專利名稱：重組雞馬立克氏病病毒轉(zhuǎn)移載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種病毒轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重組活載體疫苗是指利用基因工程技術(shù)，將保護性抗原基因(目的基因)轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的載體中，通過和病毒基因重組后表達(dá)出保護性抗原蛋白質(zhì)的活疫苗，這種疫苗可通過1次免疫預(yù)防多種疾病，明顯降低疫苗的成本，簡化免疫程序，增加免疫覆蓋率，同時這種疫苗中的保護性抗原成分單一，有利于建立免疫監(jiān)測方法，因此利用活的疫苗病毒作為載體研究重組活載體疫苗是未來疫苗的一個重要方向。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些基因組龐大的病毒的分子位點和結(jié)構(gòu)被逐步搞清楚，從而奠定了這些病毒在重組活載體疫苗研究中的地位。禽病疫苗的研究中，用于構(gòu)建重組疫苗的病毒載體主要有雞痘病毒(FPV)、禽腺病毒以及皰疹病毒，包括雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和雞馬立克氏病病毒(MDV)。目前應(yīng)用較為廣泛的病毒活載體是痘病毒載體，痘病毒作為載體有很多優(yōu)點，如插入外源基因組大、不會整合入宿主染色體、免疫方法簡單、疫苗生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，因此重組雞痘疫苗已廣泛應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中。但痘病毒作為載體一個最重要的缺點是能引起載體效應(yīng)，因而痘病毒載體疫苗不能用于接種過痘苗的禽，而且由于機體產(chǎn)生的抗痘病毒抗體也會消滅載體病毒，因而痘病毒載體疫苗也無法克服母源抗體的干擾。
雞馬立克氏病病毒(MDV)是雞的一種傳染性腫瘤病(淋巴組織增生和腫瘤形成為特征的疾病)的病原，它在世界范圍內(nèi)流行，是嚴(yán)重危害著養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展。近30年來，為了控制該病的發(fā)生，人們不斷地研制和使用MDV的致弱毒株作為疫苗。MD疫苗病毒有3個血清型，即弱毒MDV1、自然無毒MDV2和自然無毒株火雞皰疹病毒(HVT)即MDV3。在MDV疫苗病毒的3個血清型中，減毒的I型MDV毒株(MDV1)如CVI988比HVT更具優(yōu)越性，這是因為MDV1疫苗與超強毒的(vv)MDV1(包括野毒株)的抗原性更為接近，減毒MDV1對預(yù)防MD最為有效。由于馬立克氏病病毒的DNA較大，容許插入多個外源基因而不影響自身的復(fù)制和生物學(xué)特性，所以其弱毒株也可和雞痘病毒(FPV)一樣作為病毒載體來表達(dá)外源基因。在三個血清型的MDV疫苗毒株中，MDV1被研究者作為另一個重要的病毒載體而得到廣泛研究。
選用MDV弱毒株作為重組病毒載體還具有如下優(yōu)點(1)MDV為細(xì)胞結(jié)合性皰疹病毒，可持續(xù)感染，經(jīng)疫苗免疫的雞可終生帶毒，產(chǎn)生持久的免疫力。(2)MDV疫苗接種后，病毒在細(xì)胞間傳播，因而不受母源抗體的干擾。(3)MDV存在于細(xì)胞內(nèi)，不容易引起載體效應(yīng)，可以使用不同型的MDV協(xié)同免疫或多次接種，而不象痘病毒載體疫苗那樣不能用于接種過痘苗的禽。(4)該病毒的自然宿主只有禽類，對其它家畜和人類是安全的(5)MDV的基因組比較大，可插入多個外源基因，在MDV的基因組中，US是位于S節(jié)段中部的一個ORF，為病毒生長的非必需基因，US區(qū)有12個開放的閱讀框(ORF)，其中US1、US2、US10、US3、US6均為病毒非必需區(qū)。因此MDV1基因組的US區(qū)可提供一個適于外源基因插入的合適位點。
MDV CVI988/Rispens株是上世紀(jì)70年代初開始使用的一株分離自健康雞的I型MDV原始弱毒株，美國于1992年批準(zhǔn)使用CVI988來預(yù)防超強野毒株(vvMDV)和特超強野毒株(+vvMDV)，由于它被發(fā)現(xiàn)比二價苗對vvMDv有更強的保護力，因而是目前公認(rèn)的最有效防制MD的疫苗毒株。該毒種實驗室和田間試驗均表明，其對MD的免疫保護率可達(dá)95％以上，因此該疫苗株可作為一種安全有效的病毒載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組雞馬立克氏病病毒的轉(zhuǎn)移載體，及其構(gòu)建方法，該轉(zhuǎn)移載體可通過與MDV疫苗病毒同源重組，獲得重組病毒MDV，為MDV CV1988株病毒作為載體構(gòu)建抗MD和其它病原的新型重組疫苗打下基礎(chǔ)。
一種轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ，其特征在于重組質(zhì)粒pUS2上的US2基因片段由CMV啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40 polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因替換。
上述轉(zhuǎn)移載體的制備方法，用BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ質(zhì)粒，回收CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因；用BglII和AvrII酶切pUS2質(zhì)粒，回收酶切位點2端的pUS2片段(命名為pUSE)；將CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因插入pUSE片段中的BglII和AvrII之間，即得上述轉(zhuǎn)移載體。
重組馬立克氏病病毒制備方法，包括如下步驟(1)MDV CVI988/Rispens疫苗病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞，(2)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，(3)加底物X-gal顯色，(4)通過藍(lán)斑純化篩選即可。
所述轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點表達(dá)盒上還插入有外源基因。
所述外源基因是雞傳染性法氏囊病毒VP2基因。
上述方法制備的重組馬立克氏病病毒。
上述重組病毒作為疫苗的應(yīng)用。
用BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ，得到5.2kb的酶切的產(chǎn)物；用Bgl II和AvrII酶切pUS2質(zhì)粒，得到6.7kb的酶切產(chǎn)物，命名為pUSE，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，BglII和AvrII酶切鑒定結(jié)果表明獲得了轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒，命名為pUS2-LacZ。該質(zhì)粒含CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40 polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點，該多克隆位點中，NotI、XhoI、ApaI是質(zhì)粒的其它地方?jīng)]有的酶切位點，可以用于外源基因的插入，EcoRI和PstI分別在2367bp和3364bp各有一個位點，在不完全酶切的情況下，通過回收大片段的方法也能將外源基因插入。在5’端保留了約3163bp及在3’端保留了602bp的MDV US2基因序列作為和MDV的DNA同源重組的同源臂，與獲得重組MDV的要求相一致。
將上述得到的轉(zhuǎn)移載體用于篩選重組馬立克氏病病毒，得到純化的重組病毒。
本發(fā)明將1.35Kb的IBDV VP2基因通過EcoR I和Xhol I位點插入到pUS2-LacZ載體中，獲得了重組質(zhì)粒pUS2-LacZ-VP2，再通過同源重組并純化篩選得到重組病毒rMDV。
以表達(dá)傳染性法氏囊VP2基因的重組馬立克氏病病毒(rMDV)作為疫苗(毒價為5000PFU/ml)，免疫1日齡SPF雞，同時設(shè)以雞傳染性法氏囊病中等毒力活疫苗BJ836(毒價為106.25TCID50/0.1ml)于14日齡免疫的SPF雞作為對照，另設(shè)2組SPF雞作為攻毒的陰陽性對照。35日齡時，對重組疫苗接種組、中等毒疫苗接種組及非免疫的陽性對照組以中國標(biāo)準(zhǔn)I型強毒株IBDV CJ801攻擊。攻擊后6天剖殺所有的雞，進行肉眼病理觀察并稱取囊重與體重，然后按Giambrone等的方法(1990)計算保護指數(shù)。結(jié)果表明，重組疫苗免疫組攻擊強毒后大致有2只雞剖檢時可見法氏囊出現(xiàn)輕度萎縮，其余的法氏囊大小、色澤、質(zhì)量均很正常保護指數(shù)為90％，BJ836疫苗的保護指數(shù)為93％，其平均囊/體比與非免疫的陰性對照組無顯著性差異(P＞0.05)；而非免疫攻毒的陽性對照組雞只剖檢時法氏囊部分100％出現(xiàn)肉眼病變，或萎縮或出現(xiàn)凍膠樣水腫、黃色化，其平均囊/體比與非免疫的陰性對照組之間存在顯著差異(P＜0.05)。(見表1)H.E染色的結(jié)果也表明，重組疫苗組強毒攻擊后其法氏囊淋巴濾泡結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，與正常對照組的法氏囊相同.而陽性對照法氏囊組織全部出現(xiàn)病變，組織中淋巴細(xì)胞壞死脫落，大部分間質(zhì)細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞外益，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹。(見圖10a、10b、10c、10d)由于轉(zhuǎn)移載體上具有多克隆位點，可插入外源病毒基因，由此獲得重組質(zhì)粒，再通過同源重組并純化篩選得到重組病毒。該重組病毒制成疫苗，具有抗多種病毒的效果。這種疫苗可通過1次免疫預(yù)防多種疾病，明顯降低疫苗的成本，簡化免疫程序，增加免疫覆蓋率。


圖1真核表達(dá)載體pcDNA4.0/His/LacZ的示意2重組馬立克氏病病毒轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ的示意3轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ酶切鑒定結(jié)果1λDNAHindIIIMaker；2pUS2-LacZ雙酶切(BglII、AvrII)圖4含LacZ基因的第一代重組病毒在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上形成的藍(lán)斑圖5第八代純化的重組病毒在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上形成的藍(lán)斑圖6含LacZ基因和法氏囊VP2基因的重組病毒在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上形成的藍(lán)斑圖7重組病毒PCR鑒定1，陰性對照；2，VP2基因的PCR結(jié)果；3，DL2000Maker圖8Western-blot檢測重組病毒中法氏囊VP2基因的表達(dá)1，親本MDV感染的CEF；2，重組MDV感染的CEF圖9不同試驗組雞的法氏囊大小比較。
圖10a重組病毒組(rMDV)攻毒后法氏囊組織H.E染色結(jié)果圖10b BJ836疫苗免疫組的法氏囊組織切片H.E染色結(jié)果圖10c陽性對照組雞的法氏囊組織切片H.E染色結(jié)果圖10d陰性對照組雞的法氏囊組織切片H.E染色結(jié)果具體實施方式
下面結(jié)合實施例對發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明。
實驗材料1病毒毒株和細(xì)胞馬立克氏病病毒MDV CVI988/Risepens疫苗，此疫苗為液氮保存的活病毒，北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；按常規(guī)方法取9～11日齡SPF雞胚(購自北京市實驗動物中心)，制備雞胚成纖維細(xì)胞單層，增殖重組病毒用；IBDV CJ801株本所分離鑒定的中國標(biāo)準(zhǔn)I型強毒株由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存，使用F15代囊毒，毒價為106. 56EID50/0.2ml，雞傳染性法氏囊病中等毒力活疫苗BJ836(毒價為106.25TCID50/0.1ml)。北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所疫苗中試車間生產(chǎn)，市場有售。
2重組質(zhì)粒MDV US區(qū)基因與pUC18的重組載體將MDV的US基因區(qū)6.5kb的片段通過SalI和BamHI酶切位點和克隆載體pUC18連接而成，命名為pUS2，由日本國家動物疾病防治研究所病毒室(Department of Virology，National Institute of Animal Health)Kenji Tsukamoto教授贈送，現(xiàn)保存在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所內(nèi)。
3真核表達(dá)載體pcDNA4.0/His/LacZ含有人巨細(xì)胞病毒主要早期啟動子(CMV)和轉(zhuǎn)錄終止信號SV40 ployA，6個組氨酸標(biāo)記基因，用于質(zhì)粒篩選的氨芐青霉素及新霉素基因，LacZ報告基因及多克隆位點，為INVITROGEN公司產(chǎn)品。該載體示意圖如圖1。
4分子生物學(xué)試劑及試劑盒限制性內(nèi)切酶(BglII和AvrII)和T4 DNA連接酶均為New England Biolabs產(chǎn)品；λDNA/HindIII Marker購自大連TaKaRa生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；DMEM、MEM及轉(zhuǎn)染用營養(yǎng)液opti-MEM均為Invitrogen產(chǎn)品；凝膠回收純化試劑盒購自鼎國公司和天為時代公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，購自Invitrogen公司。
5試驗所用溶液及其配制10mg/mL EB貯存液以10mg/mL濃度將EB溶于去離子水中，劇烈攪拌，完全溶解后，室溫下避光保存。
50×TAE(Tris-乙酸)24.2g Tris堿，5.71g冰乙酸，10mL 500mmol/L EDTA(pH8.0)，加去離子水，定容至100mL，工作液為1×TAE。
0.8％瓊脂糖凝膠稱取0.8g瓊脂糖溶于100mL1×TAE電泳緩沖液，融化后加入5μL10mg/mL EB貯存液，使凝膠中EB終濃度達(dá)到0.5μg/mL2×YT液體培養(yǎng)基Tryptone 16g，Yeast Extract 8g，NaCl 5g加入蒸餾水950mL，NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，定容至1000mL，115℃，20min。
Amp/2×YT液體培養(yǎng)基于2×YT液體培養(yǎng)基中，按終濃度100μg/mL加入Amp貯存液。
Amp/2×YT固體培養(yǎng)基瓊脂粉1.5g溶于100mL液體2×YT中，121℃高壓滅菌20min，冷卻至50℃左右，加入Amp至終濃度為100μg/mL，澆制平板。
6細(xì)胞培養(yǎng)用溶液15％NaHCO315gNaHCO3溶于100mL雙蒸水中，經(jīng)115℃滅菌20min，置4℃?zhèn)溆肕EM原液按1000mL雙蒸水溶解1包MEM粉，15％NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7.4，過濾除菌，4℃保存。
犢牛血清Hyclone公司產(chǎn)品，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2×104U/mL青鏈霉素液(雙抗)青霉素、鏈霉素各2×106U溶于100mL雙蒸水中，過濾除菌，分裝后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 7.5％NaHCO37.5g NaHCO3溶于100mL雙蒸水中，經(jīng)115℃滅菌20min，置4℃?zhèn)溆谩?br> MEM營養(yǎng)液于100mL 1×MEM溶液中無菌加入5mL犢牛血清，1mL濃度為2×104U/mL雙抗液，用7.5％NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.2左右。
MEM維持液于100mL 1×MEM溶液中無菌加入2mL犢牛血清，1mL濃度為2×104U/mL雙抗液，用7.5％NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.2左右10×EDTA-胰酶溶液(2.5％)Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H202.89g，KH2PO40.2g，1％酚紅溶液1.5mL，胰酶2.5g，溶于100mL去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2～7.5，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。使用時1∶10稀釋。
0.01mol/L pH7.4PBS稱取NaCl 8g，KCl 0.2g，NaH2PO41.44g，KH2PO40.24g，溶于900mL雙蒸水中，HCl調(diào)pH值至7.4，定容至1000mL，分裝后121℃高壓滅菌20min，存于室溫。
7實驗動物1日齡SPF雛雞，購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物所，飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中。
實施例1 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建1.1pcDNA4.0/His/LacZ和pUS2質(zhì)粒的提取將帶有質(zhì)粒pcDNA4.0/His/LacZ和pUS2的大腸桿菌JM109 Amp/2xYT固體培養(yǎng)基平皿上劃線，37℃培養(yǎng)20h，挑取單個白色菌落接種于Amp/2xYT液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)16h，然后按博大泰克生物工程公司質(zhì)粒提取試劑盒操作說明進行收集1.5~3mL菌液的沉淀于1.5mL的Eppendorf離心管中，加入100μL溶液I，振蕩至徹底懸??；加入150μL溶液II，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管放置于冰上2min；
加入150μL溶液III，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5min。12000r/min離心12min；將420μL結(jié)合緩沖液加入離心吸附柱中，然后將步驟3中的上清加入離心吸附柱中(盡量去除雜質(zhì))，混勻，12000r/min離心30s。倒掉廢液，收集管中的廢液；加入750μL洗滌緩沖液于離心吸附柱中，12000r/min離心30s，倒掉廢液收集管中的廢液；重復(fù)步驟5一次。再次于12000r/min離心2min，盡量除去漂洗緩沖液；小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5mL的Eppendorf離心管中，加入適量的洗脫緩沖液，室溫放置5min后，12000r/min離心1min；將得到的產(chǎn)物進行0.8％瓊脂糖電泳鑒定并用分光光度計測定DNA的含量。
1.2BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ和pUS2質(zhì)粒按如下比例建立100μL的反應(yīng)體積10×NEB Buffer25μLBglII 5μLAvrII 5μLpcDNA4.0/His/LacZ或pUS220μL無菌去離子水 64μL100×BSA 1μL37℃水浴反應(yīng)4h后，0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收酶切pcDNA4.0/His/LacZ后5.2kb的產(chǎn)物及pUS2質(zhì)粒酶切后約6.7kb的基因片段pUS。回收步驟按天為時代試劑盒操作說明進行切取含DNA片斷的瓊脂糖(100～300mg)搗碎按比重1∶3(DNA片斷溶液B體積重量比)加入溶液B；50℃水溶10min，直至膠完全融化，其間漩渦3次，瓊脂糖必須完全融化。如果體積大于500μL，可適當(dāng)增加溶膠時間，如此時溶液變紅，可加15μL NaAc；將溶液置于離心柱中，靜置1min，8000r/min離心60s，分兩次離；倒掉液體，加入500μL溶液C(用無水乙醇1∶1稀釋)于離心柱中8000r/min 60s離心，到掉液體；用溶液C(用無水乙醇1∶1稀釋)500μL再洗一遍，8000r/min離心60s；15000r/min再次離心60s，以甩干剩余液體；將離心柱置于新的離心管中，(若此時離心管蓋不住，不影響試驗結(jié)果)加入56℃預(yù)熱的30μL溶液D，混勻，靜置2min，1500r/min離心60s，管底即為所需DNA1.3按順序加入下列試劑建立10μL的連接體系，將純化回收后的DNA連接10×T4DNA連接酶緩沖液 1μLpUS2質(zhì)粒酶切后約6.7kb的基因片段 100ngpcDNA4.0/His/LacZ酶切后5.2kb的產(chǎn)物 100ngT4DNA連接酶(3U/uL) 1μL用無菌雙蒸水補至10μL，離心混勻于管底，16℃連接9h。
1.4連接物的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp+/LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，利用Amp抗性篩選重組轉(zhuǎn)化體。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，按天為時代試劑盒操作說明進行分別取感受態(tài)細(xì)胞和SolutionA，SolutionB，置于冰浴上融化；每支感受態(tài)細(xì)胞(100μL)加入10μL SolutionA 8μL，SolutionB 95μL，冰預(yù)冷的無菌去離子水，混合均勻；用冷卻的無菌吸頭將上述懸液分裝到新的預(yù)冷的離心管中；加入目的DNA，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰浴中放置30min；將管放在室溫(＞25℃)10min，或者放在42℃水浴放置75s，不要搖動；快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2～3min。
每管加入500μL LB培養(yǎng)基，置于37℃搖床振搖培養(yǎng)，溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；取100μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。用一無菌彎頭玻璃棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開；將平板置于室溫，直至液體被吸收；倒置平板，于37℃培養(yǎng)12～16h。
1.5用QIAGEN試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒用QIAGEN公司Plasmid Mini Purification Kit試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒，按試劑盒說明書操作，具體步驟如下5000r/min離心10min沉淀10mL培養(yǎng)物菌體，倒盡上清液，加1mL PBS液重懸菌體，轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL離心管中，12000r/min離心30s，倒盡上清液；加入300μL的Buffer P1，充分懸浮菌體；加入300μL的Buffer P2，輕輕混勻溶液，并輕柔顛倒離心管4～6次，然后于室溫下孵育5min；加入300μL冰浴中預(yù)冷的Buffer P3，立即輕輕混勻溶液，然后于冰浴中孵育5min；12000r/min離心10min，取上清液備用；取一QIAGEN-tip 20柱子，直立于試管架上，加入1mL的Buffer QBT，在重力作用下使溶液流盡；將上述取得的上清液加入QIAGEN-tip 20柱子中，在重力作用下使溶液流盡；加入1mL的Buffer QC洗滌QIAGEN-tip 20柱子，在重力作用下使溶液流盡，重復(fù)4次；加入800μL的Buffer QF溶解DNA，在重力作用下使溶液流盡至一新的1.5mL離心管中；加入0.7倍體積的異丙醇，室溫下沉淀DNA；12000r/min離心30min，小心倒盡上清液；加入1mL的70％乙醇洗滌DNA，為保證質(zhì)粒無菌，在超凈工作臺中吹干后，加入適當(dāng)體積的70℃水浴過的pH 8.0的TE Buffer溶解DNA；此DNA即為轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)移載體示意圖如圖2。
BglII和AvrII酶切后，5.2kb的pcDNA4.0/His/LacZ酶切的產(chǎn)物和6.7kb的pUS2質(zhì)粒酶切片段，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，BglII和AvrII酶切鑒定結(jié)果(如圖3)表明獲得了轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒，命名為pUS2-LacZ。該質(zhì)粒含CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40po1yA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點，該多克隆位點中，NotI、XhoI、ApaI是質(zhì)粒的其它地方?jīng)]有的酶切位點，可以用于外源基因的插入，EcoRI和PstI分別在2367bp和3364bp各有一個位點，在不完全酶切的情況下，通過回收大片段的方法也能將外源基因插入。在5’端保留了約3163bp及在3’端保留了602bp的MDV US2基因序列作為和MDV的DNA同源重組的同源臂，與獲得重組MDV的要求相一致。
實施例2.轉(zhuǎn)移載體在構(gòu)建和篩選重組雞馬立克氏病病毒中的應(yīng)用2.1重組雞馬立克氏病病毒的構(gòu)建和篩選按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，待其長成80％單層后，以MDV的稀釋液洗2遍，再接種MDVCVI988/Rispens疫苗病毒，接種劑量為24孔板中每孔50PFU(以MDV稀釋液稀釋)，37℃作用4h后，用不含抗生素的MEM洗滌兩次，按照LipofectamineTM2000說明書，將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，作用2h后，倒掉轉(zhuǎn)染液，加入含5％牛血清的MEM培養(yǎng)液于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5d后，待出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，加入含有X-gal(200μg/ml)營養(yǎng)液，觀察藍(lán)色蝕斑，將24孔中感染的CEF細(xì)胞用0.25％胰酶消化，接種到有新鮮CEF細(xì)胞單層的96孔培養(yǎng)板上。觀察藍(lán)斑，將有藍(lán)色孔消化并接到新的細(xì)胞上，如此重復(fù)多個循環(huán)，直至確信所有的蝕斑都是藍(lán)色(如圖4)，通過藍(lán)斑篩選獲得純化的重組病毒。
2.2重組馬立克氏病病毒的生長特性及穩(wěn)定性將純化的重組病毒在CEF中傳5代以上，顯微鏡觀察重組病毒在CEF上的病變形態(tài)，并與MDVCVI988/Rispens的形態(tài)相比較，并觀察重組病毒的生長特性。對第八代病毒用X-gal處理，觀察藍(lán)斑形成情況，以確證重組體的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，如圖5所示，重組體MDV在CEF中的生長特性與MDVCVI988/Rispens相似，且重組MDV能穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶。
實施例3.表達(dá)傳染性法氏囊病毒(IBDV)VP2基因的重組馬立克氏病病毒的構(gòu)建及應(yīng)用3.1表達(dá)傳染性法氏囊病毒(IBDV)VP2基因的重組馬立克氏病病毒的構(gòu)建和篩選將1.35kb的IBDV VP2基因通過EcoR I和Xhol I位點插入到pUS2-LacZ載體中，獲得了重組質(zhì)粒pUS2-LacZ-VP2，將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUS2-LacZ-VP2用質(zhì)脂體包裹轉(zhuǎn)染MDVCVI988/Rispens株感染的CEF細(xì)胞，按照2.1的方法，轉(zhuǎn)染后4～5d，開始加底物X-gal，觀察到有藍(lán)斑的出現(xiàn)，(如圖6)通過藍(lán)斑純化篩選重組MDV。
3.2重組病毒的鑒定提取純化獲得的穩(wěn)定的重組病毒的DNA，用傳染性法氏囊VP2基因的特異性引物擴增出大小約1.35kb的PCR產(chǎn)物。(如圖7)3.3重組病毒在CEF上表達(dá)IBDV VP2蛋白的分析含有重組病毒的細(xì)胞裂解物的Western-blot分析表明，在分子量大約40KD處有特異的反應(yīng)條帶，說明VP2蛋白在重組病毒中表達(dá)。(如圖8)3.4重組病毒(rMDV)應(yīng)用效果試驗1日齡雛雞共54只，分A、B、C、D四組，A組為基因工程重組疫苗組，20只；B組為BJ836疫苗接種組，15只；C組為非接種的陽性對照組，15只；D組為非接種的陰性對照組，4只。A組對1日齡雛雞免疫重組病毒，劑量為0.1ml/只；B組BJ836疫苗接種組，在雞14日齡時接種，接種途徑為點眼滴鼻，劑量為0.2ml/只；非接種的陽性對照組雞和非接種的陰性對照組雞在1日齡注射馬立克病毒稀釋液，劑量為0.2ml/只。分別在14、21、28、35日齡時采血，測定IBDV抗體的ELISA效價。35日齡時，對重組疫苗接種組、中等毒疫苗接種組及非免疫的陽性對照組進行IBDV強毒CJ801攻擊，觀察，攻擊后6天剖殺所有的雞，進行肉眼病理觀察。結(jié)果表明，重組疫苗免疫組經(jīng)強毒攻擊后，只有2只雞剖檢時可見法氏囊出現(xiàn)輕度萎縮，其余的法氏囊大小、色澤、質(zhì)量均很正常，而非免疫攻毒的陽性對照組，剖檢時法氏囊部分100％出現(xiàn)肉眼病變，或萎縮或出現(xiàn)凍膠樣水腫、黃色化。(如圖9)剖殺時稱體重和囊重，計算囊/體比，評價疫苗免疫保護指數(shù)。然后計算保護指數(shù)(％)保護指數(shù)(％)是指IBDV免疫攻毒組中法氏囊正常大小雞的百分率，所謂正常大小的法氏囊是指不顯著小于陰性對照組的法氏囊。再進行統(tǒng)計分析(按生物統(tǒng)計中的方差分析)，結(jié)果表明進行平均囊/體比，顯著水平為P＜0.05.重組病毒(rMDV)的保護指數(shù)為90％，BJ836疫苗的保護指數(shù)為93％，其平均囊/體比與非免疫的陰性對照組無顯著性差異(P＞0.05)。(如表1)
表1不同組雞的平均囊/體比、平均囊指數(shù)及保護指數(shù)

a囊體/比(B/B)指囊重÷體重×1000。
b保護指數(shù)，即不同的攻毒組中法氏囊正常大小雞的百分率(這里所謂正常大小的法氏囊是指不顯著小于未接種未攻毒組的法氏囊)。
采集所有的法氏囊組織，用10％甲醛固定。將采集的法氏囊組織按常規(guī)的石蠟包埋切片技術(shù)處理，進行H.E染色，顯微鏡下進行組織病理學(xué)觀察。(見圖10a、10b、10c、10d)圖10a為重組病毒組(rMDV)攻毒后法氏囊組織H.E染色結(jié)果，其結(jié)構(gòu)完整，排列致密；圖10b為BJ836疫苗免疫組的法氏囊組織切片H.E染色結(jié)果，其結(jié)構(gòu)完整，排列致密，出現(xiàn)中性粒細(xì)胞密集團；圖10c為陽性對照組雞的法氏囊組織切片H.E染色結(jié)果，法氏囊組織松散，淋巴細(xì)胞壞死脫落，間質(zhì)細(xì)胞增生，中性粒細(xì)胞集團中的淋巴細(xì)胞嚴(yán)重脫落，出現(xiàn)空泡化；圖10d為陰性對照組雞的法氏囊組織切片H.E染色結(jié)果，其結(jié)構(gòu)完整，排列致密。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ，其特征在于重組質(zhì)粒pUS2上的US2基因片段由CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40 polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因替換。
2.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ的制備方法，用BglII和AvrII酶切pcDNA4.0/His/LacZ質(zhì)粒，回收CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因；用BglII和AvrII酶切pUS2質(zhì)粒，回收pUSE片段；將CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40 polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因插入pUSE片段BglII和AvrII之間，即得上述轉(zhuǎn)移載體。
3.重組馬立克氏病病毒制備方法，包括如下步驟(1)MDV CVI988/Rispens疫苗病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞，(2)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，(3)加底物X-gal顯色，(4)通過藍(lán)斑純化篩選即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組馬立克氏病病毒的制備方法，所述轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ的多克隆位點表達(dá)盒上還插入有外源基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組馬立克氏病病毒的制備方法，所述外源基因是雞傳染性法氏囊病毒VP2基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5所述任一方法制備的重組馬立克氏病病毒。
7.權(quán)利要求6所述的重組馬立克氏病病毒作為疫苗的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及“重組雞馬立克氏病病毒轉(zhuǎn)移載體及應(yīng)用”。一種轉(zhuǎn)移載體pUS2－LacZ，其特征在于重組質(zhì)粒pUS2上的US2基因片段由CMV立即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及一個多克隆位點基因替換。該轉(zhuǎn)移載體可通過與MDV疫苗病毒同源重組，獲得LacZ標(biāo)記基因的重組病毒MDV；同時轉(zhuǎn)移載體上具有多克隆位點，可插入外源病毒基因，由此獲得了重組質(zhì)粒，再通過同源重組并純化篩選得到重組病毒。該重組病毒制成疫苗，具有抗多種病毒的效果。
文檔編號C12R1/93GK1763205SQ200510086230
公開日2006年4月26日 申請日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者李永清, 周雪媚, 張培君 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院