLIPORE公司)負(fù)壓抽濾，再次往超濾杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩沖液使之通過濾膜(該步驟可達(dá)到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎后，放入1.5ml的EP管中，待下一步核酸提取。

3.諾如病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)

3.1.RNA提取

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負(fù)電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液(Qiagen，Germany)，混勻后放入振蕩器中劇烈振蕩30min，8000×g離心后取上清至另一個(gè)EP管中，余下步驟按照其說明書進(jìn)行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.一步法熒光定量PCR

NoV GI(JJV1F/JJV1R，JJV1P)和NoV GII(JJV2F/JJV2R，JJV2P)引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板采用One Step Primescript^TMRT-PCR Kit(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)，反應(yīng)在熒光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進(jìn)行，并對(duì)結(jié)果熒光檢測(cè)。擴(kuò)增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH₂O 5μL。擴(kuò)增條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個(gè)循環(huán)。

3.3.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取1份NoV GI標(biāo)準(zhǔn)品和NoV GII標(biāo)準(zhǔn)品，按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取RNA，以一步法RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)(引物及探針見表1)，將標(biāo)準(zhǔn)樣本的RNA進(jìn)行1:10梯度稀釋后作為檢測(cè)模板，通過判斷以最低檢測(cè)稀釋度作為病毒的PCRU，并根據(jù)病毒原液不同稀釋度(即NoV GI病毒濃度1.27～1.27×10⁵PCRU/mL，NoV GII病毒濃度0.86～0.86×10⁸PCRU/mL)與其對(duì)應(yīng)的PCRU(即Ct值)之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，NoV GI標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝-0.44X+14.46，NoV GII標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝-0.35X+14.47。

3.4.熒光定量PCR檢測(cè)濃縮病毒的量(PCRU/mL)

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三份，樣品檢測(cè)時(shí)，每份樣品同時(shí)檢測(cè)起始病毒原液、洗脫液和濃縮液。每份樣品檢測(cè)時(shí)均包含1份陰性對(duì)照(核酸提取時(shí)不加樣品，只加洗脫緩沖液)、1份空白對(duì)照(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系中以ddH₂O代替RNA)。Ct值<40則判定為檢出NoV GI和NoV GII。

檢出限的計(jì)算：分別取1份NoV GI和NoV GII標(biāo)準(zhǔn)品，按1:10進(jìn)行梯度系列稀釋(10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5…….)后，各取140μl涂抹于15g生菜葉上，以上每個(gè)稀釋度樣品重復(fù)六份，每份按照上述方法洗脫、濃縮和檢測(cè)病毒，以每個(gè)稀釋度中的六份檢測(cè)樣品首次出現(xiàn)全為陰性時(shí)，上一個(gè)稀釋度所對(duì)應(yīng)的病毒含量為本方法在生菜中的檢出限。

4.諾如病毒洗脫和濃縮效率的計(jì)算

公式如下：

5.結(jié)論

根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果，陽性對(duì)照即初始加入生菜樣品中諾如病毒NoV GII和NoV GI的量分別是6.5×10¹⁰PCRU/15g和7.8×10⁸PCRU/15g，生菜樣品洗脫和濃縮后諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計(jì)算結(jié)果如表2和表3所示，使用該方法濃縮生菜樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為74.75％、69.54％和6.5 PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為73.32％、57.23％和7.8 PCRU/15g。

實(shí)施例2：藍(lán)莓樣品中諾如病毒濃縮和檢測(cè)方法的建立

在濃縮藍(lán)莓樣品中病毒之前，先對(duì)病毒濃縮容器等進(jìn)行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。

1、利用BE洗脫液洗脫藍(lán)莓樣品中的諾如病毒

水果(藍(lán)莓)每份15g分裝。每份藍(lán)莓中加入140μl諾如病毒NoV GI和NoV GII陽性糞便上清，點(diǎn)狀涂布于藍(lán)莓表面(5μl每點(diǎn))，置于二級(jí)生物安全柜中30-60min。待風(fēng)干后，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液BE(Tris 12.11g，Glycine 3.75g，Beef extract 20g，ddH₂O 1L，pH＝9.5)，加入果膠酶(30000U/g，0.02g/mL)和纖維素酶(10000U/g，0.01g/mL)各150μl，室溫下漩渦振蕩30min，10000rpm離心15min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管中。

2、利用負(fù)電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒

用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清使pH＝3.5，將調(diào)整后的上清移入超濾杯中，采用孔徑為0.45μm負(fù)電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵負(fù)壓抽濾，再次往超濾杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩沖液使之通過濾膜(該步驟可達(dá)到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎后，放入1.5ml的EP管中，待下一步核酸提取。

3、諾如病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)

3.1.RNA提取

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負(fù)電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μl AVL裂解液，混勻后放入振蕩器中劇烈振蕩30min，8000×g離心后取上清至另一個(gè)EP管中，余下步驟按照其說明書進(jìn)行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.一步法熒光定量PCR

NoV GI和NoV GII引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板采用One Step Primescript^TMRT-PCR Kit(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)，反應(yīng)在熒光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進(jìn)行，并對(duì)結(jié)果熒光檢測(cè)。擴(kuò)增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH₂O 5μL。擴(kuò)增條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個(gè)循環(huán)。

3.3.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

同實(shí)施例1。

3.4.熒光定量PCR檢測(cè)濃縮病毒的量(PCRU/mL)

同實(shí)施例1。

6.諾如病毒洗脫和濃縮效率的計(jì)算

同實(shí)施例1。

7.結(jié)論

根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果，陽性對(duì)照即初始加入藍(lán)莓樣品中諾如病毒NoV GII和NoV GI的量分別是6.5×10¹⁰PCRU/15g和7.8×10⁸PCRU/15g，藍(lán)莓樣品洗脫和濃縮后諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計(jì)算結(jié)果如表2和表3所示，使用該方法濃縮藍(lán)莓樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為55.23％、22.43％和65 PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為43.65％、18.35％和78 PCRU/15g。

實(shí)施例3：火腿樣品中諾如病毒濃縮和檢測(cè)方法的建立

在濃縮火腿樣品中病毒之前，先對(duì)病毒濃縮容器等進(jìn)行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。

1、利用BE洗脫液洗脫火腿樣品中的諾如病毒

肉類等即時(shí)性熟食(火腿)每份15g分裝。每份火腿中加入140μL諾如病毒NoV GI和NoV GII陽性糞便上清，點(diǎn)狀涂布于火腿表面(5μl每點(diǎn))，置于二級(jí)生物安全柜中30-60min。待風(fēng)干后，剪碎火腿，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液ALK(KH₂PO₄ 6.8g，NaCl 58.5g，Trinton X-100 1mL，ddH₂O 1L，pH＝9.2)，調(diào)節(jié)洗脫液pH值在9.2-9.5之間，室溫下漩渦振蕩30min，10000rpm離心15min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管中，如發(fā)現(xiàn)油脂狀物質(zhì)漂浮于上清，可按特定比例(上清：混合液＝3:1，v/v)加入氯仿-正丁醇混合液(體積比1:1)，振蕩離心后取水相備用。

2、利用負(fù)電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒

用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清或水相使pH＝3.5，將調(diào)整后的上清移入超濾杯中，采用孔徑為0.45μm負(fù)電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵負(fù)壓抽濾，再次往超濾杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩沖液使之通過濾膜(該步驟可達(dá)到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎后，放入1.5mL的EP管中，待下一步核酸提取。

3、諾如病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)

3.1.RNA提取

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負(fù)電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液，混勻后放入振蕩器中劇烈振蕩30min，8000g離心后取上清至另一個(gè)EP管中，余下步驟按照其說明書進(jìn)行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.一步法熒光定量PCR

NoV GI和NoV GII引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板采用One Step Primescript^TMRT-PCR Kit(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)，反應(yīng)在熒光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進(jìn)行，并對(duì)結(jié)果熒光檢測(cè)。擴(kuò)增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH₂O 5μL。擴(kuò)增條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個(gè)循環(huán)。

3.3.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

同實(shí)施例1。

3.4.熒光定量PCR檢測(cè)濃縮病毒的拷貝數(shù)

同實(shí)施例1。

4、諾如病毒洗脫和濃縮效率的計(jì)算

同實(shí)施例1。

5、結(jié)論

根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果，陽性對(duì)照即初始加入火腿樣品中諾如病毒NoV GII和NoV GI的量分別是6.5×10¹⁰PCRU/15g和7.8×10⁸PCRU/15g，火腿樣品洗脫和濃縮后諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計(jì)算結(jié)果如表2和表3所示，使用該方法濃縮火腿樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為34.61％、13.64％和650 PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為39.77％、11.88％和780 PCRU/15g。

實(shí)施例4：沙拉樣品中諾如病毒濃縮和檢測(cè)方法的建立

在濃縮沙拉樣品中病毒之前，先對(duì)病毒濃縮容器等進(jìn)行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。

1、利用BE洗脫液洗脫沙拉樣品中的諾如病毒

沙拉由黃瓜、西紅柿、胡蘿卜和沙拉醬按一定比例制備(西紅柿：黃瓜：胡蘿卜：沙拉醬＝1：1：1：2，w/w)。每份15g分裝。每份沙拉中加入140μL諾如病毒NoV GI和NoV GII陽性糞便上清，點(diǎn)狀涂布于沙拉表面(5μl每點(diǎn))，置于二級(jí)生物安全柜中30-60min。待風(fēng)干后，剪碎混勻，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液GE(Glycine 3.75g，NaCl 8.775g，ddH₂O 1L，pH＝9.5)，室溫下漩渦振蕩15min，10000rpm離心5min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管中，按一定比例(濾液：Vertrel XF＝2：1，體積比)加入試劑Vertrel XF(HFC,Dupont Chemical，購于深圳市優(yōu)寶惠新材料科技有限公司)，振蕩1-5min后，靜置15min取水相備用。

2、利用負(fù)電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒

用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)水相使pH＝3.5，將調(diào)整后的上清移入超濾杯中，采用孔徑為0.45μm負(fù)電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵負(fù)壓抽濾，再次往過濾漏斗中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩沖液使之通過濾膜(該步驟可達(dá)到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎后，放入1.5mL的EP管中，待下一步核酸提取。

3.諾如病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)

3.1.RNA提取

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負(fù)電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液，混勻后放入振蕩器中劇烈振蕩10min，8000×g離心30s后取上清至另一個(gè)EP管中，余下步驟按照其說明書進(jìn)行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.一步法熒光定量PCR

NoV GI和NoV GII引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板采用One Step Primescript^TMRT-PCR Kit(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)，反應(yīng)在熒光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進(jìn)行，并對(duì)結(jié)果熒光檢測(cè)。擴(kuò)增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH₂O 5μL。擴(kuò)增條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個(gè)循環(huán)。

3.3.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

同實(shí)施例1。

3.4.熒光定量PCR檢測(cè)濃縮病毒的拷貝數(shù)

同實(shí)施例1。

4、諾如病毒洗脫和濃縮效率的計(jì)算

同實(shí)施例1。

5、結(jié)論

根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果，陽性對(duì)照即初始加入生菜樣品中諾如病毒NoVGII和NoV GI的量分別是6.5×10¹⁰和7.8×10⁸PCRU/15g，生菜樣品洗脫和濃縮后諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計(jì)算結(jié)果如表2和表3所示，使用該方法濃縮生菜樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為28.64％、7.76％和650PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為18.94％、4.56％和780PCRU/15g。

表1諾如病毒(NoV GI和GII)特異性引物與探針

R＝A or G；Y＝C or T.

表2四種洗脫緩沖液配方

表3四種即食性食品中諾如病毒(NoV GI和GII)的洗脫率和回收率

表4負(fù)電荷膜吸附法對(duì)四種即食性食品中諾如病毒(NoV GI和GII)檢出限

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所做的進(jìn)一步說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其構(gòu)架形式能夠靈活多變，可以派生系列產(chǎn)品。只是做出簡單的推演活替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。