專利名稱：誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞的方法
誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞的方法發(fā)明背景1、 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的方法。特別地，本發(fā)明涉及 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞的方法，以及具有此用途的試劑盒。2、 現(xiàn)有技術(shù)描述糖尿病作為最常見的代謝失調(diào)性疾病，影響著世界上4-5%的人群。據(jù) 估計，到2010年，糖尿病患者的數(shù)量會超過三億五千萬。I型糖尿病是由 于胰島中的e細(xì)胞遭受自身免疫破壞所致。所以許多研究小組都在尋找各 種方式試圖來替換這些被破壞的產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。目前，胰島細(xì)胞移植是 除了注射胰島素外唯一有效的可治愈I型糖尿病的方法(SempP,Madsen OD, Mandrup-Poulsen T. Islet and stem cell transplantation for treating diabetes. BMJ 2001;322:29-32)。但是，由于可移植的供體胰島嚴(yán)重短缺，導(dǎo)致該方法無法廣泛應(yīng)用。由胚胎干(ES)細(xì)胞獲得功能性的P細(xì)胞被認(rèn)為能解決可移植的胰島 不足的問題。ES細(xì)胞已經(jīng)被證明能夠分化成胰島樣的集落，特別是胰腺P 細(xì)胞(Soria B, Roche E, Bema G， et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162;Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394;Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 2001;50(8):1691-169.)。 Soria等通過一種"細(xì)胞捕獲"的方案首次成功 地誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成胰腺e細(xì)胞。(Soria B, Roche E， Berna G， et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162)。不過，
這種方法比較復(fù)雜，且需要一些遺傳操作。Lumelsky等(Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394)設(shè)計了一種誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素的胰島樣結(jié) 構(gòu)的"五步法"，此法無需遺傳操作。Hori等(HoriY,RulifsonIC，TsaiBC, et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99(25):16105-16110)和Blyszczuk等(Blyszczuk P， Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003)通過添加生長抑制劑LY294002或過表達(dá)基因 pax4來改進(jìn)Lumelsky的"五步法"。但是，所有的這些誘導(dǎo)方案在某些方 面都是復(fù)雜的，周期很長。Hansson等(Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A2003;100(3):998-1003)，在使用了 "五步法"后發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞在培養(yǎng)中可 能通過吸收培養(yǎng)基中的胰島素而使結(jié)果出現(xiàn)假陽性。因此，尋找能夠方便 快捷地誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成胰腺e細(xì)胞的特異性誘導(dǎo)因子十分必要。某些因子已經(jīng)被報道可以促進(jìn)確定的內(nèi)胚層分化。TGF-P超家族的成 員之一，激活蛋白A(activinA)，在原腸胚形成中對內(nèi)胚層和中胚層的形 成起關(guān)鍵性作用。高濃度下它主要誘導(dǎo)內(nèi)胚層形成(Kumar M, Jordan N, Melton DA, et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122; Hill CS. TGF-(3 signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;ll(5):533-540)。全反式視黃酸(All-trans retinoic acid， RA)是 一種充分表征的信號分子，在脊椎動物的神經(jīng)外胚層和中胚層前后模式的 形成中起重要作用(Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. IntRev Cytol 2001;209:1-77)。目前的證據(jù)顯示RA也參 與調(diào)節(jié)胚胎內(nèi)胚層分化模式，特別是在胰芽形成過程中，并且它也能增強(qiáng) 胰腺P細(xì)胞和INS-1細(xì)胞系中胰島素的表達(dá)(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreaticdevelopment. Current Biology 2002;12(14): 1215-1220; Bl腿entrath J， Neye H， Verspohl EJ. Effects of retinoids and thiazolidinediones on proliferation, insulin release, insulin mRNA, GLUT2 transporter protein and mRNA of INS-l cells. Cell BiochemFunct 2001;19:159-169)。還證明了在爪蟾中激活 蛋白A和RA聯(lián)合作用可以使本來應(yīng)該發(fā)育成外胚層的區(qū)域分化成可以 表達(dá)胰島素的胰腺細(xì)胞(Moriya N, Komazaki S， Takahashi S， et al. In vitro pancreas formation from Xenopus ectoderm treated with activin and retinoic acid. Develop Growth Differ 2000;42:593-602)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種能用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞的試劑合rm. o為達(dá)到所述目的，本發(fā)明通過了提供一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的方法，包括以下順序的步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞以形成胚體； 利用激活蛋白A孵育胚體；和利用全反式視黃酸(RA)孵育胚體以使其發(fā)育為產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞。在一方面，當(dāng)胚胎干細(xì)胞來源于小鼠時，本方法中使用的培養(yǎng)基是含有約10。/。胎牛血清的DMEM。在另一種情形，當(dāng)胚胎干細(xì)胞來源于人時， 所述培養(yǎng)基是CDM。在一方面，所述激活蛋白A的濃度約為50-300 ng/ml培養(yǎng)基，所述 RA的濃度可為約1 X 10_7-1 X 10—5mol/L培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟在用激活蛋白A 孵育胚體前，在包被Metrigel的培養(yǎng)基中孵育胚體。在一方面，所述Metrigel 在培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分含量約為1%。在另一個實施方案中，用激活蛋白A孵育胚體20小時到4天，再在 不含激活蛋白A的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時，然后再利用RA孵育20 小時到4天以使其發(fā)育為產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞。在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟在含有成熟因
子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由此生成的產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞以使其擴(kuò)增。在一個實施方案中，所述成熟因子是濃度為8-12ng/ml的bFGF。在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟在含有N2添 加劑、B27添加齊U、層粘連蛋白(Laminin)和煙酰胺的培養(yǎng)基中孵育此擴(kuò) 增了的產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞以使其發(fā)育為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。在一方面，所 述培養(yǎng)基是含N2添加劑(1:100，可從Gibco購買)，B27添加劑(1:50, 可從Gibco購買)，l嗎/ml的層粘連蛋白，10ng/ml的bFGF ，胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒-A (1:100，可從Gibco購買)，以及10 mmol/L煙酰胺的 DMEM/F12或CDM培養(yǎng)基。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的試劑盒。 在一個實施方案中，所述試劑盒包括激活蛋白A和RA。在另一個實 施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括Metrigd。在再一個實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括血清和/或一級培養(yǎng)基。在一方面，Metrigel被包被在所 述一級培養(yǎng)基上。在另一方面，單獨(dú)提供MetrigeL在另一方面，所述一級培養(yǎng)基含有成熟因子，例如bFGF。在另一個實施方案中，所述試劑盒 進(jìn)一步包括一種含有bFGF的二級培養(yǎng)基。


圖1A為在本發(fā)明中提供的能誘導(dǎo)ES細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞分化的三步培養(yǎng)法。圖1B為小鼠ES-R1細(xì)胞形成EB細(xì)胞集落的照片。圖1C為在三步培養(yǎng)法的第二步中的胰腺前體細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣結(jié)構(gòu)的 照片。圖1D-圖1E為在三步培養(yǎng)法的第三步出現(xiàn)的細(xì)胞集落樣結(jié)構(gòu)的照片。 圖2A為RT-PCR檢測在第二步末由激活蛋白A或RA分別誘導(dǎo)的分化細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況。圖2B為RT-PCR檢測在第二步末由激活蛋白A和RA共同誘導(dǎo)的分化細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況。圖2C為RT-PCR檢測在第三步末分化細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況。圖3A為三步培養(yǎng)法得到的細(xì)胞被胰島素一抗染色的免疫組化檢測結(jié)果。
圖3B為三步培養(yǎng)法得到的細(xì)胞被C-肽一抗染色的免疫組化檢測結(jié)果。圖3C為未經(jīng)激活蛋白A和RA誘導(dǎo)的細(xì)胞的胰島素二氨基聯(lián)苯胺四 鹽酸鹽(DAB)染色檢測結(jié)果(200X)。圖3D為經(jīng)激活蛋白A和RA誘導(dǎo)的細(xì)胞的胰島素DAB染色檢測結(jié) 果(200X)。圖3E和圖3G為由三步培養(yǎng)法誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染了 EGFP報告基因的ES-R1 細(xì)胞的EGFP表達(dá)情況，其中E、 G分別代表不同的結(jié)構(gòu)(200X)。圖3F和圖3H為由三步培養(yǎng)法誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染了 EGFP報告基因的ES-R1 細(xì)胞被胰島素一抗染色的免疫組化分析結(jié)果，其中F、 H分別代表不同的 結(jié)構(gòu)(200X)。圖31為由ELISA檢測的胰島素釋放結(jié)果。圖4A為被移植了分化細(xì)胞的糖尿病小鼠(n-9)和被移植了 PBS的糖尿 病小鼠(n-12)存活率的比較。圖4B為被移植了分化細(xì)胞的糖尿病小鼠(『5)和被移植了 PBS的糖尿 病小鼠(『3)血液葡萄糖水平的分析。圖5A為被移植了 PBS的小鼠胰島素表達(dá)的免疫組化分析結(jié)果(200X)。圖5B為被移植了分化細(xì)胞的小鼠胰島素表達(dá)的免疫組化分析(200X)。圖6為人胚胎千(hES)細(xì)胞的誘導(dǎo)方法流程。 圖7A為由CDM作用/RA方法誘導(dǎo)的hES的標(biāo)志基因的表達(dá)情況。 圖7B為僅由CDM培養(yǎng)的對照hES的標(biāo)志基因的表達(dá)情況。 圖8A-D為最終誘導(dǎo)的hES細(xì)胞表達(dá)C-肽和Pdxl的照片(400X)。 圖8E-H為最終誘導(dǎo)的hES細(xì)胞表達(dá)胰高血糖素和C-肽的照片。 圖8I-L為最終誘導(dǎo)的hES細(xì)胞表達(dá)淀粉酶和C-肽的照片(400X)。 圖8M-P為最終誘導(dǎo)的hES細(xì)胞表達(dá)C-肽和促生長素抑制素的照片。 圖9A為懸浮和貼壁培養(yǎng)獲得的末端分化細(xì)胞胰島素分泌量的比較。 圖9B為懸浮和貼壁培養(yǎng)獲得的末端分化細(xì)胞C-肽釋放量的比較。 圖10A為移植了被誘導(dǎo)細(xì)胞的糖尿病裸鼠和移植了 PBS小鼠，以及 移植了未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的小鼠的血液葡萄糖水平的比較。
圖10B為被操作小鼠腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試結(jié)果。圖11A為被誘導(dǎo)細(xì)胞中人C-肽表達(dá)的照片(400X)。 圖11B為人核特異性抗體的染色結(jié)果，顯示了 C-肽陽性細(xì)胞來源于人 ES細(xì)胞(400X)。優(yōu)選實施方案詳述預(yù)先的研究顯示，胚胎干細(xì)胞能夠被特異性誘導(dǎo)分化成胰腺(3細(xì)胞(Blyszczuk P, Czyz J， Kania G， et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003; Hansson M, Tonning A， Frandsen U， et al. Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004; 53:2603-2609)。但是， 絕大多數(shù)誘導(dǎo)方案都需要大約一個月才能獲得胰島素陽性的細(xì)胞。本發(fā)明 提供了一種新的三步培養(yǎng)法，它是基于激活蛋白A、 RA和其它一些成熟 因子例如matrigel、煙酰胺(nicotinamide)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的聯(lián)合作用。在該三步培養(yǎng)法的第三步末，這些被誘導(dǎo)的細(xì)胞形 成小的胰島樣的集落結(jié)構(gòu)并表達(dá)胰腺P細(xì)胞的標(biāo)志基因，包括/mw^、 ; 血7、 g/w^、 &/7和/7" ， 并且還能通過移植拯救經(jīng)STZ處理的糖尿病 小鼠。三種因子，如激活蛋白A,RA和matrigd，在我們的胰腺(3細(xì)胞實驗誘 導(dǎo)方案中起了十分重要的作用。激活蛋白A對早期確定的內(nèi)胚層的發(fā)育十 分重要。它是二硫鍵穩(wěn)定的蛋白，屬于TGF-(3超家族。它與細(xì)胞表面受體 的結(jié)合能誘導(dǎo)許多基因的表達(dá)，包括m/;c/7和goosecoW，這對早期內(nèi)胚層 的發(fā)育很重要(Kumar M, Jordan N， Melton DA， et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122; Hill CS. TGF-卩signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;11(5):533-540)。 Kubo等報 導(dǎo)激活蛋白A能夠誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成為確定的內(nèi)胚層細(xì)胞(Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development 2004; 131:1651 -1662 )。 另夕卜， 激活蛋白A在培養(yǎng)的人胰島中促進(jìn)胰島素的分泌(Florio P, Luisi S,Marchetti P， et al. Activin A stimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets. J Endocrinol Invest 2000;23(4):231-234)，并在患糖尿病的 新生小鼠的P細(xì)胞發(fā)育中調(diào)控分化和P細(xì)胞的再生(Lei L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and Betacellulin Effect on Regeneration of Pancreatic B-Cells in Neonatal Streptozotocin-Treated Rats, Diabetes 2004; 53:608-615)。激活蛋白 A的這些功能的聯(lián)合能夠解釋它如何在我們的系統(tǒng)中起作用。第二，近期 已經(jīng)證明RA除了具有誘導(dǎo)外胚層和中胚層發(fā)育的功能，在早期胎胰發(fā)育 中也是一個重要的信號分子(Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. Int Rev Cytol 2001 ;209:1 -77 )。在斑馬魚的發(fā)育中， PA信號上調(diào)能夠誘導(dǎo)胰臟和肝臟內(nèi)胚層前端的顯著擴(kuò)增。相反地，用 BMS493抑制RA，能夠抑制胚胎內(nèi)胚層向胰腺的早期分化(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development. Current Biology 2002;12(14):1215-1220)。 而且，Micalle傳報導(dǎo)，在小鼠胚胎干細(xì)胞分化的第四天加入RA能誘導(dǎo)p血7 陽性的內(nèi)胚層形成(Micallef SJ， Janes ME， Knezevic K, et al. Retinoic Acid Induces Pdxl-Positive Endoderm in Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004 Dec 7 [Epub ahead of print])。對于胰腺的成熟，RA在 內(nèi)分泌和導(dǎo)管細(xì)胞分化中的作用主要是通過旁分泌以及上調(diào)P血7基因?qū)?!見的(Tulachan SS, Doi R, Kawaguchi Y, et al. All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrine cells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas. Diabetes 2003; 52(l):76-84)。在背胰的發(fā) 育中RA被發(fā)現(xiàn)通過抑制外分泌部分分化而促進(jìn)內(nèi)分泌部分發(fā)育(Chen Y, Pan FC, B認(rèn)des N, et al. Retinoic acid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrine at the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus. Developmental Biology 2004; 271:144—160)。 因 此，很顯然RA能促進(jìn)胰腺前體細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)育。在激活蛋白A 誘導(dǎo)ES細(xì)胞向內(nèi)胚層分化的過程中，RA可以進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)胚層向胰腺前 體的特化。在用激活蛋白A和RA誘導(dǎo)后，分化的胚胎干細(xì)胞可以表達(dá)許 多胰腺前體細(xì)胞的標(biāo)志基因，例如pdxl、 hnf3 a和hnf4P 。這些數(shù)據(jù)顯示， 激活蛋白A和RA的聯(lián)合作用能夠誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向早期胰腺細(xì)胞的分 化。本發(fā)明的結(jié)果也表明同時使用激活蛋白A和RA進(jìn)行誘導(dǎo)比只用其中
之一更為有效。已經(jīng)證明matrigel在胰腺的體外分化和成熟中起著很重要的 胞外基質(zhì)的作用。Matrigel是一種包括層粘連蛋白在內(nèi)的胞外基質(zhì)和一些 生長因子例如FGF和TGF-P的混合物，對胰腺祖細(xì)胞的遷移、三維囊狀結(jié) 構(gòu)的形成和胰島芽突出有重要作用(Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, et al. Characterization of Endocrine Progenitor Cells and Critical Factors for Their Differentiation in Human Adult Pancreatic Cell Culture. Diabetes 2003; 52:2007-2015)。 Gittes GK等也證明matrigel中最主要的成分之一，層粘連 蛋白，參與了小鼠胚胎胰導(dǎo)管系的選擇(Jiang FX, Cram DS, DeAizpuma HJ, et al. Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic betacells. Diabetes 1999; 48:722-730; Crisera CA， Kadison AS， Breslow GD, et al. Expression and role of laminin-1 in mouse pancreatic organogenesis. Diabetes 2000;49:936-944)。而且，培養(yǎng)在matrigd上的人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞能夠形 成胰島素陽性的胰島樣集落結(jié)構(gòu)(Bomer-Weir S, TanejaM， Weir GC， et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:7999-8004)。本發(fā)明證明matrigel在誘導(dǎo)中對于小的 胰島樣集落結(jié)構(gòu)形成是必需的。如果ES細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)在層粘連蛋白或者明 膠(gelatin)上，細(xì)胞集落不能很好的形成。在此后的例舉性實施例中進(jìn)一 步顯示分化的細(xì)胞在matrigd上生長得比在層粘連蛋白或明膠上好。這些說 明，matrigd能比層粘連蛋白或明膠提供更多的誘導(dǎo)因子。本發(fā)明提供了一種新的、能在短期內(nèi)誘導(dǎo)ES細(xì)胞向功能性的產(chǎn)胰島素 的細(xì)胞分化的三步培養(yǎng)法，此方法基于激活蛋白A、 RA以及任選地其它 成熟因子的組合。結(jié)果顯示TGF-P和RA信號對于胰腺p細(xì)胞的發(fā)育和成熟 是很關(guān)鍵的。胰島素陽性細(xì)胞還能進(jìn)一步表達(dá)一些特征性的胰腺P細(xì)胞標(biāo) 志基因，例如^m/^/、 p血八g/wf2、 /z打^和W/。而且，利用攜帶位于胰 島素啟動子下游的EGFP的報告基因的載體，本發(fā)明能夠降低假陽性率， 從而真實地誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。此外，如下述實施例所證 明的，當(dāng)被移植到腎包囊部位下時本發(fā)明還能夠拯救鏈脲菌素(STZ)誘 導(dǎo)的糖尿病小鼠。此處描述的誘導(dǎo)系統(tǒng)為研究胰腺e細(xì)胞的形成和分化機(jī) 制提供了一種新的體外誘導(dǎo)模型，同時為I型糖尿病的移植治療提供了一種 潛在的產(chǎn)胰島素的細(xì)胞的來源。到此已對本發(fā)明進(jìn)行了概括的描述，通過參考下面的實施例將更便于
對其內(nèi)容的理解。這些實施例的提供是為了進(jìn)行例證，而不意欲限制本發(fā) 明。實施例實施例l、誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。在含20%胎牛血清(FBS)(Gibco-BRL)， 1000 U/ml白血病抑制因子 (LIF， Gibco-BRL)的Dulbecco，s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 一 個己被廣泛測試過ES細(xì)胞品系—— ES-Rl(Nagy A， Rossant J， Nagy R， et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90:8424-8428)。一、ES細(xì)胞培養(yǎng)和分化的條件ES細(xì)胞向胰腺P細(xì)胞分化的方法(三步培養(yǎng)法，參見圖1A)如下所示第一步，為誘導(dǎo)胚體(EB)的形成，用胰蛋白酶常規(guī)消化ES細(xì)胞并使 其懸浮在裝有無LIF的10XFBS/DMEM培養(yǎng)基的Petri培養(yǎng)皿(Alpha medical instmment)中。24至48小時后(參見圖1B)，收集EB并轉(zhuǎn)移到裝有無LIF的 10XFBS/DMEM培養(yǎng)基且包被了1。/。 Matrigel (BD Biosciences)的培養(yǎng)皿 中。兩小時后，EB開始鋪展，并在含有100ng/ml激活蛋白A (Sigma)的 10% FBS/DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。然后，再將EB轉(zhuǎn)入10。/。 FBS/DMEM中培養(yǎng)6-8小時作為間歇時間。間歇過后，再用含有10—6MRA (Sigma)的10。/。FBS/DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)分化的EB細(xì)胞24小時。第二步，為了引起產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞的擴(kuò)增，用含有10ng/mlbFGF (Sigma)的10。/。FBS/DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)分化的EB細(xì)胞3-5天，在此期間， 大部分的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣結(jié)構(gòu)(參見圖1C)。第三步，為引起產(chǎn)胰島素的細(xì)胞的成熟，在第二步中擴(kuò)增的細(xì)胞被轉(zhuǎn) 入含有N2增補(bǔ)劑(l:100,Gibco-BRL)， B27增補(bǔ)劑(l:50 Gibco-BRL)，l (ig/ml 層粘連蛋白(Sigma)， 10 ng/ml bFGF (Sigma)和10 mM煙堿胺(Sigma)的 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中繼續(xù)培養(yǎng)3-5天(Lunielsky N, BIondel 0, Laeng P， et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394)。用尼康 相差顯微鏡(TS-100)觀察細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示被培養(yǎng)的細(xì)胞形成集落結(jié)構(gòu)(參見圖1D和圖l E)。二、用RT-PCR檢測分化的細(xì)胞中基因的表達(dá)情況用Catrimox-14 RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取由第二步或第三步得到 被激活蛋白A和RA共同誘導(dǎo)的，沒有被激活蛋白A和RA誘導(dǎo)的，或僅被 其中之一誘導(dǎo)的細(xì)胞的總RNA。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)將RNA逆轉(zhuǎn) 錄為cDNA。利用PCR緩沖液中Ex Taq聚合酶(TaKaRa)體系完成PCR反 應(yīng)。循環(huán)條件如下在94。C反應(yīng)5分鐘，之后循環(huán)35個周期(在94。C變性 50秒，在56-58。C退火30秒，在72。C延長40秒)，最后再在72。C培養(yǎng)4分 鐘。利用Prime Premier 5.0設(shè)計pdxl， glut2, isll, P-肌動蛋白等的PCR引物。 PCR引物的序列(有義鏈和反義鏈分別顯示)如下JCGCC44GG:rcTa4JGGrCC f2S卵W (序列號2》(序號1) 和序列號3) 和(序歹U號5)和 號6),'g/w,2.' GGL47X^47TCGCCTG04ra4( 序 歹ij 7TCC7TrGG7TrCrG04爿Cr f29處p)(序列號8);爿7TrGCC4CC7^GCC4C4GC4CC( 序歹U/^ac^:CCr044CCCrX4GGCC4v4CCGrGX4 (序歹ij號11)和號 7) 和號 9) 和^C4CGrCCCC4rCT0^4G (序列號 13) 和結(jié)果如圖2A-圖2C所示，圖2A的第一行顯示第二步末得到的只用激活 蛋白A誘導(dǎo)的細(xì)胞主要表達(dá)hnf3p和pdx-1;第二行顯示第二步末得到的只 用RA誘導(dǎo)的細(xì)胞只表達(dá)hnfip。圖2B表明，第二步末得到的用激活蛋白A 和RA雙因子誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志基因pdx-l,hnf3p， insulinl和hnf4a;圖 2C表明在第三歩末，激活蛋白A和RA雙因子誘導(dǎo)的細(xì)胞主要表達(dá)insulinI, pdx-l， isll, glut2禾P hnf3(3 (第三泳道"+ ")。 圖2A—圖2C中，-RT表示 沒有逆轉(zhuǎn)錄的陰性對照，空白表示在陰性對照中僅使用水；圖2C中，第一 泳道"胰腺"為成熟小鼠胰腺細(xì)胞陽性對照；第二泳道的符號"一"表示 在第三步末沒有用激活蛋白A和RA誘導(dǎo)的小鼠ES-R1細(xì)胞；符號"+ " 表示在第三步末有用激活蛋白A和RA雙因子誘導(dǎo)的小鼠ES-R1細(xì)胞。這些細(xì)胞不表達(dá)其它胰島內(nèi)分泌細(xì)胞(非P細(xì)胞)的標(biāo)志，如胰高血 糖素或促生長素抑制素。該結(jié)果表明TGF-(3和RA信號可能對胰腺P細(xì)胞 的發(fā)育和成熟具有特異性。并發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過程對激活蛋白A和RA的具有嚴(yán) 格的依賴性，如果缺少二者其一則幾乎沒有小細(xì)胞集落的形成，且被誘導(dǎo) 的細(xì)胞不表達(dá)或僅微弱表達(dá)胰島素，pdxl, isll， glut2和hnf3卩(參見圖2C 中第二泳道)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)如果用層粘連蛋白或明膠代替matrigel來 鋪被培養(yǎng)皿，在第三步?jīng)]有小細(xì)胞集落形成。三、 免疫組化分析為了證明誘導(dǎo)的胰島素陽性細(xì)胞還能夠表達(dá)C-肽，對其進(jìn)行了免疫組 化分析將由第三步得到的被誘導(dǎo)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，PBS洗三遍 后用10%正常山羊或兔血清室溫孵育20分鐘。棄山羊血清，分別加胰島素 一抗(兔多克隆IgG， 1:200， Santa Cruz)或C-肽 一抗(Linco)4。C過夜培養(yǎng) 細(xì)胞。接著進(jìn)一步用羅丹明綴合山羊抗兔二抗IgG，F(xiàn)ITC綴合兔抗山羊二抗 IgG(l:200， SantaCmz)或生物素綴合IgG(工作溶液，SantaCruz)孵育。利用 DAB作為以生物素綴合IgG作為二抗時的反應(yīng)底物。用奧林帕斯相差顯微 鏡(Olympus IX-71)捕獲圖像。結(jié)果表明細(xì)胞既表達(dá)胰島素，又表達(dá)C-肽(圖3A和圖3B)。利用DTZ染色(Shiroi A, Yoshikawa M， Yokota H, et al. Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by Zinc-Chelating Dithizone. STEM CELLS 2002;20(4):284-292)來檢測由該三步培養(yǎng)法發(fā)育 而來的細(xì)胞或沒有經(jīng)過激活蛋白A和RA誘導(dǎo)發(fā)育而來的細(xì)胞(對照組)。 結(jié)果表明經(jīng)三步處理出現(xiàn)了的DTZ陽性細(xì)胞集落(洋紅色)(圖3D)，而對 照組中無DTZ陽性細(xì)胞集落(圖3C)。這表明由此得到的細(xì)胞集落含有胰 島素陽性的細(xì)胞。四、 EGFP報告基因的構(gòu)建以及ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
有證據(jù)表明ES細(xì)胞后代能夠吸收來源于培養(yǎng)基中的胰島素而被胰島素抗體染色為陽性(Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC， et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. ProcNatlAcadSciUSA 2002;99(25):16105-16110)。為確定胰島素確實是 由誘導(dǎo)的細(xì)胞集落產(chǎn)生，采用EGFP報告體系來檢測胰島素的表達(dá)。用 EGFP報告載體轉(zhuǎn)染R1 ES細(xì)胞，其中含有一個被胰島素啟動子驅(qū)動的綠 色熒光蛋白質(zhì)cDNA。利用G418篩選已接入此載體的ES細(xì)胞，并利用激活 蛋白A和RA對其進(jìn)行誘導(dǎo)。具體方法如下構(gòu)建人胰島素啟動子接EGFP 的載體。將一個從pFOXCAT-362 hlns(Odagiri H, Wang JH, and German MS. Function of the Human Insulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 19%;271(4):1909—1915)切下 0.4 kb的含人胰島素啟動子的Xba I和Hind III片段與CMV啟動子己被 AseI和HindIII切除的pCMV-EGFPN3載體(BD Biosciences)連接。將此 具有新霉素抗性的載體通過電穿孔轉(zhuǎn)染到ES Rl細(xì)胞品系中，并用250 jig/mlGW8(Gibco-BRL)篩選陽性ES克隆。篩選出的小鼠ES-Rl陽性克隆 首先通過激活蛋白A和RA雙因子刺激，利用EGFP對得到的小細(xì)胞集落進(jìn) 行檢測。EGFP結(jié)果如圖3E和圖3G所示，在得到的小的細(xì)胞集落中可以檢 測到EGFP的表達(dá)。另外其表達(dá)模式同胰島素表達(dá)相吻合(圖3F和圖3H， 按照第三步的免疫組化分析方法進(jìn)行檢測)。這些數(shù)據(jù)表明激活蛋白A和 RA以及其它成熟的因子的聯(lián)合作用，能夠誘導(dǎo)ES細(xì)胞向胰腺細(xì)胞的分化。五、ELISA檢測胰島素的分泌量為了進(jìn)一步測試誘導(dǎo)后的細(xì)胞的胰島素分泌量是否能夠?qū)ζ咸烟蔷?有依賴性，使用了兩種濃度(5.5mM和27.7mM)的葡萄糖。用含有2.5 mM 葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液(pH 7.4)在37。C來預(yù)孵育細(xì)胞90分鐘。為誘導(dǎo) 胰島素的釋放，再用含27.7mM葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液在37^孵育15 分鐘(樣品A)。將另一組細(xì)胞先用含2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液 在37。C預(yù)孵育90分鐘，為誘導(dǎo)胰島素的釋放，再用含5.5 mM葡萄糖的 Krebs-Ringer緩沖液在37。C孵育15分鐘(樣品B，作為對照)。收集被調(diào)節(jié) 的培養(yǎng)基。用Rat/Mouse Insulin ELISA試劑盒(CRYSTAL CHEM INC)檢 測兩份培養(yǎng)基樣品的胰島素分泌量。細(xì)胞總蛋白量用BCATM Protein Assay試劑盒(PIERCE)測定。結(jié)果表明細(xì)胞在高葡萄糖濃度中胰島素的分泌量 比低葡萄糖濃度時高五倍左右(參見圖31，圖3I中胰島素的含量單位為ng胰 島素/mg細(xì)胞總蛋白；柱A為經(jīng)27.7mM葡萄糖處理后的胰島素分泌水平， 比柱B (經(jīng)5.5mM葡萄糖處理的)高近5倍)。該結(jié)果表明ES來源的胰島素 陽性細(xì)胞進(jìn)行的胰島素分泌也能夠受葡萄糖濃度的調(diào)控。六、產(chǎn)胰島素的細(xì)胞向小鼠腎包囊下的移植為了測試ES細(xì)胞來源的胰島素陽性細(xì)胞是否能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠，將 分化細(xì)胞移植到STZ誘發(fā)的糖尿病小鼠的左側(cè)腎包囊中(i^9)D具體方法如下在細(xì)胞或PBS移植前，向6到8周的129只公鼠腹腔內(nèi)注射50mg/kg劑量 的鏈脲菌素(STZ, Sigma)，連續(xù)注射5天，以誘導(dǎo)的實驗糖尿病的形成。 當(dāng)被STZ處理的小鼠血液葡萄糖濃度高于13.9mM時，向小鼠左側(cè)腎包囊中 移植lxl06個產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。向?qū)φ战M(n=12)進(jìn)行PBS處理。用 GlucoTREND2 (Roche)從被剪斷的尾巴中測量血液葡萄糖濃度。取經(jīng)過手 術(shù)的腎臟進(jìn)行冰凍切片，并對腎包囊中被移植細(xì)胞的胰島素表達(dá)進(jìn)行免疫 組化分析。結(jié)果表明被分化細(xì)胞處理的糖尿病小鼠(11=9)存活時間較長， 其存活率達(dá)到70。/。，而移植了PBS的糖尿病小鼠(r^12，實線)存活率為25% (圖4A)。并且存活的小鼠能夠?qū)Ⅲw重維持在正常水平。約兩周后，被進(jìn)行 細(xì)胞移植的糖尿病小鼠的血液葡萄糖恢復(fù)到正常水平(低于13.9 mM); 相反，進(jìn)行了PBS移植的小鼠(n=3)的血液葡萄糖持續(xù)維持較高水平 (〉13.9mM)(圖4B)。此外，將進(jìn)行了細(xì)胞移植的左腎切除后，小鼠的血液 葡萄糖上升至14mM。利用胰島素一抗沒有在注射了PBS的左腎中檢測到 胰島素陽性細(xì)胞(圖5A);而只在被分化細(xì)胞處理的STZ-糖尿病小鼠腎臟 中檢測到胰島素陽性細(xì)胞(圖5B)。這些結(jié)果表明來源于ES細(xì)胞的胰島素 陽性的細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠。實施例2、誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞為胰腺細(xì)胞本發(fā)明使用了人ES細(xì)胞品系，H1或H9。 (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al, Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998;282:1145-1147.)。這些細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37。C 。 培養(yǎng)體系為化學(xué)組份確定的培養(yǎng)基(CDM: 50%IMDM (Gibco)， 50%F12 (Gibco),單硫甘油(sigma) 450umol/L,胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒-A (ITS， Gibco),清蛋白片段V (Sigma) 5mg/ml)。簡要地，hES細(xì)胞被轉(zhuǎn)入 CDM進(jìn)行分化。然后用激活蛋白A和RA誘導(dǎo)hES細(xì)胞向胰腺前體細(xì)胞 的分化。在此基礎(chǔ)上，利用在mES誘導(dǎo)方法中描述的胰島培養(yǎng)條件進(jìn)一步 成熟hES來源的胰腺P細(xì)胞。為進(jìn)行分化，實驗流程設(shè)計如下第一步，將hES細(xì)胞傳代到被1。/。 Matrigd (B&D Biosciences)包被的組 織培養(yǎng)皿(Nunc)上。然后，用改良的CDM (11)替換上述培養(yǎng)基。此改良 的CDM含有50% IMDM(Gibco)和50。/。F12 NUT-MIX (Gibco),并添加胰 島素-運(yùn)鐵蛋白-硒-A(l:100， Gibco)， 450 pM的單硫甘油(sigma)和5 mg/ml 的清蛋白片段V(Sigma)。兩天后，以含50ng/ml激活蛋白A (Sigma)的 CDM培養(yǎng)基對這些細(xì)胞誘導(dǎo)4天。第二步，激活蛋白A誘導(dǎo)4天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10—SMRA(Sigma) 的CDM中，再誘導(dǎo)4天。第三步，將培養(yǎng)基從CDM變換為改良的胰島成熟培養(yǎng)基(12): DMEM/F12 (Gibco),胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒-A(l:100， Gibco)和2 mg/ml清蛋 白片段V(Sigma)以及10ng/mlbFGF。細(xì)胞在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。之后， 再轉(zhuǎn)入含DMEM/F12 (Gibco),胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒-A(l:100, Gibco)和2 mg/ml清蛋白片段V (Sigma)以及10 mM煙堿胺(Sigma)。并在此培養(yǎng)基 中培養(yǎng)2天。然后再利用0.5 mg/ml的分散酶(Gibco)消化這些細(xì)胞，并將其 轉(zhuǎn)移到超級低依附培養(yǎng)皿(Costar)中放置5天，以形成懸浮培養(yǎng)液從而實現(xiàn)胰島的成熟。二 、分化細(xì)胞中基因表達(dá)的RT-PCR分析。根據(jù)實施例l第二部分描述的方法，利用RT-PCR檢測了促生長素抑制 素(SST), Glut2,淀粉酶(Amy), Soxl7, Hnf4a, pdx-l，胰島素(INS), Hb9,葡 糖激酶(GCK)， IFABP等在分化細(xì)胞和對照組細(xì)胞中(培養(yǎng)在不含激活蛋白 A和RA誘導(dǎo)的CDM中)的表達(dá)。在此，分化細(xì)胞是指依照此三歩培養(yǎng)法 獲得的成熟(3細(xì)胞。對照組細(xì)胞指被激活蛋白A和RA其中之一誘導(dǎo)的細(xì) 胞。PCR引物序列(有義和反義分別顯示)如下ga/^/.' GTC4rrG^04GG^rG"CC4(7( 序歹!j號 15) 和 GrG7TCCZ4CCCCC^rGrG 口WZ^ (序列號16);mjc/7: C4GT04Ca4CC4(^4GCC4G^CC (序列號17) 和 CC4C04C7TGCCC4GC4rC7Tp"&」(序列號18)/p血/: 爿CC4X4(7CrC4C( CGTGa4^4 (序歹ij號19) 和 r04rGTGTCrCTCC GTC^Grr P06^; ,(序列號20);/;/xW.' CC7^404rGCCC04CrrC^4CrCCC C序列號21) 和/w/4a.' ^rC4044(7GC4CC^(XTC^C (序列號23) 和 rGTCrTTG7rC4CC4CGC4CT(797*」(序列號24),'嚴(yán)島# : 04GGCC4rC44GC4CCMrC4C (序列號25) 和 GGCrGCGrCr4GrrGC4GT^ f373Z^ (序列號26》g/w/2' GCZ4CCG4C4GCC7^rrCT^ (序列號 27) 和 OL4G7rC4Cr04C47UX4G (267—,(序列號28);淀粉朦 fa^y人CTG^CA4C7TOL^GC4yL4 (序歹U號29)和 Z4C4GC4rCC4C4L4X47^C04 (35幼p,(序列號30),-促全長7素^/劍,素(5OT> G^rGCrGrCCTGCCGCCrCC (序列號31)和 rGCC47]4GCC(7GGr7TG^ (序列號32);5w尸入'7TGCC04^4CCG7^a^4Ga4(序列號 33) 和,驀i錄,素(t CG人」GGC4a4CCC4crc4Gra4 (序列號35)和 ^uc4JrGGC04CcrcrrcrG卩o幼^ (序列號36);曹薪激艨「Gd」.'JGGO^rGC7TGCC04CTC (序列號37)和 C4CTGG(XTCrrG4rGGG2Y3756p」(序列號38).結(jié)果如圖7A和圖7B所示，表明分化的ES細(xì)胞能夠表達(dá)成熟e細(xì)胞的 標(biāo)志基因如胰島素,p血-人葡糖激酶和g/^2 (圖7A)。相反，對照組基本 上不表達(dá)任何標(biāo)志基因(圖7B)。三、免疫組化分析。用4%多聚甲醛固定被誘導(dǎo)細(xì)胞，PBS洗三遍后，在含有0.3% tritonX-100 (Sigma)和10。/。正常血清的PBS中，室溫孵育細(xì)胞40分鐘。然后 再用山羊抗人soxl7抗體(1:40， R&D SYSTEMS) —抗，小鼠抗人胰島素單 克隆抗體(1:100, CHEMICON) —抗，兔抗人C-肽抗體(l:200, Linco) —
抗，胰高血糖素(山羊多克隆IgG, 1:200, SantaCmz) —抗，pdxl (山羊多 克隆IgG, 1:200, Santa Cmz) 一抗，淀粉酶(兔多克隆IgG， 1:500， Sigma) 一抗，ngn3 (山羊多克隆IgG, 1:200, Santa Cmz) —抗或促生長素抑制素(山 羊多克隆IgG， 1:200, Santa Cruz)—抗在4。C過夜孵育，并進(jìn)一步分別用下 列二抗孵育TRITC-綴合山羊抗兔IgG， HTC-綴合兔抗山羊IgG， FITC -綴合山羊抗鼠IgG， FITC -綴合驢抗山羊IgG或TRITC-綴合驢抗兔IgG (1:200，全部購自Jackson ImmunoResearch, INC.)。利用DAPI (Sigma)染 色檢測細(xì)胞核。用奧林帕斯相差顯微鏡(Olympus IX-71)捕獲圖像。用 Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics)計算了C-肽陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明這些細(xì)胞能夠表達(dá)胰腺P細(xì)胞基因，例如C-肽,pdx-l等(圖8)。四、產(chǎn)胰島素的細(xì)胞向腎包囊下的移植為了證明ES細(xì)胞來源的胰島素陽性細(xì)胞是否能夠在體內(nèi)環(huán)境下行使 正常的功能，將分化細(xì)胞移植到STZ誘發(fā)的糖尿病小鼠的左側(cè)腎包囊中 (n=12)。具體方法如下所有的動物操作都經(jīng)過北京大學(xué)教育動物護(hù)理與使用委員會的批準(zhǔn)。 在細(xì)胞或PBS移植前，向4到6周的BALB/c公裸鼠腹腔內(nèi)注射40 mg/kg劑量 的鏈脲菌素(STZ, Sigma)，連續(xù)注射5天，以誘導(dǎo)實驗糖尿病的形成。當(dāng)被STZ處理的小鼠己發(fā)展患有糖尿病時，將大約ixioMs秀導(dǎo)細(xì)胞移植到左 腎包囊中。無激活蛋白A和RA誘導(dǎo)的PBS或細(xì)胞作為實驗對照使用。過 夜禁食后，利用i.g.葡萄糖(2.5 gkg—M本重)進(jìn)行了糖耐性測試。利用 GlucoTREND2 (Roche)從剪斷的尾巴中測定血液葡萄糖水平。取經(jīng)過手術(shù) 的腎臟進(jìn)行冰凍切片，并利用免疫組化分析確定被移植了細(xì)胞的腎包囊中 C-肽的表達(dá)。利用小鼠抗人核單克隆抗體(1:30, CHEMICON)檢測到了 hES來源的細(xì)胞。用奧林帕斯相差顯微鏡(Olympus IX-71)捕獲圖像。結(jié) 果顯示注射了PBS的腎臟中沒有發(fā)現(xiàn)胰島素陽性細(xì)胞；此移植小鼠的結(jié)果 顯示在圖11A和11B中。移植了人ES來源的分化細(xì)胞能夠表達(dá)C-肽(圖 IIA)。 C-肽陽性細(xì)胞能通過對人核特異性抗體被染色，說明這些細(xì)胞來源 于人ES細(xì)胞(圖11B)。人胚胎干(hES)細(xì)胞向胰腺P細(xì)胞的實驗誘導(dǎo)為I型糖尿病的移植治 療提供了一種潛在的來源。本發(fā)明提供的三步培養(yǎng)法能夠誘導(dǎo)hES分化為
功能性的產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。這種基于將hES培養(yǎng)在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(CDM)及激活蛋白A，全反式視黃酸(RA)和其它成熟因子(參見圖 6)中的方法模擬了體內(nèi)胰腺發(fā)育的信號傳導(dǎo)。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，hES 來源的細(xì)胞表達(dá)胰腺P細(xì)胞標(biāo)志基因，例如pdxl,胰島素，葡糖激酶和 glut2 (參見圖7)。這些細(xì)胞為C-肽，pdxl，胰高血糖素，促生長素抑制素或 淀粉酶陽性，且C-肽陽性排除了胰島素是通過免疫組化檢測方法被吸收的 可能性(參見圖8)。為了進(jìn)一步分析誘導(dǎo)后細(xì)胞的胰島素分泌是否是葡萄 糖依賴型，使用了兩種濃度P.5mM和2"mM)的葡萄糖。用Krebs-Ringer 緩沖液在37。C來預(yù)孵育細(xì)胞90分鐘后，用含有2.5 mM葡萄糖的 Krebs-Ringer緩沖液在37。C來預(yù)孵育15分鐘。為誘導(dǎo)胰島素的釋放，再用 27.5mM葡萄糖孵育細(xì)胞15分鐘。收集各自的被調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。用Rat/Mouse InsulinELISA試劑盒(Linco)檢測兩份培養(yǎng)基樣品的胰島素分泌量。細(xì)胞 內(nèi)C-肽濃度由Human C-肽ELISA試劑盒(Linco)測定。細(xì)胞總蛋白量用 BCATM Protein Assay試劑盒(P正RCE)檢測。結(jié)果表明在懸浮培養(yǎng)中被誘導(dǎo)的細(xì)胞在高葡萄糖水平培養(yǎng)基中分泌胰島素的量與在低葡萄糖水平培 養(yǎng)基中相比提高了200% (圖9A)。而且，懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)C-肽含量也增加了 (圖9B)。然而，由貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞的胰島素分 泌量不響應(yīng)葡萄糖的刺激(圖9A， B)。這些數(shù)據(jù)表明與貼壁培養(yǎng)相比， 懸浮培養(yǎng)引起了胰島樣細(xì)胞更高效的成熟。為了研究被誘導(dǎo)的細(xì)胞是否能夠在體內(nèi)具有功能性，我們向糖尿病裸 鼠的腎包囊下移植了分化細(xì)胞。30%的移植了被誘導(dǎo)細(xì)胞的小鼠的血液葡 萄糖在近6周內(nèi)維持在正常水平(<13.9 mM)(圖10A)。糖耐受性檢測顯 示這30。/。的血液葡萄糖被逆轉(zhuǎn)了的裸鼠，與被進(jìn)行了對照操作的小鼠相比， 還獲得了改善了的葡萄糖調(diào)控能力(圖10B)。移植后一個月，在被移植了 由此三步培養(yǎng)法誘導(dǎo)的細(xì)胞的腎包囊中檢測到了C-肽陽性細(xì)胞。利用人核 特異性抗體對這些細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示這些C-肽陽性細(xì)胞來源于被注 射的hES細(xì)胞(圖11A和11B)。這些結(jié)果清楚地顯示hES細(xì)胞來源的產(chǎn)胰島素的細(xì)胞不僅能夠存活； 而且它們還能體內(nèi)逆轉(zhuǎn)30。/。的STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠。此發(fā)現(xiàn)為人類胰島 細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制的研究提供了一個新的體外模型，并且這些hES來源的產(chǎn) 胰島素的細(xì)胞可在未來的對I型糖尿病移植治療中被利用。
權(quán)利要求
1、一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞方法，包括以下順序的步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞以形成胚體；利用激活蛋白A孵育所述胚體；和利用RA孵育所述胚體，使其發(fā)育為產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞。
2、 權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)胚胎干細(xì)胞來源于小鼠時，所述培養(yǎng)基為含有約10%胎牛血清的DMEM;當(dāng)胚胎干細(xì)胞來源于人時，所 述培養(yǎng)基為CDM。
3、 權(quán)利要求1的方法，其中所述激活蛋白A的濃度為約50-300ng/ml 培養(yǎng)基；所述RA的濃度為約1X10—7-lX10—Smol/L培養(yǎng)基。
4、 權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng) 胚胎干細(xì)胞以形成胚體的步驟前，用Metrigd包被用于容納培養(yǎng)基的 培養(yǎng)容器。
5、 權(quán)利要求4的方法，其中所述metrigel在培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比大 約為1%。
6、 權(quán)利要求5的方法，其中所述胚體與激活蛋白A —起孵育20小 時到4天，再在不含激活蛋白A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8小時，然后用 RA孵育20小時到4天，使其發(fā)育為產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞。
7、 權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在含有成熟因子的培 養(yǎng)基中孵育獲得的產(chǎn)胰島素的前體細(xì)胞，以擴(kuò)增產(chǎn)胰島素的前體細(xì) 胞。
8、 權(quán)利要求7的方法，其中所述成熟因子包括bFGF。
9、 權(quán)利要求8的方法，其中所述bFGF的濃度為8-12ng/ml。
10、 權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括以下步驟在含有N2增補(bǔ)劑、 B27增補(bǔ)劑、層粘連蛋白和煙酰胺的培養(yǎng)基中孵育所述擴(kuò)增了的產(chǎn)胰 島素的前體細(xì)胞以使其發(fā)育為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。
11、 權(quán)利要求10的方法，其中所述培養(yǎng)基為在含有N2增補(bǔ)劑、B27 增補(bǔ)劑、lpg/ml的層粘連蛋白，10ng/ml的bFGF，胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒-A(l:100)和10mmol/L的煙酰胺的DMEM/F12或CDM。
12、 一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的試劑盒，包括激活蛋白A和RA。
13、 權(quán)利要求12的試劑盒，進(jìn)一步包括Metrigel。
14、 權(quán)利要求13的試劑盒，進(jìn)一步包括一種一級培養(yǎng)基。
15、 權(quán)利要求14的試劑盒，進(jìn)一步包括血清。
全文摘要
本發(fā)明提供一種簡單的能誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞的三步培養(yǎng)法，此三步培養(yǎng)法是建立在激活蛋白A，全反式視黃酸和任選地其它成熟因子的聯(lián)合誘導(dǎo)基礎(chǔ)上的。本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞的試劑盒。
文檔編號C12N5/00GK101160390SQ200680012473
公開日2008年4月9日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者丁明孝, 候玲玲, 艷 時, 湯富酬, 衛(wèi) 蔣, 鄧宏魁 申請人:北京大學(xué)