本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及在同一PCR體系中同步對4種侵染小麥的蟲傳病毒進(jìn)行擴(kuò)增，達(dá)到快速區(qū)分、高效檢測的目的。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈娜蠹Z食作物之一，而病毒病是危害小麥生產(chǎn)的一類重要病害，國際上已報道的有50多種，病毒病在小麥的苗期和成株期均能侵染，一般侵染愈早，對小麥生長和產(chǎn)量的影響愈大。近年來由于全球氣候變暖、免耕和高毒農(nóng)藥的禁用等因素使傳毒介體昆蟲群體逐漸加大，加之品種抗病性程度普遍較低等，蟲傳麥類作物病毒病在我國危害日趨嚴(yán)重，發(fā)生面積及為害程度迅速增長，成為影響國家糧食安全的重要因素。近年來，在我們北部麥區(qū)危害嚴(yán)重的蟲傳病毒病有小麥叢矮病、小麥矮縮病、小麥綠矮病等多種，小麥叢矮病由北方禾谷花葉病毒(Northern cereal mosaic virus，NCMV)引起，小麥綠矮病由水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)引起,小麥矮縮病則由小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起。前兩種病毒均由灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallen)傳播，而小麥矮縮病毒病的傳播主要通過介體條沙葉蟬(Psammotettix striatus L.)以持久循回方式傳播的。小麥叢矮病和小麥綠矮病以及小麥矮縮病在癥狀表現(xiàn)上很難區(qū)分，均表現(xiàn)植株矮縮、分蘗增多等癥狀，且田間多為混合發(fā)生，近年來新發(fā)現(xiàn)小麥上另一種病毒病即由灰飛虱傳播的大麥黃條點花葉病毒(Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV)也表現(xiàn)黃化，矮化等癥狀。因此生產(chǎn)上急需可靠、方便且經(jīng)濟(jì)實用的區(qū)分這四種病毒的檢測方法。

分子檢測技術(shù)因其快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、病毒、的快速檢測和鑒定，以及病害的早期篩查與診斷中。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于核酸的多重檢測技術(shù)在核酸診斷領(lǐng)域發(fā)揮了越來越重要的作用，主要包括以多重PCR、核酸等溫擴(kuò)增、基因芯片為基礎(chǔ)的多重核酸檢測技術(shù)，這些技術(shù)可對多個靶標(biāo)進(jìn)行同時檢測，具有快速、高通量、樣品消耗少等特點。多重PCR(multiplex PCR)是Chamberlain于1988年報道的一種PCR衍生方法，即在一個PCR體系中加入1對以上的引物，以對兩種及以上的目的基因進(jìn)行同時擴(kuò)增的檢測技術(shù)。多重PCR的基本原理、反應(yīng)試劑和操作均與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR體系中含有2對或多對引物，分別擴(kuò)增不同模板，以對多個靶標(biāo)進(jìn)行同時檢測。該發(fā)明即利用以上原理針對侵染小麥的4種蟲傳病毒建立了特異、高效的多重PCR檢測體系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速又高效的用于同步檢測侵染小麥的4種蟲傳病毒的方法，準(zhǔn)確度高，靈敏性好。

一種用于同步檢測RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV 4種蟲傳病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR體系中，包含有如下特異性引物對：

擴(kuò)增RBSDV病毒的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-ACGAACAACGACCTAAGTGA-3′；

SEQ ID NO.2：5′-AAGTATTCCCATTTGAGCAG-3′。

擴(kuò)增BYSMV病毒的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-TGGGACTCTTCAGGTTGTGG-3′；

SEQ ID NO.4：5′-CTGGCTGTTGGATTCATTTCTC-3′。

擴(kuò)增WDV病毒的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′-TCTTCAAAGGTTTGCGTGTC-3′；

SEQ ID NO.6：5′-GGGAGGCATAAGTCCATCTA-3′。

擴(kuò)增NCMV病毒的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-CTATGCAAGAACAAAGCAGGAT-3′；

SEQ ID NO.8：5′-ACCGACAGTAATGAAGAGGC-3′。

所述PCR體系中引物對的摩爾比為WDV：RBSDV：BYSMV：NCMV＝1：2：2：5。

所述的PCR體系總體積25μL，其中含有2μLcDNA，2μL濃度為2.5mM的dNTP、0.2μL rTaq、1.5μL濃度為25mM的Mg²⁺以及濃度為10μmol/L WDV/RBSDV/BYSMV/NCMV上下游引物各0.1μL、0.2μL、0.2μL、0.5μL。

所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s、53℃45s和72℃80s共35個循環(huán)；72℃10min。

上述方法在同步檢測農(nóng)作物上RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV四種病毒中的應(yīng)用。

所述農(nóng)作物為小麥、大麥、燕麥或黑麥。

本發(fā)明提供的擴(kuò)增RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV四種病毒的特異性引物，通過RT-PCR可分別獲得273bp,565bp,783bp和1296bp的單一條帶，通過對體系中退火溫度，dNTP Mix，rTaq以及Mg²⁺濃度進(jìn)行系列優(yōu)化，建立了基于單重RT-PCR技術(shù)的多重RT-PCR檢測方法，從而實現(xiàn)對小麥上RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV等四種蟲傳病毒同步檢測技術(shù)的突破。具體發(fā)明內(nèi)容涉及到：1)4種病毒的植物樣品采集與保存；2)病毒RNA的提??；3)特異性引物的設(shè)計；4)4種病毒的單重RT-PCR鑒定體系；5)基于單重RT-PCR技術(shù)的多重RT-PCR檢測方法的建立與優(yōu)化；6)多重RT-PCR檢測方法靈敏度的測定；7)多重RT-PCR體系成功應(yīng)用于田間樣品的檢測。本發(fā)明的多重PCR經(jīng)優(yōu)化，確定了體系中最佳條件為：退火溫度為53℃，2μL dNTP mix(2.5mM each)、0.2μL rTaq以及1.5μL Mg²⁺(25mM)的使用量。多重RT-PCR擴(kuò)增體系如下：94℃3min，(94℃30s、53℃45s和72℃80s)×35個循環(huán)，72℃10min。

以上所述的四對特異性引物可做為組合應(yīng)用于小麥上RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV四種病毒的同步檢測的應(yīng)用。

所述的RBSDV和NCMV毒源均采自山東濟(jì)南，所述的BYSMV采自河北石家莊，所述的WDV毒源是采自陜西韓城，經(jīng)PCR和血清學(xué)鑒定為陽性的植株，分別經(jīng)相應(yīng)的介體灰飛虱或條沙葉蟬活體飼喂保存在感病小麥品種揚(yáng)麥12號。

所述的灰飛虱種群采自江蘇鹽城，常年在水稻幼苗上飼養(yǎng)；

所述的條沙葉蟬種群采自陜西韓城，常年在小麥幼苗上飼養(yǎng)。

所述的介體飼養(yǎng)和作為飼料的寄主小麥或水稻材料均種植在22℃培養(yǎng)箱內(nèi)，16h光照、8h黑暗，光照強(qiáng)度為20000Lx。每兩周將葉蟬或灰飛虱轉(zhuǎn)移到新種的幼苗上，以此方法來保存介體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明首次提出在小麥上同步檢測RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV四種病毒；

2.本發(fā)明提出的檢測引物具有特異性和兼并性，優(yōu)化了PCR擴(kuò)增程序，大大地提高了檢測效率、縮短了檢測時間，提高了檢測結(jié)果的可信度；

3.本發(fā)明實施的檢測是在同一個PCR體系完成，節(jié)約了病毒RNA以及PCR擴(kuò)增體系各試劑特別是反轉(zhuǎn)錄酶、Taq的使用量，大大減低了檢測成本。

附圖說明

圖1.四種病毒的單重PCR檢測的引物特異性電泳結(jié)果；其中：M代表DL2000DNA Marker,從上到下依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1～4泳道依次為RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV病毒樣品分別應(yīng)用相應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果。

圖2.四種病毒特異性引物擴(kuò)增的兼容性電泳結(jié)果；其中：M代表D2000DNA Marker,從上到下依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1～5泳道依次為RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV以及四種病毒樣品混合物分別用混合的四種病毒特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果，6泳道為健康樣品對照。

圖3.多重PCR體系的優(yōu)化；其中A:退火溫度的優(yōu)化,從左到右分別為49/51/53/55/57℃；B:dNTP用量的優(yōu)化,從左到右分別為1/2/4/6/8μL；C:rTaq用量的優(yōu)化,從左到右分別為0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μL；D:Mg²⁺用量的優(yōu)化，從左到右分別為0.5/1.0/1.5/2.0/2.5μL。所有圖中的M代表DL2000DNA Marker,從上到下依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。

圖4.多重PCR體系的靈敏度測定；圖中的M代表DL2000DNA Marker,從上到下依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。1～5泳道依次為混合病毒樣品的cDNA 5個濃度梯度(10⁰～10^-4)的電泳結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。

需特別指出的是，盡管本發(fā)明闡述的是針對小麥上RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV四種蟲傳病毒的鑒定技術(shù)，但RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV病毒也侵染大麥、燕麥、黑麥等多種麥類種質(zhì)資源，因此應(yīng)用本發(fā)明對任何引起RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV病毒的寄主如大麥、燕麥、黑麥等麥類種質(zhì)資源均也包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。

實施例1.四種蟲傳病毒的分離與保存

所述的水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)毒源是水稻黑條矮縮病毒山東濟(jì)南分離物，挑選癥狀明顯的植株經(jīng)PCR和血清學(xué)鑒定為陽性后，由介體灰飛虱傳毒活體保存在寄主小麥上。所述的大麥黃條點病毒(BYSMV)毒源是大麥黃條點花葉病毒河北石家莊分離物，挑選癥狀明顯的植株經(jīng)PCR和血清學(xué)鑒定為陽性后，由介體灰飛虱傳毒活體保存在寄主小麥上。所述的北方禾谷花葉病毒(NCMV)毒源是北方禾谷花葉病毒山東濟(jì)南分離物，挑選癥狀明顯的植株經(jīng)PCR和血清學(xué)鑒定為陽性后，由介體灰飛虱傳毒活體保存在寄主小麥上。傳毒介體灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallen)采自江蘇鹽城，經(jīng)脫毒純化后在健康水稻上常年扣罩飼養(yǎng)繁殖。所述的介體飼養(yǎng)和作為飼料的水稻品種均飼養(yǎng)在25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，16h光照、8h黑暗，光照強(qiáng)度為20000Lx。所述的小麥矮縮病毒(WDV)毒源是小麥矮縮病毒陜西韓城分離物，挑選癥狀明顯的植株經(jīng)PCR和血清學(xué)鑒定為陽性后，經(jīng)條沙葉蟬傳毒活體保存在寄主小麥上。傳毒介體條沙葉蟬[Psammotettix striatus(Linnaeus)]采自陜西韓城，經(jīng)脫毒純化后在健康小麥上常年扣罩飼養(yǎng)繁殖。所述的介體飼養(yǎng)和作為飼料及傳毒寄主的小麥品種揚(yáng)麥12號均飼養(yǎng)在22℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，16h光照、8h黑暗，光照強(qiáng)度為20000Lx。

實施例2.病毒RNA的提取

采用TRIzol(Invitrogen,USA)法分別提取四種病毒樣品及待檢測樣品的總RNA。具體提取過程為：將約0.1g新鮮或冰凍的樣品在液氮中充分研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移入液氮冷凍過的1.5mL離心管中，然后加入1mLTRIzol，劇烈搖晃混勻，冰上靜置5min；加入200μL氯仿，用力搖15s，冰上靜置5min。4℃，12,000rpm離心10min；將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入與上清等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，冰上靜置10min；4℃，12,000rpm離心15min，去上清；加入1mL預(yù)冷的75％乙醇(滅菌的DEPC水配制)，洗滌沉淀。4℃，12,000rpm離心5min棄上清，重復(fù)上述洗滌步驟，以徹底洗干凈鹽分；用槍頭盡量吸出上清。在通風(fēng)廚中，開口朝上，干燥15～20min后用50μL滅菌的DEPC水溶解。取1μL RNA用NanoDrop-2000紫外分光光度計測定RNA樣品的純度和濃度值。合格樣品置于-70℃冰箱保存待用。

實施例3.特異性引物的設(shè)計

每種病毒依據(jù)GenBank上登錄的序列用Primer Premier 5軟件設(shè)計特異性引物，每對引物選擇相似的退火溫度且不同的PCR產(chǎn)物大小及避免二級結(jié)構(gòu)和引物之間的互作，具體引物如表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

表1.RBSDV、WDV、BYSMV和NCMV四種病毒的多重PCR檢測體系中的特異性引物

實施例4.四種病毒的單重RT-PCR體系

cDNA合成體系總體積為20μL，其中RNA(大約1μg)1μL,反向引物(10μmol/L)2μL,dNTP Mix(2.5mM each)2μL,5×MMLV-buffer 4μL，DEPC H₂O補(bǔ)足至10μL,混勻后90℃變性1min，立即置于冰上2min；然后加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega,USA)1μL,RRI(Takara,China)0.5μL以及DEPC H₂O 8.5μL?；靹蚝螅?7℃孵育1hr,70℃10min。

PCR體系如下：cDNA2μL,10×PCR Buffer(Mg²⁺plus,15mM)2.5μL,dNTP Mix(each 2.5mM)2μL,上下游引物各0.5μL,rTaq(Takara,China)0.2μL，用ddH₂O補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增體系如下：94℃3min，(94℃30s、55℃45s和72℃80s)×35個循環(huán)，72℃10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳，用EB染色觀察結(jié)果。電泳結(jié)果顯示：用相應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV分別獲得了273bp,565bp,783bp和1296bp的單一條帶(圖1)。

實施例5.PCR產(chǎn)物的克隆與多重RT-PCR產(chǎn)物回收測序測序

將實施例4中的PCR產(chǎn)物切膠回收，與pEASY-T5載體(全式金生物有限公司，中國)進(jìn)行連接，導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1(全式金生物有限公司，中國)中實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，挑取10個克隆斑，經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增陽性并送樣測序，每個樣品送3個克隆，測序工作由上海生物工程有限公司完成。測序結(jié)果經(jīng)比對表明獲得的序列與原參考序列的同源性在98％以上，證明了擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。

實施例6.四種病毒的多重RT-PCR體系建立與優(yōu)化

多重RT-PCR體系與單重RT-PCR體系的試劑成分相同，但是多重PCR體系是在一個反應(yīng)體系中檢測所有4種病毒，因此多重PCR體系中的RNA和引物為4種病毒RNA和特異性引物對的混合物，引物對的最佳比例為WDV：RBSDV：BYSMV：NCMV＝1：2：2：5。結(jié)果表明4對引物有良好的兼容性(圖2)。為了優(yōu)化多重PCR體系，將不同的退火溫度，不同的dNTP Mix，rTaq以及Mg²⁺濃度做為優(yōu)化的因素，其中：分49/51/53/55/57℃5個梯度對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化；分別以1/2/4/6/8μL的用量對dNTP mix的濃度進(jìn)行優(yōu)化；分別以0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μL的用量對rTaq使用濃度進(jìn)行優(yōu)化；分別以0.5/1.0/1.5/2.0/2.5μL的用量對Mg²⁺濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化體系中最佳條件為退火溫度53℃、2μL dNTP mix、0.2μL rTaq以及1.5μL Mg²⁺濃度，結(jié)果分別如圖3(A-D)。

最終優(yōu)化的多重RT-PCR體系如下：cDNA合成體系總體積為20μL，其中RNA(大約1μg)1μL,反向引物(10μmol/L)各0.5μL,dNTP Mix(2.5mM each)2μL，5×MMLV buffer 4μL，DEPC H₂O補(bǔ)足至10μL,混勻后90℃變性1min，立即置于冰上2min；然后加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL,RRI 0.5μL以及DEPC H₂O 8.5μL。混勻后，37℃孵育1hr，70℃10min。取上述合成體系中的cDNA2μL,10×PCR buffer(Mg²⁺-Free)2.5μL,Mg²⁺(25mM)1.5μL,dNTP Mix(each 2.5mM)2μL,WDV/RBSDV/BYSMV/NCMV上下游引物各0.1/0.2/0.2/0.5μL,rTaq(Takara,China)0.2μL，用ddH₂O補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增體系如下：94℃3min，(94℃30s、53℃45s和72℃80s)×35個循環(huán)，72℃10min。

實施例7.多重RT-PCR體系的靈敏度測定

為檢測多重RT-PCR體系的靈敏度，將cDNA成10倍系列稀釋(10⁰-10^-4)，結(jié)果表明多重RT-PCR的檢測底限是10^-2的cDNA，當(dāng)稀釋100倍時，NCMV和WDV的條帶比較模糊，而BYSMV的條帶依然清晰,結(jié)果如圖4。

實施例8.多重RT-PCR體系的應(yīng)用

2016年3月至4月期間，采集陜西韓城等5個不同地區(qū)的具典型矮化、叢生癥狀的117份小麥病株，按照實施例2的方法提取樣品總RNA,利用實施例6中建立的多重RT-PCR體系鑒定樣品中的病原物，具體檢測結(jié)果如表2所示。該體系成功地從陜西韓城27份樣品中檢出5個WDV和1個NCMV陽性樣品，山東濟(jì)南9份樣品中5個RBSDV和2個NCMV陽性樣品，河南鄭州的6份樣品中檢出1個BYSMV陽性樣品，河北石家莊的62份樣品中檢出38個BYSMV和4個WDV陽性樣品，以上結(jié)果表明建立的多重RT-PCR方法可以較好地應(yīng)用于田間樣品的檢測。

表2.應(yīng)用多重RT-PCR法檢測田間小麥樣品中的四種病毒

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種用于同步檢測4種蟲傳病毒的多重RT－PCR方法

<130> PP16122-ZWB

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增RBSDV病毒的正向特異性引物的核苷酸序列

<400> 1

acgaacaacg acctaagtga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增RBSDV病毒的反向特異性引物的核苷酸序列

<400> 2

aagtattccc atttgagcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增BYSMV病毒的正向特異性引物的核苷酸序列

<400> 3

tgggactctt caggttgtgg 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增BYSMV病毒的反向特異性引物的核苷酸序列

<400> 4

ctggctgttg gattcatttc tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增WDV病毒的正向特異性引物的核苷酸序列

<400> 5

tcttcaaagg tttgcgtgtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增WDV病毒的反向特異性引物的核苷酸序列

<400> 6

gggaggcata agtccatcta 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增NCMV病毒的正向特異性引物的核苷酸序列

<400> 7

ctatgcaaga acaaagcagg at 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增NCMV病毒的反向特異性引物的核苷酸序列

<400> 8

accgacagta atgaagaggc 20