1.一種用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,所述鯧鲹巨噬細胞吞噬所述微生物是通過下面步驟進行的:
1).用無水乙醇洗滌顯微鏡載玻片,并用蠟筆在所述顯微鏡的干凈的區(qū)域上圈畫圓形區(qū)域,所述圓形區(qū)域的直徑為1.5cm;
2).將鯧鲹巨噬細胞懸液滴加在所述圓形區(qū)域,所述鯧鯵巨噬細胞懸液的用量為50μl,所述鯧鲹巨噬細胞濃度為2×106細胞/ml;
3).將所述載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中并加蓋,25oC條件下培養(yǎng)1-2小時;
4).所述鯧鲹巨噬細胞孵育完畢后,用25oC左右的L-15洗滌所述載玻片;
5).將50μl微生物細胞懸液加入所述圓形區(qū)域,巨噬細胞:微生物細胞為1:10的比例;
6).將所述載玻片放鋪有濕潤濾紙的加蓋培養(yǎng)皿中,25℃培養(yǎng)60min;
7).用磷酸鹽緩沖液或L-15洗所述載玻片5次;
8).用100μl 100%甲醇固定所述載玻片上的所有細胞5min,用70%甲醇沖洗所述載玻片5次;
9).用迪夫快速染色液染色所述載玻片后,空氣干燥,滴加封片劑后用蓋玻片封片;
10).用油鏡觀察計數(shù)所述鯧鲹巨噬細胞吞噬所述微生物細胞的情況。
2.如權利要求1所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,
所述微生物細胞為鰤魚諾卡氏菌細胞,步驟5)中用含20%(v/v)鯧鲹血清的L-15制備鰤魚諾卡氏菌懸液,濃度為1×107cfu/ml,在20℃,孵育30分鐘;用PBS洗菌2次,3000rpm,10min;用含5%(v/v)卵形鯧鲹血清的L-15將所述鰤魚諾卡氏菌懸液濃度調(diào)整到2×107cfu/ml。
3.如權利要求1所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,
所述微生物細胞為酵母菌細胞,步驟5)中酵母懸液的制備方法為:酵母干粉按0.5%(w/v)溶解于含20%(v/v)卵形鯧鲹血清或小牛血清的L-15。
4.如權利要求1所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,所述鯧鲹巨噬細胞是按照下面的步驟制備的:
a.解剖鯧鲹,取出頭腎;
b.將所述頭腎放置在一個無菌的100目細胞篩上,該細胞篩下放置一個裝含有20i.u./ml肝素的裝有5ml L-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿;
c.將所述培養(yǎng)皿放置冰塊上,在所述細胞篩的網(wǎng)格上摩擦所述頭腎,使所述頭腎細胞落入所述含L-15的培養(yǎng)皿中形成鯧鯵細胞懸液;
d.將細胞懸液貼壁輕柔的轉(zhuǎn)移到Percoll梯度離心管的34%Percoll層之上;
e.移動加樣完畢的所述Percoll梯度離心管,于4℃,400g,離心25分鐘;
f.用無菌吸管小心吸取并棄去所述Percoll梯度離心管的上層34%Percoll液體,再用無菌吸管吸取臨近34%Percoll/51%Percoll界面處的細胞懸液層,即得到鯧鲹頭腎巨噬細胞;
g.加入1ml L-15到所述鯧鲹頭腎巨噬細胞懸液,然后在4℃,2000rpm條件下離心7min,棄上清;
h.取沉淀加入1ml滅菌雙蒸水沖洗所述鯧鲹頭腎巨噬細胞15-30s,4℃,2000rpm離心7min,棄上清。
5.如權利要求4所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,
在進行步驟h后,用1ml-15培養(yǎng)基重懸所述鯧鲹頭腎巨噬細胞,用臺盼藍溶液染色,用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。
6.如權利要求4所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,
在進行步驟a之前,用針筒對所述鯧鲹進行抽血,抽血體積為15-30mL血/Kg鯧鲹體重。
7.如權利要求4所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,所述Percoll梯度離心管是按照下面步驟制備的:
i.用10×HBSS和滅菌雙蒸水稀釋Percoll溶液至34%濃度的34%Percoll;
ii.用10×HBSS和滅菌雙蒸水稀釋Percoll溶液至51%濃度的51%Percoll;將51%Percoll加入0.01g/L酚紅,或?qū)?4%Percoll加入0.01g/L酚紅;
iii.取離心管,加入34%Percoll;
iv.用吸管將51%Percoll緩慢注入所述離心管的34%Percoll的底部;
其中,所述34%Percoll溶液和所述51%Percoll溶液的體積百分比范圍分別為35-65%和35-65%。
8.如權利要求4所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法,其特征在于,
步驟h所獲得的所述鯧鲹巨噬細胞進行如下步驟的培養(yǎng):
A.用L-15培養(yǎng)基重懸所述鯧鲹巨噬細胞沉淀形成巨噬細胞懸液后用血球計數(shù)板,顯微鏡觀察,計數(shù)所述鯧鲹巨噬細胞;
B.根據(jù)鯧鲹巨噬細胞計數(shù)結(jié)果用L-15培養(yǎng)基調(diào)整所述鯧鲹巨噬細胞濃度為1×107細胞/ml,用含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的無血清L-15培養(yǎng)液進行稀釋,其中鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽用量:每100mlL-15培養(yǎng)基中青霉素和鏈霉素各100i.u;
C.將所述巨噬細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)板或細胞瓶,無血清L-15培養(yǎng)液中25℃培養(yǎng)2h;
D.待頭所述腎巨噬細胞貼壁后,吸棄無血清L-15培養(yǎng)液,加入含10%小牛血清、含鉀青霉素/鏈霉素硫酸鹽的L-15培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
9.如權利要求1-8中任一項所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法在檢測鯧鲹巨噬細胞濃度或數(shù)量中的應用。
10.如權利要求1-8中任一項所述的用于表征鯧鲹巨噬細胞吞噬微生物的方法在研究鯧鲹巨噬細胞與微生物細胞相互作用中的應用。