專利名稱：一種鑒別牛及其早期胚胎性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛性別鑒定的方法，特別用于牛早期胚胎性別的鑒定，屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，家畜的生產(chǎn)性狀常受到性別的影響，如奶牛只有母牛才表現(xiàn)產(chǎn)奶性狀，而肉牛生產(chǎn)中公畜因為生長速度快而具有較高的經(jīng)濟價值，因此快速準確地鑒別家畜早期胚胎性別并實施性別控制技術(shù)，是提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益的重要措施。
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是目前鑒別動物胚胎性別最為有效的技術(shù)方法。常規(guī)或標準PCR反應(yīng)每個循環(huán)包括三個步驟(1)變性，在溫度90-98℃下，雙鏈DNA變性，反應(yīng)時間15-30s；(2)退火，在溫度40℃～70℃下，引物與模板DNA特異結(jié)合，反應(yīng)時間15-30s(3)延伸，在溫度72℃左右和DNA聚合酶存在條件下，擴增DNA模板的目標片斷，反應(yīng)時間15-30s。一般整個性別鑒別反應(yīng)過程需要30-35個循環(huán)，時間約3～4個小時。為了增加性別鑒別的靈敏度，有些方法對某些技術(shù)環(huán)節(jié)進行了特殊的技術(shù)處理。如巢式PCR技術(shù)(nested-PCR)，需要預(yù)先進行一次PCR模板的富集后再進行胚胎的性別鑒別，增加了鑒別的工作量和所需時間；兩步PCR方法需要對Y染色體特異引物進行10個左右PCR循環(huán)的預(yù)擴增，然后加入內(nèi)標引物進行多重PCR擴增，增加了反應(yīng)的循環(huán)數(shù)和鑒定所用時間，也增加了反應(yīng)污染的幾率；單重PCR法僅擴增Y染色體特異引物，避免了多重PCR中常染色體引物對Y染色體特異引物擴增的影響，方法簡便，但由于反應(yīng)中沒有內(nèi)標引物作為內(nèi)部標記，就可能將沒有發(fā)生反應(yīng)的樣品誤判為雌性，從而增加了鑒別結(jié)果假陰性的幾率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是通過改善傳統(tǒng)PCR反應(yīng)的技術(shù)參數(shù)，建立一種操作時間短、污染幾率低、結(jié)果準確可靠的牛性別，特別是牛早期胚胎性別的鑒定方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案之一是將傳統(tǒng)PCR方法的三溫度循環(huán)改變?yōu)閮蓽囟妊h(huán)，并且減少每個溫度的反應(yīng)時間。具體地說，本發(fā)明方法的兩溫度循環(huán)參數(shù)為(1)92～94℃，反應(yīng)1～15s；(2)56～58℃，反應(yīng)1～15s。此條件下PCR反應(yīng)時間大大縮短，由原來的3～4個小時降低到35～55min。當使用本發(fā)明方法鑒定牛早期胚胎性別時，可以縮短胚胎在體外停留的時間，最大限度地減少外環(huán)境對胚胎帶來的不利影響，提高胚胎移植成功率。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案之二是在反應(yīng)體系中利用兩對引物，即Y-染色體特異引物和牛DNA特異引物，分別擴增長度100～300bp的目標片斷。具體地說，本發(fā)明采用的兩對引物組合為A12和B34，或者A12和B78。其中A12的引物序列為5’-TCG TCA GAA ACC GCA CAC TG和5’-TGG AAG CAA AGAACC CCG CT；B34的引物序列為5’-TCT TTG TCT CGG GTT GTG GT和5’-GAA TCC TAC TCC TCA GAA TG；B78的引物序列為5’-GAT CAC TAT ACATAC ACC ACT和5’GCT ATG CTA ACA CAA ATT CTG。所述三個引物的擴增片斷長度分別為216bp、268bp和141bp。使用兩對引物進行擴增避免了單重PCR法僅擴增Y染色體特異片斷而造成的假陰性實驗結(jié)果的出現(xiàn)，提高了鑒定結(jié)果的準確性。
使用以上優(yōu)化參數(shù)，利用現(xiàn)有常規(guī)儀器，使用國產(chǎn)化試劑，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員即可實施本發(fā)明。通常采用20μL PCR反應(yīng)體系，其中Taq酶1U，dNTP，濃度為200μmol/L，Y特異引物濃度為120pmol/L，內(nèi)標引物濃度為50pmol/L。各離子濃度分別為20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/L KCl、0.1％Triton X-100和2mmol/L MgCl2。擴增產(chǎn)物采用EB染色或熒光燃料染色觀察。因此本發(fā)明方法減少了應(yīng)用中對專有生產(chǎn)廠商的依賴性，大大減低了鑒別成本，具有簡便、快速、準確和實用的特點。


圖1為牛血液DNA的性別鑒定電泳圖；圖2為采用程序1和程序2對牛培養(yǎng)細胞性別進行鑒定的電泳圖；
圖3為采用程序3對牛培養(yǎng)細胞性別進行鑒定的電泳圖；圖4為?？寺∨咛サ男詣e鑒定電泳圖；圖5為牛體內(nèi)胚胎樣品的性別鑒定電泳圖。
具體實施例方式
實施例1牛血液DNA的性別鑒定以一頭母牛和一頭公牛為材料，各取100μL抗凝血于1.5mL離心管中，加1mL雙蒸水，充分混勻。冰浴5～10分鐘后12000rpm離心1分鐘，棄去上清。加入100μL雙蒸水懸浮下層沉淀，煮沸5～10分鐘，然后立即冰浴3～5分鐘。以12000rpm離心5分鐘，取上清于另一離心管中即可用于PCR檢測，或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 取按上述方法制備的牛血液DNA樣品各1μL，采用20μL反應(yīng)體系進行PCR擴增，其中Taq酶1U，dNTP濃度為200μmol/L，Y特異引物B34濃度為120pmol/L，內(nèi)標引物A12濃度為50pmol/L。各離子濃度分別為20mmol/LTris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/L KCl、0.1％Triton X-100和2mmol/LMgCl2。
PCR擴增采用程序194℃，4min；94℃，15sec，56℃，15sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為50min?；蛘卟捎贸绦?為94℃，4min；94℃，2sec，56℃，5sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為40min。擴增產(chǎn)物采用熒光燃料染色。PCR結(jié)果如圖1所示。其中1和2道為采用程序1擴增的母牛和公牛血液DNA樣品，其中1道為母牛血液DNA樣品，2道為公牛血液DNA樣品；3～6道為采用程序2擴增的母牛和公牛血液DNA樣品，其中3道為母牛血液DNA樣品，4、5、6道為公牛血液DNA樣品；7道為DNA分子量標準。檢測結(jié)果與實際情況相符。
實施例2牛培養(yǎng)細胞的性別鑒定將體外培養(yǎng)的魯西黃牛耳成纖維細胞(分別來源于母牛和公牛)，用胰酶消化后在體視顯微鏡下分裝成1細胞、5細胞、10細胞梯度，分裝在用于PCR反應(yīng)的Eppendorf管中，然后分別加入PCR反應(yīng)所用試劑，其中Taq酶1U，dNTP濃度為200μmol/L，Y特異引物B34和B78濃度均為120pmol/L，內(nèi)標引物A12濃度為50pmol/L。各離子濃度分別為20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/L KCl、0.1％Triton X-100和2mmol/L MgCl2，最后用水定容至20μL。
PCR擴增采用程序194℃，4min；94℃，15sec，56℃，15sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為50min。PCR結(jié)果如圖2所示。其中9道為來源于母魯西黃牛耳成纖維細胞樣品，樣品量為5個細胞；10～12道為來源于公魯西黃牛耳成纖維細胞樣品，樣品量分別為1、5和10個細胞；泳道7、8分別為母牛和公?；蚪MDNA對照樣品的擴增結(jié)果。13為DNA分子量標準。
PCR擴增或者采用程序294℃，4min；94℃，2sec，56℃，5sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為40min。PCR結(jié)果如圖2所示。其中3道為來源于母魯西黃牛耳成纖維細胞樣品，樣品量為5個細胞；4～6道為來源于公魯西黃牛耳成纖維細胞樣品，樣品量分別為1、5和10個細胞，泳道1、2分別為母牛和公?；蚪MDNA對照樣品的擴增結(jié)果。
PCR擴增或者采用程序394℃，4min；94℃，1sec，56℃，1sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為37min。PCR結(jié)果如圖3所示。1～6道為引物B34與引物A12的擴增產(chǎn)物；8～13道為引物B78與引物A12的擴增產(chǎn)物。1和8道為母牛對照樣品，2和9道為公牛對照樣品；3、4、10、11道為來源于母魯西黃牛耳成纖維細胞樣品，其中3和10道樣品量為1個細胞，4和11道樣品量為5個細胞；5、6、12和13道為來源于公魯西黃牛耳成纖維細胞樣品，其中5和12道樣品量為1個細胞，6和13道樣品量為5個細胞；7道為DNA分子量標準。結(jié)果與實際情況相符。
實施例3牛克隆胚胎的性別鑒定將4個培養(yǎng)7天的體細胞克隆胚胎(樣品1和2來源于母牛，樣品3和4來源于公牛)分別移入底部劃道的塑料平皿(直徑100mm)的切割液滴內(nèi)(胚胎保存液)，用玻璃切割針在體視顯微鏡下將胚胎置于淺道上。用針在透明帶上作一切口，然后用切割針輕壓透明帶，將部分胚胎細胞擠出透明帶，將胚胎分成四份或者6份，用移液器取出切割樣品移到Eppendorf管中，置-20℃冷藏待用或直接進行性別鑒定。
向含有待測樣品的PCR反應(yīng)管中分別加入PCR反應(yīng)所用試劑，其中Taq酶1U，dNTP濃度為200μmol/L，Y特異引物為120pmol/L B34或者B78，內(nèi)標引物A12濃度為50pmol/L。各離子濃度分別為20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/L KCl、0.1％Triton X-100和2mmol/L MgCl2，最后用水定容至20μL。
PCR擴增采用程序394℃，4min；94℃，1sec，56℃，1sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為37min。PCR結(jié)果如圖4所示。1、2道依次為引物A12和B34擴增的母牛和公牛基因組DNA對照樣品；3～6道依次為引物A12和B34擴增的母牛體細胞克隆胚胎樣品1和2及公牛體細胞克隆胚胎樣品3和4；7道為DNA分子量標準。8、9道依次為引物A12和B78擴增的母牛和公牛基因組DNA陽性對照樣品；10～13道依次為引物A12和B78擴增的母牛體細胞克隆胚胎樣品1和2及公牛體細胞克隆胚胎樣品3和4。結(jié)果與實際情況相符。
實施例4牛體內(nèi)胚胎細胞樣品的性別鑒定自牛體內(nèi)取出9枚胚胎樣品。將單個胚胎移入底部劃道的塑料平皿(直徑100mm)的切割液滴內(nèi)，用玻璃切割針在體視顯微鏡下將胚胎置于淺道上。用針在透明帶上作一切口，然后用切割針輕壓透明帶，將部分胚胎細胞擠出透明帶，并順勢切割下一個或幾個細胞，或者將透明帶中散碎游離的細胞擠出透明帶。切割完成后，用移液器取出切割樣品移到Eppendorf管中，置-20℃冷藏待用或直接進行性別鑒定。取樣后，胚胎保存在胚胎保存液。
向含有待測樣品的PCR反應(yīng)管中分別加入PCR反應(yīng)所用試劑，其中Taq酶1U，dNTP濃度為200μmol/L，Y特異引物B34為120pmol/L，內(nèi)標引物A12濃度為50pmol/L。各離子濃度分別為20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/L KCl、0.1％Triton X-100和2mmol/L MgCl2，最后用水定容至20μL。
PCR擴增采用程序394℃，4min；94℃，1sec，56℃，1sec，30個循環(huán)。全部反應(yīng)時間為37min。部分胚胎樣品PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5所示。1道為空白對照；2、3道為已知性別?；蚪MDNA對照樣品擴增結(jié)果；4道為DNA分子量標準；5～13道為胚胎樣品擴增結(jié)果。結(jié)果表明，在鑒定的9枚胚胎中，有4枚雌性胚胎和5枚雄性胚胎。鑒定后的胚胎進行移植。生產(chǎn)的犢牛性別與PCR對胚胎早期性別鑒定結(jié)果相符。
權(quán)利要求
1.一種鑒別牛及其早期胚胎性別的方法，其特征在于采用兩溫度循環(huán)的聚合酶鏈式反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的兩溫度循環(huán)包括(1)在溫度92～94℃下，反應(yīng)1～15s；(2)在溫度56～58℃下，反應(yīng)1～15s。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的聚合酶鏈式反應(yīng)的產(chǎn)物大小為100～300bp。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)時間為35～55min。
5.如任一權(quán)利要求1～4所述的方法，其特征在于所述的聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)體系中含有兩種引物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的引物為A12和B34，或者A12和B78，其中A12的引物序列為5’-TCG TCA GAA ACC GCA CAC TG和5’-TGG AAG CAA AGA ACC CCG CT；B34的引物序列為5’-TCT TTG TCTCGG GTT GTG GT和5’-GAA TCC TAC TCC TCA GAA TG；B78的引物序列為5’-GAT CAC TAT ACA TAC ACC ACT和5’-GCT ATG CTA ACA CAA ATTCTG。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于引物A12、B34和B78的擴增產(chǎn)物大小分別為216bp、268bp和141bp。
全文摘要
通過改善傳統(tǒng)PCR反應(yīng)的技術(shù)參數(shù)，本發(fā)明建立了一種操作時間短、污染幾率低、結(jié)果準確可靠的牛性別，特別是牛早期胚胎性別的鑒定方法。首先將傳統(tǒng)PCR方法的三溫度循環(huán)改變?yōu)閮蓽囟妊h(huán)，并且減少每個溫度的反應(yīng)時間。具體地說，本發(fā)明方法的兩溫度循環(huán)參數(shù)為(1)92～94℃，反應(yīng)1～15s；(2)56～58℃，反應(yīng)1～15s。另外，在反應(yīng)體系中利用兩對引物，即Y－染色體特異引物和牛DNA特異引物，分別擴增長度100～300bp的目標片斷。本發(fā)明采用的兩對引物組合為A12和B34，或者A12和B78。A12、B34和B78的擴增片斷長度分別為216bp、268bp和141bp。通過PCR反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化，本發(fā)明提供了一種成本低廉，操作簡便、快速、準確的牛性別，特別是牛早期胚胎性別的鑒定方法。
文檔編號C12P19/34GK1916184SQ200510086260
公開日2007年2月21日 申請日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者朱化彬, 王棟, 郝海生, 王宗禮, 程金華, 楊波 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所