本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及表征免疫細(xì)胞與微生物相互作用的方法，具體涉及一種用于表征鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬微生物的方法。

背景技術(shù)：

卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)(Linnaeus)，俗稱金鯧，黃臘鯧，屬硬骨魚綱，脊椎動物門，硬骨魚綱，鱸形目，鲹科，鯧鲹屬。卵形鯧鲹體型側(cè)扁，卵圓形，體型大，生長快，抗病力強(qiáng)。自然水域中卵形鯧鲹喜卵形鯧魚集群覓食洄游，爭搶食物兇猛，主要以小型軟體動物、小型螺類為食。大的個體有5-10kg，肉細(xì)嫩，味鮮美，為名貴的食用魚類。

卵形鯧鲹是一種抗病力較強(qiáng)的海水魚類，過去關(guān)于其病害方面的報道極少。但隨著工業(yè)化的發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也越趨現(xiàn)代化，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度也逐漸增加，卵形鯧鲹疾病的發(fā)生率也不斷增高，病毒性、細(xì)菌性等的疾病時常出現(xiàn)，其中近年來以諾卡氏菌病例最多。諾卡氏菌病的主要癥狀為病魚體表有點(diǎn)狀出血斑小而隆起的濃腫，有時口唇部糜爛本病的典型癥狀是脾臟及腎臟上有白色結(jié)節(jié)的病變，另一種流行癥狀主要發(fā)生鰓，也叫鰓型諾卡氏菌癥，可在鰓上見到直徑為5mm的不規(guī)則結(jié)節(jié)，也有兩種癥狀混合出現(xiàn)的。卵形鯧鲹諾卡氏菌病發(fā)病率達(dá)20％～60％，死亡率10％～30％，未死魚由于體表潰瘍癥狀也嚴(yán)重影響其市場價值。

魚類諾卡氏菌病主要致病菌為鰤魚諾卡氏菌(Nocardia seriolea)。鰤魚諾卡氏菌在分類學(xué)上屬放線菌目(Actinomycetales)，諾卡氏菌科(Nocardiaceae)，諾卡氏菌屬(Nocardioides)。鰤魚諾卡氏菌菌體形態(tài)為長桿、短桿或分支狀；屬于放線菌類生物，呈弱抗酸性，在培養(yǎng)基上生長遲緩。其菌落形態(tài)呈白色沙粒狀，培養(yǎng)3-7天可轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色沙粒狀。

近年來水產(chǎn)動物病害進(jìn)行免疫學(xué)角度的研究，對于病害防控和治療以后的發(fā)展越來越重要，并且逐漸成為研究的熱點(diǎn)。魚類頭腎是其重要的免疫器官，頭腎的巨噬細(xì)胞是非特異性防御系統(tǒng)的重要的細(xì)胞。當(dāng)受到病原生物的入侵時，巨噬細(xì)胞將被激活并吞噬病原體，并且發(fā)生一系列反應(yīng)殺死病原生物。同時其免疫活性參數(shù)溶酶體活性、補(bǔ)體活性的都得到加強(qiáng)。

巨噬細(xì)胞的吞噬作用(phagocytosis)是指細(xì)胞把入侵的病原體(如細(xì)菌和病毒)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)并加以清除的過程。此過程構(gòu)成生物體先天免疫的第一道防線。吞噬作用是所有后生動物的一種原始的防御機(jī)制。

現(xiàn)今，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，諾卡氏菌對魚類的影響越來越嚴(yán)重，而相關(guān)的研究卻還比較少，所以探討魚類本身對于諾卡氏菌等細(xì)菌的免疫，將有利于我們更好地了解卵形鯧鲹對于鰤魚諾卡氏菌的免疫情況。從而有利于我們更好地研究出防控其病害影響的藥物，同時也為其他魚類巨噬細(xì)胞對于諾卡氏菌的病害防控的研究提供一個參考。促進(jìn)卵形鯧鲹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并且為水產(chǎn)養(yǎng)殖戶提供一定的理論知識，幫助他們獲得更好的收益。

有關(guān)卵形鯧鲹免疫功能的報道較少，頭腎是魚類的重要免疫器官，未見到卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和表征的報道。

對卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和表征為卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞的生理學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)等方面奠定基礎(chǔ)，有利于更深入地研究卵形鯧鲹的免疫功能，有利于研究微生物-卵形鯧鲹的致病機(jī)理，有利于研究卵形鯧鲹對微生物等成分的吞噬作用，有利于對卵形鯧鲹病害的控制，為卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞的分子生物學(xué)研究提供材料保障。

本文相關(guān)背景技術(shù)：

袁思平,王國良,金珊.養(yǎng)殖魚類致病諾卡氏菌研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報,2006,33(2):137-141.

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于表征鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬微生物的方法，所述鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬所述微生物是通過下面步驟進(jìn)行的：

1).用無水乙醇洗滌顯微鏡載玻片，并用蠟筆在所述顯微鏡的干凈的區(qū)域上圈畫圓形區(qū)域，所述圓形區(qū)域的直徑為1.5cm；

2).將鯧鲹巨噬細(xì)胞懸液滴加在所述圓形區(qū)域，所述鯧鯵巨噬細(xì)胞懸液的用量為50μl，所述鯧鲹巨噬細(xì)胞濃度為2×10⁶細(xì)胞/ml；

3).將所述載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中并加蓋，25℃條件下培養(yǎng)1-2小時；

4).所述鯧鲹巨噬細(xì)胞孵育完畢后，用25℃左右的L-15洗滌所述載玻片；

5).將50μl細(xì)菌懸液加入所述圓形區(qū)域，巨噬細(xì)胞：微生物細(xì)胞為1:10的比例；

6).將所述載玻片放鋪有濕潤濾紙的加蓋培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)60min；

7).用磷酸鹽緩沖液或L-15洗所述載玻片5次；

8).用100μl 100％甲醇固定所述載玻片上的所有細(xì)胞5min，用70％甲醇沖洗所述載玻片5次；

9).用迪夫快速染色液染色所述載玻片后，空氣干燥，滴加封片劑后用蓋玻片封片；

10).用油鏡觀察計數(shù)所述鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬所述微生物細(xì)胞的情況。

可選地，所述微生物細(xì)胞為鰤魚諾卡氏菌細(xì)胞，步驟5)中用含20％(v/v)鯧鲹血清的L-15制備鰤魚諾卡氏菌懸液，濃度為1×10⁷cfu/ml，在20℃，孵育30分鐘；用PBS洗菌2次，3000rpm，10min；用含5％(v/v)卵形鯧鲹血清的L-15將所述鰤魚諾卡氏菌懸液濃度調(diào)整到2×10⁷cfu/ml。

可選地，所述微生物細(xì)胞可為酵母菌細(xì)胞，步驟5)中酵母懸液的制備方法為：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鯧鲹血清或小牛血清的L-15。

為了獲取鯧鲹巨噬細(xì)胞，所述鯧鲹巨噬細(xì)胞可按照下面的步驟制備：

a.解剖鯧鲹，取出頭腎；

b.將所述頭腎放置在一個無菌的100目細(xì)胞篩上，該細(xì)胞篩下放置一個裝含有20i.u./ml肝素的裝有5ml L-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿；

c.將所述培養(yǎng)皿放置冰塊上，在所述細(xì)胞篩的網(wǎng)格上摩擦所述頭腎，使所述頭腎細(xì)胞落入所述含L-15的培養(yǎng)皿中形成鯧鯵細(xì)胞懸液；

d.將細(xì)胞懸液貼壁輕柔的轉(zhuǎn)移到Percoll梯度離心管的34％Percoll層之上；

e.移動加樣完畢的所述Percoll梯度離心管，于4℃，400g，離心25分鐘；

f.用無菌吸管小心吸取并棄去所述Percoll梯度離心管的上層34％Percoll液體，再用無菌吸管吸取臨近34％Percoll/51％Percoll界面處的細(xì)胞懸液層，即得到鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞；

g.加入1ml L-15到所述鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞懸液，然后在4℃，2000rpm條件下離心7min，棄上清；

h.取沉淀加入1ml滅菌雙蒸水沖洗所述鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞15-30s，4℃，2000rpm離心7min，棄上清。

在進(jìn)行步驟h后，可用1ml L-15培養(yǎng)基重懸所述鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞，用臺盼藍(lán)溶液染色，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。

為了所獲鯧鲹巨噬細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)和/或增殖，步驟h所獲得的所述鯧鲹巨噬細(xì)胞可進(jìn)行如下步驟的培養(yǎng)：

A.用L-15培養(yǎng)基重懸所述鯧鲹巨噬細(xì)胞沉淀形成巨噬細(xì)胞懸液后用血球計數(shù)板，顯微鏡觀察，計數(shù)所述鯧鲹巨噬細(xì)胞；

B.根據(jù)鯧鲹巨噬細(xì)胞計數(shù)結(jié)果用L-15培養(yǎng)基調(diào)整所述鯧鲹巨噬細(xì)胞濃度為1×10⁷細(xì)胞/ml，用含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的無血清L-15培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，其中鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽用量:每100mlL-15培養(yǎng)基中青霉素和鏈霉素各100i.u；

C.將所述巨噬細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞瓶，無血清L-15培養(yǎng)液中25℃培養(yǎng)2h；

D.待頭腎巨噬細(xì)胞貼壁后，吸棄無血清L-15培養(yǎng)液，加入含10％小牛血清、含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的L-15培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

為了減少紅細(xì)胞對實(shí)驗結(jié)果的干擾，在進(jìn)行步驟a之前，可用針筒對所述鯧鲹進(jìn)行抽血,抽血體積為15-30mL血/Kg鯧鲹體重。

所述Percoll梯度離心管可按照下面步驟制備：

i.用10×HBSS和滅菌雙蒸水稀釋Percoll溶液至34％濃度的34％Percoll；

ii.用10×HBSS和滅菌雙蒸水稀釋Percoll溶液至51％濃度的51％Percoll；將51％Percoll加入0.01g/L酚紅，或?qū)?4％Percoll加入0.01g/L酚紅；

iii.取離心管，加入34％Percoll；

iv.用吸管將51％Percoll緩慢注入所述離心管的34％Percoll的底部；

其中，所述34％Percoll溶液和所述51％Percoll溶液的體積百分比范圍分別為35-65％和35-65％。

可選地，為了鯧鲹巨噬細(xì)胞的保藏，步驟h所獲得的所述鯧鲹巨噬細(xì)胞進(jìn)行如下步驟的培養(yǎng)：

A.用L-15培養(yǎng)基重懸所述鯧鲹巨噬細(xì)胞沉淀形成巨噬細(xì)胞懸液后用血球計數(shù)板，顯微鏡觀察，計數(shù)所述鯧鲹巨噬細(xì)胞；

B.根據(jù)鯧鲹巨噬細(xì)胞計數(shù)結(jié)果用L-15培養(yǎng)基調(diào)整所述鯧鲹巨噬細(xì)胞濃度為1×10⁷細(xì)胞/ml，用含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的無血清L-15培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，其中鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽用量:每100mlL-15培養(yǎng)基中青霉素和鏈霉素各100i.u；

C.將所述巨噬細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞瓶，無血清L-15培養(yǎng)液中25℃培養(yǎng)2h；

D.待頭所述腎巨噬細(xì)胞貼壁后，吸棄無血清L-15培養(yǎng)液，加入含10％小牛血清、含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的L-15培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

本發(fā)明還提供了上述用于表征鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬微生物的方法在檢測鯧鲹巨噬細(xì)胞濃度或數(shù)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述用于表征鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬微生物的方法在研究鯧鲹巨噬細(xì)胞與微生物細(xì)胞相互作用中的應(yīng)用。

本申請的方法至少還適用于對布氏鯧鲹(Trachinotus blochii)等其他鯧鲹屬(Trachinotus)魚類吞噬微生物等方面的表征。

本發(fā)明通過觀察卵形鯧鯵頭腎的巨噬細(xì)胞對鰤魚諾卡氏菌的吞噬情況來探討其吞噬作用。為卵形鯧鲹對鰤魚諾卡氏菌等微生物的致病機(jī)理方面的研究打下基礎(chǔ)，為今后鰤魚諾卡氏菌等細(xì)菌致病因子基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞離心分離效果。

圖2示出了獲取頭腎前對卵形鯧鲹抽血的預(yù)處理對卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離效果的影響的圖像。

圖3示出了本發(fā)明方法對卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞存活情況的圖像。

圖4示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞一周的存活情況的曲線圖。

圖5示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞染色情況的圖像。

圖6示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞吞噬酵母情況的圖像。

圖7示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞吞鰤魚諾卡氏菌情況的圖像。

圖8示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞吞海豚鏈球菌情況的圖像。

具體實(shí)施方式

為了更好的解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖詳細(xì)介紹本發(fā)明的各個實(shí)施例。以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的固定或限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)特征可以替換為具有在不背離發(fā)明構(gòu)思前提下等同或相似功能或效果的其他本領(lǐng)域已知的技術(shù)特征。

1.實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗魚

卵形鯧鲹，俗稱金鯧魚。體呈鯧形，高而側(cè)扁；體長為體高1.7-1.9倍，為頭長3.8倍。尾柄短細(xì)，側(cè)扁。頭小，高小于長。枕骨嵴明顯。頭長為吻長4.4-4.9倍，為眼徑4.9-5.4倍。吻鈍，前端幾呈截形。體質(zhì)量250g-500g，體長15cm-20cm。

2.2 菌株

廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室于2005年3月在廣東省湛江港和陽江閘坡海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖場，對患結(jié)節(jié)病卵形鯧鲹體內(nèi)分離獲得一株鰤魚諾卡氏菌野生毒株ZJ0503，并將其保存于-80℃冰箱。

休眠的酵母菌為安琪酵母干粉產(chǎn)品。

海豚鏈球菌為廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室分離并保存。

2.3 試劑

leibovitz-15(L15)、卵形鯧鲹的魚血清、小牛血清、青霉素/鏈霉素(P/S)雙抗、肝素、Percoll、漢克斯緩沖鹽溶液(×10)(HBSS)、酚紅、無菌蒸餾水滅菌蒸餾水、迪夫快速染色液、無水乙醇、70％甲醇、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·2H₂O、氯化鈉、Tween 20、檸檬酸、結(jié)晶紫、甲醇、DMSO、KOH、NBT(nitroblue tetrazolium硝基藍(lán)四氮唑)、PMA((Phorbol-12-myristate-13-acetate，佛波酯)、臺盼藍(lán)染色液。

1.4 緩沖液

1.4.1 裂解緩沖液

0.1M檸檬酸，1％Tween 20，0.05％(重量/體積比)結(jié)晶紫。

1.4.2 磷酸鹽緩沖液(PBS)

0.02M磷酸鹽，0.15M氯化鈉，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2。

NaH₂PO₄.2H₂O 0.876g/L

Na₂HPO₄.2H₂O 2.56g/L

NaCl 8.77g/L

1.4.3 34％/51％Percoll

10ml的51％Percoll制備：5.1ml Percoll+1ml 10×HBSS+3.9ml蒸餾水；

10ml 34％Percoll制備：3.4ml Percoll+1ml 10×HBSS+5.6ml蒸餾水；

酚紅(0.01g/L)作為顏色指示劑加入其中一個濃度的Percoll溶液中，另一個濃度不加酚紅。

1.5 試劑制備

1.5.1 1mg/ml NBT

將10mg NBT(nitroblue tetrazolium硝基藍(lán)四氮唑)溶于10ml1×HBSS中(用前取1ml 10×HBSS加入到9ml去離子水中)。

1.5.2 1mg/ml PMA

將1mg PMA溶于1ml無水乙醇，分裝到200ul PCR管中，每管10ul，共100管，保存到-20℃冰箱。

1.5.3 NBT/PMA(1mg/ml NBT含終濃度1ug/ml PMA)

將10ul 1mg/ml PMA儲備液加入到10ml 1mg/ml NBT溶液中，需要按照實(shí)驗需要體積配置(現(xiàn)配現(xiàn)用，用前將PMA加入NBT，注意避光)。

1.5.4 KOH(2mol/L)

稱取5.6g KOH溶于50ml去離子水。

1.6 器材

滅菌離心管、自動移液器、無菌槍頭、一次性無菌吸管(移液管)、尼龍或不銹鋼細(xì)胞篩(100目)、培養(yǎng)皿(9厘米)、鑷子、手術(shù)刀片和手柄、注射器(2毫升)、注射器5毫升)、冷凍離心機(jī)、含透明區(qū)域的磨砂載玻片、蠟筆(或巴氏抹片筆)、顯微鏡蓋玻片、自動移液器、無菌槍頭、冷凍離心機(jī)、培養(yǎng)皿、血細(xì)胞計數(shù)器、細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.7 儀器設(shè)備

低溫超速離心機(jī)、電子天平、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高溫滅菌鍋、低溫冰箱、烘箱、超純水器、制冰機(jī)、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀、冰箱。

2 實(shí)驗方法

2.1 實(shí)驗方法1：卵形鯧鲹預(yù)處理實(shí)驗

卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞的分離實(shí)驗前，用一次性針筒對卵形鯧鲹進(jìn)行抽血,盡量將魚體內(nèi)的血抽盡。抽血體積為15-30mL血/Kg卵形鯧鲹體重。

抽血有助于減少巨噬細(xì)胞中紅細(xì)胞的摻雜量，特別地在進(jìn)行細(xì)菌吞噬實(shí)驗中，減少潛在的雜細(xì)胞干擾。保留魚血清，可以用于進(jìn)行細(xì)菌吞噬實(shí)驗。

抽血后，把注射器針頭去掉后，將魚血從注射器中轉(zhuǎn)入滅菌離心管，4℃放置2－4小時，3000-4000rpm離心10min，將上清吸出移新的至滅菌離心管，-20℃保存。

2.2 實(shí)驗方法2：Percoll梯度離心管的制備實(shí)驗

用10×HBSS和滅菌雙蒸水稀釋Percoll溶液至34％和51％濃度，其中一個濃度加入酚紅(0.01g/L)作為顏色指示劑，另一個濃度不加酚紅。更具體地：

10ml的51％Percoll制備：5.1ml Percoll+1ml 10×HBSS+3.9ml蒸餾水；

10ml 34％Percoll制備：3.4ml Percoll+1ml 10×HBSS+5.6ml蒸餾水；

取1.5ml離心管制備Percoll梯度離心管，加入34％Percoll。

將51％Percoll加入0.01g/L酚紅作為顏色指示劑。

再用移液槍或用一次性吸管吸取含有酚紅的51％Percoll，小心地插到離心底部(34％Percoll的下層)緩慢釋放含有酚紅的51％Percoll，形成有顏色差異的Percoll梯度(如圖1a所示)。

注意不要在這個步驟引入氣泡。34％Percoll溶液和51％Percoll溶液的加入體積與離心管大小及所需分離的巨噬細(xì)胞懸液的多少相關(guān)。34％Percoll溶液和51％Percoll溶液的體積百分比范圍分別為35-65％和35-65％。

離心管根據(jù)需要可選擇1.5ml至50ml或其他容積的離心管。

也可選擇將0.01g/L酚紅加入34％Percoll，而51％Percoll不加酚紅。

2.3 實(shí)驗方法3：卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的分離實(shí)驗

卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的分離步驟如下：

a.在超凈工作臺內(nèi)冰上解剖卵形鯧鲹，用無菌手術(shù)刀片切開胸腔，用無菌鑷子取出頭腎。

小心處理，避免破壞動物的內(nèi)臟，以減少其他細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的污染。

b.將頭腎放置在一個無菌的100目細(xì)胞篩上，網(wǎng)下放置一個裝含有20i.u./ml肝素的裝有5ml L-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。

該處細(xì)胞篩可以換為尼龍網(wǎng)。

c.將培養(yǎng)皿放置冰塊上，輕輕在細(xì)胞篩的網(wǎng)格上摩擦頭腎，使頭腎細(xì)胞落入含L-15的培養(yǎng)皿中形成細(xì)胞懸液。

為了提高產(chǎn)量，可用5-10毫升培養(yǎng)液進(jìn)一步?jīng)_洗細(xì)胞篩，將沖洗產(chǎn)物混合入細(xì)胞懸液。

d.仔細(xì)的將細(xì)胞懸液貼壁輕柔的轉(zhuǎn)移到Percoll梯度離心管的34％Percoll層(如圖1b所示)。

e.小心移動加樣完畢的離心管，于4℃，400g，離心25分鐘。

為避免造成細(xì)胞破碎，需調(diào)小離心機(jī)的升速速率為4；為了避免破壞離心后已經(jīng)形成的頭腎細(xì)胞分離層，需將離心機(jī)的減速速率調(diào)小為1。

升速速率是指離心機(jī)的離心速度從0升至目標(biāo)離心轉(zhuǎn)速(這里是400g)的速率，數(shù)值大則速度增加的快、最大值為10。減速速率反之，當(dāng)離心機(jī)從高速降到0時，需要非常慢，才能不破壞已經(jīng)形成的頭腎細(xì)胞離心層，便于后續(xù)的吸取細(xì)胞。

f.用無菌吸管小心吸取并棄去上層34％Percoll液體，再用無菌吸管吸取臨近34％Percoll/51％Percoll界面處細(xì)胞懸液層，即得到鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞。

離心后仔細(xì)觀察，在34％Percoll/51％Percoll界面附近，會有一層細(xì)胞帶，這里是富含巨噬細(xì)胞的一層(如圖1c所示)?？斓骄奘杉?xì)胞層時，可以換一根新的無菌吸管，收集這部分的細(xì)胞至新離心管中，減少其他細(xì)胞的污染。

g.加入1ml L-15到細(xì)胞懸液，然后4℃，2000rpm離心7min，棄上清。

h.取沉淀加入1ml滅菌雙蒸水輕柔沖洗細(xì)胞15-30s，4℃，2000rpm離心7min，棄上清。

可選使用雙蒸水來使血紅細(xì)胞破裂。觀察細(xì)胞沉淀，如有較多血紅細(xì)胞，則通過水的低滲作用使血紅細(xì)胞破裂從而提高巨噬細(xì)胞純度，減少紅細(xì)胞對后續(xù)使用的結(jié)果的干擾。

i.用1ml L-15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后用臺盼藍(lán)溶液染色，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。

該步驟為可選步驟，根據(jù)是否需要定量表征而確定。

2.4 實(shí)驗方法4：卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗

a.用1毫升L-15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后用血球計數(shù)板，計數(shù)細(xì)胞?；盍τ嫈?shù)用臺盼藍(lán)溶液染色后再計數(shù)，顯微鏡觀察。

b.根據(jù)計數(shù)結(jié)果用L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁷細(xì)胞/ml，用含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽(pen/strep)的無血清L-15培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。其中，雙抗pen/strep用量:每100mlL-15培養(yǎng)基中青霉素和鏈霉素各100i.u。

c.將巨噬細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞瓶，無血清L-15培養(yǎng)液中25℃培養(yǎng)2h。

實(shí)驗表明，卵形鯧鲹頭腎細(xì)胞從體內(nèi)分離出來，在體外培養(yǎng)的最初2h，細(xì)胞培養(yǎng)液中如果含小牛血清(FCS)，會抑制卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞貼壁生長。實(shí)驗過程如下：取步驟b中卵形鯧鲹頭腎細(xì)胞懸液(1×10⁷細(xì)胞/ml)各400μl，分別加樣在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的6個孔中，其中3個孔加入小牛血清至終濃度為10％(v/v),其余3個孔不加血清。25℃培養(yǎng)2h后，吸棄培養(yǎng)液，用1×HBSS沖洗細(xì)胞1-2次后，用100μl/孔胰酶消化細(xì)胞，加入300μl/孔L-15培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)。發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)組的貼壁細(xì)胞數(shù)為5.76±0.57×10⁶細(xì)胞/ml，而含10％FCS培養(yǎng)組的貼壁細(xì)胞數(shù)為2.92±0.39×10⁶細(xì)胞/ml。因此分離后在不含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，有利于卵形鯧鲹頭腎細(xì)胞貼壁，同時通過洗滌去除非貼壁的細(xì)胞，可以進(jìn)一步提高頭腎細(xì)胞的純度。

d.待頭腎巨噬細(xì)胞貼壁后，吸棄無血清L-15培養(yǎng)液，加入含10％FCS、含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的L-15培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 實(shí)驗方法5：卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌實(shí)驗

a.細(xì)菌懸液的準(zhǔn)備：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鯧鲹血清或小牛血清的L-15，使用前新鮮配置；

含20％(v/v)卵形鯧鲹血清的L-15制備鰤魚諾卡氏菌懸液，濃度為1×10⁷cfu/ml，在20℃，孵育30分鐘；用PBS洗菌2次(3000rpm，10min)；用含5％(v/v)卵形鯧鲹血清的L-15將細(xì)菌調(diào)整到2×10⁷cfu。

b.準(zhǔn)備單層貼壁巨噬細(xì)胞：使用顯微鏡載玻片，用無水乙醇洗滌載玻片，并用蠟筆在干凈的區(qū)域上畫圈，直徑約1.5cm。

蠟?zāi)茏柚挂后w溢出，將細(xì)胞懸液限定在圈內(nèi)的圓形區(qū)域。

一塊玻片上可畫2個圈，可一共準(zhǔn)備多塊玻片、多個蠟圈，以進(jìn)行樣品平行試驗和/或?qū)φ赵囼灐?/p>

c.將巨噬細(xì)胞懸液滴加在蠟圈內(nèi)的圓形區(qū)域，巨噬細(xì)胞懸液的用量為50μL，細(xì)胞濃度2×10⁶cells/ml。

d.將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中并加蓋，25℃培養(yǎng)1-2小時。

濕潤濾紙用于保持濕度。

e.巨噬細(xì)胞孵育完畢后，用25℃左右的L-15洗滌去除非貼壁細(xì)胞。

實(shí)驗過程中巨噬細(xì)胞所處的溫度要保持在25℃左右，過高的溫度會使細(xì)胞失去活性，過冷則會導(dǎo)致已貼壁細(xì)胞的脫離。

f.將準(zhǔn)備好的酵母菌懸液和鰤魚諾卡氏菌懸液分組分別加入e中準(zhǔn)備好的巨噬細(xì)胞已貼壁的圓形區(qū)域內(nèi)，以巨噬細(xì)胞：微生物細(xì)胞為1:10的比例，每個圓形區(qū)域使用50μl微生物細(xì)胞懸液，以添加5％魚血清的L-15(v/v)作為陰性對照組。

g.將載玻片放鋪有濕潤濾紙的加蓋培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)60min，讓巨噬細(xì)胞吞噬作用發(fā)生。

h.用磷酸鹽緩沖液(PBS)或L-15洗5次，除去未被吞噬的細(xì)菌。

i.用100μl 100％甲醇固定5min，用70％甲醇沖洗5次。

j.用迪夫快速染色液染色后，空氣干燥，滴加封片劑后用蓋玻片封片。

k.油鏡下觀察，隨機(jī)選擇100-200個巨噬細(xì)胞計數(shù)吞噬細(xì)菌的情況。

3.實(shí)驗

3.1 實(shí)驗1：鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離實(shí)驗

圖1為鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離效果圖，其中a為通過實(shí)驗方法2制備的Percoll梯度離心管，其中上層透明液體為34％Percoll，下層紅色液體為51％Percoll；b和c顯示了通過實(shí)驗方法2的鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離過程和結(jié)果情況，其中b顯示了將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Percoll梯度離心管中34％/51％Percoll梯度buffer的上層；c顯示了離心后的結(jié)果，箭頭所指是離心后位于Percoll梯度離心管中34％/51％Percoll梯度界面的巨噬細(xì)胞。

從上圖可見看到，通過本申請的實(shí)驗方法，可以有效地使目的產(chǎn)物鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞聚集到34％/51％Percoll梯度界面，且肉眼可見聚集的鲹頭腎巨噬。因此，本發(fā)明的方法可以有效地提取鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞。

3.2 實(shí)驗2：抽血對卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離的影響

在進(jìn)行卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離前，對魚體進(jìn)行抽血，會大幅減少分離細(xì)胞中夾雜的血紅細(xì)胞數(shù)量。結(jié)合實(shí)驗方法1、2、3，所得分離細(xì)胞培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在Leica顯微鏡下觀察血紅細(xì)胞數(shù)量并拍照，以進(jìn)行抽血對卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞分離的影響的驗證性實(shí)驗，結(jié)果如圖2所示。

圖a為結(jié)合實(shí)驗方法2、3，即未抽血，直接進(jìn)行頭腎巨噬細(xì)胞分離所得的細(xì)胞懸液的顯微圖像，其中含有大量的呈橢圓形的血紅細(xì)胞(如箭頭所示)；圖b結(jié)合實(shí)驗方法1、2、3的實(shí)驗結(jié)果，為先抽血，然后在進(jìn)行巨噬細(xì)胞分離所得到的細(xì)胞懸液，其中所含的血紅細(xì)胞數(shù)量大幅減少。

由此可見，實(shí)驗方法1所述的卵形鯧鲹預(yù)處理后卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞純度更高，減少血細(xì)胞的干擾，更有利于鯧鲹巨噬細(xì)胞的純化、活性測定與表征。

3.3 實(shí)驗3：卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞一周的存活情況實(shí)驗

使用實(shí)驗方法3所分離到的卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗方法4的步驟，將分離到的卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞在含10％FCS、鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的L-15培養(yǎng)液中，于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)25℃貼壁培養(yǎng)一周，每天取3個孔的頭腎巨噬細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入L-15培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液經(jīng)臺盼藍(lán)染色液(終濃度0.2％)后，取10μl染色后的細(xì)胞懸液滴加在血球計數(shù)板上進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，染色后3分鐘內(nèi)完成計數(shù)。結(jié)果參見圖3和圖4。

根據(jù)活細(xì)胞不會被臺盼藍(lán)染色、而死細(xì)胞會被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色來判斷細(xì)胞的存活狀態(tài)。如圖3所示，其中1-7分別為培養(yǎng)第1-7天的卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞存活情況。8和9分別為活細(xì)胞和死細(xì)胞在臺盼藍(lán)染色下的染色情況示意圖，活細(xì)胞透明，而死細(xì)胞被染為藍(lán)色。在光鏡下可以發(fā)現(xiàn)染成藍(lán)色的細(xì)胞隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多。

這說明通過本實(shí)驗的方法，能夠檢測到卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，成活率在下降。

通過更大視野中統(tǒng)計存活與死亡的細(xì)胞，計數(shù)分析結(jié)果表明卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞的存活率在培養(yǎng)后第1天急劇下降至約50％，之后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，到第7天存活率為10-20％，卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞存活率隨時間變化情況如圖3所示。

活細(xì)胞不會被臺盼藍(lán)染色，而第一天存活率為百分之百，也說明本發(fā)明的方法分離培養(yǎng)的卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞純度很高。

兩條魚分離出的卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的存活曲線極其接近，這也說明本發(fā)明的方法的可重復(fù)性較好。

3.4 實(shí)驗4：卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗

實(shí)驗方法3所獲得的卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞，涂抹載玻片，在100×的油鏡下，可觀察到卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞呈橢圓形，形狀不一，被染成偏紫紅色，其平均長度在5μm左右，如圖5所示。

而被巨噬細(xì)胞吸附或吞噬的酵母菌和鰤魚諾卡氏菌則被染成較深的藍(lán)色(如圖6、圖7所示)。

圖6顯示了按照實(shí)驗方法5所示的卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬酵母情況的結(jié)果，其中1為酵母吸附在巨噬細(xì)胞上，但未被吞噬進(jìn)巨噬細(xì)胞；2為巨噬細(xì)胞吞噬1個酵母；3和4為巨噬細(xì)胞吞噬了兩個酵母進(jìn)細(xì)胞內(nèi)；5和6分別為巨噬細(xì)胞吞噬3個酵母和4個酵母的情況，7-9為較大視野下觀察巨噬細(xì)胞吞噬酵母的情況,圖中展示了多個染色偏紫紅色的巨噬細(xì)胞，深藍(lán)色呈橢圓形的是酵母，圖中的巨噬細(xì)胞有的吞噬了1-2個酵母，有的尚未發(fā)生吞噬作用。

由圖6可看出，酵母菌的體積比較大，其直徑約為3μm，其體積差不多為卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞的大小的1/4。因此每個巨噬細(xì)胞能吞噬的酵母菌個數(shù)并不多，大多數(shù)的巨噬細(xì)胞只能吞噬1-2個酵母菌，偶爾可看到吞噬3個及以上個數(shù)的酵母菌的巨噬細(xì)胞，而且從顯微鏡下可看出吞噬超過3個酵母菌的巨噬細(xì)胞常被撐破，造成細(xì)胞形態(tài)不完整。

圖7顯示了按照實(shí)驗方法5所示的卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬鰤魚諾卡氏細(xì)菌情況的結(jié)果，其中1為2個鰤魚諾卡氏細(xì)菌吸附在卵形鯧鲹的巨噬細(xì)胞表面，但未被吞噬的情況；2和3都為巨噬細(xì)胞吞噬1個鰤魚諾卡氏細(xì)菌的情況；4和5分別為巨噬細(xì)胞吞噬2個和3個鰤魚諾卡氏細(xì)菌的情況；6和7為巨噬細(xì)胞吞噬了4個鰤魚諾卡氏細(xì)菌的情況；8則為巨噬細(xì)胞吞噬了6個鰤魚諾卡氏細(xì)菌的情況；9-10為較大視野下觀察的巨噬細(xì)胞吞噬了鰤魚諾卡氏細(xì)菌的情況，圖中展示了多個巨噬細(xì)胞，深藍(lán)色呈點(diǎn)狀的是鰤魚諾卡氏菌，圖中的多個巨噬細(xì)胞發(fā)生了吞噬作用，巨噬細(xì)胞內(nèi)有數(shù)量不等的鰤魚諾卡氏菌。

由圖7可看出，盡管大多數(shù)的卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬了1-2個鰤魚諾卡氏菌，但由于諾鰤魚卡氏細(xì)菌體積相對較小，因而一個卵形鯧鲹的巨噬細(xì)胞吞噬3個及以上鰤魚諾卡氏細(xì)菌的情況增多，觀察到的最多的能吞噬6個鰤魚諾卡氏細(xì)菌。在視野中還能看到許多尚未被吞噬，但是已經(jīng)被吸附在巨噬細(xì)胞表面的鰤魚諾卡氏菌。

對鰤魚諾卡氏細(xì)菌與酵母吞噬的載玻片的結(jié)果，各自隨機(jī)選取100個巨噬細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(如表1、表2所示)，根據(jù)吞噬指數(shù)和吞噬容量的公式進(jìn)行計算：

吞噬指數(shù)(Phagocytic Index，PI)＝吞噬的細(xì)菌總數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100

吞噬容量(Phagocytic Capacity，PC)＝吞噬的細(xì)菌總數(shù)/發(fā)生吞噬的巨噬細(xì)胞數(shù)×100

結(jié)果表明(如表3所示)，卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞對酵母的吞噬指數(shù)(PI)為60，對鰤魚諾卡氏菌的吞噬指數(shù)為86，即在相同的條件下，相同數(shù)目的卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞，吞噬鰤魚諾卡氏細(xì)菌的數(shù)目比吞噬酵母的數(shù)目多。同樣，卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞對酵母的吞噬容量(PC)為153，對鰤魚諾卡氏菌的吞噬容量為183，即卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞對鰤魚諾卡氏菌的吞噬容量比酵母高。

表1.酵母被卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬的情況

表2 鰤魚諾卡氏菌被卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬的情況

表3.卵形鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬鰤魚諾卡氏細(xì)菌和酵母的比較

3.5 實(shí)驗5：卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗

海豚鏈球菌為鏈球?qū)偌?xì)菌，無芽胞，無鞭毛，革蘭氏染色陽性，是兼性胞內(nèi)菌，可感染卵形鯧鲹。卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞也可用于海豚鏈球菌的吞噬、吸附研究。實(shí)驗過程中，取海豚鏈球菌培養(yǎng)物，離心收集菌體、并用PBS清洗菌沉淀后，用含20％(v/v)卵形鯧鲹血清的L-15制備海豚鏈球菌懸液，濃度為1×10⁷cfu/ml。其他實(shí)驗方法同2.5實(shí)驗方法5。

圖8示出了卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞海豚鏈球菌情況的圖像。由圖可見海豚鏈球菌呈球形或卵圓形，直徑0.6-1.0μm，呈鏈狀排列，短者4-8個細(xì)菌組成，長者有20-30個細(xì)菌組成。圖中所示呈鏈狀的海豚鏈球菌有些緊貼在巨噬細(xì)胞上，說明海豚鏈球菌可被卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞有效吸附；有些鏈狀海豚鏈球菌的一部分已經(jīng)被吞噬進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗證明海豚鏈球菌可被分離所得卵形鯧鲹頭腎巨噬細(xì)胞有效吸附及吞噬。因此可用于海豚鏈球菌逃避巨噬細(xì)胞殺滅并在胞內(nèi)生存機(jī)制的研究，也可用于比較不同菌株的特征差異，如比較特定缺失株與野生株，在巨噬細(xì)胞吸附、吞噬、吞噬后菌細(xì)胞存活率等方面的研究。

從實(shí)驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明中用于表征鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬微生物的方法可以有效地表征鯧鲹巨噬細(xì)胞吞噬微生物的細(xì)節(jié)，這對進(jìn)一步研究鯧鲹巨噬細(xì)胞殺傷病原菌的機(jī)制、胞內(nèi)菌逃避巨噬細(xì)胞殺滅并在胞內(nèi)生存的機(jī)制等奠定基礎(chǔ)。對從細(xì)胞水平研究鯧鲹的抗病、致病機(jī)理具有重要意義。

以上各個實(shí)施例只是用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不是用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是基于本發(fā)明的構(gòu)思所作出的等同變換及對本發(fā)明的各個技術(shù)方案顯而易見的改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。