專(zhuān)利名稱(chēng)：一種測(cè)定吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌殺傷活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體內(nèi)容是檢測(cè)吞噬細(xì) 胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷活性的方法。
背景技術(shù)：
由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的結(jié)核病，目前仍 是發(fā)病率和病死率最高的傳染病之一。然而迄今為止，關(guān)于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，特別是機(jī)體 對(duì)Mtb感染的免疫機(jī)制并未完全闡明。近年來(lái)已有許多學(xué)者探討天然免疫在抗Mtb感染中 的作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞(PMN)這一具有天然免疫作用的細(xì)胞可能與抗Mtb 感染的免疫保護(hù)作用密切相關(guān)，但有關(guān)PMN與抗Mtb感染的免疫保護(hù)作用并未得到一致意 見(jiàn)，以及PMN對(duì)Mtb的確切作用機(jī)制尚未明確。因此，探討PMN在抗Mtb感染的天然免疫中 的作用，闡明其能否通過(guò)激活殺菌機(jī)制殺傷Mtb，是解決PMN是否參與抗結(jié)核感染保護(hù)性免 疫的關(guān)鍵問(wèn)題，對(duì)于全面了解機(jī)體抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)機(jī)制，具有重要的理論意義和臨 床實(shí)用價(jià)值。傳統(tǒng)檢測(cè)吞噬細(xì)胞殺傷Mtb功能的方法，是將吞噬Mtb的吞噬細(xì)胞裂解后，接種在 培養(yǎng)Mtb的培養(yǎng)基(如蘇通培養(yǎng)基)培養(yǎng)2至3周或更長(zhǎng)時(shí)間后檢查和計(jì)數(shù)Mtb菌落數(shù)，與 對(duì)照對(duì)比計(jì)算出殺傷率。傳統(tǒng)方法操作繁瑣，周期較長(zhǎng)，影響因素較多。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外專(zhuān)利 文獻(xiàn)和各種出版物，迄今為止，未見(jiàn)有快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)Mtb殺傷活性方法的發(fā) 明和報(bào)道。因此，發(fā)明一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)吞噬細(xì)胞殺傷Mtb的方法，用于探討PMN 在結(jié)核桿菌感染中發(fā)揮的非特異性免疫殺傷功能，以闡述PMN在抗結(jié)核感染免疫中的確切 的保護(hù)性作用機(jī)制是非常重要的，對(duì)于闡明人類(lèi)抗結(jié)核的免疫機(jī)制以達(dá)到控制結(jié)核病的發(fā) 生和發(fā)展，也都具有十分重要的學(xué)術(shù)探討意義和臨床實(shí)際價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明目的在于提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)Mtb的殺傷功能 的方法。本發(fā)明的方法是利用熒光染料標(biāo)記Mtb被吞噬細(xì)胞殺傷后熒光強(qiáng)度明顯降低的原 理，設(shè)計(jì)了應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬細(xì)胞殺傷Mtb活性的方法，具體包括以下主要步驟(I)Mtb體外培養(yǎng)擴(kuò)增后用活細(xì)胞熒光染料標(biāo)記，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記率。(2)熒光染料標(biāo)記Mtb與吞噬細(xì)胞置于37°C共同孵育，數(shù)分鐘至幾十分鐘，或幾個(gè) 小時(shí)(因不同吞噬細(xì)胞類(lèi)型而有所不同)后，離心洗滌除去未被吞噬的結(jié)核桿菌。(3)將吞噬了熒光染料標(biāo)記Mtb的吞噬細(xì)胞置于37°C孵育1至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí) 間后，裂解吞噬細(xì)胞，釋放被出Mtb。同時(shí)設(shè)立置于0°C孵育相同時(shí)間的對(duì)照組。(4)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光陰性和陽(yáng)性Mtb比率，或Mtb熒光的強(qiáng)度，計(jì)算吞噬細(xì) 胞對(duì)Mtb的殺傷率。2.本發(fā)明所涉及Mtb，主要是(但不僅限于)人型結(jié)核桿菌。體外培養(yǎng)擴(kuò)增的方
4法可以采用通常培養(yǎng)Mtb的培養(yǎng)基，可以是固體培養(yǎng)基如羅氏培養(yǎng)基，或液體培養(yǎng)基如蘇 通氏培養(yǎng)基，通常需要培養(yǎng)1至2周或更長(zhǎng)時(shí)間。收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Mtb，用于熒光染 料標(biāo)記以及后續(xù)的吞噬殺傷實(shí)驗(yàn)。3.本發(fā)明的方法所涉及的用于標(biāo)記Mtb的熒光染料，是活細(xì)胞熒光染料，例如(但 不僅限于)(1)熒光素二醋酸酯(Fluorescein Diacetate, FDA)，是一種非熒光的酯酶底物， 經(jīng)活細(xì)胞吸收后，被細(xì)胞內(nèi)普遍存在的酯酶水解成帶電荷的熒光素，呈較強(qiáng)的綠色熒光，并 能保留在細(xì)胞內(nèi)；被細(xì)胞殺傷后(包括凋亡及壞死)，熒光強(qiáng)度明顯降低或消失。FDA標(biāo)記 的終濃度范圍為0. 01 μ g/ml至5 μ g/ml (或0. 02 μ mol/L至10 μ mol/L)，合適的標(biāo)記終濃 度為 0. 1 μ g/ml 至 0· 5 μ g/ml (或 0· 2 μ mol/L 至 1· 0 μ mol/L)。0)2，7雙O羧乙酸)5(和6)羧基熒光素乙酰甲酯[2' ,7' -bis-(2-carboxyeth yl) -5- (and-6) -carboxyf luorescein, acetoxymethyl ester (BCECF-AM)]，也是類(lèi)似于 FDA 的活細(xì)胞非熒光的酶底物，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后即被胞內(nèi)的酶水解為有熒光的產(chǎn)物(BCECF)，在細(xì) 胞內(nèi)比FDA更能穩(wěn)定的保留。被細(xì)胞殺傷后，熒光強(qiáng)度也明顯降低。BCECF的標(biāo)記終濃度為 0. 02 μ g/ml M 10 μ g/ml (或 0. 05 μ mol/L 至 20 μ mol/L)，合適的標(biāo)記終濃度為 0. 2 μ g/ml 至 1· 0 μ g/ml (或 0· 5 μ mol/L 至 2· 0 μ mol/L)。上述熒光染料標(biāo)記Mtb時(shí)，熒光染料與Mtb共同孵育的溫度可在4°C至37°C，時(shí)間 為5至60分鐘，合適溫度是37°C，時(shí)間是20至30分鐘。4.在本發(fā)明的方法中，檢測(cè)熒光染料對(duì)Mtb標(biāo)記的效率的方法采用流式細(xì)胞儀檢 測(cè)，具體的檢測(cè)方法在流式細(xì)胞儀的檢測(cè)圖中先以前散射光和側(cè)散射光(均設(shè)定為L(zhǎng)og)作 二維點(diǎn)圖，圈定Mtb區(qū)域，然后再在有第1熒光通道(FLl)的二維點(diǎn)圖(如FLI對(duì)SSC，或 FLI對(duì)FL2)中，以Mtb區(qū)域設(shè)門(mén)，檢測(cè)FLI熒光陽(yáng)性的Mtb比例，達(dá)到90%或以上者作為熒 光標(biāo)記Mtb的合適樣品，用于后續(xù)的吞噬細(xì)胞吞噬和殺傷Mtb的樣本。具體的操作方法參 考實(shí)施例1，Mtb熒光標(biāo)記率的檢測(cè)結(jié)果可以參見(jiàn)附圖1。5.在本發(fā)明的方法中，吞噬細(xì)胞的標(biāo)本來(lái)源包括(但不僅限于)人和各種動(dòng)物血 液標(biāo)本，或從血液標(biāo)本和淋巴器官組織及其他器官組織分離獲得的含有吞噬細(xì)胞的樣品， 或者是體外培養(yǎng)的具有吞噬活性的細(xì)胞系，如THP-I細(xì)胞等。6.在本發(fā)明的方法中，檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)Mtb的殺傷活性實(shí)驗(yàn)步驟包括(1)首先是吞噬細(xì)胞吞噬Mtb，可將吞噬細(xì)胞標(biāo)本與熒光染料標(biāo)記的Mtb在37°C共 同孵育數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘，或更長(zhǎng)時(shí)間。孵育時(shí)間因不同吞噬細(xì)胞的類(lèi)型而有所不同，就中 性粒細(xì)胞吞噬Mtb而言，合適的吞噬(即共同孵育)時(shí)間是5至20分鐘。(2)其次是離心洗滌吞噬Mtb的吞噬細(xì)胞，以除去游離的即未被吞噬的熒光染料 標(biāo)記的Mtb。離心的速率和時(shí)間以能沉淀細(xì)胞而不沉淀Mtb為原則，通常是離心500至 2000r/min, 5至20分鐘。合適的離心速率是1000至1800r/min,時(shí)間是5至10分鐘。細(xì)胞 樣本離心后，棄上清(含有未被吞噬的游離的Mtb)后，再加緩沖液(如PBS)重復(fù)離心洗滌 1次，再棄上清，即可除去未被吞噬的熒光染料標(biāo)記的Mtb。如果吞噬細(xì)胞樣本是全血標(biāo)本， 則在離心洗滌前，先用溶血?jiǎng)?如0. 83%氯化銨溶液)，加入全血標(biāo)本，溶血除去紅細(xì)胞。(3)最后是將除去游離Mtb的吞噬細(xì)胞樣本置于37°C孵育0分鐘(可作為對(duì)照 組)至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，其孵育時(shí)間根據(jù)不同吞噬細(xì)胞類(lèi)型而異，就中性粒細(xì)胞而言，合適的孵育時(shí)間是10至60分鐘。另外也可將吞噬了熒光染料標(biāo)記Mtb的吞噬細(xì)胞置于0°C 孵育，孵育時(shí)間與在37°C孵育相同，也可作為對(duì)照組。通常隨著吞噬Mtb的吞噬細(xì)胞在37°C 孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，殺傷活性(即殺傷率)逐漸增加。7.在本發(fā)明的方法中，對(duì)吞噬Mtb的吞噬細(xì)胞裂解后，釋放出被吞噬細(xì)胞吞噬和 沙上的的結(jié)核分枝桿菌，其裂解吞噬細(xì)胞的方法的原則是采用(但不僅限于)低滲和溶解 細(xì)胞膜等方法，例如(但不僅限于)(1)用2至10倍體積的蒸餾水處理1至10分鐘，合適的體積是4至5倍，合適的 時(shí)間是2至3分鐘。(2)先加2至10倍體積的1 %去氧膽酸鈉，作用3至5分鐘后，再加2至4倍體積 的蒸餾水作用2至5分鐘，即可裂解吞噬細(xì)胞釋放出Mtb，用于流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。8.在本發(fā)明中，對(duì)吞噬細(xì)胞裂解后釋放出來(lái)的Mtb是否被殺傷的檢測(cè)方法，是用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記Mtb的熒光強(qiáng)度的減少作為Mtb被殺傷的指標(biāo)。在設(shè)定熒光陰性 和熒光界限的基礎(chǔ)上，將熒光陰性的Mtb作為被殺傷的Mtb。檢測(cè)和計(jì)算熒光陰性和陽(yáng)性 的Mtb的數(shù)量和比率，計(jì)算吞噬細(xì)胞的對(duì)Mtb的殺傷活性。并以37°C孵育0分鐘，或者0°C 孵育相同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)樣本作為對(duì)照組。另外也可以檢測(cè)殺傷組(即在37°C孵育不同時(shí)間) 和對(duì)照組(在37°C孵育0分鐘，或者0°C孵育不同時(shí)間)的Mtb的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的 不同，計(jì)算吞噬細(xì)胞對(duì)Mtb的殺傷活性。9.在本發(fā)明中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)Mtb的殺傷活性(或殺傷率)的計(jì) 算有以下2種方法和公式(1)檢測(cè)熒光陰性和熒光陽(yáng)性Mtb的比例，按以下公式計(jì)算
吞嚼細(xì)胞對(duì)-殺傷率=突■性=+;_—。(2)測(cè)定殺傷組(在37°C孵育)和對(duì)照組(在0°C孵育)Mtb的平均熒光強(qiáng)度 (MFI)，按以下公式計(jì)算
吞噬細(xì)胞對(duì)Mtb殺傷率=對(duì)薩Mt=H(gMt_F) x 1QQ%10.本發(fā)明檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷功能的方法的優(yōu)點(diǎn)在于(1)所需實(shí)驗(yàn)樣本少，操作便捷，客觀性和重復(fù)性好；(2)能在很短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷活性；(3)本發(fā)明方法適用檢測(cè)人群和各種動(dòng)物的不同類(lèi)型吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的 殺傷活性。11.本發(fā)明提出一種利用熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺 傷功能的技術(shù)方法，為免疫研究領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究人員探討吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷活性 及其調(diào)節(jié)功能和機(jī)制的研究提供了新的技術(shù)手段，在研究機(jī)體天然免疫細(xì)胞對(duì)抗結(jié)核感染 免疫保護(hù)機(jī)制中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


。圖1.流式細(xì)胞儀對(duì)FDA標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)記率檢測(cè)圖。結(jié)核分枝桿菌與熒光染料FDA(熒光素二醋酸酯)在37°C共同孵育25分鐘后，加 PBS，離心洗滌2次后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，左圖為未標(biāo)記的結(jié)核桿菌；右圖為標(biāo)記FDA的 結(jié)核桿菌。圖2.人外周血中性粒細(xì)胞與FDA標(biāo)記結(jié)核桿菌孵育不同時(shí)間對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷 活性。A圖為人外周血中性粒細(xì)胞不同時(shí)間殺傷FDA標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌殺傷率流式分析 圖。B圖為多次實(shí)驗(yàn)(n = 9)的人外周血中性粒細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷活性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果示 意圖。圖3，人外周血分離的中性粒細(xì)胞對(duì)BCECF 0，7雙Q羧乙酸)5(和6)羧基熒光素 乙酰甲酯)標(biāo)記的結(jié)核桿菌的殺傷活性。從人外周血中分離獲取純化的中性粒細(xì)胞，與BCECF-AMQ，7雙Q羧乙酸)5(和 6)羧基熒光素乙酰甲酯)標(biāo)記的結(jié)核桿菌共同孵育后，離心洗滌除去未被吞噬的結(jié)核桿 菌，然后在37°C共同孵育不同時(shí)間，同時(shí)設(shè)立置于0°C孵育不同時(shí)間的對(duì)照組，用去氧膽酸 鈉和蒸餾水裂解中性粒細(xì)胞后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。A圖為典型的流式細(xì)胞儀分析圖，B 圖為多次實(shí)驗(yàn)(n = 5)的流式檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，以下實(shí)施例是以檢測(cè)以中性 粒細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷活性，但并非限制本發(fā)明的方法僅限于對(duì)中性粒細(xì)胞的殺傷結(jié)核 桿菌的活性的檢測(cè)。實(shí)施例1本實(shí)施例1包括以下步驟1.結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)將H37Ra菌株接種于羅琴氏固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)1個(gè) 月，收集菌體于Iml EP管，加入生理鹽水研磨，取細(xì)菌懸液，加入生理鹽水洗滌3次，離心 10000r/min，2min，抗酸染色陽(yáng)性且鏡下觀察細(xì)菌分散。分光光度計(jì)檢測(cè)菌液濃度，用生理 鹽水配成濃度為5 X 108/ml的M. tb懸液，4°C備用。2.熒光染料標(biāo)記結(jié)核桿菌和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Mtb熒光標(biāo)記率取5 X 108/ml未 標(biāo)記M. tb菌液30 μ 1，加入DMSO配制的FDA溶液(1 μ g/ml) 4 μ 1，然后置37°C 30min后， 離心10000r/min，2min，棄上清，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)M. tb的FDA標(biāo)記率時(shí)，先 設(shè)定FSC為EOl和Log，設(shè)定SSC為L(zhǎng)og，然后在FSC/SSC 二維點(diǎn)陣圖上檢測(cè)Mtb，選取M. tb 區(qū)域?yàn)镽1，然后在SSC(Log)和FLl (FITC) 二維點(diǎn)陣圖上以M. tb區(qū)域(Rl)設(shè)門(mén)，檢測(cè)FDA 標(biāo)記率，此即M. tb存活率。3.實(shí)施結(jié)果根據(jù)上述實(shí)施方法，Mtb與FDA溶液(終濃度0.11 μ g/ml)在 37°C 30min作用后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到FDA對(duì)結(jié)核桿菌的標(biāo)記率為96%，也表示結(jié)核桿菌 的存活率為96%。結(jié)果見(jiàn)附圖1。實(shí)施例21.人外周血PMN對(duì)FDA標(biāo)記M. tb的殺傷實(shí)驗(yàn)取健康成人新鮮抗凝全血加入流
7式管，30 μ 1/管，置冰上lOmin，然后加入5 X 108/ml FDA標(biāo)記的M. tb菌液30 μ 1/管，混勻， 置37°C水浴，20min后迅速取出，加冰冷的PBS洗滌兩次，棄上清，加入氯化銨溶血?jiǎng)?3ml， 放置15min，離心，棄上清，冰冷的PBS洗滌一次，棄上清，加入自體血清，10 μ 1/管，然后置 37°C水浴，0 60min后，立即加入冰冷三蒸水，200 μ 1/管，孵育2min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 同時(shí)設(shè)定全血加入未標(biāo)記細(xì)菌組(空白對(duì)照)和0°C各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組。2.流式細(xì)胞術(shù)對(duì)人外周血PMN殺傷FDA標(biāo)記M. tb的檢測(cè)方法用流式細(xì)胞儀檢 測(cè)PMN殺傷M. tb活性時(shí)，先設(shè)定FSC為EOl禾口 Log,設(shè)定SSC為L(zhǎng)og,然后在FSC/SSC二維點(diǎn)陣圖上檢測(cè)Μ. tb，選取Μ. tb區(qū)域?yàn)镽l，然后在SSC(Log)和 FLl (FDA) 二維點(diǎn)陣圖上以M. tb區(qū)域(Rl)設(shè)門(mén)，檢測(cè)M. tb的FDA陽(yáng)性率和陰和FLl (FDA) 二維點(diǎn)陣圖上以Mtb區(qū)域(Rl)設(shè)門(mén)，檢測(cè)Mtb的FDA陽(yáng)性率和陰性率，PMN對(duì)Mtb殺傷率 計(jì)算公式如下殺傷率=FDA陰性率/ (FDA陽(yáng)性率+FDA陰性率)X 100%。3.結(jié)果PMN與FDA標(biāo)記的Mtb先37°C孵育20min，然后置37°C水浴10 60min 后，結(jié)果顯示，PMN對(duì)Mtb的殺傷率0°C時(shí)10 60min無(wú)顯著差異，在23. 23%至31. 46% ； 37°C時(shí)IOmin殺傷率30. 06%，隨時(shí)間延長(zhǎng)，60min殺傷率達(dá)到56. 43%，表明PMN對(duì)Mtb的 殺傷活性隨時(shí)間增加逐漸增強(qiáng)。附圖2的A圖為流式分析圖，B圖為多次(n = 9)實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。實(shí)施例31.從人外周血分離中心粒細(xì)胞的方法健康成人外周血經(jīng)右旋糖酐沉淀后再經(jīng) 密度梯度離心法分離外周血中性粒細(xì)胞。2.分離的中心粒細(xì)胞對(duì)BCECF標(biāo)記Mtb的殺傷實(shí)驗(yàn)取健康成人新鮮抗凝全血加 入流式管，30 μ 1/管，置冰上lOmin，然后加入5 X 108/ml BCECF標(biāo)記的Mtb菌液30 μ 1/管， 混勻，置37°C水浴，7min后迅速取出，加冰冷的PBS洗滌兩次，棄上清，加入氯化銨溶血?jiǎng)?:3ml，放置15min，離心，棄上清，冰冷的PBS洗滌一次，棄上清，加入自體血清，10 μ 1/管，然 后置37°C水浴，0 60min后，立即加5倍體積的去氧膽酸鈉，作用3分鐘后，再加3倍 體積的蒸餾水作用5分鐘，裂解PMN釋放出Mtb，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)設(shè)定全血加入未 標(biāo)記細(xì)菌組(空白對(duì)照)和0°C各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組。2.流式細(xì)胞術(shù)對(duì)人外周血分離PMN殺傷BCECF標(biāo)記Mtb的檢測(cè)方法用流式細(xì)胞 儀檢測(cè)PMN殺傷Mtb活性時(shí)，先設(shè)定FSC為EOl和Log，設(shè)定SSC為L(zhǎng)og，然后在FSC/SSC 二 維點(diǎn)陣圖上檢測(cè)Mtb，選取Mtb區(qū)域?yàn)镽l，然后在SSC(Log)和FLl (BCECF) 二維點(diǎn)陣圖上以 Mtb區(qū)域(Rl)設(shè)門(mén)，檢測(cè)Mtb的BCECF陽(yáng)性率和陰性率，PMN對(duì)Mtb殺傷率計(jì)算公式如下 殺傷率=BCECF陰性率/ (BCECF陽(yáng)性率+BCECF陰性率)X 100%。3.結(jié)果PMN與BCECF標(biāo)記的Mtb先37°C孵育7min，然后置37°C水浴10 60min 后，結(jié)果顯示,PMN對(duì)Mtb的殺傷率在0°C 0 60min為15. 37% 17. 33%;而在37°C 30min 時(shí)殺傷率為37. 20%,60min時(shí)殺傷率達(dá)57. 44%，表明PMN對(duì)Mtb的殺傷活性隨時(shí)間增加逐 漸增強(qiáng)。附圖3為流式分析圖。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)吞噬細(xì)胞殺傷結(jié)核分枝桿菌的方法，包括以下步驟(1)結(jié)核分枝桿菌體外培養(yǎng)擴(kuò)增后用熒光染料標(biāo)記，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記率。(2)熒光染料標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌與吞噬細(xì)胞置于37°C共同孵育1至90分鐘或更長(zhǎng) 時(shí)間后，離心洗滌除去未被吞噬的結(jié)核分枝桿菌。(3)將吞噬結(jié)核分枝桿菌的吞噬細(xì)胞置于37°C孵育0至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后，裂解吞 噬細(xì)胞，釋放被出的結(jié)核分枝桿菌。(4)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光陰性和陽(yáng)性結(jié)核分枝桿菌比率，或結(jié)核分枝桿菌熒光的強(qiáng) 度，計(jì)算吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(1)所述的“結(jié)核分枝桿菌體外培養(yǎng)擴(kuò)增”，其特征是結(jié)核分 枝桿菌接種在固體培養(yǎng)基，如(不僅限于)羅氏培養(yǎng)基，或液體培養(yǎng)基，如(不僅限于)蘇 通培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)1至2周以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(1)和( 所述“熒光染料標(biāo)記”，其特征是應(yīng)用活細(xì)胞熒光 染料以合適的濃度標(biāo)記結(jié)核桿菌?；罴?xì)胞熒光染料如(但不僅限于)(1)熒光素二醋酸 酯(Fluorescein Diacetate, FDA)，標(biāo)記終濃度為 0. 01 μ g/ml 至 5 μ g/ml，合適終濃度為 0. 1 μ g/ml至Ο.δι^/πι 。^”，7雙O羧乙酸)5(和6)羧基熒光素乙酰甲酯[2'，7' -bis -(2-carboxyethyl)(and-6)-carboxyfluorescein,acetoxymethyl ester (BCECF-AM)]， 標(biāo)記終濃度為0. 02 μ g/ml M 10 μ g/ml，合適終濃度為0. 2 μ g/ml至1· 0 μ g/ml。標(biāo)記方法 的特征是上述熒光染料與結(jié)核分枝桿菌在4°C至37°C共同孵育5至60分鐘，孵育的合適溫 度是37°C，時(shí)間是20至30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(1)所述的“用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記率”，其檢測(cè)方法的 特征是用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光陽(yáng)性結(jié)核桿菌，具體方法是先在前散射光和側(cè)散射光二維點(diǎn) 圖中，圈定結(jié)核桿菌區(qū)域，然后再在有第1熒光通道(FLl)的二維點(diǎn)圖中，以結(jié)核桿菌區(qū)域 設(shè)門(mén)，檢測(cè)熒光陽(yáng)性的結(jié)核桿菌比例，達(dá)到90%或以上者作為熒光標(biāo)記結(jié)核桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1及其步驟(2)至⑷所述的“吞噬細(xì)胞”，是指含有吞噬細(xì)胞的標(biāo)本， 包括但不僅限于外周血標(biāo)本，從外周血或淋巴器官或其他器官組織分離或純化獲得的吞 噬細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞)標(biāo)本，或培養(yǎng)的具有吞噬活性的細(xì)胞系(如THP-I細(xì) 胞等)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中的步驟(2)所述的“熒光染料標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌與吞噬細(xì)胞置 于37°C共同孵育1至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間”，其特征是共同孵育時(shí)間因不同的吞噬細(xì)胞類(lèi)型 而有所不同，就中性粒細(xì)胞而言，其合適孵育時(shí)間是5至20分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(2)所述的“離心洗滌除去未被吞噬的結(jié)核分枝桿菌”，其特 征是將吞噬結(jié)核桿菌的吞噬細(xì)胞用離心機(jī)離心，離心速率500至2000r/min，時(shí)間5至15分 鐘，合適的轉(zhuǎn)速和時(shí)間分別為1000至1800r/min，和5至10分鐘。棄上清后，再加緩沖液 (如PBS)重復(fù)離心洗滌1次，以棄去未被吞噬的熒光標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌。如為血液標(biāo)本， 在離心之前加氯化銨溶血?jiǎng)┤苎?，以去除紅細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(3)所述的“吞噬結(jié)核分枝桿菌的吞噬細(xì)胞置于37°C孵育0 至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間”。其特征是其時(shí)間根據(jù)不同吞噬細(xì)胞類(lèi)型而異，就中性粒細(xì)胞而言， 合適的孵育時(shí)間是10至60分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(3)所述的“裂解吞噬細(xì)胞，釋放被出的結(jié)核分枝桿菌”，其裂解吞噬細(xì)胞的方法的特征是應(yīng)用(但不僅限于)低滲和溶解細(xì)胞膜等原理裂解細(xì)胞，采 用的方法例如(但不僅限于)(1)用2至10倍體積的蒸餾水處理1至10分鐘，合適的體 積是4至5倍，合適的時(shí)間是2至3分鐘。(2)先加2至10倍體積的去氧膽酸鈉，作用 3至5分鐘后，再加2至4倍體積的蒸餾水作用2至5分鐘，即可裂解吞噬細(xì)胞釋放出結(jié)核 分枝桿菌，用于流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(4)所述的“用流式細(xì)胞儀檢測(cè)”和“計(jì)算吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核 分枝桿菌的殺傷率”的方法，其特征是可按照以下2種方法計(jì)算吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌(Mtb) 的殺傷率；(1)檢測(cè)熒光陰性和熒光陽(yáng)性Mtb的比例，按以下公式計(jì)算
全文摘要
本發(fā)明屬于抗感染免疫的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種測(cè)定吞噬細(xì)胞殺傷結(jié)核桿菌的方法。其步驟包括(1)結(jié)核桿菌體外培養(yǎng)后用熒光染料標(biāo)記；(2)人或動(dòng)物血液標(biāo)本，或分離或培養(yǎng)的吞噬細(xì)胞，與熒光染料標(biāo)記結(jié)核桿菌于37℃共孵育1至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后，洗滌除去未被吞噬結(jié)核桿菌；(3)將吞噬結(jié)核桿菌的吞噬細(xì)胞置于37℃1至90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后，裂解吞噬細(xì)胞，釋放出結(jié)核桿菌；(4)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光降低的結(jié)核桿菌比例，計(jì)算吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷活性。本發(fā)明方法是應(yīng)用熒光染料標(biāo)記的結(jié)核桿菌被殺傷后熒光強(qiáng)度明顯降低的原理，能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)吞噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌殺傷活性。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便和快捷，客觀性和重復(fù)性好。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102127587SQ20101057365
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者姜麗娜, 李柏青, 賀文欣 申請(qǐng)人:蚌埠醫(yī)學(xué)院