專利名稱：胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的體外誘導和分離提純培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞的體外誘導和分離提純培養(yǎng)方法，尤其涉及胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的體外誘導和分離提純培養(yǎng)方法。
背景技術：
胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)是由哺乳動物早期胚泡的內細胞團中分離出的一類未分化二倍體細胞，具有自我更新和全能分化的潛能[1]。特定條件下胚胎干細胞能保持未分化狀態(tài)并可無限擴增，具有分化為構成機體所有組織和細胞的潛能，是一種無限的細胞來源，它在臨床細胞、組織、器官修復和移植治療上的潛力十分巨大。能控制胚胎干細胞的定向分化生成各種所需的目的細胞用于細胞治療甚或構建所需的器官，這正是眾多研究者夢寐以求的。人類ES細胞的建系使得干細胞研究連續(xù)兩年被Science雜志評為世界十大科技進展，胚胎干細胞的研究熱潮也就此掀起[2]。已有多項研究結果示胚胎干細胞能分化生成成熟的肝細胞。[3]-[5]我們先前的研究也證實了這一點[6]。作為一種肝干細胞，肝卵圓細胞(Hepatic oval cells)是具有自我更新能力、能分化生成肝細胞和膽管上皮細胞等肝實質細胞的成體干細胞。1958年Leduc和Wilson在用電鏡研究藥物誘導小鼠肝損傷后局部形態(tài)變化時，發(fā)現(xiàn)了肝卵圓細胞。它是是一類體積較小、卵圓型細胞核、胞質較少呈嗜堿性、核漿比較高的、細胞器不發(fā)達的細胞。如果肝臟嚴重受損致使肝細胞大部分壞死，或由于某些原因(肝毒性物質、致癌物質的作用)抑制殘留肝細胞增殖時，肝內卵圓細胞被激活。正是基于這個理論，人們以嚙齒類動物為對象建立了較成熟的肝卵圓細胞誘導實驗模型食物中持續(xù)添加低劑量2-乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene，2-AAF)加上三分之二肝切除[7]，或者食物中添加3，5-二乙羰基-1，4-二氫-三甲基吡啶(3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-collidine，DDC)[8]等。借助這些動物模型，人們對嚙齒類動物肝卵圓細胞的認識有了很大的提高。誘導后對肝卵圓細胞的分離方法，現(xiàn)多采用改良的兩步膠原酶灌注法分離肝實質細胞和非實質細胞，然后使用等密度梯度離心法離心(將percoll液配成不連續(xù)濃度的梯度離心液)，最后于50％至70％percoll層間獲得肝卵圓細胞。[9]-[10]一系列的體內、體外實驗證實了卵圓細胞有雙向分化潛能，既能增殖分化生成肝細胞，又能增殖分化生成膽管細胞[11]-[14]。也有研究示卵圓細胞亦可轉分化生成非肝系細胞，如胰島內分泌細胞[15]等?，F(xiàn)已知肝損傷刺激能引起肝內如肝星形細胞(hepatic stellate cells)等非實質細胞分泌多種細胞因子，包括肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth factor，HGF)，轉生長因子α(Transforming growth factorα，TGF-α)，轉生長因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)，表皮生長因子(epidermal growth facter，EGF)，酸性成纖維細胞生長因子(acid fibroblast growth factor，α-FGF)等，它們對卵圓細胞激活、增生、分化過程有著重要調控作用。卵圓細胞表達HGF配體c-met，星形細胞分泌的HGF結合c-met后強烈地促進卵圓細胞的增殖(使其DNA合成水平明顯增高)。使用攜帶HGF cDNA的重組腺病毒轉染卵圓細胞，增殖細胞核抗原PCNA(+)的卵圓細胞量可明顯增高。單用HGF時，卵圓細胞明顯誘導膽管上皮的增生，HGF與EGF、SCF等聯(lián)用時能明顯誘導肝板或肝索樣結構的形成，EGF對卵圓細胞到肝細胞的定向誘導有關鍵性作用。[16]-[18]到目前為止，在胚胎干細胞體外定向誘導生成肝實質細胞的過程中是否存在著有雙向分化能力的胚胎干細胞源性肝卵圓細胞這個中間分化階段，及HGF與EGF對胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的生成是否有作用，國內外一直沒有相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一個高效的肝卵圓細胞新誘導模型。
本發(fā)明要解決的技術問題是解決現(xiàn)有技術中嚙齒類動物卵圓細胞誘導模型誘導過程煩瑣耗時、誘導劑均為化學毒性物質，具有不利影響，從而限制其應用范圍的缺陷；證實在胚胎干細胞體外定向誘導生成肝實質細胞的過程中存在著有雙向分化能力的胚胎干細胞源性肝卵圓細胞這個中間分化階段，及HGF與EGF對胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的生成有顯著性誘導作用；以及快速便捷地誘導并分選出合適的肝卵圓細胞。
本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)選用小鼠胚胎干細胞，轉成擬胚體分化3天后分組，誘導組添加肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)作定向誘導分化；期間用免疫細胞化學檢測肝卵圓細胞標志物A6等的表達，用流式細胞儀分析并使用Sca-1和CD34雙指標篩選A6+肝卵圓細胞，所篩選的卵圓細胞行RT-PCR、透射電鏡檢測，并計算肝卵圓細胞分化率；篩選的A6+/Sca-1+/CD34+肝卵圓細胞繼續(xù)體外培養(yǎng)并檢驗其是否具有雙向分化能力；用原子力顯微鏡研究A6陽性肝卵圓細胞膜表面超微結構。
本發(fā)明的技術效果本發(fā)明首次證實胚胎干細胞體外定向誘導生成肝實質細胞的過程中存在著A6陽性的胚胎干細胞源性肝卵圓細胞(RT-PCR及透射電鏡檢測亦證實其存在)；FACS篩選的A6陽性卵圓細胞能分化生成成熟的肝細胞和膽管細胞。
HGF和EGF能顯著性誘導胚胎干細胞源性卵圓細胞的生成，誘導組肝卵圓細胞分化率均顯著的高于對照組，最高時可達4.46％左右；使用雙指標流式細胞術能篩選出較高比例A6+肝卵圓細胞(約92.48％)，篩選出的A6+肝卵圓細胞在總細胞中所占的比例為1.12％左右，整個誘導方法較簡便，誘導周期也很短。
利用本發(fā)明所闡述的肝卵圓細胞誘導培養(yǎng)方法，利用很少的胚胎干細胞種源便可誘導生成足夠多的、能滿足臨床需要的肝卵圓細胞，進而可用于肝卵圓細胞移植、肝臟組織工程學等臨床范疇，對各種原因所致肝功能衰竭、肝代謝疾病等起到輔助支持治療或治愈疾病的功用。
四

圖1.ESC向肝實質細胞誘導分化過程中的細胞生長狀態(tài)。(A)ESC呈集落樣生長，緊密排列，界限不清(200×)；(B)ESC呈透明的球形(400×)；(C)誘導組-Day8，形態(tài)較均一，呈鋪路石樣(100×)；(D)對照組-Day8，形態(tài)較復雜，三角形、圓形、梭形細胞相混生長(100×)圖2.胚胎干細胞向肝實質細胞誘導分化過程中細胞及流式分選細胞培養(yǎng)后的子代細胞A6抗原和ALB抗原的表達。(A)-(E)示第9天誘導組分化細胞群A6(+)細胞(箭頭示)。(B)-(D)為(A)的局部放大。單個A6(+)細胞呈卵圓形，A6陽性卵圓細胞主要分布在擬胚體貼壁后所形成的細胞集落之中(圖2B、C)，以及外周分化較成熟細胞群之間的小集落中(圖2E)。細胞集落的左下方可見兩個長梭形的A6陽性膽管上皮樣細胞(圖2D)。(F)示第15天誘導組分化細胞群中ALB(+)肝細胞，其中可見多個雙核肝細胞(箭頭示)。(G)示流式細胞儀分選的CD34+/Sca-1+細胞培養(yǎng)第15天后的ALB(+)肝細胞，其中可見多個雙核肝細胞(箭頭示)。(H)陰性對照。圖中陽性染色為棕色(DAB顯色)，蘇木精染細胞核后呈藍色。A、E、H×100，F(xiàn)、G×200，B、C、D×400。
圖3.胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的三色FACS分析。R1框選出FACS分析的細胞群，R2框選為Sca-1門選，Sca-1+細胞進一步行CD34/CD45雙標分析。UL為CD34+/CD45-，UR為CD34+/CD45+，LL為CD34-/CD45-，LR為CD34-/CD45+。誘導組的分化子代細胞中Sca-1+/CD34+/CD45+占總細胞數(shù)(R1)的2.38％，而對照組的三陽細胞只有0.10％。Sca-1+的細胞幾乎均共表達CD45(UL和UR中的細胞數(shù)為0)。
圖4.胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的雙色FACS分析。取分化第4天至第10天的誘導組和對照組的分化子代細胞，分析抗原Sca-1和CD34的表達情況(以Sca-1為門選)。誘導組的分化子代細胞中Sca-1+/CD34+細胞陽性率從分化第4天開始上升，至第8天達到高峰(1.20％)后下降；而對照組的基本上維持在一個低水平(0.03％-0.21％)。R1區(qū)中的細胞以小細胞為主，大多數(shù)細胞結構較簡單，對照組分化第8天細胞分成兩群，而誘導組則無此現(xiàn)象。R2區(qū)(Sca-1 Gated)中對照組細胞點圖一直較分散，而誘導組的隨著分化時間的推移細胞點圖趨向于集中且向右移。對照組細胞峰群相對位置一直改變不大且處于低水平，而誘導組的隨著分化時間的推移細胞峰群不斷向右移(雙陽細胞比例增大)，至第8天達到最大值。
圖5.分化第8天誘導組流式細胞儀篩選細胞A6抗原的表達情況。(A)Sca-1+/CD34+細胞(92.48％±2.01％)，絕大部分呈A6陽性，部分呈強陽性。(B)非雙陽細胞僅少數(shù)呈A6陽性(1.66％±1.57％)。(C)陰性對照。圖中陽性染色為棕色(DAB顯色)。A、B、C×100圖6.流式細胞儀篩選雙陽細胞的透射電鏡檢測。細胞體積較小(13μm左右)，核漿比高；核呈卵圓形，可見濃縮的染色質；核漿內細胞器較少，可見少量線粒體及粗面內質網(wǎng)；細胞邊緣可見少量微絨毛。標尺1μm圖7.RT-PCR分析。A為流式細胞儀篩選雙陽細胞的RT-PCR結果，肝細胞標志物AFP、ALB，膽管細胞標志物ck19，肝系細胞標志物ck8、ck18均為陽性，而成熟肝細胞標志物G6Pase和成熟膽管細胞標志物BG為陰性；B為篩選雙陽細胞培養(yǎng)20天的細胞群的RT-PCR結果，與A不同的是AFP無表達，而G6Pase和BG有表達。BG指biliary glycoprotein，G6Pase指glucose-6-phosphatase。Marker為100-2000。內參為β-actin。
圖8.A6陽性肝卵圓細胞膜表面超微結構的原子力顯微鏡分析。(A)，(B)誘導組第9天的單個肝卵圓細胞通過用A6單克隆抗體染色定位(箭頭示)，(A×100；B×400)。(C)-(F)為該細胞膜表面超微結構的原子力掃描圖，后者為前者框選區(qū)域的局部放大。(G)-(I)是作為對照的單個胚胎干細胞膜表面超微結構的原子力掃描圖，后者為前者框選區(qū)域的局部放大。胚胎干細胞呈圓形，直徑約為9μm，細胞膜表面有多數(shù)橢球形顆粒，顆粒大小為40-80nm。肝卵圓細胞呈橢圓形，體積略大(直徑約為11μm)，細胞膜表面顆粒數(shù)量更多且更大(大小為200-400nm)，呈粗大的長橢球形。掃描范圍(C)20×20μm2；(D)，(H)5×5μm2；(E)，(I)2×2μm2；(F)1×1μm2；(G)15×15μm2。
五具體實施例方式
以下具體的實施例只是對技術方案作進一步描述，并不限制本發(fā)明的范圍。
(一)實驗材料以及器材1.胚胎干細胞的來源選取商業(yè)可得的Balb/c系小鼠胚胎干細胞。
2.細胞培養(yǎng)試劑2.1細胞培養(yǎng)基(1)胚胎干細胞培養(yǎng)基成分含高糖和谷氨酰胺的DMEM(Dubecco′s modifided Eagle′smedium)(美國Hyclone公司)；20％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(杭州四季清公司)；1000U/ml重組小鼠白血病抑制因子(recombinant murineleukemia inhibitory factor，LIF)(美國ESGRO-Chemicon公司)；0.1mmol/Lβ-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)(美國Invitrogen公司)；25mmol/L HEPES(美國Invitrogen公司)；100U/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)(美國Invitrogen公司)。
(2)分化階段基本培養(yǎng)基與胚胎干細胞培養(yǎng)基相比較，不含LIF外，且胎牛血清的濃度變?yōu)?5％，并添加了0.1mmol/L非必需氨基酸(nonessentialaminoacids)(美國Invitrogen公司)，其余成分同。
2.2細胞生長因子肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth factor，HGF)(美國Peprotech公司)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(美國Peprotech公司)。
2.3其它試劑、器材一次性塑料培養(yǎng)瓶、一次性塑料培養(yǎng)板(美國Corning公司)，消化液0.25％Trypsin-1mM EDTA·4Na(美國Invitrogen公司)。
3.免疫細胞化學及流式細胞術試劑大鼠A6單克隆抗體為商業(yè)可得；抗小鼠/人白蛋白(albumin，ALB)單克隆抗體(美國R&D公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)；PE-Cy5共軛的抗小鼠Sca-1單克隆抗體(美國eBioscience公司)；R-PE共軛的抗小鼠CD34單克隆抗體(美國BD Pharmingen公司)；FITC共軛的抗小鼠CD45單克隆抗體(美國Biolegend公司)；帶拍攝系統(tǒng)(日本NIKON E4500)的倒置相差顯微鏡(日本Nikon Eclipse TS100)；流式細胞儀為美國BECTON DICKINSON FACScalibur FlowCytometers。
4.RT-PCR試劑TROZOL(TRI REAGENT-美國MRC公司)；cDNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)；PCR試劑盒(美國Fermentas公司)；引物合成由上海生工生物工程公司合成。引物序列及引物長度、退火溫度如下a-fetoprotein，5’-ACT CAC CCC AAC CTT CCT GTC-3’forward，5’-CAG CAG TGG CTG ATA CCA GAG-3’reverse，423bp，退火溫度為56℃；albumin，5’-CAT GAC ACC ATG CCT GCT GAT-3’forward，5’-CTC TGA TCT TCA GGA AGT GTA C-3’reverse，452bp，退火溫度為53℃；cytokeratin 19，5’-GTC CTA CAG ATT GAC AAT GC-3’forward，5’-CAC GCT CTG GAT CTG TGA CAG-3’reverse，569bp，退火溫度為53℃；
cytokeratin 18，5’-GGA CCT CAG CAA GAT CAT GGC-3’forward，5’-CCA CGA TCT TAC GGG TAG TTG-3’reverse，515bp，退火溫度為55℃；cytokeratin 8，5’-AGT CTC AGA TCT CAG ACA CG-3’forward，5’-CCA TAG GAT GAA CTC AGT CC-3’reverse，561bp，退火溫度為55℃；glucose-6-phosphatase，5’-AAC CCA TTG TGA GGC CAG AGG-3’forward，5’-TAC TCA TTA CAC TAG TTG GTC-3’reverse，438bp，退火溫度為55℃；biliary glycoprotein，5’-GAA CTA GAC TCT GTC ACC CTG-3’forward，5’-GCC AGA CTT CCT GGA ATA GA-3’reverse，407bp，退火溫度為53℃；β-actin，5’-TTC CTT CTT GGG TAT GGA AT-3’forward，
5’-GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC-3’reverse，203bp。
5.透射電鏡為PHILIPS TECNAL 10；原子力顯微鏡為Auto-probe CP Research(Si3N4Cantilevers with integral tips；Thermomicroscopes，美國)。
(二)胚胎干細胞源性肝卵圓細胞的體外誘導和分離提純培養(yǎng)過程1.胚胎干細胞的培養(yǎng)將液氮中凍存的Balb/c胚胎干細胞快速取出，立即置于37℃溫水中快速解凍復溫(1-2分鐘內)，終止液清洗，1000rpm離心5min，棄上清，加入胚胎干細胞培養(yǎng)基，適中密度轉種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。當細胞生長密度達到70％-80％左右傳代，平均每2～3d傳代1次。
2.生成擬胚體將胚胎干細胞以適中密度轉至玻璃培養(yǎng)瓶中，用分化階段基本培養(yǎng)基重懸，搖動培養(yǎng)法培養(yǎng)(平均每1小時搖動培養(yǎng)瓶1次，保持細胞處于懸浮狀態(tài)生長以發(fā)育為擬胚體)。每天換液1次，培養(yǎng)3天。開始培養(yǎng)擬胚體的當天作為誘導分化的第1天。
3.向肝實質細胞定向誘導分化擬胚體培養(yǎng)3天后，擬胚體大小均勻適度。將其適中密度轉至塑料培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶并分組，誘導組的培養(yǎng)基為含HGF(30ng/ml)和EGF(100ng/ml)的分化階段基本培養(yǎng)基；對照組的培養(yǎng)基僅為分化階段基本培養(yǎng)基，擬胚體將自然隨機分化。
4.免疫細胞化學(Immunocytochemistry，ICC)4.1.染色程序如下(1)培養(yǎng)細胞(貼壁生長)用冷的4％多聚甲醛室溫固定20min，蒸餾水洗；(2)檢測ALB抗原時用的0.3％Triton X100室溫破膜20min，蒸餾水洗；(3)30％H2O2純甲醇(1∶50)滅活內源性過氧化物酶，室溫20min，蒸餾水洗3次；(4)5％BSA室溫封閉20min，甩去多余液體(不洗)；(5)滴加稀釋的一抗(A6-McAb 1∶20；ALB-McAb 1∶100)4℃孵育過夜，PBS(PH7.2-7.6)洗3次，每次2min；
(6)滴加生物素化羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，PBS(PH7.2-7.6)洗3次，每次2min；(7)滴加SABC(鏈霉親和素-過氧化物酶復合物)，37℃孵育，20min，PBS(PH7.2-7.6)洗4次，每次5min；(8)新鮮配制的DAB室溫顯色(鏡下控制反應時間)，蘇木素輕度復染，常規(guī)梯度酒精脫水封片鏡檢。
陰性對照則用PBS替代一抗孵育，其余步驟不變。
4.2.A6陽性卵圓細胞百分率誘導組和對照組消化后的單細胞懸液及流式細胞儀分選細胞行A6單抗染色，其染色程序大體同上述ICC的，DAB顯色后滴在載玻片上鏡檢并細胞計數(shù)。不同培養(yǎng)時間(誘導分化第5、7、9、11天)的細胞各取3個樣本，每次樣本均隨機取5個視野計數(shù)A6陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)，兩者的比例即為A6陽性卵圓細胞百分率。誘導組和對照組結果間的差異行統(tǒng)計學分析(t檢驗)，P＜0.05時為差異顯著性。
5.逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)對流式細胞儀分選的CD34+/Sca-1+細胞及其培養(yǎng)20天的細胞進行RT-PCR分析(按試劑盒說明書操作)。大體步驟如下用Trizol抽提細胞總RNA；
逆轉錄反應；PCR反應，具體為冰上加入(50ul體系)2×PCR Mix 25ul，forward primer 1ul，reverse primer 1ul，Template DNA 5ul，H2O 18ul.
混勻后短暫離心，置于PCR儀中進行擴增。94℃預變性5min；94℃變性1min，退火1min，72℃延長1min，共30個循環(huán)；最后72℃延長10min。
PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳成像，紫外線下觀察結果并拍照。
6.流式細胞術分析(FACS)誘導組及對照組的培養(yǎng)細胞團首先適當消化(0.25％Trypsin-1mM EDTA·4Na)，并充分吹打成單細胞懸液。0.1mM的PBS(PH7.2-7.4)清洗細胞后，計數(shù)細胞取約1×106個，依次加入抗小鼠Sca-1-PE-Cy5、抗小鼠CD34-PE、抗小鼠CD45-FITC及適量的PBS(反應體系為20μl)，充分混勻后避光室溫孵育20分鐘。PBS充分清洗并重懸后上機檢測。不同培養(yǎng)時間(分化第4天至第10天)的細胞行FACS檢測，以分析Sca-1、CD34和CD45抗原的表達程度及趨勢；分化第4、6、8、10天的細胞各取3個樣本，獲得的數(shù)值取均值作為該天的CD34+/Sca-1+細胞陽性率，誘導組和對照組結果間的差異行統(tǒng)計學分析(t檢驗)，P＜0.05時為差異顯著性。
7.透射電鏡檢測(TEM)流式細胞儀分選的CD34+/Sca-1+細胞于4℃下用2.5％戊二醛固定約4小時，用0.01M的PBS充分清洗。然后用1％OsO4預固定30分鐘，常規(guī)梯度酒精脫水，之后用環(huán)氧樹脂包埋。制備超薄切片，并用醋酸雙氫鈾及枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。
8.原子力顯微鏡檢測(AFM)取誘導組分化第9天的分化細胞進行A6抗原染色(步驟同ICC)。未分化的胚胎干細胞作為對照。胚胎干細胞用0.25％胰酶-EDTA消化成單細胞懸液(濃度為1×106/ml)，用2.5％的戊二醛室溫固定30min后，滴在蓋玻片上空氣干燥20min備用。待檢細胞置于云母片上，然后置入樣品臺的掃描區(qū)內。在監(jiān)視器上確定目的細胞的大致位置，將掃描探針針尖小心的移至在目的細胞所在區(qū)域。調整為Autoprobe CP Tapping模式下，懸臂(ParkScientific Instruments，Microlever)針尖曲率半徑為10nm，力常數(shù)約為2.8N/m，掃描速率為0.5-1Hz，正常大氣壓、室溫下觀察。AFM圖像僅經(jīng)平滑處理(使用Thermomicroscopes ProscanImage Processing Software Version 2.1軟件)，利用軟件的線分析和面分析功能，對圖像進行分析。
(三)結果1.胚胎干細胞及其向肝實質細胞誘導分化過程中的細胞生長狀態(tài)胚胎干細胞克隆增殖，生長迅速，細胞緊密排列，界限不清(圖1-A)。消化后用分化階段基本培養(yǎng)基重懸，行搖動法培養(yǎng)，胚胎干細胞相互聚集并形成透明的球形擬胚體(圖1-B)。3天后，待擬胚體生長成適度大小，將其分組并轉入塑料培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。約3-4小時擬胚體貼壁后，將誘導組的培養(yǎng)基換成含HGF和EGF的培養(yǎng)基，開始誘導分化。分化細胞群以擬胚體著壁處為中心向四周輻射生長，誘導組的分化細胞群為形態(tài)較均一的上皮細胞，呈鋪路石樣(圖1-C)。而對照組的分化細胞群較復雜，形態(tài)多樣，可見三角形、圓形、梭形細胞相混生長(圖1-D)。
2.胚胎干細胞向肝實質細胞誘導分化過程中細胞A6抗原和ALB抗原的表達分化的第6、9、12、15天對ESC定向誘導分化子代細胞群用免疫細胞化學檢測了A6抗原和ALB抗原的表達。分化的第6天已能測到A6抗原的表達，圖2(A)-(E)示分化第9天誘導組分化細胞群A6抗原的表達情況。A6陽性肝卵圓細胞主要分布在擬胚體貼壁后所形成的緊密排列的細胞集落之中(圖2B、C)，以及集落外周部位分化較成熟細胞群之間的小集落中(圖2E)。圖2B中可見細胞集落的上部夾雜著一個A6陽性卵圓細胞，它的旁邊可見一個雙核肝細胞。細胞集落的左下方可見兩個長梭形的A6陽性膽管上皮樣細胞(圖2D)。圖2(F)示第15天誘導組分化細胞群中ALB抗原的表達情況，可見多個ALB陽性雙核肝細胞。
3.胚胎干細胞的肝系定向誘導分化過程中的流式細胞術分析取分化第4天至第10天的誘導組和對照組的分化子代細胞，用FACS分析抗原Sca-1、CD34和CD45的表達情況，結果見圖3、4。Sca-1作為門選指標。圖3結果提示幾乎所有的Sca-1+細胞均復表達CD45，也就是說CD45對肝卵圓細胞的分選無明顯作用。所以只用Sca-1和CD34雙指標來分析分化第4天至第10天兩組的分化子代細胞。大體上(圖4)，誘導組的分化子代細胞中Sca-1+/CD34+細胞陽性率從分化第4天開始上升，至第8天達到高峰(1.20％)后下降；而對照組的基本上維持在一個低水平(0.03％-0.21％)。從R1區(qū)中數(shù)據(jù)點分布來看，誘導組的細胞以小細胞為主，且大多數(shù)細胞結構較簡單；對照組的細胞于分化第8天分成兩群，而誘導組則一直無此現(xiàn)象。R2區(qū)(Sca-1 Gated)中對照組細胞點圖一直較分散，而誘導組的隨著分化時間的推移細胞點圖趨向于集中且向右移。誘導組細胞的總體熒光強度不斷增強并于第8天達到高峰，而對照組的一直處于低水平。分化第4、6、8、10天的細胞各取3個樣本，取均值作為該天的CD34+/Sca-1+細胞陽性率，誘導組和對照組結果間的差異行統(tǒng)計學分析，結果見表1。
表1.胚胎干細胞向肝實質細胞誘導分化過程中Sca-1+/CD34+細胞陽性率的統(tǒng)計

p＜0.05示有顯著性差異；p＜0.01示有極顯著性差異。
4.流式細胞儀篩選雙陽細胞行A6抗原及透射電鏡的檢測我們檢測了分化第8天誘導組流式細胞儀篩選Sca-1+/CD34+細胞中表達A6抗原細胞所占的比例(見圖5)。Sca-1+/CD34+細胞中A6+細胞占總細胞數(shù)的92.48％±2.01％，部分細胞呈強陽性；而非雙陽細胞的占1.66％±1.57％。透射電鏡結果見圖6，卵圓細胞體積較小，一般7-15μm左右，胞核大而胞漿較少，核漿比高；核呈卵圓形，可見濃縮的染色質；核漿內細胞器較少，可見少量線粒體及粗面內質網(wǎng)；細胞邊緣可見少量微絨毛。
5.流式細胞儀篩選雙陽細胞及其培養(yǎng)子代細胞的RT-PCR檢測RT-PCR結果見圖7。圖7 A為流式細胞儀新鮮篩選Sca-1+/CD34+細胞的RT-PCR結果，可見肝細胞標志物AFP、ALB，膽管細胞標志物ck19，肝系細胞標志物ck8、ck18均為陽性，而成熟肝細胞標志物glucose-6-phosphatase(G6Pase)和成熟膽管細胞標志物biliaryglycoprotein(BG)為陰性；圖7B為篩選Sca-1+/CD34+細胞培養(yǎng)了20天的細胞群的RT-PCR結果，與A不同的是，AFP不表達，而glucose-6-phosphatase和biliaryglycoprotein則有陽性條帶。
6.胚胎干細胞源性卵圓細胞的分化率分化的第5、7、9、11天將誘導組和對照組各取樣消化成單細胞懸液行A6-McAb染色，DAB顯色后滴在載玻片上鏡檢計數(shù)。所得的兩組A6(+)卵圓細胞的分化率見表2。誘導組A6(+)卵圓細胞的分化率變化范圍為1.25％-4.46％，誘導第7天左右達到高峰；而對照組的一直保持在低水平(0.14％-0.25％)。t檢驗結果示同期誘導組A6(+)卵圓細胞的分化率比對照組的高，且差異有顯著性。
表2.胚胎干細胞源性卵圓細胞的分化率

p＜0.05示有顯著性差異；p＜0.01示有極顯著性差異。
7.A6陽性肝卵圓細胞膜表面超微結構的原子力顯微鏡分析誘導組第9天的肝卵圓細胞通過用A6單克隆抗體染色定位(圖8.A、B)，圖8.C-F為肝卵圓細胞膜表面超微結構的原子力掃描圖。胚胎干細胞作為對照(圖8.G-I)，呈圓形，直徑約為9μm，細胞膜表面有多數(shù)橢球形顆粒，顆粒大小為40-80nm。肝卵圓細胞呈橢圓形，體積略大(直徑約為11μm)，細胞膜表面顆粒數(shù)量更多且更大(大小為200-400nm)，呈粗大的長橢球形。為了進一步分析細胞膜表面顆粒分布情況，肝卵圓細胞和胚胎干細胞各取相同面積(2×2μm)的局部膜表面(圖8.E和I)進行定量分析。圖8.(1)和(2)分別為圖8.E和I中全部掃描區(qū)域細胞膜表面顆粒直徑的直方圖，統(tǒng)計結果見表3。肝卵圓細胞的膜表面顆粒(圖8.(1))中高度為335nm的數(shù)據(jù)點(data points)最多，而胚胎干細胞的(圖8.(2))高度為602nm的數(shù)據(jù)點最多。使用IP2.1軟件的線分析和面分析功能測量圖8.E和I區(qū)域中細胞膜表面顆粒分布情況，并通過四個參數(shù)——平均粗糙度(average roughness，Ra)、最大峰谷間距(maximumpeak-to-valley distance，Rp-v)、均方根粗糙度(root-mean-squared roughness，Rrms)、平均高度(mean height，z)來進一步定量分析肝卵圓細胞膜和胚胎干細胞膜間的特征差異(表3)。胚胎干細胞膜的四個參數(shù)(尤其是Ra和Rrms)均大于肝卵圓細胞膜的，也就是說胚胎干細胞局部膜表面比肝卵圓細胞的更粗糙些。
表3.肝卵圓細胞膜和胚胎干細胞膜間特征差異的定量分析

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權利要求
1.一種干細胞源性肝卵圓細胞的體外誘導方法，其特征在于用肝細胞生長因子HGF、表皮生長因子EGF對胚胎干細胞進行定向誘導分化；對誘導分化的細胞進行A6+肝卵圓細胞的篩選。
2.如權利要求1所述的體外誘導方法，其中胚胎干細胞為轉成擬胚體分化3天后的胚胎干細胞。
3.如權利要求1或2所述的體外誘導方法，其中胚胎干細胞為哺乳動物胚胎干細胞。
4.如權利要求1或2所述的體外誘導方法，其中胚胎干細胞為小鼠胚胎干細胞。
5.如權利要求1所述的體外誘導方法，其中的篩選利用Sca-1和CD 34為雙指標。
6.如權利要求5所述的體外誘導方法，其中的篩選利用流式細胞儀進行。
7.如權利要求1所述的體外誘導方法，其中HGF為30ng/ml以及EGF為100ng/ml。
8.用權利要求1-7中任一方法獲得的肝卵圓細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個高效的肝卵圓細胞新誘導模型。該模型中利用HGF和EGF顯著性誘導胚胎干細胞源性卵圓細胞的生成，整個誘導方法較簡便，誘導周期也很短。利用本發(fā)明的肝卵圓細胞誘導模型，利用很少的胚胎干細胞種源便可誘導生成足夠多的、能滿足臨床需要的肝卵圓細胞，進而可用于肝卵圓細胞移植、肝臟組織工程學等臨床范疇，對各種原因所致肝功能衰竭、肝代謝疾病等起到輔助支持治療或治愈疾病的功用。
文檔編號C12N5/06GK1948465SQ200510086599
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月13日 優(yōu)先權日2005年10月13日
發(fā)明者銀東智, 蔡繼業(yè), 鄭啟昌, 劉美莉 申請人:暨南大學