專利名稱：編碼1ysR1基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了來自棒狀細菌(coryneform bacteria)的編碼lysR1基因的核苷酸序列，和通過弱化lysR1基因酶促生產(chǎn)氨基酸尤其L-賴氨酸的方法。lysR1基因編碼LysR1蛋白，其是LysR家族的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。
現(xiàn)有技術(shù)L-氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或例如通過離子交換層析對產(chǎn)物形式的加工方法，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物有抗性或重要的調(diào)節(jié)代謝物缺陷的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于改良棒桿菌菌株生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
發(fā)明目的本發(fā)明人的目的是為酶促生產(chǎn)氨基酸，尤其L-賴氨酸提供改良的新方法。
發(fā)明描述本發(fā)明提供了來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有編碼lysR1基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼包含SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包含與SEQ ID NO2氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)多核苷酸互補的多核苷酸，及d)包含a)，b)或c)多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，所述多肽優(yōu)選具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物LysR1活性。
本發(fā)明還提供了上述多核苷酸，其優(yōu)選是一種能復制的DNA，含有(i) SEQ ID NO1所示核苷酸序列，或(ii) 在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于(i)序列的至少一個序列，或(iii)與(i)或(ii)序列的互補序列雜交的至少一個序列，及任選地，(iv) (i)中中性功能的有義突變。
本發(fā)明還提供了一種能復制的DNA，其含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列；一種多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；一種載體，其含有本發(fā)明的多核苷酸d)，尤其是插入大腸桿菌DSM13616中的pCR2.1lysR1int，保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，德國不倫瑞克)；及棒狀細菌，其中l(wèi)ysR1基因中含有尤其是使用載體pCR2.1lysR1int進行的插入或缺失。
本發(fā)明因此提供了基本上由一種多核苷酸序列組成的多核苷酸，這些多核苷酸可通過用含有相應(yīng)于SEQ ID NO1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交相應(yīng)的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述的文庫含有具有相應(yīng)于SEQ ID NO1所述多核苷酸序列的完整基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼LysR1蛋白的全長核酸、多核苷酸或基因，或分離與lysR1基因的序列具有高度序列相似性的核酸、多核苷酸或基因。
另外，含有本發(fā)明序列的多核苷酸還適用作引物，借助于其通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，可以制備編碼LysR1蛋白的基因的DNA。
作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30個、優(yōu)選至少20個、特別優(yōu)選至少15個連續(xù)核苷酸。具有至少40或50個核苷酸的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應(yīng)理解為含有經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特別是具有LysR1蛋白生物學活性的多肽，以及與SEQ ID NO2的多肽至少70％，優(yōu)選至少80％，特別優(yōu)選至少90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)氨基酸的棒狀細菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸尤其L-賴氨酸的方法，在該棒狀細菌中編碼lysR1基因的核苷酸序列被弱化，尤其是被消除或低水平表達。
文中術(shù)語“弱化”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性的降低或消除，例如通過使用弱啟動子或編碼低活性相應(yīng)酶的基因或等位基因，或失活相應(yīng)基因或酶(蛋白質(zhì))，及如果需要組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴氨酸。所述微生物可以是棒狀細菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當?shù)陌魲U菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC 17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和擴展短桿菌ATCC 14020或從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體或菌株，例如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P 6464谷氨酸棒桿菌DM58-1谷氨酸棒桿菌DG52-5谷氨酸棒桿菌DSM 5714和谷氨酸棒桿菌DSM 12866。
本發(fā)明人已成功地從谷氨酸棒桿菌中分離編碼LysR1蛋白的新lysR1基因，該蛋白是LysR家族的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。
為了分離谷氨酸棒桿菌的lysR1基因或其他基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chamie，Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實驗手冊(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文庫是已由Kohara等(細胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學，252255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。
為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個例子是菌株DH5α(Jeffrey H.Miller“細菌遺傳學短期教材，針對大腸桿菌和相關(guān)細菌的實驗指導和手冊”，冷泉港實驗室出版社，1992)。
然后將借助于粘粒或其它λ載體克隆的長DNA片段，亞克隆入適于DNA測序的常規(guī)載體中。
DNA測序方法參見于Sanger等(美國科學院院報745463-5467，1977)所述。
獲得的DNA序列然后可以使用已知公式或序列分析程序加以檢測，如Staden(核酸研究14，217-232(1986))所述，Marck(核酸研究16，1829-1836(1988))所述，或Butler所述GCG程序(生物化學分析方法39，74-97(1998))。
以此方式可獲得編碼lysR1基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，是本發(fā)明的一部分。另外，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得lysR1基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ ID NO2表示。
通過遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生自SEQ ID NO1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，蛋白質(zhì)中的保守氨基酸置換如用丙氨酸置換甘氨酸，或用谷氨酸置換天冬氨酸，是有義突變，其不引起所述蛋白質(zhì)活性的任何改變，即它們是中性的。另外，已知在蛋白質(zhì)N末端和/C末端的變化基本不損害其功能而且甚至還穩(wěn)定其功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以找到關(guān)于這方面的信息，參見Ben-Bassat等(細菌學雜志169751-757(1987))，O’Regan等(基因77237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學3240-247(1994))，Hochuli等(生物/技術(shù)61321-1325(1988))及熟知的遺傳和分子生物學教材。以適當方式產(chǎn)生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
最后，使用得自SEQ ID NO1的引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的DNA序列是本發(fā)明的一部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15個核苷酸。
通過雜交鑒別DNA序列的指導可見于Boehringer MannheimGmbH(德國曼海姆，1993)的“濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用指導”，和Liebl等(國際系統(tǒng)細菌學雜志41255-260(1991))。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增DNA序列的指導參見Gait的手冊寡核苷酸合成實用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在lysR1基因弱化后，棒狀細菌以改良方式生產(chǎn)氨基酸，尤其L-賴氨酸。
為獲得弱化，可降低或消除lysR1基因的表達或酶蛋白的催化活性。兩種措施可任選地組合。
可通過適當控制培養(yǎng)或通過遺傳修飾(突變)用于基因表達的信號結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)降低基因表達。用于基因表達的信號結(jié)構(gòu)例如是阻遏基因、激活基因、操縱子、啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子和終止子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在如下文獻中發(fā)現(xiàn)此方面的信息，例如專利申請WO96/15246，Boyd & Murphy(細菌學雜志1705949(1988))，Voskuil & Chambliss(核酸研究263548(1998))，Jensen & Hammer(生物技術(shù)和生物工程58191(1998))，Patek等(微生物學1421297(1996))，Vasicova等(細菌學雜志1816188(1999))，以及已知的遺傳學和分子生物學教科書如Knippers的教科書(分子遺傳學，第6版，Georg Thieme Verlag，德國斯圖加特，1995)，或Winnacker的教科書(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國，1990)。
導致酶蛋白催化活性的變化或降低的突變是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，可提及的例如Qiu和Goodman的論文(生物化學雜志2728611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科學生物技術(shù)和生物化學611760-1762(1997))以及Mockel(谷氨酸棒桿菌的蘇氨酸脫水酶酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)，Berichte des Forschungszentrums Julichs，Jul-2906，ISSN09442952，Julich，德國，1994)。綜述可參見遺傳學和分子生物學的已知教科書，如Hagemann的教科書(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
合適的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。根據(jù)氨基酸置換對酶活性的影響，分別為錯義突變或無義突變。在基因中插入或缺失至少一個堿基對(bp)導致移碼突變，其結(jié)果是插入不正確的氨基酸或者翻譯過早終止。缺失幾個密碼子典型地導致酶活性的完全喪失。產(chǎn)生此類突變的指導屬于現(xiàn)有技術(shù)并可在遺傳學和分子生物學的已知教科書中找到，如Knippers的教科書(分子遺傳學，第6版，GeorgThieme Verlag，德國斯圖加特，1995)，Winnacker的教科書(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國，1990)或Hagemann的教科書(″普通遺傳學″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
在谷氨酸棒桿菌中突變基因的常用方法是基因破壞和基因置換方法，如Schwarzer和Puhler所述(生物/技術(shù)9，84-87(1991))。
在基因破壞方法中，將所述基因編碼區(qū)的中心部分克隆在質(zhì)粒載體中，所述載體能在一種宿主(典型地為大腸桿菌)中復制，但在谷氨酸棒桿菌中不能復制。適當?shù)妮d體例如pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，細菌學雜志1745462-65(1992))，pGEM-T(Promega公司，Madison，Wis.，美國)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994))，生物化學雜志26932678-84；美國專利No.5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bemard等，分子生物學雜志234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細菌學雜志1734510-4516)。然后將含有所述基因編碼區(qū)中心部分的質(zhì)粒載體通過接合或轉(zhuǎn)化移至所需谷氨酸棒桿菌菌株中。接合方法例如Schafer等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學60，756-759(1994))所述。轉(zhuǎn)化方法例如Thierbach等(應(yīng)用微生物學及生物技術(shù)學29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7，1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微生物學通信123，343-347(1994))所述。在通過“交換”同源重組后，相應(yīng)基因的編碼區(qū)被載體序列間斷，并獲得兩個不完整的等位基因，一個缺失3’末端，一個缺失5’末端。這個方法例如已經(jīng)由Fitzpatrick等使用，以消除谷氨酸棒桿菌中的recA基因(應(yīng)用微生物學和生物技術(shù)42，575-580(1994))。


圖1示出質(zhì)粒載體pCR2.1lysR1int，利用其可破壞或消除lysR1基因。
在基因置換方法中，突變例如缺失，插入或堿基置換是在體外在相應(yīng)基因中產(chǎn)生的。然后將產(chǎn)生的等位基因克隆入在谷氨酸棒桿菌中不復制的載體中，然后將其通過轉(zhuǎn)化或接合移至所需谷氨酸棒桿菌宿主中。在通過實現(xiàn)整合的第一次“交換”事件，及實現(xiàn)切除的第二次“交換”事件的同源重組后，實現(xiàn)靶基因或靶序列中摻入突變體或等位基因。這種方法例如已經(jīng)由Peters-Wendisch等使用，以通過缺失而消除谷氨酸棒桿菌中的pyc基因(微生物學144，915-927(1998))。
以此方式可以在lysR1基因中摻入缺失，插入或堿基置換。
另外，除了lysR1基因的弱化之外，特定生物合成途徑、糖酵解、回補代謝、檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶的增強特別是過表達，對L-氨基酸尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)也可以是有益的。
因此，例如為生產(chǎn)L-賴氨酸，選自以下的一或多種基因可以同時增強尤其過表達·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·編碼烯醇化酶的eno基因(DE19947791.4)，·編碼zwf基因產(chǎn)物的zwf基因(JP-A-09224661)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物學144，915-927(1998)，·編碼賴氨酸輸出的lysE基因(DE-A-19548222)。
為生產(chǎn)氨基酸尤其L-賴氨酸，除了弱化lysR1基因之外，同時弱化選自以下的一或多種基因也是有益的·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1，DSM13047)，·編碼編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)。
另外，除lysR1基因的弱化之外，抑制非所需的二級反應(yīng)對氨基酸尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學術(shù)出版社，倫敦，英國，1982)。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明制備的微生物，其可連續(xù)培養(yǎng)或在分批方法，或在補料分批法或重復補料分批法中分批培養(yǎng)以生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-賴氨酸。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(生物方法技術(shù)學1，生物工程入門，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合特定菌株的需求，關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓D.C.，USA，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可單獨或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。另外培養(yǎng)基還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素，此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中。上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍達到。
L-氨基酸的分析方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，分析可如Speckman等(分析化學，30，(1958)，1190)所述通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)茚三酮衍生化作用進行，或通過反相HPLC，如Lindroth等(分析化學(1979)511167-1174)進行。
以下微生物根據(jù)布達佩斯條約，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)·大腸桿菌菌株TOP10F/pCR2.1lysR1int，保藏號DSM 13616。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，尤其L-賴氨酸。
本發(fā)明借助于以下提供的實施例得以更詳述闡述。
從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA及所有的限制、Klenow處理和堿性磷酸酶處理方法，均如Sambrook等所述進行(分子克隆實驗手冊，1989，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.美國)。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法也見于這本手冊。
常用的培養(yǎng)基如LB培養(yǎng)基或TY培養(yǎng)基的組分也得自Sambrook等所著手冊。
實施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組粘粒基因文庫如Tauch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編號1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCos1粘粒載體試劑盒，編號251301)的粘粒載體SuperCos1(Wahl等(1987)美國科學院院報842160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI，編號27-0948-02)酶切并類似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。
粘粒DNA然后用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編號27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032 DNA片段混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編號27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編號200217)包裝進噬菌體中。
為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細胞置于10mM MgSO4并與噬菌體懸浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實施例2 lysR1基因的分離和測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導分離一個菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編號27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編號1758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。
得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將這一連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學通信，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學院院報874645-4649)并在含有50μg/ml的zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。
重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進行。測序用Zimmeermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學院院報745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”。在帶有購自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產(chǎn)品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中進行凝膠電泳分離和序列分析。
得到的原始序列資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)制備計算機輔助編碼區(qū)分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。對該核苷酸序列的分析顯示一912堿基對的開放讀框，其被稱為lysR1基因。lysR1基因編碼304個氨基酸的多肽。
實施例3用于lysR1基因的整合誘變的整合載體的制備用Eikmanns等的方法(微生物學1401817-1828(1994))從菌株ATCC 13032中分離染色體DNA?；趯嵤├?已知的谷氨酸棒桿菌的lysR1基因的序列，選擇如下寡核苷酸進行聚合酶鏈反應(yīng)lysR1intA5′-TTC CAA TCC CTG CTG TTC AC-3′lysR1intB5′-GTG ACC TTT GAA ACC AGC GA-3′。
所述引物由MWG生物技術(shù)公司(Ebersberg，德國)合成，根據(jù)Innis等的標準PCR方法(PCR方案，方法和應(yīng)用指南，1990，學術(shù)出版社)，用來自曼海姆寶靈格公司的Pwo聚合酶進行PCR反應(yīng)。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，分離了lysR1基因的一個323bp長的內(nèi)部片段，示作SEQ ID NO3。
用來自Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carsbad，CA，USA；目錄號K4500-01)，將擴增的DNA片段連接進載體pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)生物/技術(shù)9657-663)中。
然后將這一連接混合物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌株TOP10F(Hanahan，DNA克隆實用方法，卷I，IRL出版社，Oxford，華盛頓特區(qū)，美國，1985)。通過將轉(zhuǎn)化混合物在補加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)上鋪板，選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。用來自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶EcoRI限制消化及瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)而證實。質(zhì)粒命名為pCR2.1lysR1int。
實施例4 lysR1基因在賴氨酸生產(chǎn)菌株DSM 5715中的整合誘變根據(jù)Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學通信123343-347(1994))，將實施例3中的載體pCR2.1lysR1int電穿孔進谷氨酸棒桿菌DSM 5715中。菌株DSM5715是AEC抗性賴氨酸生產(chǎn)菌(EP-B-435132)。載體pCR2.1lysR1int在DSM 5715中不能獨立復制，只有在其整合進DSM5715的染色體中后才能在細胞中保持。通過將電穿孔混合物在補加15mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)上鋪板，選擇攜帶整合進染色體的pCR2.1lysR1int的克隆。
通過用來自寶靈格公司的Dig雜交試劑盒，根據(jù)寶靈格曼海姆有限公司的“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)的方法標記lysR1int片段，以檢測整合已經(jīng)發(fā)生。根據(jù)Eikmanns等的方法(微生物學1401817-1828(1994))，從潛在整合子中分離染色體DNA，并分別用限制酶SalI，SacI和HindIII切割。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離得到的片段，并用來自寶靈格公司的Dig雜交試劑盒在68℃雜交。實施例3中的質(zhì)粒pCR2.1lysR1int已插入DSM5715染色體中的染色體lysR1基因內(nèi)。該菌株命名為DSM5715∷pCR2.1lysR1int。
實施例5賴氨酸的生產(chǎn)實施例4中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1lysR1int在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中的賴氨酸含量。
為此，首先在33℃在具有合適抗生素的瓊脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。從這一瓊脂板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
向此培養(yǎng)基中加入卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物24小時。以此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始光密度(OD，660nm)是0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿)5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l鹽(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l
硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/l亮氨酸(過濾滅菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至pH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek1000(Beckmann儀器有限公司，慕尼黑)確定在660nm測量波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)，經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸的量。
所得結(jié)果示于表1。
表1
附圖簡述圖1質(zhì)粒pCR2.1lysR1int圖譜。
圖中所采用的縮寫和符號有如下含義KmR卡那霉素抗性EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點lysR1intlysR1基因的內(nèi)部片段ColE1 ori質(zhì)粒ColE1的復制源點序列表<110>德古薩股份公司<120>編碼lysR1基因的新核苷酸序列<130>000179 BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1311<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><221>CDS<222>(201)..(1109)<223>lysR1基因<400>1acagcccagg ggccgttgag ggggaaaagc tgcgttccaa tggcagcacc aaattgcagg 60gatagggcgg aacccatcac catcaacact gcagcggact gtttattcat gcccttgatt 120attgccaaag aaacctttaa ggactagatc gaaaaacagc caactatagt taagtaatac 180tgaacaattt tggaggtgtc gtg ctc aat ctc aac cgc tta cac atc ctg cag 233Met Leu Asn Leu Asn Arg Leu His Ile Leu Gln1 5 10gaa ttc cac cgc ctg gga acg att aca gca gtg gcg gaa tcc atg aac 281Glu Phe His Arg Leu Gly Thr Ile Thr Ala Val Ala Glu Ser Met Asn15 20 25tac agc cgc tct gcc atc tcc caa caa atg gcg ctg ctg gaa aaa gaa 329Tyr Ser Arg Ser Ala Ile Ser Gln Gln Met Ala Leu Leu Glu Lys Glu30 35 40att ggt gtg aaa ctc ttt gaa aaa agc ggc cga aac ctc tac ttc aca 377Ile Gly Val Lys Leu Phe Glu Lys Ser Gly Arg Asn Leu Tyr Phe Thr45 50 55gaa caa ggc gaa gtg ttg gcc tca gaa aca cat gcg atc atg gca gca 425Glu Gln Gly Glu Val Leu Ala Ser Glu Thr His Ala Ile Met Ala Ala60 65 70 75gtc gac cat gcc cgc gca gcc gtt cta gat tcg ctg tct gaa gtg tcc 473Val Asp His Ala Arg Ala Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Val Ser80 85 90gga acg ctg aaa gtc acc tcc ttc caa tcc ctg ctg ttc acc ctt gcc 521Gly Thr Leu Lys Val Thr Ser Phe Gln Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala95 100 105ccg aaa gcc atc gcg cgc ctg acc gag aaa tac cca cac ctg caa gta 569Pro Lys Ala Ile Ala Arg Leu Thr Glu Lys Tyr Pro His Leu Gln Val110 115 120gaa atc tcc caa cta gaa gtc acc gca gcg ctc gaa gaa ctc cgc gcc 617Glu Ile Ser Gln Leu Glu Val Thr Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg Ala125 130 135cgc cgc gtc gac gtc gca ctc ggc gag gaa tac ccc gtg gaa gtc ccc 665Arg Arg Val Asp Val Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Val Glu Val Pro140 145 150 155ctt gtt gag gcc agc att cac cgc gaa gtc ctc ttc gaa gac ccc atg 713Leu Val Glu Ala Ser Ile His Arg Glu Val Leu Phe Glu Asp Pro Met160 165 170ctg ctc gtc acc cca gca agc ggc cca tac tct ggc ctc acc ctg cca 761Leu Leu Val Thr Pro Ala Ser Gly Pro Tyr Ser Gly Leu Thr Leu Pro175 180 185gaa ctc cgc gac atc ccc atc gcc atc gat cca ccc gac ctt ccc gcg 809Glu Leu Arg Asp Ile Pro Ile Ala Ile Asp Pro Pro Asp Leu Pro Ala190 195 200ggc gaa tgg gtc cat agg ctc tgc cgg cgc gcc ggg ttt gag ccc cgc 857Gly Glu Trp Val His Arg Leu Cys Arg Arg Ala Gly Phe Glu Pro Arg205 210 215gtg acc ttt gaa acc agc gat ccc atg ctc caa gca cac ctc gtg cgt 905Val Thr Phe Glu Thr Ser Asp Pro Met Leu Gln Ala His Leu Val Arg220 225 230 235agc ggc ttg gcc gtg aca ttt tcc ccc aca ctg ctc acc ccg atg ctg 953Ser Gly Leu Ala Val Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Thr Pro Met Leu240 245 250gaa agc gtg cac atc cag ccg ctg ccc ggc aac ccc acg cgc acg ctc 1001Glu Ser Val His Ile Gln Pro Leu Pro Gly Asn Pro Thr Arg Thr Leu255 260 265tac acc gcg gtc agg gaa ggg cgc cag ggg cat cca gcc att aaa gct 1049Tyr Thr Ala Val Arg Glu Gly Arg Gln Gly His Pro Ala Ile Lys Ala270 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Lys Tyr Pro His Leu Gln Val Glu Ile Ser Gln Leu115 120 125Glu Val Thr Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Arg Val Asp Val130 135 140Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Pro Val Glu Val Pro Leu Val Glu Ala Ser145 150 155 160Ile His Arg Glu Val Leu Phe Glu Asp Pro Met Leu Leu Val Thr Pro165 170 175Ala Ser Gly Pro Tyr Ser Gly Leu Thr Leu Pro Glu Leu Arg Asp Ile180 185 190Pro Ile Ala Ile Asp Pro Pro Asp Leu Pro Ala Gly Glu Trp Val His195 200 205Arg Leu Cys Arg Arg Ala Gly Phe Glu Pro Arg Val Thr Phe Glu Thr210 215 220Ser Asp Pro Met Leu Gln Ala His Leu Val Arg Ser Gly Leu Ala Val225 230 235 240Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Thr Pro Met Leu Glu Ser Val His Ile245 250 255Gln Pro Leu Pro Gly Asn Pro Thr Arg Thr Leu Tyr Thr Ala Val Arg260 265 270Glu Gly Arg Gln Gly His Pro Ala Ile Lys Ala Phe Arg Arg Ala Leu275 280 285Ala His Val Ala Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Val Glu290 295 300<210>3<211>383<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220><223>lysR1內(nèi)部片段<400>3ttccaatccc tgctgttcac ccttgccccg 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1.一種來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有編碼lysR1基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸，所述多肽優(yōu)選具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物LysR1的活性。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是在棒狀細菌中能復制的優(yōu)選重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的能復制的DNA，含有(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，含有SEQ ID NO1所示核酸序列。
6.一種棒狀細菌菌，其中l(wèi)ysR1基因被弱化，優(yōu)選被消除。
7.一種生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，其包括以下步驟(a)發(fā)酵生產(chǎn)所需L-氨基酸的細菌，該細菌中至少lysR1基因是弱化的，(b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的所需產(chǎn)物，及(c)分離L-氨基酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中使用的細菌中所需L-氨基酸生物合成途徑的其它基因額外被增強。
9.權(quán)利要求7的方法，其中使用的細菌中降低所需L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分消除。
10.權(quán)利要求7的方法，其中編碼lysR1基因的一或多種多核苷酸的表達被弱化，尤其是被消除。
11.權(quán)利要求7的方法，其中由lysR1多核苷酸編碼的多肽的調(diào)節(jié)性質(zhì)被降低。
12.權(quán)利要求7的方法，其中為生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-賴氨酸，發(fā)酵的細菌中選自以下的一或多個基因被同時增強，優(yōu)選過表達12.1編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，12.2編碼烯醇化酶的eno基因，12.3編碼zwf基因產(chǎn)物的zwf基因，12.4編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，12.5編碼賴氨酸輸出的lysE基因。
13.權(quán)利要求7的方法，其中選自以下的一或多個基因被同時弱化13.1編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，13.2編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因，13.3編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因。
14.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中使用的是谷氨酸棒桿菌或乳發(fā)酵短桿菌的微生物。
15.一種發(fā)現(xiàn)RNA、cDNA和DNA以分離編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物lysR1的核酸、多核苷酸或基因，或與lysR1基因的序列具有高度相似性的核酸、多核苷酸或基因的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-4的多核苷酸序列作為雜交探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的一種多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還涉及使用棒狀細菌酶促生產(chǎn)L－氨基酸的方法，所述細菌中至少編碼一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的lysR1基因以弱化形式存在。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列作為雜交探針的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK1446226SQ01813989
公開日2003年10月1日 申請日期2001年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月10日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 邁克爾·法爾維克, 托馬斯·赫爾曼, 卡羅琳·克羅伊策, 瓦爾特·普費勒 申請人:德古薩股份公司