專利名稱：通過pcr鑒定山羊早期胚胎性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用非電泳PCR法鑒定山羊早期胚胎性別的方法，屬家畜性別控制方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
家畜后代性別控制一直是人們關(guān)注的課題之一，尤其是對于有經(jīng)濟實用價值的家畜，如奶牛、山羊等。因此對早期胚胎進行性別鑒定，加速所需性別子代的繁殖，對促進高效益畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。
PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應(yīng))擴增技術(shù)是一種擴增目的基因的分子生物學方法，它是在模板DNA、引物和dNTP(4種脫氧核糖核苷酸)存在的條件下依賴于DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液的酶促合成反應(yīng)，具有快速、特異、靈敏、簡便、高效的特點。PCR是由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成模板DNA的變性模板DNA在90℃～96℃加熱一定時間，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便單鏈與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA經(jīng)加熱解離變性成單鏈后，溫度降至45℃～65℃，兩引物分別與模板DNA單鏈互補序列配對結(jié)合；引物的延伸DNA模板與引物的結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，從5’端向3’端延伸，合成與模板DNA互補的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過這三步，DNA含量增加一倍。如此反復，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過30個左右的循環(huán)后，理論上可使目的基因擴增109倍以上。
基于PCR上述的反應(yīng)動力特點，在用于早期胚胎性別鑒定時，需要樣品量少，只要一個細胞就能進行。隨著胚胎移植技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化推廣，用PCR法進行早期性別鑒定的技術(shù)日益發(fā)展成熟，成為目前最具有推廣和實用價值的一項性別控制技術(shù)。但對PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果傳統(tǒng)的檢測方法是對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過溴化乙錠(EB)染色后將膠置于紫外燈下觀察，出現(xiàn)特異性條帶的為雄性，否則為雌性，其中的電泳是為了保證性別鑒定的準確性。然而，現(xiàn)有的性別鑒定方法所進行的電泳實驗需花費約40分鐘左右的時間，這種方法因耗時，且需特定的儀器設(shè)備(如電泳儀和電泳槽)而不易于在生產(chǎn)實踐中推廣使用。并且，在實際操作中用于移植的胚胎和用于性別鑒定的胚胎是一次獲得的，因此在鑒定出胚胎性別之前需要對待移植的胚胎進行培養(yǎng)，而培養(yǎng)時間的增長會導致胚胎可移植性的降低甚至死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題和提出的技術(shù)任務(wù)是克服現(xiàn)有將PCR產(chǎn)物需經(jīng)電泳實驗后再進行觀察判定性別的方法所存在的不易于在生產(chǎn)實踐中推廣使用的缺陷，提供一種非電泳PCR法鑒定山羊早期胚胎性別的方法。為此，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，所述的PCR是從山羊早期胚胎中取樣制作模板DNA，并根據(jù)山羊SRY基因序列設(shè)計引物，將所述模板DNA、引物隨同DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液和dNTP一起加入到反應(yīng)管中作為反應(yīng)物，重復進行變性-退火-延伸三個步驟至反應(yīng)結(jié)束；其特征是在PCR之前先向所述反應(yīng)管中加入溴化乙錠，之后進行PCR反應(yīng)，于PCR反應(yīng)結(jié)束后直接將反應(yīng)管置于紫外燈下觀察結(jié)果。
本發(fā)明還包括以下附加技術(shù)特征所述的引物是SRY55’CGTGAACGAAGACGAAAGGTG 3’；SRY35’TGTGCCTCCTCAAAGAATGGG 3’。
所述的山羊早期胚胎為4胞期胚胎、桑椹期胚胎或者囊胚期胚胎。
所述的取樣是用玻璃針法從所述胚胎中切取細胞選用4胞期胚胎時切取2個細胞；選用桑椹期胚胎時切取2～10個細胞；選用囊胚期胚胎時從囊胚期滋養(yǎng)層細胞中切取2～10個細胞。
所述模板DNA的制作是把胚胎細胞樣品放入離心管，經(jīng)生理鹽水洗滌后加入滅菌超純水；在離心機上短暫離心，將細胞樣品置于離心管底，用封口膜封好離心管；100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷卻后高速離心10min，上清內(nèi)所含DNA作為PCR的模板DNA。
所述的DNA聚合酶為Taq酶，所述的反應(yīng)緩沖液為MgCl2和10×buffer的混合物。
所述的dNTP為濃度分別為10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核酸的混合物。
本方法在PCR反應(yīng)體系中加入EB，PCR結(jié)束后，取出反應(yīng)管直接在紫外燈下觀察，有熒光的為雄性，否則為雌性；由于本方法不需要電泳實驗，不需要特定的儀器設(shè)備就能夠簡單進行，利于在生產(chǎn)實踐中推廣使用；而且，節(jié)約了性別鑒定的時間，2～2.5小時即可完成。對山羊早期胚胎鑒定的準確率達到95％～97％。
本方法根據(jù)Genbank中所提供的山羊Y-染色體特異性DNA序列中的SRY基因序列，設(shè)計一對引物擴增SRY基因上128bp的區(qū)域；并采用非電泳法對擴增產(chǎn)物的檢測來判斷Y染色體特異性片段存在，可以縮短檢測時間，為胚胎移植爭取了時間，便于在生產(chǎn)實踐中使用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明作進一步詳細說明以下所用引物為根據(jù)Genbank中所提供的山羊Y-染色體特異性DNA序列中的SRY基因序列設(shè)計的SRY55’CGTGAACGAAGACGAAAGGTG 3’SRY35’TGTGCCTCCTCAAAGAATGGG 3’，該對引物用滅菌雙蒸水稀釋，最終濃度為20μM，-20℃保存；所用DNA聚合酶為Taq酶，所述的反應(yīng)緩沖液為MgCl2和10×buffer的混合物；所用dNTP為濃度分別為10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核酸的混合物，它作為DNA聚合酶的底物使用。
實施例一山羊4胞期胚胎性別鑒定1.微量山羊4胞期胚胎細胞DNA提取使用玻璃針法，從山羊4胞期胚胎切取1～2個細胞，然后把胚胎細胞樣品放入200μl離心管，經(jīng)生理鹽水洗滌后加入10μl滅菌超純水；在離心機上短暫離心，將細胞樣品置于離心管底，用封口膜封好離心管；在100℃下煮沸5～10min后立即置于冰上；冷卻后12000r/min離心10min，取上清用于PCR，上清內(nèi)所含DNA即為模板DNA。
2.特異性DNA序列擴增反應(yīng)管中PCR反應(yīng)總體積30μl，其中兩個特異性引物各為1μl，dNTP200μM，Taq酶1U，MgCl22.5mM，10×buffer3μl，模板原液2μl，EB1～1.5μl，補足去離子水30μl；將上述容納反應(yīng)原料的反應(yīng)管置于基因擴增儀上進行PCR先在95℃預(yù)變性5min，然后進行40～45個循環(huán)擴增，每個循環(huán)包括95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸7～10min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。用雙蒸水做空白對照。
3.產(chǎn)物檢測①對PCR產(chǎn)物的污染檢驗將作為空白對照的反應(yīng)管置于紫外燈下觀察，無熒光出現(xiàn)，證實前述PCR產(chǎn)物沒有被污染。
②非電泳法PCR擴增產(chǎn)物性別檢測PCR結(jié)束后不經(jīng)電泳直接將PCR管在紫外燈下觀察結(jié)果。通過對15個胚胎的檢測，判定有熒光的為雄性，否則為雌性。性別鑒定后胚胎移植產(chǎn)羔羊的性別和檢測結(jié)果完全一致。
實施例二山羊桑椹期胚胎性別鑒定1.微量山羊桑椹胚胚胎細胞DNA提取使用玻璃針法，從山羊桑椹胚胚胎切取2～10個細胞，然后把胚胎細胞樣品放入200μl離心管，經(jīng)生理鹽水洗滌后加入10μl滅菌超純水；在離心機上短暫離心，將細胞樣品置于離心管底，用封口膜封好離心管；在100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷卻后12000r/min離心10min，取上清用于PCR，上清內(nèi)所含DNA即為模板DNA。
2.特異性DNA擴增反應(yīng)管中PCR反應(yīng)總體積30μl，其中兩個特異性引物各為1μl，dNTP200μM，Taq酶1U，MgCl22.5mM，10×buffer3μl，模板原液2μl，EB1～1.5μl，補足去離子水30μl；將上述容納反應(yīng)原料的反應(yīng)管置于基因擴增儀上進行PCR先在95℃預(yù)變性5min，然后進行40～45個循環(huán)擴增，每個循環(huán)包括95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸7～10min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。用雙蒸水做空白對照。
3.非電泳法PCR產(chǎn)物檢測①對PCR產(chǎn)物的污染檢驗將作為空白對照的反應(yīng)管置于紫外燈下觀察，無熒光出現(xiàn)，證實前述PCR產(chǎn)物沒有被污染。
②非電泳法PCR擴增產(chǎn)物性別檢測PCR結(jié)束后不經(jīng)電泳直接將PCR管在紫外燈下觀察結(jié)果。通過對15個胚胎的檢測，判定有熒光的為雄性，否則為雌性。性別鑒定后胚胎移植產(chǎn)羔羊的性別和檢測結(jié)果完全一致。
實施例3山羊囊胚期胚胎性別鑒定1.微量山羊囊胚期胚胎細胞DNA提取使用玻璃針法，從山羊囊胚期胚胎滋養(yǎng)層細胞切取2～10個細胞，然后把胚胎細胞樣品放入200μl離心管，經(jīng)生理鹽水洗滌后加入10μl滅菌超純水；在離心機上短暫離心，將細細胞樣品置于離心管底，用封口膜封好離心管；在100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷卻后12000r/min離心10min，取上清用于PCR，上清內(nèi)所含DNA即為模板DNA。
2.特異性DNA擴增反應(yīng)管中PCR反應(yīng)總體積30μl，其中兩個特異性引物各為1μl，dNTP200μM，Taq酶1U，MgCl22.5mM，10×buffer3μl，模板原液2μl，EB1～1.5μl，補足去離子水30μl；將上述容納反應(yīng)原料的反應(yīng)管置于基因擴增儀上進行PCR反應(yīng)條件中先在95℃預(yù)變性5min，然后進行40～45個循環(huán)擴增，包括95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸7～10min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。用雙蒸水做空白對照。
3.非電泳法PCR產(chǎn)物檢測①對PCR產(chǎn)物的污染檢驗將作為空白對照的反應(yīng)管置于紫外燈下觀察，無熒光出現(xiàn)，證實前述PCR產(chǎn)物沒有被污染。
②非電泳法PCR擴增產(chǎn)物性別檢測PCR結(jié)束后不經(jīng)電泳直接將PCR管在紫外燈下觀察結(jié)果。對15個胚胎進行檢測，判定有熒光的為雄性，否則為雌性。性別鑒定后胚胎移植產(chǎn)羔羊的性別和檢測結(jié)果完全一致。
權(quán)利要求
1.一種通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，所述的PCR是從山羊早期胚胎中取樣制作模板DNA，并根據(jù)山羊SRY基因序列設(shè)計引物，將所述模板DNA、引物隨同DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液和dNTP一起加入到反應(yīng)管中作為反應(yīng)物，重復進行變性-退火-延伸三個步驟至反應(yīng)結(jié)束；其特征是在PCR之前先向所述反應(yīng)管中加入溴化乙錠，之后進行PCR反應(yīng)，于PCR反應(yīng)結(jié)束后直接將反應(yīng)管置于紫外燈下觀察結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征是所述的引物是SRY55’CGTGAACGAAGACGAAAGGTG 3’；SRY35’TGTGCCTCCTCAAAGAATGGG 3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征是所述的山羊早期胚胎為4胞期胚胎、桑椹期胚胎或者囊胚期胚胎。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征是所述的取樣是用玻璃針法從所述胚胎中切取細胞選用4胞期胚胎時切取2個細胞；選用桑椹期胚胎時切取2～10個細胞；選用囊胚期胚胎時從囊胚期滋養(yǎng)層細胞中切取2～10個細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征是所述模板DNA的制作是把胚胎細胞樣品放入離心管，經(jīng)生理鹽水洗滌后加入滅菌超純水；在離心機上短暫離心，將細胞樣品置于離心管底，用封口膜封好離心管；100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷卻后高速離心10min，上清內(nèi)所含DNA作為PCR的模板DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征是所述的DNA聚合酶為Taq酶，所述的反應(yīng)緩沖液為MgCl2和10×buffer的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征是所述的dNTP為濃度分別為10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核酸的混合物。
全文摘要
一種通過PCR鑒定山羊早期胚胎性別的方法，所述的PCR是從山羊早期胚胎中取樣制作模板DNA，并根據(jù)山羊SRY基因序列設(shè)計引物，將所述模板DNA、引物隨同DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液和dNTP一起加入到反應(yīng)管中作為反應(yīng)物，重復進行變性－退火－延伸三個步驟至反應(yīng)結(jié)束；其特征是在PCR之前先向所述反應(yīng)管中加入溴化乙錠，之后進行PCR反應(yīng)，于PCR反應(yīng)結(jié)束后直接將反應(yīng)管置于紫外燈下觀察結(jié)果。本發(fā)明根據(jù)山羊Y染色體特異性序列設(shè)計一對引物，并用非電泳PCR法進行鑒定，解決了目前山羊早期胚胎性別鑒定耗時長、需特定儀器設(shè)備的問題；簡化了操作程序，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK1978664SQ200510061758
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者徐雪明, 俞頌東, 陳阿琴, 王爭光, 王錫爐, 張銳 申請人:新昌縣大東種畜發(fā)展有限公司