專利名稱：來自猿猴的胚胎干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到在靈長類、特別是人、猿猴的發(fā)育學(xué)研究、疾病研究、臨床應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷确矫嬗杏玫膩碜栽澈锏呐咛ジ杉?xì)胞；可高收率獲得來自猿猴的胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法；為了獲得所期望的分化細(xì)胞或分化組織有用的、為進(jìn)行組織或細(xì)胞特異分化的試劑的篩選方法；以及分化細(xì)胞或分化組織。
現(xiàn)在來自小鼠的ES細(xì)胞廣泛地用于通過基因?qū)蚍ㄊ固囟ɑ蚋淖兊男∈蟮闹谱鞯?。然而，在將來自小鼠的ES細(xì)胞應(yīng)用于人的疾病模型時(shí)，由于a)在小鼠和人胚胎中存在著表達(dá)時(shí)期不同的基因，b)胎盤等胚胎外組織的構(gòu)造和功能不同以及c)著床初期胚胎的胚胎組織的構(gòu)造不同等，所以有時(shí)未必能獲得所期望的效果。
而與來自鼠的ES細(xì)胞相比，來自猿猴的ES細(xì)胞與人的親緣關(guān)系更近，所以更適合應(yīng)用于人的疾病。
到目前為止已知世界上有大約200種猿猴，但現(xiàn)狀是可用于日常實(shí)驗(yàn)的種類有限。高等靈長類大致可分為以下2類(1)新世界靈長類(New World Primates)絹毛猴(Callithrix jacchus)廣為人知，是實(shí)驗(yàn)用靈長類之一。新世界靈長類的發(fā)育雖胚胎和胎盤的構(gòu)造與舊世界靈長類的不同，但基本類似。(2)舊世界靈長類(Old World Primates)舊世界靈長類是與人親緣關(guān)系非常密切的靈長類。已知有獼猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(Macaca fascicularis)。日本猴(Macacafuscata)與食蟹猴同屬(獼猴屬)。舊世界靈長類的發(fā)育與人的發(fā)育酷似。
現(xiàn)在作為來自猿猴的ES細(xì)胞已經(jīng)建立了絹毛猴ES細(xì)胞[Thomson，J.A.等人，Biol.Reprod.55，254-259，(1996)]以及獼猴ES細(xì)胞[Thomson，J.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，7844-7848，(1995)]。然而就像上述那樣，絹毛猴是屬于與人的系統(tǒng)離得遠(yuǎn)的新世界靈長類的動(dòng)物，胚胎和胎盤的構(gòu)造也不同。另外絹毛猴由于個(gè)頭小，現(xiàn)狀是各種實(shí)驗(yàn)操作不容易，而且背景資料也少。而上述獼猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在日本和歐洲使用非常少，另外繁殖有季節(jié)性，一年也不一定看到排卵。而且在絹毛猴ES和獼猴ES細(xì)胞的制作中也存在著卵子的回收需要時(shí)間，回收效率低的缺點(diǎn)。
雖然也開發(fā)了人的ES細(xì)胞，但從倫理學(xué)觀點(diǎn)看，使用中存在著限制。
本發(fā)明的要點(diǎn)涉及到[1]包含(a)使用猿猴的卵子和精子，利用體外受精法或顯微授精法進(jìn)行受精，得到受精卵的工序，(b)使用工序(a)得到的受精卵通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚的工序，以及(c)通過利用工序(b)得到的囊胚泡期胚胎建立胚胎干細(xì)胞工序在內(nèi)的工序獲得來自猿猴的胚胎干細(xì)胞；[2]包含(a)使用猿猴的卵子和精子，利用體外受精法或顯微授精法進(jìn)行受精，得到受精卵的工序，(b)使用工序(a)得到的受精卵通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚胎的工序，以及(c)利用工序(b)得到的囊胚泡期胚胎建立胚胎干細(xì)胞工序在內(nèi)的來自猿猴胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法；[3]建立的呈現(xiàn)出下述特性的來自食蟹猴的細(xì)胞(i)維持未分化狀態(tài)可增殖繼代，(ii)具有與起源的食蟹猴個(gè)體相同染色體數(shù)，(iii)通過移植到8～12周齡SCID小鼠或裸小鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸確認(rèn)多分化功能，(iv)對(duì)SSEA-1呈陰性、而對(duì)SSEA-3和SSEA-4呈陽性，以及(v)檢測出堿性磷酸酶活性。[4]用于進(jìn)行組織或細(xì)胞的特異分化的試劑的篩選方法，其特征是在被檢測物質(zhì)存在下，維持從上述[1]記載的來自猿猴胚胎干細(xì)胞和來自上述[3]記載的食蟹猴細(xì)胞選擇出的細(xì)胞，以及[5]從上述[1]記載的胚胎干細(xì)胞和來自上述[3]記載的食蟹猴的細(xì)胞選擇出的胚胎干細(xì)胞分化出來的分化細(xì)胞或分化組織。
圖2是表示通過各種手法對(duì)本發(fā)明的來自食蟹猴胚胎干細(xì)胞進(jìn)行觀察的結(jié)果的照片。畫面A和畫面B分別表示對(duì)本發(fā)明的來自食蟹猴胚胎干細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察的結(jié)果[畫面A低倍數(shù)(標(biāo)尺(Bar)；100μm)，畫面B高倍數(shù)(標(biāo)尺；50μm)]。畫面C表示對(duì)本發(fā)明的來自食蟹猴胚胎干細(xì)胞實(shí)施堿性磷酸酶染色后顯微鏡觀察的結(jié)果(標(biāo)尺；100μm)。畫面D表示對(duì)來自本發(fā)明的食蟹猴胚胎干細(xì)胞實(shí)施SSEA-4免疫染色后顯微鏡觀察的結(jié)果(標(biāo)尺；100μm)。
圖3是表示將本發(fā)明的來自食蟹猴胚胎干細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射后，對(duì)形成的腫瘤進(jìn)行各種染色后顯微鏡觀察的結(jié)果的照片。畫面A～H表示將本發(fā)明的來自食蟹猴胚胎干細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射后，對(duì)形成的腫瘤進(jìn)行HE染色后顯微鏡觀察的結(jié)果。畫面A整個(gè)腫瘤(標(biāo)尺；300μm)，畫面B神經(jīng)上皮(標(biāo)尺；200μm)，畫面C神經(jīng)膠質(zhì)(標(biāo)尺；200μm)，畫面D腺(標(biāo)尺；200μm)，畫面E肌肉(標(biāo)尺；200μm)，畫面F軟骨(標(biāo)尺；400μm)，畫面G骨(標(biāo)尺；200μm)，畫面H絨毛上皮(標(biāo)尺；150μm)。畫面I～M表示對(duì)上述腫瘤免疫染色后進(jìn)行顯微鏡觀察的結(jié)果。畫面I是對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的NSE進(jìn)行的免疫染色(標(biāo)尺；200μm)，畫面J是對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)的GFAP進(jìn)行的免疫染色(標(biāo)尺；200μm)，畫面K是對(duì)末梢神經(jīng)的NSE進(jìn)行的免疫染色(標(biāo)尺；200μm)，畫面L是對(duì)肌肉的肌纖維蛋白進(jìn)行的免疫染色(標(biāo)尺；200μm)，畫面M是對(duì)軟骨的S-100蛋白進(jìn)行的免疫染色(標(biāo)尺；400μm)。
實(shí)施發(fā)明的最好模式本發(fā)明使用的猿猴是指靈長類、具體是指新世界靈長類和舊世界靈長類。其中，舊靈長類是與人親緣關(guān)系非常密切的靈長類，而且由于其發(fā)育類似于人的發(fā)生，所以有望用作與人接近的疾病模型動(dòng)物和種種疾病治療劑的篩選系統(tǒng)。因此在本發(fā)明中，理想的是舊世界靈長類，如日本猴、食蟹猴等，食蟹猴最理想。
上述日本猴、食蟹猴是與人親緣最近的系統(tǒng)，日本猴，由于體型中等(體重5～15公斤)，容易進(jìn)行外科手術(shù)，在體力充沛這點(diǎn)上也有優(yōu)勢。另外，由于日本猴性格溫順，訓(xùn)練效果也大，所以有在無麻醉下可進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)。而食蟹猴由于體型小(體重3～6公斤)，在進(jìn)行各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)容易操作，在日本和歐洲作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用例子很多，具有可以獲得很多背景資料的優(yōu)點(diǎn)。而食蟹猴與經(jīng)過一年才能看到排卵，即排卵有季節(jié)性的獼猴相比具有在生殖生理實(shí)驗(yàn)中更有用的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的來自猿猴胚胎干細(xì)胞可以通過包括以下工序在內(nèi)的方法獲得(以下稱做來自猿猴的胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法)(a)使用猿猴的卵子和精子，利用體外受精法或顯微授精法進(jìn)行受精，得到受精卵的工序，(b)使用工序(a)得到的受精卵通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚胎的工序，以及(c)通過利用工序(b)得到的囊胚泡期胚胎建立胚胎干細(xì)胞工序。
這樣的來自猿猴的胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明來自猴胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，通過上述(a)～(c)工序，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以以大約40～46％令人吃驚的高準(zhǔn)確率從受精卵獲得囊胚泡期胚胎。另外，按照這樣的見解利用本發(fā)明的生產(chǎn)方法可以發(fā)揮高效率發(fā)育成囊胚泡期胚胎的優(yōu)越效果。因此既便與以往的方法(例如，國際公開第96/22362號(hào)小冊(cè)子)相比也能發(fā)揮可以以極高收率地獲得來自猿猴胚胎干細(xì)胞這一優(yōu)越效果。
在工序(a)中，猿猴的卵子可以象以往那樣通過開腹，看到卵巢后進(jìn)行卵巢穿刺的方法，將排卵卵子從卵管摘出后，洗凈，回收的方法等獲得，從減少對(duì)個(gè)體的負(fù)擔(dān)、縮短或消除手術(shù)后創(chuàng)傷治愈所需要的時(shí)間，減少個(gè)體感染的危險(xiǎn)性的觀點(diǎn)出發(fā)，希望通過在腹腔鏡觀察下對(duì)猿猴進(jìn)行采卵獲得。在腹腔鏡觀察下采卵如可以只是在腹壁上切開約1cm的口子，將腹腔鏡插入腹內(nèi)，通過腹壁進(jìn)行卵巢穿刺。這樣一來由于容易獲得局部放大圖象，所以與直視下進(jìn)行卵巢穿刺情況相比具有可以更正確地捕捉到穿刺部位后進(jìn)行采卵的優(yōu)點(diǎn)。另外通過這樣的腹腔鏡觀察下采卵，采卵后對(duì)腹壁只需1針縫合，由于在短時(shí)間進(jìn)行手術(shù)，所以從動(dòng)物福祉的觀點(diǎn)出發(fā)也是所希望的。
采卵用的雌性猿猴年齡往往因猿猴的種類不同也不同，但從確認(rèn)定期的月經(jīng)周期的觀點(diǎn)出發(fā)，3.5歲以上，最好是在4歲以上，從月經(jīng)周期終止前觀點(diǎn)出發(fā)希望在20歲以下，最好是在15歲以下。具體來說，使用日本猴時(shí)希望在5～15歲，而食蟹猴在4～15歲。
采卵時(shí)也可以使用排卵誘發(fā)劑。作為上述的排卵誘發(fā)劑如促卵泡激素(FSH)、黃體形成激素(LH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)等，具體來說，如促性腺激素釋放激素(GnRH)、妊娠馬血清促性腺激素(PMSG)、人絕經(jīng)期尿促性腺激素(hMG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、黃體形成激素釋放激素(LHRH)、促卵泡激素(FSH)等。這些排卵誘發(fā)劑的投藥量以及投藥期間根據(jù)個(gè)體的體重、使用的排卵誘發(fā)劑的種類可以在發(fā)揮排卵誘發(fā)效果范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)選擇。
上述工序(a)中使用的猿猴的卵子優(yōu)選成熟的，達(dá)到MII期，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)，有彈性的。這些特性可以通過觀察顯微授精或體外受精過程進(jìn)行評(píng)價(jià)。
腹腔鏡觀察下采卵具體來說可以象下面那樣進(jìn)行向5～15歲雌性日本猴或4～15歲雌性食蟹猴皮下注射促性腺激素釋放激素(GnRH)1.8～3.65mg。從注射GnRH2周后開始，一天一次連續(xù)9天定時(shí)肌肉注射妊娠馬血清促性腺激素(PMSG)(25IU/kg)、或人絕經(jīng)期尿促性腺激素(hMG)(10IU/kg)、或促卵泡激素(FSH)(3IU/kg)。注射4～5日后，用腹腔鏡(外徑3mm)觀察卵巢，確認(rèn)卵泡有無發(fā)育。卵泡有無發(fā)育以能看到卵巢上出現(xiàn)許多薄薄白膜那樣的形狀，卵巢本身變大，進(jìn)而子宮紅色也變深作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。最終，注射9天PMSG、hMG或FSH，確認(rèn)卵泡發(fā)育充分后，進(jìn)行一次肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)(400IU/kg)。注射hCG 38～42小時(shí)后，進(jìn)行采卵。采卵可以通過對(duì)卵巢進(jìn)行腹腔鏡(外徑10mm)觀察下，使用裝有含有約0.5ml的10％SSS(血清替代輔助液(Serum SubstituteSupplement))的α-MEM溶液的60mm的帶有19G或20G卡特蘭針的2.5ml注射器，對(duì)卵泡進(jìn)行穿刺，吸引，與卵泡液一起回收卵子。回收后立即在實(shí)體顯微鏡下分離包含在卵丘細(xì)胞中的成熟卵子，移到含有BSA的TALP中。于5％CO2、5％O2、90％N2、37℃的條件下進(jìn)行3～4小時(shí)的前培養(yǎng)，可以得到受精用的卵子。
而猿猴的精子可以從附睪采集，也可以通過電刺激法采集。上述電刺激法如下面實(shí)施例記載的直腸法、陰莖法等。具體來說如下直腸法使用鹽酸氯胺酮、鹽酸甲苯噻嗪等代表性的麻醉劑，對(duì)雄性猿猴進(jìn)行麻醉，呈仰臥位。將凝膠乳膏涂到裝在電刺激器上的棒狀直腸電極，將該電極輕輕插入到該猿猴的直腸。將電刺激器設(shè)定在交流電壓、5～20V。斷斷續(xù)續(xù)地通電，從陰莖頭部采集精液。陰莖法在無麻醉下，將雄性猿猴的四肢固定在籠子前面，將陰莖置于容易固定的位置。將電刺激器的電極置于在陰莖上，用夾子連接。斷斷續(xù)續(xù)通電，從陰莖頭部采集精液。
上述工序(a)用的猿猴的精子從要獲得高受精能力的觀點(diǎn)出發(fā)，希望對(duì)精子進(jìn)行活化。精子的活化可以通過咖啡因、dbC-AMP、佛司可林(forskolin)、己酮可可堿等藥物對(duì)精子進(jìn)行處理來實(shí)施。在上述藥物中，從具有前進(jìn)性的活潑的運(yùn)動(dòng)性和生存率的觀點(diǎn)出發(fā)，最好是咖啡因和dbC-AMP組合使用。而經(jīng)上述藥物對(duì)精子進(jìn)行處理后，通過游泳法(Swim up)可以獲得受精能力更高的精子。通過對(duì)上述精子進(jìn)行活化，可以得到高的受精率，而即使使用未處理的缺乏運(yùn)動(dòng)性的精子時(shí)通過顯微授精也可以發(fā)揮受精效率高的優(yōu)越效果。
咖啡因和dbC-AMP的使用量從使運(yùn)動(dòng)性活化觀點(diǎn)看對(duì)1×107個(gè)精子希望用10μM～1mM。
上述所謂游泳法指的是通過離心分離將精子收集在圓底試管中后，添加含有咖啡因和dbC-AMP的培養(yǎng)基(約0.5ml)，通過置于5％CO2、37℃條件下的溫育箱內(nèi)，經(jīng)過約30～60分鐘后，收集向上泳動(dòng)的精子的方法。
精子的活性可以以具有前進(jìn)性的活潑的運(yùn)動(dòng)性現(xiàn)象作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
猿猴精子的活化可以按照如下那樣操作進(jìn)行從保存有從附睪采集或通過電刺激法采集的精子的麥桿將精子與冷凍保存劑一起移到試管中后，加入含有1mM咖啡因和1mM dbC-AMP的BSA/BWW(Biggers，Whitten and Wittinghams)液10ml，于5％CO2、37℃條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱溫育30分鐘，使精子獲得受精能力。然后于1,000rpm(200×g)離心分離2分鐘，棄掉上清。向留下的精子中重新加入含有1mM咖啡因和1mM dbC-AMP的BSA/BWW約0.5～10ml。將得到的精子溶液于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置60分鐘，收集向上泳動(dòng)的精子，確認(rèn)精子的運(yùn)動(dòng)性和精子數(shù)。而精子的運(yùn)動(dòng)性以精子的前進(jìn)性和活潑性作為指標(biāo)。通過這種方式就可以對(duì)精子進(jìn)行活化。
在工序(a)中，受精通過體外受精法或顯微授精法進(jìn)行。體外受精法按照Torii，R.等人[Primates，41，39-47(2000)]記載的方法進(jìn)行，而顯微授精法按照Hewitson，L.[Human Reproduction，13，3449-3455(1998)]記載的方法進(jìn)行。
在本發(fā)明的猿猴胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法中從減少對(duì)卵子的影響觀點(diǎn)出發(fā)，在實(shí)施上述體外受精法或顯微授精法時(shí)，最好是使用由TALP(蒂羅德-白蛋白-乳酸酯-丙酮酸酯(Tyrode-Albumin-Lactate-Pyruvate))液、TALP-HEPES液和BWW液中選擇的培養(yǎng)液。TALP和TALP-HEPES液制備如下表1試劑 貯存溶液最終溶液 貯存液(ml)TALPTALP-(mM) (g/100mol) (mM) HEPESHEPES - 10.0- 240mgNaCl 157.0 0.92 114.0 至100ml 至100mlKCl 166.0 1.24 3.16 1.9 1.9CaCl2120.0 1.76 2.01.7 1.7MgCl2·6H2O 120.0 2.44 0.50.410.41乳酸鈉 150.0 -10.0 6.7 6.7水 -- - 7.1NaH2PO4·H2O 20.5-0.35 1.7 1.7葡萄糖 295.0 5.31 5.0NaHCO3167.0 1.40 25.0(TALP) 15.01.22.0(TALP-HEPES)青霉素G(10,000單位/100ml)和酚紅(1mg/100ml)貯存液經(jīng)高壓蒸氣滅菌保存。
在要配制TALP溶液前制備下述試劑丙酮酸鈉0.5mM0.0055g(相對(duì)于100ml)慶大霉素硫酸鹽(10mg/ml) 50μg/ml 50μlBSA 3mg/ml 0.3g得到的試劑經(jīng)膜過濾滅菌。
另外要配制TALP-HEPES溶液前制備下述試劑丙酮酸鈉 0.1mM 0.0011g(相對(duì)于100ml)BSA 3mg/ml 0.3g
得到的試劑經(jīng)膜過濾滅菌。
在配制TALP-HEPES溶液時(shí)，首先使50ml NaCl和Na-HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)、酚紅、青霉素G溶解。向得到的溶液中按規(guī)定量分別加入貯存液，最后用NaCl貯存液調(diào)到100ml。然后用1M NaOH將pH得到的溶液調(diào)到7.4。乳酸鈉貯存液是將原液(60％糖漿)和水按1∶35進(jìn)行混合。向得到的混合液中加入1mg/ml的酚紅，然后用1M NaOH將pH得到的溶液調(diào)到7.6，過濾滅菌。得到的試劑于4℃下可保存1周。將NaHPO4·H2O 28mg溶解于10ml的葡萄糖溶液中，過濾滅菌。得到的試劑于4℃下可保存1周。
下面表2給出了BWW(Biggers，Whitten and Wittinghams)溶液的組成。表2試劑 量*(mg)氯化鈉2,770氯化鉀178KH2PO481硫酸鎂147NaHCO31,053丙酮酸鈉鹽14D(+)-葡萄糖(無水) 500青霉素G 31鏈霉素25DL-乳酸鈉 1,037乳酸鈣263酚紅1mgMerK 1*/500ml在進(jìn)行體外受精或顯微授精時(shí)使用的溶液用礦物油覆蓋表面，可以起到防止卵子的溶液或精子溶液干燥，以及溫度、pH、CO2、O2濃度的變動(dòng)的效果。
另外在工序(a)中，受精時(shí)從減少對(duì)卵子的影響觀點(diǎn)出發(fā)，最好是使用從TALP液、TALP-HEPES液和BWW液中選擇的培養(yǎng)液。
有無受精以雌雄前核的存在作為指標(biāo)，可以在相差倒置顯微鏡下通過目視進(jìn)行評(píng)價(jià)。
以下給出了一例本發(fā)明中進(jìn)行的體外受精法或顯微授精法體外受精法在塑料培養(yǎng)皿內(nèi)用礦物油包被的50μl的BSA/BWW的培養(yǎng)液小滴中，含有被卵丘細(xì)胞包覆的卵子1～5個(gè)。然后將精子懸浮液移到培養(yǎng)液小滴中使精子數(shù)得到5.0×105～1.0×106個(gè)(精子)/ml。培養(yǎng)液小滴用礦物油包被，然后進(jìn)行受精。顯微授精法(i)卵子的制備將回收的卵母細(xì)胞集中在含有用礦物油(Sigma Chem.co.)包被的50μl的含有0.3％BSA的TALP(BSA/TALP)溶液小滴中后，于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的條件下進(jìn)行前培養(yǎng)。卵子成熟的狀態(tài)可以用0.1％的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行處理卵母細(xì)胞培養(yǎng)物，除去卵丘細(xì)胞，對(duì)回收的卵子于倒置顯微鏡下分為以下級(jí)數(shù)-1～44類，進(jìn)行評(píng)價(jià)。
級(jí)數(shù)-1具有極體(PB)的成熟卵子、級(jí)數(shù)-2沒有觀察到PB和卵核泡(GV)的成熟過程中的卵子、級(jí)數(shù)-3觀察到GV的未成熟卵子、級(jí)數(shù)-4形狀變形顯著，或細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出變性、退行性變化的卵子。
級(jí)數(shù)-1卵子經(jīng)確認(rèn)后立即供顯微授精。對(duì)于級(jí)數(shù)-2和級(jí)數(shù)-3的卵子再集中在用礦物油包被的50μl的BSA/TALP的培養(yǎng)液小滴中后，于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。此時(shí)，與上述一樣對(duì)卵子的成熟狀態(tài)進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)于未成熟卵子和級(jí)數(shù)-4卵子希望不要用于受精。(ii)精子的制備按照體外受精的方法進(jìn)行。(iii)顯微授精法顯微授精在裝備了顯微操作器的倒置顯微鏡下進(jìn)行。
在150mm培養(yǎng)皿中依次放置培養(yǎng)液小滴1∶15μl稀釋精子，培養(yǎng)液小滴2∶10％聚乙烯吡咯烷酮PBS培養(yǎng)液[PVP平均分子量約360，000]5μl×3個(gè)和培養(yǎng)液小滴3卵子操縱作用的TALP-HEPES(最終濃度3mg/ml BSA)溶液5μl×3個(gè)，表面用礦物油覆蓋，防止干燥，作為顯微授精的操作區(qū)。另外為了使操作溫度一定，根據(jù)需要可以使用加溫步驟。
將注入用的針頭裝到操作精度高的ALCAHEL注射器上。作為注入用的針頭例如人顯微授精用的傾斜角度為30度的針頭等。
作為保持卵子的針頭，如上述人顯微授精用的傾斜角度為30度的針頭、用磁性·plur(PN-30、ナリシゲ公司生產(chǎn))制作的外徑約為100μm、針尖的內(nèi)徑約為15μm的針頭。保持上述卵子用的針頭裝到帶有2000μl的空氣型注射器的注射器后使用。
精子在培養(yǎng)液小滴1按照顯微授精的標(biāo)準(zhǔn)選擇具有運(yùn)動(dòng)性的精子吸入之后，將得到的精子移到培養(yǎng)液小滴2，排出。培養(yǎng)液小滴2中由于PVP的粘性，精子的運(yùn)動(dòng)性降低。用注射器針頭擦該精子的尾部，破壞部分膜，使精子的運(yùn)動(dòng)停止。將該精子與粘性高的溶液一起吸入，移到培養(yǎng)液小滴3。
將成熟的卵子加入到培養(yǎng)液小滴3，使用保持用針頭，為了不用注入用針頭破壞處于極體的下部的染色體，于該位置固定6或12小時(shí)。然后將精子置于注入用針頭的針尖處，刺入卵子。確認(rèn)針頭通過透明帶后，吸引卵細(xì)胞膜。確認(rèn)膜發(fā)生破裂后，將注入用針頭內(nèi)的內(nèi)含物(精子和卵子的細(xì)胞質(zhì))注入。反復(fù)進(jìn)行有關(guān)精子和卵子的細(xì)胞質(zhì)的注入的一系列操作。一次操作對(duì)2～3個(gè)卵子進(jìn)行顯微授精。當(dāng)精子和卵細(xì)胞質(zhì)污染了針尖內(nèi)側(cè)時(shí)，用培養(yǎng)液小滴2洗凈。
在上述工序(a)后，(b)工序使用(a)工序得到受精卵通過體外培養(yǎng)法進(jìn)行使發(fā)育成囊胚期胚胎的工序。
作為體外培養(yǎng)法如微小懸滴培養(yǎng)法，其特征是從為避免溫度和二氧化碳濃度急劇變化的觀點(diǎn)出發(fā)，用礦物油覆蓋培養(yǎng)液。而這樣的微小懸滴培養(yǎng)法是在人中不能進(jìn)行，而在小鼠和兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中廣泛采用的手法，通過這樣的培養(yǎng)法由于適用發(fā)育成來自猿猴的囊胚泡期胚胎，可以發(fā)揮出能夠得到預(yù)料不到的高發(fā)育率的非常好的效果。
在受精卵的培養(yǎng)中，從避免由于觀察培養(yǎng)過程可能引起的溫度或pH變化等不必要的事件發(fā)生的觀點(diǎn)出發(fā)，希望在體外受精時(shí)，在培養(yǎng)開始后7～10天、優(yōu)選在第8天顯微受精時(shí)，培養(yǎng)開始7-10天，優(yōu)選在第9天預(yù)料囊胚泡期胚胎出現(xiàn)之前停止開閉培養(yǎng)器門，要密閉。
囊胚泡期胚胎的出現(xiàn)具有與初期分裂速度成比例的傾向。
而在工序(b)的體外培養(yǎng)法中，在使用的培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)氣相中也有一大特征。
在工序(b)中，希望使用CMRL-1066、TCM-199、DMEM、α-MEM等，實(shí)施體外培養(yǎng)法。特別是使用CMRL-1066的體外培養(yǎng)法更好。而CMRL-1066溶液制備如下將L-谷氨酰胺0.014615g(1mM)溶解于10ml的A液[青霉素G(1000單位)]、慶大霉素硫酸鹽(10mg/ml)0.5ml、CMRL-1066(10×)(無NaHCO3和L-谷氨酰胺)10ml、NaHCO30.218g、乳酸鈉(290m0smol’s stock)6.7ml、用水調(diào)到100ml(用量筒)。然后對(duì)得到的溶液過濾滅菌。向1ml滅菌后的溶液加入A液9ml，得到總量為10ml的B液。將丙酮酸鈉0.0055g(終濃度5mM)加到B液中溶解，得到C液。將C液8ml和BCS(胎牛血清)2ml混合。對(duì)得到的混合物過濾滅菌，得到CMRL-1066液。
而作為培養(yǎng)液，從降低對(duì)卵子的影響的觀點(diǎn)出發(fā)，希望使用從TALP液、TALP-HEPES液和BWW液中選擇出的培養(yǎng)液。作為上述培養(yǎng)液具體來說如TALP和CMRL-1066組合的培養(yǎng)液。如果利用這樣的TALP和CMRL-1066組合的培養(yǎng)液，經(jīng)確認(rèn)受精后通過使用該培養(yǎng)液，在看到從桑椹胚向囊胚泡期胚胎的發(fā)育，而且可以得到受精胚胎的40～46％的非常高的發(fā)育率方面是有利的。
培養(yǎng)溫度從縮短發(fā)育所需要的時(shí)間的觀點(diǎn)以及使桑椹胚向囊胚泡期胚胎發(fā)育的觀點(diǎn)出發(fā)，37℃以上為好，最好是在37.5℃以上、38.5℃以下，最好是在38.2℃以下。具體來說，通過在38℃進(jìn)行培養(yǎng)，通過體外受精7天后，顯微授精第8天后，可以高效地獲得囊胚泡期胚胎。
培養(yǎng)氣相從使桑椹胚向囊胚泡期胚發(fā)育或提高發(fā)育的觀點(diǎn)出發(fā)，低氧氣相為好，具體來說，與通常制作ES細(xì)胞時(shí)所用的培養(yǎng)氣相相比，通過O2濃度低、即5％CO2、5％O2、90％N2的氣相可以發(fā)揮能夠獲得令人吃驚的高效率的囊胚泡期胚的極好效果。
而(c)是使用工序(b)得到的囊胚泡期胚胎建立胚胎干細(xì)胞的工序。在工序(c)中，通過將從(b)得到的囊胚泡期胚胎得到的內(nèi)部細(xì)胞塊在滋養(yǎng)細(xì)胞上或白血球增殖抑制因子[也可以表示為LIF、分化抑制因子(DIF)]培養(yǎng)，可以建立胚胎干細(xì)胞。
在從囊胚泡期胚取得內(nèi)部細(xì)胞塊時(shí)，最好使用除去透明帶的囊胚泡期胚。上述透明帶也可以通過使用透明質(zhì)酸酶、鏈霉蛋白酶、酸性蒂羅德溶液等進(jìn)行處理除去。在用透明質(zhì)酸酶、鏈霉蛋白酶、酸性蒂羅德溶液等除去透明帶時(shí)，例如可以將囊胚泡期胚在含有適當(dāng)濃度的透明質(zhì)酸酶、鏈霉蛋白酶、酸性蒂羅德溶液等M2培養(yǎng)液[例如，參照D.M.Glover等人編寫，DNA Cloning 4 Mammalian Systems APractical Approach第2版(1995)等文獻(xiàn)]中進(jìn)行溫育。透明帶除去后，對(duì)得到的囊胚泡期胚適當(dāng)?shù)赜昧姿峋彌_生理鹽水洗凈。
為了從沒有透明帶的囊胚泡期胚對(duì)內(nèi)部細(xì)胞塊進(jìn)行分離，例如可以對(duì)該囊胚泡期胚實(shí)施免疫手術(shù)。然后用移液管將內(nèi)胚層系的細(xì)胞剝離，得到的內(nèi)部細(xì)胞塊在滋養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)1周，增殖的內(nèi)部細(xì)胞塊用胰蛋白酶處理(例如，用0.25重量％胰蛋白酶+0.5mM EDTA等處理)，作成由3～4個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的塊，再將這些細(xì)胞于滋養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)。
作為免疫手術(shù)用的抗血清如兔抗猴血清，具體來說，如兔抗日本猴血清、兔抗食蟹猴血清等。將囊胚泡期胚胎移至上述抗血清用M16培養(yǎng)液[參照上述DNA Cloning 4 Mammalian Systems A PracticalApproach等]稀釋20倍的溶液中，通過于37℃下溫育30分鐘，可以對(duì)內(nèi)部細(xì)胞塊進(jìn)行分離。根據(jù)需要，使用玻璃針在顯微鏡下通過物理方法也可以將營養(yǎng)外胚層除去。
作為滋養(yǎng)細(xì)胞如通過對(duì)妊娠12～16日的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞株的初代培養(yǎng)細(xì)胞、作為小鼠胎兒成纖維細(xì)胞株的STO等進(jìn)行絲裂霉素C或X射線處理之后得到的細(xì)胞等。這種來自小鼠的滋養(yǎng)細(xì)胞在能夠大量制備這一點(diǎn)上對(duì)實(shí)驗(yàn)等是有利的。
上述滋養(yǎng)細(xì)胞的制作例如可以通過下述實(shí)施例記載的方法等進(jìn)行。
滋養(yǎng)細(xì)胞例如可以使用MEM培養(yǎng)基(Minimum Essential MediumEagle)播種到明膠包被的培養(yǎng)容器中。可以將滋養(yǎng)細(xì)胞播種到?jīng)]有間隙那樣覆蓋整個(gè)培養(yǎng)容器的程度。
上述內(nèi)部細(xì)胞塊播種到將已播種上述滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)容器中MEM培養(yǎng)基換成ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基[ES細(xì)胞培養(yǎng)基、表3]的滋養(yǎng)細(xì)胞上。
表3ES細(xì)胞培養(yǎng)基的組成產(chǎn)品名 添加量DMEM/F12(Sigma公司生產(chǎn))500mlFBS(JRH BIOSCIENCES) 75ml谷氨酰胺(Sigma公司生產(chǎn)；200mM) 5ml青霉素(Sigma公司生產(chǎn)；10,000IU/ml) 5ml鏈霉素(Sigma公司生產(chǎn)；10mg/ml)混合物 5ml丙酮酸鈉(Sigma公司生產(chǎn)；100mM) 5ml碳酸氫鈉(Sigma公司生產(chǎn)；7.5％) 8ml2-巰基乙醇(Sigma公司生產(chǎn)；終濃度10-4M)4μlLIF(ESGRO公司生產(chǎn)；終濃度1000U/ml) 0.5ml含有106U/ml細(xì)胞的培養(yǎng)條件可以是通常的小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件。例如在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天。而從不妨礙內(nèi)部細(xì)胞塊的著床的觀點(diǎn)出發(fā)，希望從培養(yǎng)開始后3天內(nèi)不換培養(yǎng)液，每日在顯微鏡下觀察著床狀況。而根據(jù)細(xì)胞增殖依次在大尺寸的培養(yǎng)皿中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
以下進(jìn)行胚胎干細(xì)胞的鑒定和評(píng)價(jià)。而評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)例子如下所示。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的例子核型(karyotype)染色體數(shù)沒有異常。通常要研究與作為起源的猿猴染色體數(shù)(2n＝42)是否具有同樣的數(shù)目。多分化能力例如，將認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞(1×105～1×106個(gè))注射到8～12周齡的SCID小鼠或裸鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸，研究5～16周后有無腫瘤形成，有腫瘤形成時(shí)，通過對(duì)該腫瘤進(jìn)行組織學(xué)檢查，研究分化能力。而通過除去滋養(yǎng)細(xì)胞，或通過添加視黃酸等分化誘導(dǎo)劑可以研究各種分化能力，可以對(duì)多分化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。
形態(tài)學(xué)特征1.表現(xiàn)出高的核/細(xì)胞質(zhì)比、顯著的核仁、集落形成。2.與小鼠ES細(xì)胞相比，集落形態(tài)為扁平。

圖1和圖2的畫面A和畫面B給出了上述形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞表面標(biāo)記的出現(xiàn)陰性對(duì)照SSEA-1陽性對(duì)照SSEA-3、SSEA-4上述細(xì)胞表面標(biāo)記分別是作為階段特異的胚胎抗原的糖脂細(xì)胞表面標(biāo)記。通過用這樣的標(biāo)記作為抗原，制備各個(gè)抗體，通過常用的免疫染色等可以檢測。堿性磷酸酶活性可以通過常用的堿性磷酸酶染色檢測。
作為本發(fā)明的來自猿猴的胚胎干細(xì)胞，具體表現(xiàn)出下述特性的建立的來自食蟹猴的細(xì)胞，具體如胚胎干細(xì)胞；(i)可維持未分化狀態(tài)進(jìn)行增殖繼代、(ii)具有與起源的食蟹猴個(gè)體相同的染色體數(shù)、(iii)通過移植到8～12周齡的SCID小鼠或裸鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸，可以確認(rèn)多分化能力、(iv)對(duì)SSEA-1呈陰性，而對(duì)SSEA-3、SSEA-4呈陽性、以及(v)檢測出堿性磷酸酶活性這樣的來自食蟹猴的胚胎干細(xì)胞具有(vi)表現(xiàn)出高的核/細(xì)胞質(zhì)比、顯著的核小體、集落形成，而且與小鼠ES細(xì)胞相比，集落形態(tài)為扁平的形態(tài)學(xué)特征[例如，參照?qǐng)D1和圖2的畫面A和畫面B]。
本發(fā)明建立的來自食蟹猴的胚胎干細(xì)胞移植到8～12周齡的SCID小鼠或裸鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸時(shí)，表現(xiàn)出向來自外胚層的細(xì)胞、來自中胚層細(xì)胞、來自內(nèi)胚層細(xì)胞等的分化能力，更具體來說，例如表現(xiàn)出向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、肌肉、軟骨、骨、纖毛上皮、腸道上皮等的分化能力。
本發(fā)明建立的來自食蟹猴的胚胎干細(xì)胞有望用于疾病模型動(dòng)物的制作、移植用組織的制作。
本發(fā)明的來自食蟹猴的胚胎干細(xì)胞可以用于對(duì)進(jìn)行組織或細(xì)胞、最好是來自靈長類的組織或細(xì)胞的特異分化的試劑進(jìn)行篩選。本發(fā)明中也包括用于進(jìn)行組織或細(xì)胞的特異分化的試劑的篩選的方法。
本發(fā)明的用于進(jìn)行組織或細(xì)胞的特異分化的試劑的篩選方法的一個(gè)特征是在被檢測物質(zhì)存在下，維持本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞。
在本發(fā)明的篩選法中，由于使用本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞，不僅在靈長類、特別是在人、猿猴的胚胎學(xué)的研究、疾病研究、臨床應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷仁怯杏玫模野l(fā)揮出對(duì)要獲得所期望的分化細(xì)胞或分化組織使用的有用的試劑進(jìn)行篩選的非常好的效果。
在本發(fā)明的篩選法中由胚胎干細(xì)胞向所期望的組織或細(xì)胞特異分化，例如可以以在所期望的組織或細(xì)胞中出現(xiàn)的標(biāo)記作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。作為上述所期望的組織或細(xì)胞的標(biāo)記如組織或細(xì)胞特異抗原。作為上述所期望的組織或細(xì)胞的標(biāo)記如作為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的標(biāo)記如神經(jīng)元特異的烯醇化酶、神經(jīng)膠質(zhì)纖維性酸性蛋白質(zhì)、巢蛋白(ネスチン)等，作為軟骨的標(biāo)記如S-100蛋白質(zhì)、酒石酸抗性酸磷酸酶等，作為肌肉的標(biāo)記如肌纖維蛋白、肌肉特異的肌動(dòng)蛋白等。這樣特異的標(biāo)記使用針對(duì)該標(biāo)記的抗體通過常用的ELISA、免疫染色等也可以檢測，也可以使用編碼該標(biāo)記的核酸，通過常用的RT-PCR、DNA分析雜化等檢測。而所謂核酸是指基因組DNA、RNA、mRNA或cDNA。
通過上述篩選方法得到的試劑也包括在本發(fā)明的范圍。這些試劑有望應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
而由本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞或組織也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
前述分化細(xì)胞和分化組織，通過上述組織或細(xì)胞特異標(biāo)記的表達(dá)，觀察其形態(tài)學(xué)特征可檢測出。
上述分化細(xì)胞和分化組織由于是與人親緣近的猿猴細(xì)胞和組織，適合用于針對(duì)各種藥劑的各種實(shí)驗(yàn)的被檢測體，組織或細(xì)胞的移植模型等。
以下通過實(shí)施例等進(jìn)一步詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。而在以下的實(shí)施例等中，「％」在沒有特別說明時(shí)表示重量％。而在CO2、O2和N2中「％」表示體積％。實(shí)施例1食蟹猴的囊胚泡期胚胎的制作方法猿猴類與小鼠、大鼠或兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同，目前利用卵管或子宮環(huán)流的受精卵回收法還沒有確立。而且已經(jīng)知道從子宮內(nèi)回收排卵周期的體內(nèi)受精卵的方法效率極低。
本發(fā)明為了獲得適合于建立胚胎干細(xì)胞的囊胚泡期胚胎，對(duì)通過體外授精法和顯微授精法進(jìn)行受精，然后對(duì)通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚胎的方法進(jìn)行了研究。(1)卵巢刺激法將促性腺激素釋放激素(GnRH)[商品名Leuplin、武田藥品工業(yè)(株)公司生產(chǎn)；或商品名Sprecur，Hoechst Marion Roussel公司生產(chǎn)]1.8mg注入雌性食蟹猴(4～15齡)皮下。從注入GnRH2周后開始一天一次連續(xù)9天，在每天的一定時(shí)刻(在本實(shí)施例中是傍晚時(shí)刻)肌肉注射妊娠馬血清促性腺激素(PMSG)[商品名Serotropin、帝國臟器制藥(株)公司生產(chǎn)](25IU/kg)、或人絕經(jīng)期尿促性腺激素(hMG)[Pergonal，帝國臟器制藥(株)公司生產(chǎn)](10IU/kg)、或促卵泡激素(FSH)[Fertinorm，Serono Laboratories公司生產(chǎn)](3IU/kg)。注入5日后，用腹腔鏡(外徑3mm)觀察卵巢，確認(rèn)卵泡有無發(fā)育。
然后，注入PMSG、hMG或FSH，確認(rèn)卵泡發(fā)育充分后，進(jìn)行一次肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)[商品名Puberogen、三共(株)公司生產(chǎn)](400IU/kg)。注射hCG 40小時(shí)后，進(jìn)行采卵。
采卵可以通過對(duì)卵巢進(jìn)行腹腔鏡(外徑10mm)觀察下，使用裝有含有約0.5ml的10％SSS(Irvine Scientific Sales Inc.公司生產(chǎn))的α-MEM(α-調(diào)節(jié)的Eagles培養(yǎng)基，ICD Biomedical Inc.生產(chǎn))溶液的60mm的帶有19G或20G卡特蘭針的2.5ml注射器，對(duì)卵泡穿刺，吸引，與卵泡液一起回收卵子。
回收后立即在實(shí)體顯微鏡下分離包含在卵丘細(xì)胞中的成熟卵子，移到含有0.3％BSA的TALP(以下表示為BSA/TALP)中。于5％CO2、5％O2、90％N2、37℃的條件下進(jìn)行3～4小時(shí)的前培養(yǎng)。
象以上那樣，在腹腔鏡觀察下采卵只是在腹壁上切開約1cm的口，從切口處插入腹腔鏡，通過腹壁實(shí)施卵巢穿刺進(jìn)行采卵。
另外作為采卵方法，通常如果采卵對(duì)象是小鼠，是采用摘出子宮后，進(jìn)行卵管灌流的卵巢摘出法，而如果是人是通過使用超聲波裝置的卵巢穿刺法進(jìn)行的。然而猿猴類由于個(gè)體數(shù)有限，所以有時(shí)不能使用卵巢摘出法。而由于體軀比人小，使用超聲波診斷裝置的方法非常困難。因此作為在國內(nèi)外用于猴類的體外受精的未受精卵的回收方法通常都是通過開腹，在直視卵巢下的卵巢穿刺法。然而該方法存在著①使個(gè)體負(fù)擔(dān)大、②手術(shù)后的創(chuàng)傷治愈需要時(shí)間、③感染的危險(xiǎn)性大等缺點(diǎn)。
與上述方法相比，本實(shí)施例中的方法不用說可以得到比直視下更擴(kuò)大的圖象。因此可以正確地捕捉到穿刺部位進(jìn)行采卵。而在采卵后由于只是對(duì)腹壁進(jìn)行1針縫合，時(shí)間非常短就可以結(jié)束了，所以從愛護(hù)動(dòng)物的觀點(diǎn)出發(fā)是個(gè)非常有用的方法。(2)精子的采集(i)從附睪的采集法在采集雄性食蟹猴(10～15齡)的附睪后，立即將裝有23G針頭的1ml注射器插入精管，慢慢地注入含有0.3％BSA的BWW(以下表示為BSA/BWW)，切斷附睪尾部，采集流出的精液。(ii)利用電刺激法的采集法i)直腸法使用鹽酸氯胺酮、鹽酸甲苯噻嗪(分別為5mg/kg和1mg/kg)對(duì)雄性食蟹猴(10～15齡)進(jìn)行麻醉，呈仰臥位。將凝膠乳膏涂到裝在電刺激器上的棒狀直腸電極，將該電極輕輕插入到上述猿猴的直腸。用滅菌的生理鹽水洗凈陰莖，用紙巾擦干，將陰莖的前端放人試管(50ml)中。然后將電刺激器設(shè)定在交流電壓、5V之后通電。通電3～5秒后，停5秒。反復(fù)操作最多進(jìn)行3次?？吹缴渚珪r(shí)結(jié)束。沒有看到射精時(shí)，將電壓設(shè)定為10V進(jìn)行同樣的操作。還沒有看到射精時(shí)就將電壓設(shè)定為15V、20V進(jìn)行同樣的操作。ii)陰莖法在無麻醉下，將雄性食蟹猴(10～15齡)的四肢固定在籠子前面，將陰莖置于容易固定的位置。帶著手術(shù)用橡膠手套，用無菌生理鹽水洗凈陰莖，用紙巾擦干。準(zhǔn)備電刺激器，將電極裝到陰莖上，用夾子夾在一起。通電，首先在直流電壓5V下每隔1秒反復(fù)進(jìn)行開-關(guān)，同時(shí)漸漸地縮短間隔操作。沒有看到射精時(shí)，在10V、15V、20V下進(jìn)行同樣操作。還沒有看到射精時(shí)用交流反復(fù)進(jìn)行同樣操作。(3)精液采集后的處理和冷凍保存法(Torii et al.1998)將利用直腸法或陰莖法采集的精液于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置約30分鐘。只采集液體成分，加入含有0.3％BSA的BWW(Biggers，Whitten and Wittinghams)(BSA/BWW)培養(yǎng)液約1～2ml調(diào)制精子溶液后，靜靜地鋪在80％珀可(percoll)(AmericanPermacia Biotech Inc.生產(chǎn))2.5ml和60％珀可2.5ml液體上。將得到的混合物于1400rpm、室溫下離心分離20分鐘后，試管內(nèi)底部約殘留0.5ml，吸引除去上層。再添加約10ml BSA/BWW，輕輕混合。得到的混合物于1400rpm、室溫下離心分離3分鐘后，試管內(nèi)底部約殘留0.5ml，吸引除去上層。
向得到的精子中加入適量的BSA/BWW使精子數(shù)變?yōu)榧s5×107～1.0×108個(gè)，制備精子溶液，于4℃下靜置約60～90分鐘。然后于冰水中慢慢地滴入精子溶液1/5量的含有TTE-G溶液[含有終濃度12％甘油的TTE培養(yǎng)基(100ml培養(yǎng)基中的組成Tes 1.2g、Tris-HCl0.2g、葡萄糖2g、乳糖2g、蜜三糖0.2g、卵黃20ml、青霉素G10,000IU、鏈霉素硫酸鹽5mg)]，靜置5分鐘。反復(fù)進(jìn)行5次上述的TTE-G溶液的滴入和靜置。
冰水中放置60～90分鐘后，將得到的精子溶液裝入0.25或0.5ml的麥桿吸管。將麥桿吸管于液氮容器的上部維持約5分鐘后，再于液氮上面維持5分鐘。然后將上述麥桿吸管投入到液氮中保存。(4)體外受精用精子的制備從液氮中取出的麥桿吸管一旦于室溫下保持30秒后，就投入到37℃的溫浴中，保持30秒鐘，使保存精子溶液融解。然后向上述麥桿吸管加入含有1mM咖啡因(Sigma公司生產(chǎn))和1mMdbC-AMP(Sigma公司生產(chǎn))的BSA/BWW 10ml，于37℃條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱溫育30分鐘，使精子獲得受精能力。
然后于1,000rpm(200g)離心分離精子溶液2分鐘，棄掉上清。向留下的精子中重新加入含有1mM咖啡因和1mMdbC-AMP的BSA/BWW約0.5～1ml。將得到的精子溶液于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置60分鐘，收集向上泳動(dòng)的精子，確認(rèn)精子的運(yùn)動(dòng)性和精子數(shù)。這樣一來就獲得了體外受精用精子。(5)受精方法l)體外受精法在塑料培養(yǎng)皿內(nèi)用礦物油包被的50μl BSA/BWW的培養(yǎng)液小滴中，加入被卵丘細(xì)胞包裹的卵子1～5個(gè)。然后將精子懸浮液移到培養(yǎng)液小滴中使精子數(shù)達(dá)到5.0×105～1.0×106個(gè)(精子)/ml。培養(yǎng)液小滴用礦物油包被，然后進(jìn)行受精。
受精后的卵子于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。受精5小時(shí)后，將BWW液換成TALP液，確認(rèn)是否受精。結(jié)果以約45％的高受精率獲得受精卵。對(duì)于確認(rèn)受精的卵子培養(yǎng)約20小時(shí)之后，移至CMRL-1066液中繼續(xù)培養(yǎng)。2)顯微授精法(i)卵子的制備將回收的卵母細(xì)胞集中在含有用礦物油(Sigma公司生產(chǎn))包被的50μl的含有0.3％BSA的TALP(BSA/TALP)培養(yǎng)液小滴中后，于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的條件下進(jìn)行2-4小時(shí)前培養(yǎng)。
為了確認(rèn)卵子成熟的狀態(tài)可以用將卵母細(xì)胞培養(yǎng)物加到含有0.1％的透明質(zhì)酸酶(Sigma公司生產(chǎn))的TALP-HEPES溶液中1分鐘，用移液管除去卵丘細(xì)胞，回收的卵子用倒置顯微鏡分為以下級(jí)數(shù)-1～44類。
級(jí)數(shù)-1具有極體(PB)的成熟卵子、級(jí)數(shù)-2沒有觀察到PB和卵核胞(GV)的成熟過程中的卵子、級(jí)數(shù)-3觀察到GV的未成熟卵子、級(jí)數(shù)-4形狀變形顯著，或細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出變性、退行性變化的卵子。
級(jí)數(shù)-1卵子經(jīng)確認(rèn)后立即供顯微授精測試。對(duì)于級(jí)數(shù)-2和級(jí)數(shù)-3的卵子再集中在用礦物油包被的50μl的BSA/TALP的培養(yǎng)液小滴中后，于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)卵子的成熟狀態(tài)進(jìn)行確認(rèn)。此時(shí)成熟的卵子供受精實(shí)驗(yàn)用。對(duì)于其余未成熟卵子和級(jí)數(shù)-4卵子不能用于受精實(shí)驗(yàn)。(ii)精子的制備按照體外受精的方法進(jìn)行。(iii)顯微授精法在裝備了Narishige公司生產(chǎn)的顯微操作器的倒置顯微鏡下IX70進(jìn)行顯微授精。
在150mm培養(yǎng)皿中依次放置培養(yǎng)液小滴1∶15μl稀釋精子，培養(yǎng)液小滴2∶10％聚乙烯吡咯烷酮PBS培養(yǎng)液[PVP平均分子量約360，000，Nacalaitesque公司]5μl×3個(gè)和培養(yǎng)液小滴3卵子操作用的TALP-HEPES(最終濃度3mg/ml BSA)溶液5μl×3個(gè)，表面用礦物油覆蓋，防止干燥，作為顯微授精的操作區(qū)。另外本實(shí)施例中，為了使操作溫度一定，根據(jù)需要可以使用加溫步驟。
作為注入用的針頭使用人顯微授精用的傾斜角度為30度的針頭(外徑約7～8μm、內(nèi)徑5～7μm，メデイ-·コンインタ-ナシヨナル公司生產(chǎn))。將上述針頭裝到動(dòng)作精度高的ALCATEL注射器上。
作為保持卵子的針頭，使用上述同樣的人顯微授精用的傾斜角度為30度的針頭、或用磁性·plur(PN-30、Narishige公司生產(chǎn))制作的外徑約為100μm、針尖的內(nèi)徑約為15μm的針頭。上述針頭裝到帶有2000μl的空氣型注射器的Narishige注射器上。
在培養(yǎng)液小滴1按照人顯微授精的標(biāo)準(zhǔn)選擇具有運(yùn)動(dòng)性的精子吸入之后，將得到的精子移到培養(yǎng)液小滴2，排出。在培養(yǎng)液小滴2中由于PVP的粘性，精子的運(yùn)動(dòng)性降低。用注射器針頭擦該精子的尾部，破壞部分膜，使精子的運(yùn)動(dòng)停止。將該精子與粘性高的溶液一起吸入，移到培養(yǎng)液小滴3。
將成熟的卵子加入到培養(yǎng)液小滴3，使用保持用針頭，為了不用注入用針頭破壞處于極體的下部的染色體，于該位置固定6或12小時(shí)。然后將精子置于注入用針頭的前端，將該精子刺入卵子。確認(rèn)針頭通過透明帶后，吸引卵細(xì)胞膜。確認(rèn)膜發(fā)生破裂后，將注入用針頭內(nèi)的內(nèi)含物(精子和卵子的細(xì)胞質(zhì))注入。反復(fù)進(jìn)行有關(guān)精子和卵子的細(xì)胞質(zhì)的注入的一系列操作。一次操作對(duì)2～3個(gè)卵子進(jìn)行顯微授精。當(dāng)精子和卵細(xì)胞質(zhì)污染了針尖內(nèi)側(cè)時(shí)，用培養(yǎng)液小滴2洗凈。
將顯微授精的卵子立即放回到培養(yǎng)箱中，于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的條件下開始培養(yǎng)。顯微授精后立即在60mm未覆蓋的培養(yǎng)皿中制作50μl的CMRL-1066溶液的培養(yǎng)液小滴，然后用液體石蠟包被。而培養(yǎng)液小滴與氣相的平衡原則上進(jìn)行3小時(shí)以上。在顯微授精后24小時(shí)，由TALP溶液移至上述CMRL-1066溶液的培養(yǎng)液小滴，在二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃、5％CO2、5％O2、90％N2的條件下一直密封培養(yǎng)8天。結(jié)果以約75～85％的高受精率獲得受精卵。
象上述那樣當(dāng)進(jìn)行猿猴類的體外受精、顯微授精時(shí)，進(jìn)行了精子的活化。對(duì)于小鼠和人，在進(jìn)行通常的體外受精、顯微授精時(shí)可以直接使用精子，但在本實(shí)施例中為了獲得更高的受精率，通過咖啡因和dbC-AMP進(jìn)行了活化，通過游泳法獲得受精能力更高的精子。通過加入該操作，表明在體外受精中可以得到高的受精率。而對(duì)于缺乏運(yùn)動(dòng)性不適合體外受精的精子也可通過同樣的處理通過顯微授精獲得高效率受精。該方法表明在供給受精率不好的精子時(shí)是非常有效的。(6)培養(yǎng)方法在體外受精和顯微授精中確認(rèn)受精后，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)為避免溫度和二氧化碳濃度急劇變化，在人中不能進(jìn)行，而在小鼠和兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中廣泛采用的用礦物油覆蓋培養(yǎng)基的微小懸滴培養(yǎng)法。為避免由于觀察培養(yǎng)過程可能引起的溫度或pH變化等不必要的事件發(fā)生，在體外受精培養(yǎng)開始后7天、顯微授精培養(yǎng)開始后8天，在預(yù)料囊胚泡期胚出現(xiàn)之前不要開閉培養(yǎng)器門，要密閉進(jìn)行培養(yǎng)。
這里使用的培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)氣相如下。培養(yǎng)液TALP和CMRL-1066通常對(duì)于小鼠使用BWW和對(duì)于人使用P1(ナカメデイカル公司生產(chǎn))、胚細(xì)胞基質(zhì)(ナカメデイカル公司生產(chǎn))以及新開發(fā)的HFF(人卵泡液(human follicular fluid)、扶桑藥品(株)公司生產(chǎn))，結(jié)果表明能順利進(jìn)行受精和分裂，直至發(fā)育成桑椹胚。確認(rèn)受精后通過使用TALP和CMRL-1066組合的培養(yǎng)液表明能夠看到向囊胚泡期胚胎的發(fā)育，而且得到受精胚的40～46％的極高的發(fā)育率。在培養(yǎng)箱外的操作通過不使用磷酸緩沖液體系的PBS而使用HEPES緩沖液體系的TALP，可以減少對(duì)卵子的壞影響。培養(yǎng)溫度38℃對(duì)于小鼠和人通常培養(yǎng)溫度為37℃，在這個(gè)溫度下發(fā)育緩慢，而且完全不會(huì)向桑椹胚以后發(fā)育。因此與在38.5℃進(jìn)行胚胎培養(yǎng)的牛等同樣，通過在38℃和稍高的溫度進(jìn)行培養(yǎng)，體外受精7天后，顯微授精8天后可以得到囊胚泡期胚胎。培養(yǎng)氣相5％CO2、5％O2、90％N2在通常利用的5％CO2、95％空氣的條件下，發(fā)育停止在桑椹胚，但通過在5％CO2、5％O2、90％N2下進(jìn)行培養(yǎng)，能夠看到向囊胚泡期胚胎發(fā)育的高發(fā)育率。實(shí)施例2猿猴ES細(xì)胞建立法(1)滋養(yǎng)細(xì)胞的制作將從12.5日齡的小鼠胚胎得到的初代胚成纖維細(xì)胞(以下也稱為PEFs)于含有10％胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中經(jīng)初代～3代培養(yǎng)至鋪滿為止。然后于含有終濃度10μg/ml絲裂霉素C(MMC)的MEM培養(yǎng)基中對(duì)PEFs培養(yǎng)2～3小時(shí)，對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行鈍化。然后除去含有MMC的培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS洗3次。通過胰蛋白酶處理(0.05％胰蛋白酶、1mM EDTA)，將洗凈后的細(xì)胞從培養(yǎng)皿剝離下來，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
明膠包被的24孔培養(yǎng)皿的各個(gè)孔中播種2×104個(gè)經(jīng)MMC處理的PEFs。
就得到的細(xì)胞實(shí)際播種到培養(yǎng)皿上，在確認(rèn)比較合適的細(xì)胞數(shù)后對(duì)鼠ES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，研究其性質(zhì)。結(jié)果表明增殖能力良好，由于維持未分化狀態(tài)，得到的細(xì)胞適合作為滋養(yǎng)細(xì)胞。而培養(yǎng)至3代以下(初代～3代)的滋養(yǎng)細(xì)胞好用。(2)從猴囊胚泡期胚胎分離內(nèi)部細(xì)胞塊將除去透明帶的囊胚泡期胚胎移至含有最終濃度為0.5％的鏈霉蛋白酶或蒂羅德(Tyrode)溶液的M2培養(yǎng)液[例如，參照D.M.Glover等人編寫，DNA Cloning 4 Mammalian Systems A Practical Approach第2版(1995)等文獻(xiàn)]中，37℃下進(jìn)行溫育10分鐘。對(duì)于還殘留透明帶的囊胚泡期胚于37℃下用鏈霉蛋白酶處理5分鐘。確認(rèn)除去透明帶后，得到的囊胚泡期胚胎用PBS洗2次。
然后將囊胚泡期胚移至用M16培養(yǎng)液[上述DNA Cloning 4Mammalian Systems A Practical Approach]稀釋兔抗食蟹猴淋巴球血清20倍的溶液中，于37℃下溫育30分鐘。然后得到的囊胚泡期胚用PBS洗3次。將囊胚泡期胚移至用M16培養(yǎng)液稀釋50倍的補(bǔ)體溶液中，于37℃下溫育30分鐘。得到的囊胚泡期胚用PBS洗3次。當(dāng)囊胚泡期胚的營養(yǎng)外胚層沒有完全除去時(shí)，使用玻璃針在顯微鏡下通過物理方法也可以將營養(yǎng)外胚層除去。通過這樣方式對(duì)內(nèi)部細(xì)胞塊(InnerCell Mass；ICM)進(jìn)行分離(3)猴內(nèi)部細(xì)胞塊的培養(yǎng)從播種了(1)中得到的滋養(yǎng)細(xì)胞的24孔培養(yǎng)皿中除去MEM培養(yǎng)基，然后每孔各加入800μl的ES細(xì)胞培養(yǎng)基[表3]。
接下來用微量移液管將(2)中得到的ICM移至各個(gè)孔中(每孔一個(gè))，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)7天。為了不妨礙ICM的著床，從培養(yǎng)開始后3天內(nèi)不換培養(yǎng)液，每日在顯微鏡下觀察著床狀況。
在培養(yǎng)第7天進(jìn)行ICM細(xì)胞的解離。從孔中除去ES細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗1次。向孔中加入300μl的0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA，然后立即除去。對(duì)24孔培養(yǎng)皿于37℃下溫育1分鐘。在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞的解離進(jìn)行確認(rèn)后，向孔中加入500μl的ES細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液管充分?jǐn)嚢琛?br> 向預(yù)先播種了滋養(yǎng)細(xì)胞的24孔培養(yǎng)皿的孔中移入上述的全細(xì)胞。添加300μl的ES細(xì)胞培養(yǎng)基，加了總計(jì)800μl的ES細(xì)胞培養(yǎng)基后，充分混合使其不出現(xiàn)細(xì)胞播種的痕跡。每2天更換一次ES細(xì)胞培養(yǎng)基。解離后，于7天內(nèi)認(rèn)為是ES細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)增殖，以集落出現(xiàn)，每日進(jìn)行觀察。
如果出現(xiàn)ES細(xì)胞集落，對(duì)24孔培養(yǎng)皿上的細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。其間，每天或每2天一次更換ES細(xì)胞培養(yǎng)基。結(jié)果從食蟹猴囊胚泡期胚胎可以得到許多ES細(xì)胞株。實(shí)施例3猿猴ES細(xì)胞的評(píng)價(jià)(1)食蟹猴ES細(xì)胞核型(karyotype)研究染色體數(shù)是否正常(與作為起源的猴染色體數(shù)同樣的數(shù)2n＝42)。結(jié)果表明建立的ES細(xì)胞株保持正常的核型。多分化能力將1×106個(gè)食蟹猴ES細(xì)胞注射到8周齡的SCID鼠頸部皮下。在注射5～12周后確認(rèn)有腫瘤形成。將上述腫瘤用布郎(ブラン)液固定后，切成薄片，實(shí)施蘇木精嗜紅染色(HE染色)或免疫染色，進(jìn)行組織學(xué)檢查。而在免疫染色中，由于能夠利用的猴組織特異抗體極少，所以使用針對(duì)人神經(jīng)元特異的烯醇化酶(NSE)的抗體、針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)纖維性酸性蛋白質(zhì)(GFAP)的抗體，針對(duì)S-100蛋白質(zhì)的抗體和針對(duì)肌纖維蛋白的抗體。
其結(jié)果表明形成的腫瘤是由來自外胚層(神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì))、中胚層(肌肉、軟骨、骨)和內(nèi)胚層(纖毛上皮、腸道上皮)的細(xì)胞群構(gòu)成的畸胎瘤。而在免疫學(xué)檢查中神經(jīng)元可以通過針對(duì)NSE的抗體、而神經(jīng)膠質(zhì)可以通過針對(duì)NSE的抗體和針對(duì)GFAP抗體，末梢神經(jīng)可以通過針對(duì)NSE的抗體，軟骨可以通過針對(duì)S-100蛋白質(zhì)的抗體，肌肉可以通過針對(duì)肌纖維蛋白的抗體檢測。以上結(jié)果表明食蟹猴ES細(xì)胞具有向來自外胚層的細(xì)胞、來自中胚層的細(xì)胞、來自內(nèi)胚層的細(xì)胞等，更具體來說向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、肌肉、軟骨、骨、絨毛上皮、腸道上皮等的多分化能力。
圖3的畫面A～H給出了上述HE染色后顯微鏡觀察的結(jié)果，圖3畫面I～M分別給出了免疫后的顯微鏡觀察的結(jié)果。形態(tài)學(xué)特征圖1和圖2的畫面A和畫面B給出了下述形態(tài)學(xué)特征1.表現(xiàn)出高的核/細(xì)胞質(zhì)比、顯著的核仁、集落形成。
2.與鼠ES細(xì)胞相比，集落形態(tài)為扁平。細(xì)胞表面標(biāo)記的出現(xiàn)為了確認(rèn)有無作為細(xì)胞表面標(biāo)記的階段特異胚胎抗體(Stage-specific embryonic antigens)(SSEA)，使用針對(duì)SSEA-1(陰性對(duì)照)、SSEA-3、SSEA-4的各個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體，進(jìn)行免疫染色。這些抗體從The Developmental Studies Hybridoma Bank ofthe national Institute of Child Health and Human Development獲得。對(duì)于SSEA的各個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記通過以下操作進(jìn)行評(píng)價(jià)使4％對(duì)-甲醛固定的細(xì)胞和一次抗體反應(yīng)。然后使過氧化物酶和二次抗體結(jié)合的標(biāo)記聚合物(シンプルステインPO，ニチレイ公司生產(chǎn))與氨基酸聚合物反應(yīng)后，加入シンプルステイン DAB溶液(ニチレイ公司生產(chǎn))進(jìn)行檢測。
結(jié)果沒有檢測出SSEA-1，而檢測出了SSEA-3和SSEA-4。
所述免疫染色的SSEA-4的檢出結(jié)果如圖2的畫面D所示。堿性磷酸酶活性以Fast-Red TR SaH作為底物，使用HNPP(ロツシユ公司生產(chǎn))測定堿性磷酸酶活性。結(jié)果檢測出堿性磷酸酶活性。圖2中的畫面C給出了這些檢測結(jié)果。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的來自猴胚胎干細(xì)胞在靈長類、特別是人、猿猴的胚胎學(xué)研究、疾病研究、臨床應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷确矫媸怯杏玫?；利用本發(fā)明的來自猴干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，由于可以高收率獲得來自猿猴的干細(xì)胞，有望用于靈長類胚胎學(xué)的研究、疾病研究、以及應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?。另外根?jù)本發(fā)明的用于進(jìn)行對(duì)組織或細(xì)胞特異分化用試劑的篩選方法，可用于為獲得所期望的分化細(xì)胞或分化組織，進(jìn)行組織或細(xì)胞特異分化的試劑的篩選。
權(quán)利要求
1.可以通過包括以下工序的方法獲得的來自猿猴的胚胎干細(xì)胞，(a)使用猿猴的卵子和精子，利用體外受精法或顯微授精法進(jìn)行受精，得到受精卵的工序，(b)使用工序(a)得到的受精卵通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚胎的工序，以及(c)通過利用工序(b)得到的囊胚泡期胚胎建立胚胎干細(xì)胞工序。
2.權(quán)利要求1記載的胚胎干細(xì)胞，其中猿猴是日本猴或食蟹猴。
3.權(quán)利要求1記載的胚胎干細(xì)胞，其中猿猴是食蟹猴。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中在工序(a)中使用從TALP液、TALP-HEPES液和BWW液中選擇出的培養(yǎng)液。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中工序(b)中的體外培養(yǎng)法是微小懸滴培養(yǎng)法。
6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中在工序(b)中使用CMRL-1066實(shí)施體外培養(yǎng)法。
7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中在工序(b)中培養(yǎng)溫度是38℃。
8.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中在工序(b)中培養(yǎng)條件是5％CO2、5％O2、90％N2條件。
9.來自猿猴胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其包括以下工序(a)使用猿猴的卵子和精子，利用體外受精法或顯微授精法進(jìn)行受精，得到受精卵的工序，(b)使用工序(a)得到的受精卵通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚胎的工序，以及(c)通過利用工序(b)得到的囊胚泡期胚胎建立胚胎干細(xì)胞工序。
10.權(quán)利要求9記載的方法，其中猴是日本猴或食蟹猴。
11.權(quán)利要求9記載的方法，其中猴是食蟹猴。
12.權(quán)利要求9～11任一項(xiàng)記載的方法，其中在工序(a)中使用從TALP液、TALP-HEPES液和BWW液中選擇出的培養(yǎng)液。
13.權(quán)利要求9～12任一項(xiàng)記載的方法，其中工序(b)中的體外培養(yǎng)法是微小懸滴培養(yǎng)法。
14.權(quán)利要求9～13任一項(xiàng)記載的方法，其中在工序(b)中培養(yǎng)溫度是38℃。
15.權(quán)利要求9～14任一項(xiàng)記載的方法，其中在工序(b)中培養(yǎng)條件是5％CO2、5％O2、90％N2條件。
16.權(quán)利要求9～15任一項(xiàng)記載的方法，其中在工序(b)中使用CMRL-1066實(shí)施體外培養(yǎng)法。
17.建立的來自食蟹猴的細(xì)胞，其具有下述特性(i)可維持未分化狀態(tài)進(jìn)行增殖繼代、(ii)具有與起源的食蟹猴個(gè)體相同的染色體數(shù)、(iii)通過移植到8～12周齡的SCID小鼠或裸鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸，可以確認(rèn)多分化能力、(iv)對(duì)SSEA-1呈陰性，而對(duì)SSEA-3、SSEA-4呈陽性、以及(v)檢測出堿性磷酸酶活性。
18.權(quán)利要求17記載的建立的來自食蟹猴的細(xì)胞，其中當(dāng)移植到8～12周齡的SCID小鼠或裸鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸時(shí)，至少表現(xiàn)出向選自外胚層、中胚層和內(nèi)胚層中的至少一種的分化能力。
19.權(quán)利要求17或18記載的建立的來自食蟹猴的細(xì)胞，其中當(dāng)移植到8～12周齡的SCID小鼠或裸鼠的皮下、腎筋膜下或睪丸時(shí)，表現(xiàn)出向選自神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、肌肉、軟骨、骨、纖毛上皮、腸道上皮中至少一種分化能力。
20.為進(jìn)行組織或細(xì)胞的特異分化的試劑的篩選方法，其特征是，在被檢測物質(zhì)存在下，維持從權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)記載的來自猿猴的胚胎干細(xì)胞以及權(quán)利要求17～19任一項(xiàng)記載的來自食蟹猴的細(xì)胞選擇出的細(xì)胞。
21.從權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞以及權(quán)利要求17～19任一項(xiàng)記載的來自食蟹猴的細(xì)胞中選擇出的細(xì)胞分化形成的分化細(xì)胞或分化組織。
全文摘要
使用猿猴的卵子和精子，利用體外受精法或顯微授精法進(jìn)行受精，得到受精卵，使用該受精卵通過體外培養(yǎng)法使發(fā)育成囊胚泡期胚胎，利用該囊胚泡期胚胎建立ES細(xì)胞的，猿猴ES細(xì)胞的生產(chǎn)方法；以及利用該方法得到的猿猴ES細(xì)胞、使用該ES細(xì)胞對(duì)組織或細(xì)胞特異分化用試劑的篩選方法；由該ES分化的分化細(xì)胞或分化組織。本發(fā)明有望用于靈長類胚胎學(xué)的研究、疾病研究、以及應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷取?br> 文檔編號(hào)C12N5/0735GK1447854SQ01814239
公開日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2001年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月15日
發(fā)明者中辻憲夫, 多田高, 鳥居隆三, 細(xì)井美彥, 入谷明, 芥照夫 申請(qǐng)人:田邊制藥株式會(huì)社