專利名稱：新型成纖維細胞生長因子(fgf23)及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
血清磷酸鹽水平降低或升高的狀況(分別稱為低血磷(Hypophosphatemia)和高血磷(Hyperphosphatemia))與多種多樣的臨床重要疾病有關(guān)。通常源自腎磷酸鹽流失的低血磷是由許多遺傳紊亂引起的，包括X連鎖低血磷佝僂病(X-linked hypophosphatemic rickets，XLH)、伴隨高鈣尿的遺傳性低血磷佝僂病(hereditaryhypophosphatemic rickets with hypercalciuria，HHRH)、低血磷骨病(hypophosphatemic bone disease，HBD)、和常染色體顯性低血磷佝僂病(autosomal dominant hypopohsphatemic rickets，ADHR)。在患有輕度腎機能不全和腫瘤性鈣沉積的患者中觀察到的高血磷常常與軟組織鈣化、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、三發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、和其它代謝紊亂有關(guān)。
關(guān)于維持正常血清磷酸鹽濃度的分子機制了解得很少。對牽涉磷酸鹽穩(wěn)態(tài)紊亂的遺傳紊亂負有責(zé)任的基因的鑒定有可能洞察調(diào)控磷酸鹽平衡的途徑。目前，盡管低血磷和高血磷狀況患者具有明顯的臨床特征，然而尚無可用于這些紊亂的早期診斷、分級、和分段的分子標記。同樣， 目前對于低血磷和高血磷紊亂患者缺乏有效的治療方法也提出了對候選療法的需要。本發(fā)明滿足了這些需要。
發(fā)明概述本發(fā)明包括編碼FGF23或其突變體、變體、同系物、或片段的分離核酸。
一方面，編碼FGF23的分離核酸與SEQ ID NO1和SEQ ID NO3之至少一項的核酸序列共享至少大約50％的序列同一性。
本發(fā)明還包括編碼FGF23的分離核酸，其中所述分離核酸編碼的多肽所具有的氨基酸序列與SEQ ID NO2和SEQ ID NO4之至少一項的氨基酸序列共享至少40％的序列同一性。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離核酸包含在DSMZ保藏號DSM 13530中。
在本發(fā)明的一個方面中，編碼FGF23的核酸共價連接編碼標簽多肽的核酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，標簽多肽是myc標簽多肽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標簽多肽、綠色熒光蛋白標簽多肽、myc-丙酮酸激酶標簽多肽、His6標簽多肽、流感病毒血凝素標簽多肽、FLAG標簽多肽、或麥芽糖結(jié)合蛋白標簽多肽。
本發(fā)明還包括編碼FGF23的核酸，其中核酸可操作連接表述啟動子/調(diào)控序列的核酸。
本發(fā)明還包括包含編碼FGF23的分離核酸的載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，載體包含可操作連接啟動子/調(diào)控序列的編碼FGF23的分離核酸。
本發(fā)明還包括包含編碼FGF23的分離核酸或包含所述核酸的載體的重組細胞。
本發(fā)明包括與編碼FGF23或其突變體、變體、同系物、或片段的核酸互補的分離核酸，其中互補核酸處于反義取向。在一個優(yōu)選的實施方案中，互補核酸與具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3之至少一項的序列的核酸的互補核酸共享至少大約50％的序列同一性。本發(fā)明還包括包含反義核酸的載體，以及包含可操作連接表述啟動子/調(diào)控序列的反義核酸的載體。
本發(fā)明還包括包含反義核酸和包含所述核酸的載體的重組細胞。
本發(fā)明包括包含編碼FGF23或其突變體、變體、同系物、或片段的分離核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
本發(fā)明還包括包含F(xiàn)GF23或其突變體、變體、同系物、或片段的分離多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離多肽與SEQ ID NO2和SEQID NO4之至少一項的氨基酸序列共享至少大約40％的序列同一性。
本發(fā)明包括特異結(jié)合FGF23多肽或其突變體、變體、同系物、或片段的抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、或合成抗體。
本發(fā)明還包括編碼FGF23的分離核酸，其中核酸包含突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，突變賦予FGF23以升高的穩(wěn)定性。更優(yōu)選的是，突變影響相對于SEQ ID NO2的第176位氨基酸(精氨酸)或相對于SEQ ID NO2的第179位氨基酸(精氨酸)。甚至更優(yōu)選的是，突變選自下組相對于SEQ ID NO1的527G＞A、535C＞T、和536G＞A。
本發(fā)明還包括包含突變的FGF23多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)GF23多肽包含賦予升高的穩(wěn)定性的突變。更優(yōu)選的是，突變位于相對于SEQ ID NO2的第176位氨基酸(精氨酸)或相對于SEQ ID NO2的第179位氨基酸(精氨酸)。
本發(fā)明包括FGF23的抑制劑。抑制劑可以是降低編碼FGF23多肽的mRNA水平的分子、降低FGF23多肽水平的分子、或降低FGF23生物學(xué)活性的分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，抑制劑是反義核酸、核酶、抗體、肽、或肽模擬物。更優(yōu)選的是，抑制劑是特異結(jié)合FGF23的抗體或特異結(jié)合FGF23受體的抗體。
本發(fā)明包括包含編碼FGF23的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括包含與編碼FGF23的核酸互補的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括包含分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括包含特異結(jié)合FGF23的抗體和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括包含編碼突變型FGF23的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括包含編碼穩(wěn)定性升高的突變型FGF23的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括包含編碼突變型FGF23的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物，所述突變型FGF23在相對于SEQ ID NO2的第176位氨基酸(精氨酸)或相對于SEQ ID NO2的第179位氨基酸(精氨酸)處包含突變。
本發(fā)明還包括包含分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物，所述FGF23多肽包含突變。
本發(fā)明還包括包含分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物，所述FGF23多肽包含賦予升高的穩(wěn)定性的突變。
本發(fā)明還包括包含分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物，所述FGF23多肽在相對于SEQ ID NO2的第176位氨基酸(精氨酸)或相對于SEQ ID NO2的第179位氨基酸(精氨酸)處包含突變。
本發(fā)明還包括包含F(xiàn)GF23的抑制劑和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
本發(fā)明還包括診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括(1)由所述哺乳動物獲得生物學(xué)樣品；并(2)使所述生物學(xué)樣品接觸能夠檢測編碼FGF23的核酸中是否存在突變的試劑，其中突變的存在指示哺乳動物患有低血磷紊亂，由此診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂。
在一個優(yōu)選的實施方案中，低血磷紊亂是常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，生物學(xué)樣品是血液或尿液。
在還有一個優(yōu)選的實施方案中，試劑是核酸。更優(yōu)選的是，試劑被可檢測標記。優(yōu)選的標記物包括放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物、和酶。
本發(fā)明還包括診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括(1)由所述哺乳動物獲得生物學(xué)樣品；并(2)使所述生物學(xué)樣品接觸能夠檢測是否存在突變型FGF23多肽的試劑，其中所述突變型FGF23多肽的存在指示哺乳動物患有低血磷紊亂，由此診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂。
在一個優(yōu)選的實施方案中，低血磷紊亂是常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，生物學(xué)樣品是血液或尿液。
在還有一個優(yōu)選的實施方案中，試劑是抗體。
本發(fā)明還包括診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括(1)由所述哺乳動物獲得生物學(xué)樣品；并(2)使所述生物學(xué)樣品接觸能夠檢測樣品中FGF23多肽水平的試劑，其中樣品中FGF23多肽水平相對于對照哺乳動物中FGF23多肽水平的升高指示哺乳動物患有低血磷紊亂，由此診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂。
在一個優(yōu)選的實施方案中，低血磷紊亂選自下組X連鎖遺傳性佝僂病(XLH)、遺傳性低血磷佝僂病(HHRH)、低血磷骨病(HBD)、常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)、由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、和腎結(jié)石。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，生物學(xué)樣品是血液或尿液。
在還有一個優(yōu)選的實施方案中，試劑是FGF23抗體。更優(yōu)選的是，試劑經(jīng)過可檢測標記。優(yōu)選的標記物包括放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物、和酶。
本發(fā)明還包括診斷患者體內(nèi)由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的方法，包括(1)由所述患者獲得腫瘤樣品；并(2)檢測腫瘤中FGF23的表達或缺乏，其中FGF23的表達指示患者患有由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括對患有該紊亂的哺乳動物施用治療有效量的FGF23抑制劑。抑制劑可以是降低所述哺乳動物體內(nèi)編碼FGF23多肽的mRNA水平的抑制劑、降低所述哺乳動物體內(nèi)FGF23多肽水平的抑制劑、或降低所述哺乳動物體內(nèi)FGF23生物學(xué)活性的抑制劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，低血磷紊亂選自下組X連鎖遺傳性佝僂病(XLH)、遺傳性低血磷佝僂病(HHRH)、低血磷骨病(HBD)、常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)、由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、和腎結(jié)石。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，抑制劑是反義核酸、核酶、抗體、肽、或肽模擬物。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有該紊亂的哺乳動物施用治療有效量的編碼FGF23的分離核酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，分離核酸包含賦予其所編碼的FGF23多肽以升高的穩(wěn)定性的突變。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，高血磷紊亂是輕度腎機能不全或腫瘤性鈣沉積。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有該紊亂的哺乳動物施用治療有效量的分離FGF23多肽。
在一個優(yōu)選的實施方案中，分離FGF23多肽包含賦予升高的穩(wěn)定性的突變。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，高血磷紊亂是輕度腎機能不全或腫瘤性鈣沉積。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有該紊亂的哺乳動物施用治療有效量的試劑，所述試劑能夠升高哺乳動物體內(nèi)的FGF23多肽水平。
在一個優(yōu)選的實施方案中，試劑可抑制FGF23多肽的降解。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，高血磷紊亂是輕度腎機能不全或腫瘤性鈣沉積。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有紊亂的哺乳動物施用治療有效量的細胞群體，所述細胞群體包含編碼FGF23的分離核酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，分離核酸包含賦予其所編碼的FGF23多肽以升高的穩(wěn)定性的突變。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，高血磷紊亂是輕度腎機能不全或腫瘤性鈣沉積。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的骨質(zhì)疏松的方法，包括對哺乳動物施用治療有效量的FGF23或能夠升高哺乳動物體內(nèi)的FGF23多肽水平的試劑。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)牽涉鈣和磷酸鹽在動脈或軟組織中沉積的狀況，包括對哺乳動物施用治療有效量的FGF23或能夠升高FGF23多肽水平的試劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該狀況是皮肌炎。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的冠狀動脈疾病的方法，包括對患病哺乳動物的冠狀動脈細胞施用編碼FGF23的核酸。
本發(fā)明還涉及診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的試劑盒。試劑盒包含能夠檢測編碼FGF23的核酸序列中是否存在突變的試劑，其中突變的存在指示哺乳動物患有低血磷紊亂。試劑盒還包含用于使用它們的施用器和指導(dǎo)材料。
本發(fā)明還包括診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的試劑盒。試劑盒包含能夠檢測FGF23多肽水平的試劑，其中FGF23多肽水平的升高指示哺乳動物患有低血磷紊亂。試劑盒還包含用于使用它們的施用器和指導(dǎo)材料。
本發(fā)明還包括診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的試劑盒。試劑盒包含能夠檢測是否存在突變型FGF23多肽的試劑，其中突變型FGF23的存在指示哺乳動物患有低血磷紊亂。試劑盒還包含用于使用它們的施用器和指導(dǎo)材料。
圖的簡述結(jié)合附圖進行閱讀將能夠更好的理解上文概述及下文本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳述。出于例示本發(fā)明的目的，圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所示明確安排和手段。
在附圖中

圖1A是描繪兩個不同ADHR家族(1406和1478)的家譜內(nèi)連鎖分析的示意圖。
圖1B是描繪三個不同ADHR家族(1406、1478、和2318)的突變分析的一系列家譜示意圖和瓊脂糖凝膠圖像。
圖2是描繪ADHR區(qū)域的物理圖譜的示意圖。根據(jù)尚未完成的序列數(shù)據(jù)(貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測序中心)的估計，按比例繪制了DNA標記和BAC/PAC的位置。箭頭指示克隆RP11-303E5與RP11-320N7、克隆RP11-103A11與RP11-935C2之間的基因組序列中的缺口。指示了D12S1624與D12S1594之間的基因、GPR64、和GDF2的大致位置。
圖3A-3C是FGF23與其它哺乳動物FGF家族成員的氨基酸序列比對(SEQ ID NO14-34即它們在圖中出現(xiàn)的順序)。比對限于由十二條反向平行β鏈組成的核心序列。下劃線指示FGF2晶體結(jié)構(gòu)中具有β-折疊構(gòu)象的區(qū)段的位置。在FGF23中突變的兩個精氨酸(圖3C；以星號指示)在FGF23的小鼠同系物中是保守的。比對是用CLUSTAL和PRETTYBOX產(chǎn)生的。人和小鼠FGF23是由PFAM數(shù)據(jù)庫的FGF文件鑒定的(4.6e-14、1.9e-16)。它們與FGF家族的其它成員在共有核心序列中共享25％-36％的氨基酸同一性。
圖4A是描繪FGF23的組織表達的瓊脂糖凝膠圖像。使用跨內(nèi)含子引物對來自人組織的RNA進行的RT-PCR分析在人心(H)、肝(L)、甲狀腺/甲狀旁腺(TP)、小腸(SI)、睪丸(T)、和骨骼肌(SM)中揭示了650bp產(chǎn)物，而腦(B)和腎(K)呈陰性。
圖4B是描繪暴露7天后多種癌細胞系中的FGF23表達的Northern印跡圖像。在嚴謹清洗條件下在慢性骨髓性白血病細胞系K562中觀察到3kb和1.3kb轉(zhuǎn)錄本(泳道3)。其它細胞系生成3kb或1.3kb轉(zhuǎn)錄本。(泳道1＝HL-60；泳道2＝HeLaS3；泳道4＝MOLT-4；泳道5＝RAJI；泳道6＝SW480；泳道7＝A549；泳道8＝G-36l)圖5A是人FGF23的cDNA序列(SEQ ID NO1)。
圖5B是人FGF23的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖6A是小鼠FGF23的cDNA序列(SEQ ID NO3)。
圖6B是小鼠FGF23的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖7A是描繪由細菌生成的FGF23的體外表達的Western印跡圖像?？笷GF23抗體識別來自經(jīng)IPTG誘導(dǎo)(+)而非未經(jīng)誘導(dǎo)(-)的細菌的27kDa蛋白質(zhì)，所述細菌被標記了組氨酸的FGF23(FGF23-6xHis)轉(zhuǎn)化。
圖7B是描繪轉(zhuǎn)染細胞的FGF23表達的Northern印跡圖像。使用FGF23探針對來自經(jīng)FGF23表達載體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的總RNA(pFGF23；泳道3)的Northern印跡分析揭示了1.1kb單一轉(zhuǎn)錄本。(泳道1＝未轉(zhuǎn)染的HEK293細胞；泳道2＝經(jīng)對照載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的HEK293細胞。)圖7C是描繪轉(zhuǎn)染細胞的FGF23分泌的Western印跡圖像。在由經(jīng)pFGF23轉(zhuǎn)染的細胞(泳道2、4、6)而非未轉(zhuǎn)染細胞(泳道1、3、5)獲得的濃縮后條件培養(yǎng)基中，抗FGF23抗體識別32kDa和12kDa的兩條蛋白質(zhì)條帶。
圖8A是描繪致癌低血磷骨軟化(OHO)腫瘤中的FGF23表達的Northern印跡圖像。來自五種不同OHO腫瘤(泳道3-7)的總RNA的Northern印跡分析展示了曝光30分鐘后1.3kb和3kb的強雜交FGF23轉(zhuǎn)錄本和弱2kb條帶，而對照組織呈陰性。(泳道1＝人肝；泳道2＝人甲狀旁腺；泳道8＝小鼠腦；泳道9＝小鼠心；泳道10＝小鼠腎。)圖8B是描繪OHO腫瘤樣品中的FGF23蛋白質(zhì)表達的Western印跡圖像。對來自O(shè)HO腫瘤的2μg提取物的分析證明了使用抗FGF23抗體(+)而非免疫前血清(-)檢測到32kDa蛋白質(zhì)。
圖9是人FGF23的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，其中指示了預(yù)測的信號肽和RXXR/S蛋白酶切割位點。
圖10A是描繪野生型和ADHR突變型FGF23蛋白質(zhì)的表達和分泌的一系列Western印跡圖像。使用抗FGF23抗體對由經(jīng)表達野生型(FGF23)或ADHR突變型(R176Q、R179W、R179Q)FGF23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞獲得的2μg條件培養(yǎng)基(M)或50μg細胞裂解物(L)進行Western印跡分析。在野生型FGF32的條件培養(yǎng)基中檢測到32kDa和12kDa條帶，而只在ADHR突變型中檢測到32kDa條帶。所有經(jīng)FGF23轉(zhuǎn)染的細胞裂解物都呈陰性，而且所有構(gòu)建物展示相似的轉(zhuǎn)染效率。
圖10B是野生型和ADHR突變型(R176Q、R179W、R179Q)人FGF23的第172-184位氨基酸的列表。
圖11A是描繪FLAG標記FGF23的表達的Western印跡圖像。使用FLAG特異性單克隆抗體(M2)進行的Western印跡分析用于檢測由經(jīng)表達野生型或R176Q突變型FGF23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞獲得的條件培養(yǎng)基中的N末端FLAG標記野生型(兩個不同克隆，左邊的兩條泳道)或R176Q(兩個不同克隆，右邊的兩條泳道)FGF23。野生型FLAG-FGF23被檢測為36kDa條帶和顯著的26kDa片段，而FLAG-R176Q突變型主要分辨為36kDa條帶，并有一26kDa的弱帶。
圖11B是描繪FGF23蛋白質(zhì)的示意圖，其中顯示了FLAG表位、抗FGF23表位、和SPC位點的相對位置。
圖12A是描繪胞外暴露FGF23蛋白質(zhì)于HEK293細胞的Western印跡圖像。使用FGF23特異抗體對與5x106個HEK293細胞一起(+)或在空培養(yǎng)皿中(-)保溫24小時的FGF23條件培養(yǎng)基進行Western印跡分析。處理后32kDa和12kDa條帶的強度沒有差異。
圖12B是考馬斯藍染色凝膠的圖像。將圖12A中所示樣品平行電泳，考馬斯染色確認了凝膠上樣量相等。
圖13是描繪野生型和ADHR突變型FGF23結(jié)合肝素的Western印跡圖像。將由經(jīng)野生型或突變型FGF23及FLAG標記野生型或突變型FGF23轉(zhuǎn)染的HEK293細胞獲得的條件培養(yǎng)基與肝素-sepharose一起保溫，并使用抗FGF23抗體對結(jié)合的物質(zhì)進行Western印跡分析。32kDa條帶對應(yīng)于結(jié)合肝素的野生型或突變型FGF23。在對照載體的情況下，培養(yǎng)基呈陰性。不知道有些樣品中大約28kDa弱帶的來源。(泳道1＝天然FGF23；泳道2＝R176Q；泳道3＝R179W；泳道4＝R179Q；泳道5＝CMV載體；泳道6＝FLAG-FGF23；泳道7＝FLAG-176Q；泳道8＝FLAG載體。)發(fā)明詳述本發(fā)明涉及編碼哺乳動物成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的新型核酸及由其編碼的蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明公開了成纖維細胞生長因子家族的新成員，其中該核酸及由其編碼的蛋白質(zhì)可用于開發(fā)用于診斷和治療低血磷和高血磷紊亂的診斷性和治療性試劑。
腎在維持正常血清磷酸鹽濃度中發(fā)揮主要作用。引起少見的磷酸鹽調(diào)控受損的可遺傳紊亂的基因的鑒定為找到控制無機離子平衡的腎途徑提供了機會。
在本文公開的初步實驗中，發(fā)現(xiàn)了對常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)負有責(zé)任的基因，并命名為FGF23。ADHR的特征是身材矮小、骨骼疼痛、骨折、和下肢畸形。本文還發(fā)現(xiàn)了FGF23在導(dǎo)致致癌低血磷骨軟化(腎磷酸鹽流失的獲得性紊亂)的腫瘤中過度表達?；加兄掳┑脱坠擒浕幕颊吲cADHR患者具有生化和臨床相似性。這些只是可以通過降低患者體內(nèi)的FGF23水平和/或活性來治療的數(shù)種低血磷疾病中的兩種。對FGF23抑制劑治療敏感的其它低血磷疾病包括但不限于XLH、HHRH、HBD、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、腎結(jié)石、等等。
與特征為腎磷酸鹽流失和低血清磷酸鹽的低血磷疾病不同，高血磷疾病(包括輕度腎機能不全、腫瘤性鈣沉積、等等)的特征是血清中磷酸鹽過度。施用FGF23能夠刺激尿液中的磷酸鹽排泄，從而降低血清中的磷酸鹽水平。因此，可以通過施用天然FGF23或能夠升高患者體內(nèi)FGF23多肽水平的分子來治療高血磷疾病。另外，突變型FGF23還可用于治療高磷血癥，特別是在突變體具有比天然FGF23更長的半衰期的情況中。本文公開了具有較長半衰期的特定FGF23突變體。
因此，在本發(fā)明中還發(fā)現(xiàn)FGF23可能涉及動物體內(nèi)的低血磷和高血磷兩種狀況。從本質(zhì)上說，當(dāng)動物體內(nèi)的FGF23水平異常升高時(通常是蛋白質(zhì)過度表達或因遺傳突變而活性升高)，動物因磷酸鹽流失升高而表現(xiàn)低血磷。盡管尚未確定異常FGF23水平是否在高血磷中發(fā)揮致病作用，然而FGF23在動物體內(nèi)降低血清磷酸鹽水平的能力清楚指示FGF23在調(diào)控磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明包括編碼FGF23的分離核酸。正如本文中公開的，由人細胞和鼠細胞分離得到了編碼FGF23的分離核酸(分別參閱例如圖5A和6A；SEQ ID NO1和SEQ ID NO3)。編碼FGF23的優(yōu)選核酸是DNA。另外，盡管本文例示了人和鼠FGF23核酸和蛋白質(zhì)，然而不應(yīng)解釋為本發(fā)明只限于由這些哺乳動物物種獲得的FGF23，而是應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明包括編碼具有本文定義的FGF23生物學(xué)活性的FGF23或其任何突變體、變體、或同系物的任何分離核酸。優(yōu)選的是，編碼本發(fā)明FGF23的DNA與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3共享大約50％的同源性。更優(yōu)選的是，該DNA與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3共享大約60％、甚至更優(yōu)選大約70％、仍然更優(yōu)選大約80％、更優(yōu)選90％、仍然更優(yōu)選95％、且甚至更優(yōu)選大約99-100％同源性。
本發(fā)明包括編碼FGF23的核酸，其中編碼標簽多肽的核酸與其共價連接。即本發(fā)明涵蓋嵌合核酸，其中編碼標簽多肽的核酸序列與編碼FGF23多肽的核酸共價連接。這些標簽多肽在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括例如綠色熒光蛋白(GFP)、myc、myc-丙酮酸激酶(myc-PK)、His6、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、流感病毒血凝素標簽蛋白、FLAG標簽多肽(FLAG)、和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽多肽。然而，絕不能解釋為本發(fā)明限于編碼上述標簽多肽的核酸，而是應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明包括編碼能夠以與這些標簽多肽基本上相似的方式發(fā)揮功能的多肽的任何核酸序列。
包含編碼標簽多肽的核酸的核酸可用于在細胞、組織、和/或完整生物體(如哺乳動物胚胎)中定位FGF23、檢測由細胞分泌的FGF23、和研究FGF23在細胞中的作用。另外，添加標簽多肽便于分離和純化被標記”蛋白質(zhì)，從而能夠容易的生成和純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括編碼FGF23的核酸，其中表述啟動子/調(diào)控序列的核酸與其可操作連接。優(yōu)選的是，表述啟動子/調(diào)控序列的核酸位于FGF23編碼序列的5’端，從而驅(qū)動所需蛋白質(zhì)在細胞中的表達。
在其它相關(guān)方面中，本發(fā)明包括包含編碼FGF23的分離核酸的載體。優(yōu)選的是，該載體能夠在包含載體的細胞中指導(dǎo)FGF23的表達。適用于本發(fā)明的載體包括但不限于便于在原核或真核細胞或二者中生成多拷貝的FGF23編碼核酸或便于表達FGF23蛋白質(zhì)的載體。因此，不應(yīng)解釋為本發(fā)明限于任何已知載體系統(tǒng)，而是應(yīng)當(dāng)包括所有已知的或至今未知的便于在細胞中生成多拷貝的FGF23編碼核酸或便于表達FGF23蛋白質(zhì)的合適載體。合適載體的范例包括用于在細菌中復(fù)制和表達的基于噬菌體T7的表達載體、用于在哺乳動物細胞中復(fù)制和表達的pMSXND表達載體、和用于在昆蟲細胞中復(fù)制和表達的由桿狀病毒衍生的載體。本發(fā)明還涵蓋腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、和其它病毒載體。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的分離核酸分子在本發(fā)明的重組載體中可操作連接啟動子/調(diào)控元件和其它調(diào)控元件，諸如終止信號、聚腺苷酸化信號、等等，每一種都保證FGF23在細胞中的有效復(fù)制和表達。不應(yīng)解釋為本發(fā)明限于驅(qū)動FGF23表達的任何特定啟動子/調(diào)控序列，而是應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明包括能夠可操作連接FGF23編碼核酸并由此在任何期望的真核或原核細胞中實現(xiàn)FGF23表達的任何和所有合適啟動子/調(diào)控序列。用于將合適啟動子序列連接核酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且描述于例如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningALaboratory Manual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約；Ausubel等人，1997，《Current Protocols in Molecular Biology》即《分子生物學(xué)通用方案》，John Wiley & Sons，紐約；和Gerhardt等人編，1994，《Methods for General and Molecular Bacteriology》即《普通和分子細菌學(xué)方法》，美國微生物學(xué)學(xué)會，華盛頓特區(qū)。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明載體的細胞，其中細胞是原核或真核細胞，即例如哺乳動物、細菌、昆蟲、或酵母細胞。正如本文所述，可以使用這些包含載體的細胞來生成FGF23蛋白質(zhì)。同樣，不應(yīng)解釋為本發(fā)明限于用于表達FGF23的特定細胞類型。
本發(fā)明還包括具有相對于編碼FGF23的分離核酸的整個或部分處于反義取向的序列的分離核酸。一方面，本發(fā)明包括特征為能夠結(jié)合編碼FGF23的mRNA從而抑制FGF23合成的反義RNA序列。同樣，本發(fā)明關(guān)注包含反義FGF23分離核酸序列的載體(包括那些其中所含核酸可操作連接啟動子/調(diào)控元件的載體)和細胞。
另一方面，本發(fā)明包括包含與編碼FGF23的mRNA互補的RNA序列的核酶，其中核酶由此能夠結(jié)合并切割該mRNA，從而抑制由mRNA編碼的FGF23的合成。核酶由能夠在分子間切割靶RNA例如FGF23mRNA的單鏈RNA構(gòu)成。遵循本領(lǐng)域所述流程，有可能構(gòu)建能夠在特定靶位點切割RNA的核酶(如Tanner等人，《Antisense Research andApplications》即《反義研究和應(yīng)用》，CRC出版社，1993，第415-426頁)。對于這些核酶的兩個主要必要條件是催化結(jié)構(gòu)域和與靶RNA互補使其能夠結(jié)合底物(切割的前提)的區(qū)域。反義RNA和核酶可用作FGF23表達的抑制劑。優(yōu)選的是，本發(fā)明的反義RNA和核酶與編碼FGF23的mRNA的5’端互補。根據(jù)本文提供的序列，反義片段和核酶生成領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道能夠通過反義分子或核酶精確靶向哪些FGF23 mRNA序列從而實現(xiàn)對FGF23表達的抑制。
有兩種類型的核酶，即四膜蟲型(tetrahymena-type)(Hasselhoff，1988，Nature，334585)和錘頭型。四膜蟲型核酶識別長度為四個堿基的序列，而錘頭型核酶識別長度為11-18個堿基的序列。序列越長，序列專一存在于靶mRNA分子中的可能性越大。因此，對于滅活特定mRNA分子，優(yōu)選錘頭型核酶而非四膜蟲型核酶，而且優(yōu)選18個堿基的識別序列而非較短的識別序列，后者可能隨機存在于各種無關(guān)mRNA分子中。
可以通過將靶序列摻入核酶基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)來設(shè)計可用于抑制FGF23表達的核酶，所述核酶基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)與由FGF23編碼的FGF23 mRNA序列互補，或者與SEQ ID NO1和SEQ ID NO3之至少一項具有至少大約50％的序列同一性。可以使用商品化試劑來合成靶向FGF23的核酶(Applied Biosystems公司，福斯特城，加州)，或者可以由編碼它們的DNA進行遺傳表達。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，它的基因組缺乏功能性FGF23，因而消除了FGF23的生物學(xué)活性。在一個范例中，轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物包含插入其基因組中的期望位點的外源核酸，從而刪除FGF23編碼區(qū)，即敲除轉(zhuǎn)基因哺乳動物。這些動物提供了研究與FGF23突變有關(guān)的人類疾病狀況的有用模型。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因哺乳動物是小鼠。其中FGF23功能遭到敲除的小鼠將具有高血磷表型或非磷酸鹽表型。
另外，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其中編碼FGF23的外源核酸插入基因組位點，即“敲入”轉(zhuǎn)基因哺乳動物。插入的敲入轉(zhuǎn)基因可以包含與編碼FGF23的核酸可操作連接的編碼例如標簽多肽、啟動子/調(diào)控區(qū)的多種核酸，它們通常不存在于細胞中或者通常不與FGF23可操作連接。FGF23敲入轉(zhuǎn)基因的表達有可能在哺乳動物中引起低血磷，導(dǎo)致與致癌性低血磷骨軟化和ADHR類似的表型。野生型和突變型FGF23都可插入哺乳動物基因組。具體而言，本文公開的突變體的插入將生成FGF23的更穩(wěn)定形式，因此可能在動物中導(dǎo)致持久的或增強的低血磷狀況。
優(yōu)選使用現(xiàn)在描述的方法來實現(xiàn)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的生成。然而，絕不能解釋為本發(fā)明只限于這種方法的使用，而是可以使用其它方法來生成所需敲除哺乳動物。
在生成轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的優(yōu)選方法中，基本上如Nagy和Rossant(1993，《Gene Targeting，A Practical Approach》即《基因靶向，實踐方法》，第146-179頁，Joyner編，IRL出版社)中所述，生成包含本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的ES細胞，然后將該細胞用于生成敲除哺乳動物。若通過注射到宿主胚泡中或與卵裂球階段的胚胎聚集而使ES細胞返回到胚胎環(huán)境中，則它們的表現(xiàn)像正常胚胎細胞。在如此返回后，細胞具有沿著所有胚胎譜系發(fā)育的全部潛能。因此，有可能獲得ES細胞，在其中導(dǎo)入期望DNA，然后使細胞返回到胚胎環(huán)境使之發(fā)育成成熟的哺乳動物細胞，其中目的DNA有可能被表達。
用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠的精確方案公開于Nagy和Rossant，1993，《Gene Targeting，A Practical Approach》即《基因靶向，實踐方法》，第146-179頁，Joyner編，IRL出版社，因此本文不再重復(fù)。使用標準方案來實現(xiàn)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)ES細胞從而導(dǎo)入期望DNA，諸如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningA Laboratory Manual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約；和Ausubel等人，1997，《CurrentProtocols in Molecular Biology》即《分子生物學(xué)通用方案》，John Wiley& Sons，紐約中所述。優(yōu)選的是，如Soriano等人(1991，Cell，64693-702)所述，將本發(fā)明轉(zhuǎn)基因中所包含的期望DNA電穿孔到ES細胞中并增殖細胞。
通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)的任何標準技術(shù)來實現(xiàn)將分離核酸導(dǎo)入哺乳動物受精卵(Hogan等人，1986，《Manipulating the Mouse EmbryoALaboratory Manual》即《小鼠胚胎操作實驗室手冊》，冷泉港，紐約)。最常用的是，通過顯微注射將核酸導(dǎo)入胚胎。
一旦將核酸導(dǎo)入卵，例如Hogan等人(1986，《Manipulating theMouse EmbryoA Laboratory Manual》即《小鼠胚胎操作實驗室手冊》，冷泉港，紐約)所述，即將卵短期保溫，然后轉(zhuǎn)移到與卵源相同物種的假孕哺乳動物中。通常，每個實驗注射許多卵，而大約三分之二的卵在流程中存活。然后將大約二十個存活卵轉(zhuǎn)移到假孕動物中，通常四-十個如此轉(zhuǎn)移的存活卵將發(fā)育成活的幼畜。
任何哺乳動物FGF23基因都可用于本文描述的方法，以生成包含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因哺乳動物或轉(zhuǎn)基因細胞，所述轉(zhuǎn)基因包含F(xiàn)GF23基因的整個或部分刪除。優(yōu)選的是，使用諸如小鼠FGF23(SEQ ID NO3)等FGF23基因，也可以使用人FGF23(SEQ ID NO1)基因。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是任何哺乳動物物種。因此，應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明包括編碼嵌合核酸的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的生成，所述哺乳動物包括小鼠、倉鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、和牛。可以使用任何哺乳動物物種而類似的應(yīng)用本文描述的用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。優(yōu)選的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物是嚙齒類，甚至更優(yōu)選的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物是小鼠。作為范例，Lukkarinen等人(1997，Stroke，28639-645)傳授了能夠生成轉(zhuǎn)基因小鼠的基因構(gòu)建物也能夠生成其它轉(zhuǎn)基因嚙齒類，包括大鼠。類似的，一種動物物種基因座中的零合突變能夠在與前一物種具有高度同源基因座的另一物種動物中復(fù)制。
為了鑒定本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，使用標準技術(shù)諸如Southern印跡雜交、PCR、和/或RT-PCR對幼畜檢查分離核酸的存在。還使用本文描述的常用技術(shù)來評估核酸在哺乳動物細胞和組織中的表達。另外，可以如本文公開的(如Western印跡分析)或使用本領(lǐng)域眾所周知的用于檢測蛋白質(zhì)的標準方法來測定FGF23在轉(zhuǎn)基因動物循環(huán)血中的存在與否。
由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得的細胞(也認為是本文中所用使用術(shù)語“轉(zhuǎn)基因細胞”)涵蓋諸如那些由本文其它部分所述FGF23(+/-)和(-/-)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物獲得的細胞，是可用于模擬被認為與FGF23表達水平改變有關(guān)的哺乳動物疾病和癥狀的有用系統(tǒng)。
特別合適的是由本文所述敲除或敲入轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的組織衍生的細胞，其中包含F(xiàn)GF23基因的轉(zhuǎn)基因在多種組織中得到表達或抑制FGF23表達。作為范例，衍生這些細胞的細胞類型包括(1)FGF23(+/+)、(+/-)、和(-/-)轉(zhuǎn)基因活產(chǎn)非人哺乳動物；(2)FGF23(+/+)、(+/-)、或(-/-)哺乳動物胚胎；和(3)由FGF23(+/+)、(+/-)、和(-/-)胎兒和活產(chǎn)哺乳動物獲得的胎盤細胞系的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞。
本發(fā)明還包括由FGF23核酸編碼的分離多肽。由人和小鼠FGF23DNA編碼的氨基酸序列分別提供于本文圖5B和6B及SEQ ID NO2和SEQ ID NO4。如上所述，絕不能解釋為本發(fā)明限于由人和鼠物種分離得到的FGF23。而是，應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明包括具有本文定義的FGF23生物學(xué)活性的任何分離FGF23多肽或其突變體、變體、或同系物。
雖然人和小鼠FGF23蛋白質(zhì)的優(yōu)選氨基酸序列分別是SEQ IDNO2和SEQ ID NO4，但是不應(yīng)解釋為本發(fā)明限于這些序列。而是，應(yīng)當(dāng)解釋為人和小鼠FGF23的氨基酸序列包括具有本文定義的FGF23生物學(xué)活性的任何突變體、變體、或同系物。優(yōu)選的是，F(xiàn)GF23的氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4共享大約40％的序列同一性。更優(yōu)選的是，氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4共享大約50％、甚至更優(yōu)選大約60％、仍然更優(yōu)選大約70％、更優(yōu)選大約80％、甚至更優(yōu)選大約90％、仍然更優(yōu)選95％、甚至更優(yōu)選大約99-100％的同源性。
本發(fā)明還提供了由FGF23基因編碼的蛋白質(zhì)或肽的類似物。正如本文的定義，類似物可以因保守氨基酸序列差異或不影響序列的修飾或二者而與天然存在的蛋白質(zhì)或肽不同。
除了全長肽，本發(fā)明還提供了具有本文定義的FGF23生物學(xué)活性的肽。根據(jù)本文公開的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以使用標準重組技術(shù)來生成FGF23交疊片段，例如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningA Laboratory Manual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，紐約；和Ausubel等人，1997，《CurrentProtocols in Molecular Biology》即《分子生物學(xué)通用方案》，John Wiley& Sons，紐約中所述。根據(jù)本文展示的公開書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以通過將FGF23片段注入小鼠并評估注射后小鼠是否展示磷酸鹽流失來測試FGF23片段的生物學(xué)活性。磷酸鹽流失的誘導(dǎo)將作為FGF23片段保留生物學(xué)活性的指示。另外，可用體外實驗測試FGF23生物學(xué)活性。例如，可以用FGF23片段灌注分離腎小管，并評估相對于野生型FGF23的磷酸鹽轉(zhuǎn)運的改變。類似的，可以用FGF23片段轉(zhuǎn)染擁有必需FGF23信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制(即FGF受體和鈉轉(zhuǎn)運蛋白)的細胞培養(yǎng)物模型，隨后測試相對于野生型FGF23的磷酸鹽轉(zhuǎn)運的改變。
如上所述，本發(fā)明還提供了由FGF23編碼的蛋白質(zhì)或肽的類似物。類似物可以因保守氨基酸序列差異或不影響序列的修飾或二者而與天然存在的蛋白質(zhì)或肽不同。使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)，諸如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningA Laboratory Manual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，紐約；和Ausubel等人，1997，《Current Protocols in Molecular Biology》即《分子生物學(xué)通用方案》，John Wiley & Sons，紐約中所述，任何流程都可用于生成FGF23的突變體、衍生物、或變體形式。
例如，可以進行保守氨基酸變化，盡管它們改變了蛋白質(zhì)或肽的一級序列，然而通常不改變其功能。保守氨基酸替代通常包括下列各組內(nèi)的替代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸(除了蛋白水解酶識別位點以外的位置)；苯丙氨酸、酪氨酸。
修飾(通常不改變一級序列)包括多肽的體內(nèi)或體外化學(xué)衍生化，如乙?；螋然＿€包括糖基化修飾，如在其合成和加工過程中或者在進一步加工步驟中改變多肽的糖基化模式產(chǎn)生的修飾；如將多肽暴露于影響糖基化的酶，如哺乳動物糖基化或去糖基化酶。還涵蓋具有磷酸化氨基酸殘基例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、或磷酸蘇氨酸的序列。
還包括已經(jīng)使用常用分子生物學(xué)技術(shù)進行了修飾的多肽，從而改進了它們對蛋白水解降解的抗性，或優(yōu)化了溶解特性，或使得它們更適合作為治療劑。這些多肽的類似物包括那些包含除了天然存在的L-氨基酸以外的殘基如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的多肽類似物。本發(fā)明的肽不限于本文所列任何特定例示方法的產(chǎn)物。
術(shù)語“FGF23的生物學(xué)活性”在用于本文時指在體內(nèi)或在體外分子結(jié)合FGF受體并改變磷酸鹽轉(zhuǎn)運的能力。根據(jù)本公開書，熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會，本發(fā)明不限于評估FGF23活性的任何具體方法，而且本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域已知的或未來將開發(fā)的評估FGF23活性的任何測定法。
本發(fā)明不僅提供了分離的FGF23蛋白質(zhì)、肽、及其類似物和片段，而且還提供了它們的生成方法。在本發(fā)明的一個方面中，通過在允許合成該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)包含載體的細胞來生成FGF23蛋白質(zhì)、肽、及其類似物和片段，其中所述載體包含F(xiàn)GF23核酸?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段包括層析、親和、和基于免疫學(xué)的分離(如使用抗FGF23抗體)來進行重組生成的FGF23蛋白質(zhì)、多肽、片段、等的分離和純化。這每一種方法都描述于標準教科書，諸如Sambrook等人，1989，《MolecularCloningA Laboratory Manual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約；Ausubel等人，1997，《Current Protocols in MolecularBiology》即《分子生物學(xué)通用方案》，John Wiley & Sons，紐約；和Gerhardt等人編，1994，《Methods for General and MolecularBacteriology》即《普通和分子細菌學(xué)方法》，美國微生物學(xué)學(xué)會，華盛頓特區(qū)。
本發(fā)明還包括可特異結(jié)合FGF23的抗體或其片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括可抑制FGF23的生物學(xué)活性的抗體。該抗體可用于在診斷性測定法中鑒定FGF23，用于在患有與FGF23水平有關(guān)的疾病的哺乳動物中測定FGF23水平。另外，正如本文所述，特異結(jié)合FGF23的抗體可用于阻斷FGF23與其相關(guān)受體之間的相互作用，因而可用于在FGF23相關(guān)疾病治療的治療狀況中。
已經(jīng)鑒定了FGF23的兩種受體，包括FGFR2和FGFR4；然而，沒有理由相信這些是唯一的兩種FGF23受體。為了鑒定其它FGF受體，可以采用下列測定法?？梢允褂脴藴实鞍踪|(zhì)結(jié)合測定法來檢測FGF23與其受體的結(jié)合，包括使用固定化的蛋白質(zhì)A來沉淀商品化FGF受體-Fc嵌合物。另外，可以通過本領(lǐng)域的標準方法來篩選表達文庫，從而檢測FGF23與除那些已知結(jié)合FGF的受體以外的受體的結(jié)合。因此，通過本文提供的下列實驗，可以鑒定其它FGF23受體。
通過本文描述的遺傳或非遺傳手段，對患者施用FGFR2和FGFR4或其它FGF23受體，可以抑制FGF23的相互作用及隨后的激活，從而治療低血磷。同樣，阻斷FGF23與其受體相互作用的抗體和其它小分子可以通過結(jié)合FGF23或其受體來發(fā)揮抑制FGF23活性的功能。根據(jù)本文呈現(xiàn)的公開書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以使用許多較好表征的蛋白質(zhì)結(jié)合測定法之一通過對化合物篩選它們阻斷FGF23與其受體相互作用的能力來鑒定FGF23受體阻斷劑。
可特異結(jié)合FGF23的抗體的生成描述于本文的實驗詳述部分。然而，不應(yīng)解釋為本發(fā)明只限于那些本文具體公開的抗體，而是應(yīng)當(dāng)包括能夠生成的特異結(jié)合FGF23的任何和所有抗體。例如，通過給期望動物接種抗原并由其分離特異結(jié)合該抗原的抗體來實現(xiàn)多克隆抗體的生成。
可以使用任何眾所周知的單克隆抗體制備流程來制備針對蛋白質(zhì)或肽的全長或肽片段的單克隆抗體，諸如Harlow等人，1988，《AntibodiesA Laboratory Manual》即《抗體實驗室手冊》，冷泉港，紐約；和Tuszynski等人，1988，Blood，72109-115中所述。還可以使用化學(xué)合成技術(shù)來合成多種期望肽?；蛘撸梢钥寺【幋a期望肽的DNA，并在適用于生成大量肽的細胞中由適當(dāng)?shù)膯幼有蛄羞M行表達。使用本文提及的標準流程，由經(jīng)肽免疫的小鼠生成針對該肽的單克隆抗體。
可以使用本領(lǐng)域可用技術(shù)對使用本文所述流程獲得的單克隆抗體的編碼核酸進行克隆和測序，所述技術(shù)描述于例如Wright等人，1992，Critical Rev.in Immunol.，12(3，4)125-168及其引用的參考文獻。另外，可以使用Wright等人，同上，及其引用的參考文獻；和Gu等人，1997，Thrombosis and Hematocyst，77(4)755-759中描述的技術(shù)將本發(fā)明的抗體“人源化”。
為了生成噬菌體抗體文庫，首先由分離自細胞如雜交瘤的mRNA獲得cDNA文庫，所述細胞表達期望表達在噬菌體表面的目的蛋白質(zhì)，如期望抗體。使用逆轉(zhuǎn)錄酶生成mRNA的cDNA拷貝。通過PCR獲得編碼免疫球蛋白片段的cDNA，并將得到的DNA克隆到合適的噬菌體載體中以生成包含編碼免疫球蛋白基因的DNA的噬菌體DNA文庫。用于生成包含異源DNA的噬菌體文庫的流程在本領(lǐng)域是眾所周知的，描述于例如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningA LaboratoryManual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約。
可以改造編碼期望抗體的噬菌體，使得蛋白質(zhì)展示在其表面，從而能夠結(jié)合其相應(yīng)結(jié)合蛋白，如抗體所針對的抗原。因此，在將表達特定抗體的噬菌體與表達相應(yīng)抗原的細胞一起保溫時，噬菌體將結(jié)合細胞。不表達抗體的噬菌體將不結(jié)合細胞。這種淘選技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知，描述于例如Wright等人，同上。
已經(jīng)開發(fā)了使用M13噬菌體展示來生成人抗體的流程，諸如上文所述(Burton等人，1994，Adv.Immunol.，57191-280)。本質(zhì)上，由得自抗體生成細胞群體的mRNA生成cDNA文庫。mRNA編碼重排后的免疫球蛋白基因，因此cDNA編碼相同基因。將擴增后的cDNA克隆到M13表達載體中，生成在其表面表達人Fab片段的噬菌體文庫。通過抗原結(jié)合選擇展示目的抗體的噬菌體，并在細菌中繁殖以生成可溶性人Fab免疫球蛋白。因此，與常規(guī)單克隆抗體合成相反，該流程使編碼人免疫球蛋白的DNA永生化，而非表達人免疫球蛋白的細胞。
剛才展示的流程描述了編碼抗體分子Fab片段的噬菌體的生成。然而，不應(yīng)解釋為本發(fā)明只限于編碼Fab抗體的噬菌體的生成。而是，本發(fā)明還包括編碼單鏈抗體(scFv/噬菌體抗體庫)的噬菌體。Fab分子包含完整的Ig輕鏈，即它們包含輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)二者，但是只包含重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CH1)。單鏈抗體分子包含單鏈蛋白質(zhì)，它包含IgFv片段。IgFv片段只包含抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其中不含恒定區(qū)。可以遵循Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，222581-597中描述的流程來生成包含scFv DNA的噬菌體文庫。為了分離期望抗體，可以與關(guān)于包含F(xiàn)ab DNA的噬菌體文庫所述相似的方式來進行對如此生成的噬菌體的淘選。
還應(yīng)解釋為本發(fā)明包括合成噬菌體展示文庫，其中可以合成重鏈和輕鏈可變區(qū)，使得它們包含幾乎所有可能的特異性(Barbas，1995，Nature Medicine，1837-839；de Kruif等人，1995，J.Mol.Biol.，24897-105)。
本發(fā)明還包括突變型FGF23。即本發(fā)明涵蓋編碼突變型FGF23的分離核酸及由其編碼的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明意欲影響FGF23蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或穩(wěn)定性的所有突變。優(yōu)選的是，突變與低血磷或高血磷狀況有關(guān)，這些狀況中的一些可能是可遺傳的，諸如ADHR，正如本文展示的資料所證明的。正如本文實驗詳述部分所證明的，幾種突變型FGF23使得FGF23比這種蛋白質(zhì)天然存在的野生型更加穩(wěn)定。這些穩(wěn)定型FGF23因而可作為治療性化合物用于治療因血清磷酸鹽水平升高而引起的FGF23相關(guān)疾病。本發(fā)明還涵蓋包含編碼(更加)穩(wěn)定型FGF23的核酸的載體(包括那些其中所述核酸可操作連接啟動子/調(diào)控元件的載體)和細胞。
正如本文所公開的，已經(jīng)鑒定了FGF23中導(dǎo)致FGF23蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高的突變。據(jù)顯示，這些突變(包括但不限于R176Q、R179W、和R179Q)通過消除共有的蛋白酶切割位點從而抑制蛋白質(zhì)降解來升高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。這些突變型FGF23的半衰期延長就治療高血磷狀況而言是一個明顯的優(yōu)點，因為有效治療所必需的突變型FGF23施用頻率可能顯著低于天然FGF23。用任何氨基酸替代位于第176位和第179位任一的精氨酸的替代突變也將升高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。不應(yīng)解釋為本發(fā)明只限于本文所例示的突變。在本文的實驗詳述部分中，提供了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定FGF23基因中的其它突變的足夠傳授，其中突變型FGF23與野生型FGF23相比可能具有增強的穩(wěn)定性等。
本發(fā)明提供了能夠在哺乳動物的細胞或體液中調(diào)控FGF23表達和/或活性的分子。
哺乳動物優(yōu)選人。
術(shù)語FGF23活性的“調(diào)控劑”在用于本文時指影響本文定義的FGF23生物學(xué)活性的化合物，其中存在調(diào)控劑時的FGF23活性高于或低于缺乏該調(diào)控劑時的FGF23活性。
因此，調(diào)控劑可以是FGF23表達或活性的抑制劑或增強劑。抑制FGF23表達的調(diào)控劑包括但不限于可結(jié)合和/或切割FGF23編碼核酸的反義核酸和核酶。
本發(fā)明提供了用于降低或消除FGF23蛋白質(zhì)分子的FGF23抑制劑。這些抑制劑可以是上文所述的反義核酸或核酶。抑制劑還可以是用于通過RNA干擾來降低FGF23 mRNA水平的雙鏈RNA分子(Elbashir等人，2001，Nature，411428-429；Carthew，2001，Curr.Opin.Cell Biol.，13244-248)。
本發(fā)明還提供了用于抑制FGF23生物學(xué)活性的FGF23抑制劑，包括但不限于阻斷FGF23與其受體相互作用的分子或抑制FGF23受體激活的分子。具體范例包括但不限于FGFR2、FGFR4、和其它FGF23受體，以及可結(jié)合FGF23或其受體從而抑制FGF23生物學(xué)活性的抗體、肽、和肽模擬物。因此，本發(fā)明涵蓋任何類型的FGF23抑制劑，其中抑制劑抑制FGF23的表達或生物學(xué)活性。
根據(jù)本文公開的FGF23序列，熟練技術(shù)人員可以生成可用作FGF23的抑制劑的肽模擬物和其它小分子。具體而言，可以使用PCT/US93/01201中描述的技術(shù)來生成肽模擬物。
在參考本公開內(nèi)容的情況下，鑒定FGF23表達或其生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)劑就成了相對簡單的工作。例如，可以使天然表達FGF23或在轉(zhuǎn)染FGF23編碼核酸后表達FGF23的細胞接觸待測化合物。然后測量存在或缺乏待測化合物時的FGF23表達水平，其中存在待測化合物時的FGF23表達水平高于或低于缺乏待測化合物時的FGF23表達水平指示待測化合物是FGF23表達的調(diào)控劑。若存在待測化合物時的FGF23表達水平高于缺乏待測化合物時的FGF23表達水平，則認為待測化合物是FGF23表達的增強劑。相反，若存在待測化合物時的FGF23表達水平低于缺乏待測化合物時的FGF23表達水平，則認為待測化合物是FGF23表達的抑制劑。
類似的，可以測量哺乳動物細胞、血清、或尿液中的FGF23生物學(xué)活性。在這種情況中，測量存在或缺乏待測化合物時由細胞生成的FGF23生物學(xué)活性水平，其中存在待測化合物時的FGF23活性水平高于或低于缺乏待測化合物時的FGF23活性水平指示待測化合物是FGF23生物學(xué)活性的調(diào)控劑。若存在待測化合物時的FGF23活性水平高于缺乏待測化合物時的FGF23活性水平，則認為待測化合物是FGF23生物學(xué)活性的增強劑。相反，若存在待測化合物時的FGF23活性水平低于缺乏待測化合物時的FGF23活性水平，則認為待測化合物是FGF23生物學(xué)活性的抑制劑。
可以使用任何普通分子生物學(xué)技術(shù)來測量FGF23表達，例如使用RT-PCR技術(shù)、RNA酶保護、Northern印跡、等等?；蛘?，可以通過可操作連接FGF23啟動子序列與合適的報道基因并用得到的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細胞來測量對表達的影響?？梢酝ㄟ^測量接觸待測化合物的細胞中的報道基因表達水平，并將這些細胞中的報道基因表達水平與不接觸待測化合物的細胞進行比較來測量應(yīng)答待測化合物的啟動子活性。合適的報道基因包括但不限于β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白、等等。
本發(fā)明提供了用于生成具有本文定義的FGF23生物學(xué)活性的分離多肽的方法。該方法包括在允許合成該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)包含編碼FGF23的載體的宿主細胞。隨后由培養(yǎng)后的細胞和/或培養(yǎng)后的培養(yǎng)基分離蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段包括制備性層析、親和、和免疫學(xué)分離(涉及使用特異結(jié)合FGF23的抗體的親和層析)來進行重組生成的蛋白質(zhì)的分離和純化。
本發(fā)明提供了診斷受試者體內(nèi)的低血磷和高血磷紊亂的方法。在本文提供的一個范例中，資料證明患有ADHR的患者在FGF23中具有突變，而且FGF23可作為診斷工具用于檢測ADHR。本文例示的方法包括使由患者獲得的生物學(xué)樣品接觸檢測FGF23(或FGF23突變)的試劑(其或是編碼蛋白質(zhì)的核酸或是蛋白質(zhì)自身)。在樣品中檢測到或未檢測到FGF23即可診斷FGF23相關(guān)低血磷和高血磷狀況。
由受試者獲得的生物學(xué)樣品可以是其中可以檢測FGF23核酸或蛋白質(zhì)的任何流體或組織。優(yōu)選的是，樣品是血液或尿液。然而，不應(yīng)解釋為本發(fā)明限于由受試者獲得的任何具體生物學(xué)樣品。
用于檢測FGF23核酸的優(yōu)選試劑包括但不限于與編碼FGF23的核酸互補的核酸。用于檢測FGF23蛋白質(zhì)的優(yōu)選試劑包括但不限于抗體。進一步優(yōu)選的是，這些試劑經(jīng)過標記而便于檢測FGF23核酸或蛋白質(zhì)。根據(jù)本公開書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以使用多種合適標記物來標記用于檢測FGF23的試劑，包括放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物、或酶。
本發(fā)明還包括低血磷狀況的血清、血漿、或其它血液測定法，以及尿液或其它體液測定法。這些測定法可用于診斷患有上文所列低血磷疾病的患者。FGF23測定法是設(shè)計用于測量對應(yīng)于FGF23片段的特定肽及FGF23的競爭性測定法。該測定法基于經(jīng)標記125I-FGF23肽與未標記肽(標準或未知數(shù)量的含F(xiàn)GF23體液)在每個反應(yīng)混合物中結(jié)合有限數(shù)量的FGF23肽特異性抗體的競爭。隨著反應(yīng)中標準或未知數(shù)量的增加，能夠結(jié)合抗體的125I-FGF23肽數(shù)量減少。通過測量125I-FGF23肽的數(shù)量作為標準反應(yīng)混合物中未標記FGF23肽濃度的函數(shù)，繪制標準曲線，由此可以測定體液中FGF23的濃度。
上文描述的競爭測定法設(shè)計用于量化患者生物學(xué)樣品中存在的FGF23水平。通過比較指定患者樣品中的FGF23多肽水平與已知未患有磷酸鹽紊亂的患者，F(xiàn)GF23水平升高可用于指示指定患者患有低血磷紊亂。該測定法可用于許多低血磷紊亂，包括那些尚無遺傳診斷手段的低血磷紊亂?？墒褂迷摐y定法的低血磷疾病包括XLH、HHRH、HBD、ADHR、由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、和腎結(jié)石。例如，正如本文公開的，ADHR患者的FGF23水平將因該蛋白質(zhì)中抑制其降解的突變而升高。
本發(fā)明還包括診斷患者體內(nèi)由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的方法，其中患者腫瘤樣品中FGF23的存在指示該疾病，正如本文公開的。可以將由患者切除的腫瘤樣品進行設(shè)計用于檢測FGF23的多種方法，包括但不限于RT-PCR、Northern印跡分析、和RNA酶保護測定法。因此，可以使用這種基于FGF23的流程而更加確定的診斷表現(xiàn)由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的臨床癥狀的患者。
本發(fā)明提供了治療患病動物體內(nèi)的低血磷疾病的方法，其中對哺乳動物施用治療有效量的降低FGF23表達和/或生物學(xué)活性的試劑?？梢灾委煹牡脱准膊“ǖ幌抻赬連鎖低血磷佝僂病(XLH)、伴隨高鈣尿的遺傳性低血磷佝僂病(HHRH)、低血磷骨病(HBD)、常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)、由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化(TIO)或致癌低血磷骨軟化(OHO)、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、腎結(jié)石、等等。正如本文公開的，低血磷疾病可以表征為FGF23的過度表達、降解FGF23的酶的突變或其它抑制、或FGF23中升高該蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的突變，所有這些都導(dǎo)致磷酸鹽流失升高并伴隨血清磷酸鹽水平降低。因此，降低FGF23表達和/或生物學(xué)活性的試劑將在低血磷患者中恢復(fù)正常的磷酸鹽穩(wěn)態(tài)。降低FGF23表達的試劑的范例包括但不限于反義核酸和核酶。降低FGF23生物學(xué)活性的試劑的范例包括但不限于阻斷FGF23與其受體之間相互作用的抗體和其它小分子。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷疾病的方法，其中對該哺乳動物施用治療有效量的FGF23(或是核酸或是由其編碼的多肽)或可升高FGF23多肽水平的試劑?？缮逨GF23多肽水平的試劑的范例是蛋白酶抑制劑。正如本文展示的實施例中所述，F(xiàn)GF23受到SPC蛋白酶的降解，而且抑制SPC對FGF23的切割可延長其半衰期，導(dǎo)致FGF23水平升高。可以治療的高血磷疾病包括但不限于輕度腎機能不全、腫瘤性鈣沉積、等等。可以通過施用FGF23或升高FGF23水平的試劑來克服高血磷患者中升高的血清磷酸鹽水平，二者都刺激磷酸鹽流失，從而降低血清磷酸鹽水平。可以通過標準基因治療方法及直接注射FGF23多肽來施用FGF23，注射方法包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、和肌肉內(nèi)注射。應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明包括天然FGF23及突變型FGF23的施用，包括但不限于本文公開的用于升高FGF23蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的突變體。
本發(fā)明還包括使用治療有效量的表達FGF23的細胞群體來治療高血磷疾病的方法。該方法可能是施用FGF23的有效方法，因為，正如本文所示，F(xiàn)GF23是分泌型蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括為此目的施用表達突變型FGF23多肽的細胞。優(yōu)選突變包括那些賦予FGF23多肽以升高的穩(wěn)定性的突變，諸如本文公開的突變。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物體內(nèi)的骨質(zhì)疏松的方法，其中對哺乳動物施用治療有效量的FGF23或升高FGF23表達的試劑?；加械脱准膊LH的患者遭受骨折的頻率低于沒有該疾病的患者(Econs等人，1994，Bone and Min.，2417-24)。施用FGF23或升高FGF23水平的試劑將引起瞬時低磷血，并伴隨對骨骼密度和強度的影響。因此，除了它在調(diào)控磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中的作用，F(xiàn)GF23在體內(nèi)可能還具有骨硬化功能。低磷血導(dǎo)致骨量增加的機制可能牽涉1，25-二羥基維生素D，但這并不意味著局限于這一理論。具體而言，間歇施用FGF23(或突變型FGF23)或升高FGF23表達的試劑可以瞬時降低磷酸鹽再吸收，這是一種刺激磷酸鹽再吸收升高和1，25-二羥基維生素D(多種骨病的有效治療劑)生成升高的反應(yīng)。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物體內(nèi)牽涉鈣和磷酸鹽在動脈或軟組織中沉積的狀況，其中對哺乳動物施用治療有效量的FGF23(或突變型FGF23)或升高FGF23表達的試劑，正如下文所述。由于血清磷酸鹽水平升高，患有輕度腎機能不全的患者常常展示鈣和磷酸鹽在他們的冠狀動脈及其它動脈中沉積。鈣和磷酸鹽二者在動脈壁中的沉積(稱為冠狀動脈病)引起通過這些動脈的血流減慢，而且能夠?qū)е滦募」ＨＲ虼?，冠狀動脈病的治療將降低形成心肌梗塞的風(fēng)險。
FGF23或升高FGF23水平的試劑將降低血清磷酸鹽水平，從而保護高血磷患者免于心血管和冠狀動脈病的加快?？梢酝ㄟ^包括但不限于基因治療的方法將編碼FGF23的核酸投遞至冠狀動脈細胞。另外，組織特異性啟動子的使用可以促進FGF23在血管平滑肌細胞或內(nèi)皮細胞中的選擇性表達。
類似的，F(xiàn)GF23或升高FGF23水平的試劑可用于治療牽涉鈣和磷酸鹽在軟組織中沉積的其它狀況，包括但不限于皮肌炎和腫瘤性鈣沉積。腫瘤性鈣沉積是特征為腎磷酸鹽再吸收升高和1，25-二羥基維生素D濃度升高的疾病。結(jié)果，患者形成軟組織鈣化，即鈣和磷酸鹽的沉積。使用本文所述任何手段對軟組織施用天然或突變型FGF23將逆轉(zhuǎn)這些生化缺陷。
本發(fā)明包括多種試劑盒，它們包含諸如編碼FGF23的核酸、特異結(jié)合FGF23的抗體、與編碼FGF23的核酸互補但就轉(zhuǎn)錄而言處于反義取向的核酸、和/或本發(fā)明的組合物、施用器、和描述使用該化合物來進行本發(fā)明方法的指導(dǎo)材料。雖然下文描述了例示性試劑盒，但是根據(jù)本公開書其它有用試劑盒的內(nèi)容對于熟練技術(shù)人員而言將是顯而易見的，它們都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
一方面，本發(fā)明包括用于減輕由FGF23不當(dāng)表達介導(dǎo)的疾病的試劑盒。依照本發(fā)明公開的方法使用試劑盒。簡而言之，試劑盒可用于使細胞接觸與編碼FGF23的核酸互補且就轉(zhuǎn)錄而言處于反義取向的核酸以降低FGF23表達，或可特異結(jié)合FGF23的抗體，其中FGF23表達、數(shù)量、或活性的降低介導(dǎo)有益作用。此外，試劑盒包含施用器和使用試劑盒的指導(dǎo)材料。這些指示僅僅收錄了本文提供的實例。
試劑盒包含制藥學(xué)可接受載體。以本文其它部分所列適當(dāng)量提供組合物。另外，施用路徑和施用頻率如本文其它部分先前所列。
根據(jù)本文提供的公開書，熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會，本發(fā)明涵蓋包含核酶、反義組合物、特異結(jié)合FGF23的抗體、等等以降低FGF23水平的試劑盒。
另外，本發(fā)明包括包含編碼哺乳動物FGF23的核酸的試劑盒。在需要升高FGF23的任何情況下，可以依照本發(fā)明的方法使用這種試劑盒。即，當(dāng)疾病、紊亂、或狀況與FGF23水平相對于正常的、無病的FGF23水平降低有關(guān)或由其介導(dǎo)時，可以依照本文其它部分公開的傳授使用試劑盒，從而向FGF23水平低于相同但正常(即無病)的細胞的細胞和/或包含這種細胞的動物提供FGF23。本文公開的比非突變型更加穩(wěn)定的突變型FGF23在這種試劑盒中特別有用。制藥學(xué)組合物本發(fā)明還涵蓋適當(dāng)FGF23調(diào)控劑的制藥學(xué)組合物用于實踐本發(fā)明方法的用途，該組合物包含適當(dāng)FGF23調(diào)控劑和制藥學(xué)可接受載體。
在用于本文時，術(shù)語“制藥學(xué)可接受載體”指可以聯(lián)合適當(dāng)FGF23調(diào)控劑且在聯(lián)合后可用于對哺乳動物施用該適當(dāng)FGF23調(diào)控劑的化學(xué)組合物。
可以1ng-100mg/kg/d的劑量來施用/投遞可用于實踐本發(fā)明的制藥學(xué)組合物。
可以在口服固態(tài)配方、氣霧劑、局部、或其它相似配方中全身施用可用于本發(fā)明方法的制藥學(xué)組合物。除了適當(dāng)FGF23調(diào)控劑，這些制藥學(xué)組合物還可包含制藥學(xué)可接受載體和已知增強和促進藥物施用的其它成分。其它可能配方，諸如納米微粒、脂質(zhì)體、重封(resealed)紅血球、和基于免疫學(xué)的系統(tǒng)，也可用于依照本發(fā)明方法來施用適當(dāng)FGF23調(diào)控劑。
現(xiàn)在描述，可以配制使用本文所述任何方法鑒定的化合物，并施用于哺乳動物來治療本文公開的疾病。
本發(fā)明涵蓋制藥學(xué)組合物的制備和使用，所述制藥學(xué)組合物包含可用于治療本文公開的疾病的化合物作為活性成分。這種制藥學(xué)組合物可以只由活性成分組成，其中活性成分采取適用于施用于受試者的形式，或者制藥學(xué)組合物可以包含活性成分和一種或多種制藥學(xué)可接受載體、一種或多種額外成分、或其組合?；钚猿煞挚梢陨韺W(xué)可接受的酯或鹽的形式存在于制藥學(xué)組合物中，諸如聯(lián)合生理學(xué)可接受的陽離子或陰離子，正如本領(lǐng)域眾所周知的。
在用于本文時，術(shù)語“制藥學(xué)可接受載體”指可以聯(lián)合活性成分且在聯(lián)合后可用于對受試者施用活性成分的化學(xué)組合物。
在用于本文時，術(shù)語“生理學(xué)可接受”的酯或鹽指與制藥學(xué)組合物中的任何其它成分相容且對將要接受組合物的受試者無害的活性成分的酯或鹽形式。
可以通過藥物學(xué)領(lǐng)域已知的或以后開發(fā)的任何方法來制備本文所述制藥學(xué)組合物的配方。一般而言，這些制備方法包括將活性成分聯(lián)合載體或者一種或多種其它附加成分的步驟，然后(如果需要或希望)將產(chǎn)物成形或包裝成期望的單劑或多劑單位。
雖然本文提供的制藥學(xué)組合物的描述主要針對適用于人的處方施用的制藥學(xué)組合物，但是熟練技術(shù)人員將理解，這些組合物通常適用于對所有類型的動物的施用。很好理解可以更改適合施用于人的制藥學(xué)組合物使之適合施用于各種動物，而且普通熟練獸醫(yī)藥物學(xué)家只通過普通(如果有的話)實驗就能夠設(shè)計并進行這種更改。本發(fā)明所關(guān)注的將要接受本發(fā)明制藥學(xué)組合物的受試者包括但不限于人和其它靈長類和其它哺乳動物。
可以適用于口服、胃腸外、肺部、鼻內(nèi)、口腔、或其它施用路徑的配方的形式來制備、包裝、或銷售可用于本發(fā)明方法的制藥學(xué)組合物。關(guān)注的其它配方包括噴射的納米微粒、脂質(zhì)體制劑、包含活性成分的重封紅血球、和基于免疫學(xué)的配方。
可以散裝、單一單位劑量、或多個單一單位劑量的形式來制備、包裝、或銷售本發(fā)明的制藥學(xué)組合物。在用于本文時，“單位劑量”指包含預(yù)定數(shù)量的活性成分的離散數(shù)量的制藥學(xué)組合物。活性成分的數(shù)量通常等于將要施用于受試者的活性成分的劑量或其方便分數(shù)，諸如這種劑量的二分之一或三分之一。
根據(jù)接受治療的受試者的身份、身材和狀況，進一步根據(jù)施用組合物的路徑，本發(fā)明制藥學(xué)組合物中活性成分、制藥學(xué)可接受載體、和任何額外成分的相對數(shù)量將發(fā)生變化。作為范例，組合物可以包含0.1-100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分，本發(fā)明的制藥學(xué)組合物還可包含一種或多種額外的制藥學(xué)活性試劑。特別關(guān)注的額外試劑包括止吐劑和凈化劑諸如氰化物和氰酸鹽凈化劑。
可以使用常規(guī)技術(shù)來生成本發(fā)明制藥學(xué)組合物的受控或緩釋配方。
可以離散固態(tài)劑量單位的形式來制備、包裝、或銷售適合于口服施用的本發(fā)明制藥學(xué)組合物的配方，包括但不限于片劑、硬或軟膠囊、扁囊劑、錠劑、或糖錠，每一個都包含預(yù)定數(shù)量的活性成分。適用于口服施用的其它配方包括但不限于粉狀或粒狀配方、水性或油性懸浮液、水性或油性溶液、或乳劑。
在用于本文時，“油性”液體指包含含碳液態(tài)分子且展示極性小于水的液體。
例如，可以通過活性成分(任選與一種或多種額外成分一起)的壓制或模制來生成包含活性成分的片劑。可以通過在合適裝置中壓制活性成分的自由流動形式諸如粉狀或粒狀制劑(任選混合一種或多種粘合劑、潤滑劑、賦形劑、表面活性劑、和分散劑)來制備壓制片劑?？梢酝ㄟ^在合適裝置中模制活性成分、制藥學(xué)可接受載體、和至少足以弄濕化合物的液體的混合物來生成模制片劑。用于制造片劑的制藥學(xué)可接受賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑、?；捅郎⒄澈蟿?、和潤滑劑。已知的分散劑包括但不限于馬鈴薯淀粉和淀粉乙醇酸鈉(sodium starch glycollate)。已知的表面活性劑包括但不限于月桂基硫酸鈉。已知的稀釋劑包括但不限于碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、微晶纖維素、磷酸鈣、磷酸氫鈣、和磷酸鈉。已知的?；捅郎┌ǖ幌抻谟衩椎矸酆驮逅?。已知的粘合劑包括但不限于明膠、阿拉伯膠、預(yù)膠凝玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、和羥丙基甲基纖維素。已知的潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、硅土、和滑石粉。
片劑可以是未包被的，或者可以使用已知方法進行包被以實現(xiàn)在受試者胃腸道中的分解延遲，從而提供活性成分的緩釋和吸收。作為范例，可以將諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等物質(zhì)用于包被片劑。進一步作為范例，可以使用美國專利號4,256,108、4,160,452、和4,265,874中描述的方法來包被片劑，形成釋放受到滲透控制的片劑。片劑還可包含甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑、或其組合，以提供制藥學(xué)上悅目且可口的制劑。
可以使用生理學(xué)可降解組合物諸如明膠來生成包含活性成分的硬膠囊。這些硬膠囊包含活性成分，而且還可以額外成分，包括例如惰性固態(tài)稀釋劑，諸如碳酸鈣、磷酸鈣、或高嶺土。
可以使用生理學(xué)可接受組合物諸如明膠來生成包含活性成分的軟明膠膠囊。這些軟膠囊包含活性成分，而且它可以混合水或油介質(zhì)，諸如花生油、液體石蠟、或橄欖油。
可以液態(tài)形式或意欲在使用前與水或其它合適載體進行重建的干燥產(chǎn)品的形式來制備、包裝、和銷售適合于口服施用的本發(fā)明制藥學(xué)組合物的液態(tài)配方。
可以使用常規(guī)方法來制備液態(tài)懸浮液，以實現(xiàn)活性成分在水性或油性載體中的懸浮。水性載體包括例如水和等滲鹽水。油性載體包括例如杏仁油、油酯、乙醇、植物油諸如落花生、橄欖、芝麻、或椰子油、分餾植物油、和礦物油諸如液體石蠟。液態(tài)懸浮液還可以包含一種或多種額外成分，包括但不限于懸浮劑、分散或潤濕劑、乳化劑、緩和劑、防腐劑、緩沖劑、鹽、調(diào)味劑、著色劑、和甜味劑。油性懸浮液還可以包含增稠劑。已知懸浮劑包括但不限于山梨糖醇糖漿、氫化食用脂肪、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、和纖維素衍生物諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素。已知分散或潤濕劑包括但不限于天然存在的磷脂諸如卵磷脂、烯基氧化物與脂肪酸、與長鏈脂肪醇、與由脂肪酸與己糖醇衍生的部分酯、或與由脂肪酸與己糖醇酐衍生的部分酯的縮合產(chǎn)物(分別是例如聚氧乙烯硬脂酸酯、十七烷基乙烯氧十六烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯、和聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)。已知乳化劑包括但不限于卵磷脂和阿拉伯樹膠。已知防腐劑包括但不限于對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、或正丙酯、抗壞血酸、和山梨酸。已知甜味劑包括例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖、和糖精。用于油性懸浮液的已知增稠劑包括例如蜂蠟、固體石蠟、和十六醇。
可以與液態(tài)懸浮液基本上相同的方式來制備活性成分在水性或油性溶劑中的液態(tài)溶液，主要區(qū)別在于活性成分是溶解而非懸浮于溶劑中。本發(fā)明制藥學(xué)組合物的液態(tài)溶液可以包含就液態(tài)懸浮液而言描述的每一種成分，可以理解，懸浮劑將不再是幫助活性成分溶于溶劑所必需的。水性溶劑包括例如水和等滲鹽水。油性溶劑包括例如杏仁油、油酯、乙醇、植物油諸如落花生、橄欖、芝麻、或椰子油、分餾植物油、和礦物油諸如液體石蠟。
可以使用已知方法來制備本發(fā)明制藥學(xué)制劑的粉狀和粒狀配方。這些配方可以直接施用于受試者，用于例如形成片劑、填充膠囊、或通過向其添加水性或油性載體來制備水性或油性懸浮液或溶液。這每一種配方還可包含一種或多種分散或潤濕劑、懸浮劑、和防腐劑。這些配方還可包含額外賦形劑，諸如填充物和甜味劑、調(diào)味劑、或著色劑。
還可以水包油乳劑或油包水乳劑的形式來制備、包裝、或銷售本發(fā)明的制藥學(xué)組合物。油相可以是植物油諸如橄欖或落花生油、礦物油諸如液體石蠟、或其組合。這些組合物還可包含一種或多種乳化劑諸如天然存在的樹膠諸如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠、天然存在的磷脂諸如黃豆或卵磷脂、由脂肪酸與己糖醇酐的組合衍生的酯或部分酯諸如山梨聚糖單油酸酯、和這些部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物諸如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。這些乳劑還可包含額外成分，包括例如甜味劑或調(diào)味劑。
在用于本文時，制藥學(xué)組合物的“胃腸外施用”包括特征為在物理上破壞受試者的組織并通過組織中的缺口施用制藥學(xué)組合物的任何施用路徑。因此，胃腸外施用包括但不限于通過注射組合物、經(jīng)手術(shù)切口應(yīng)用組合物、經(jīng)穿透組織的非手術(shù)傷口應(yīng)用組合物、等等來施用制藥學(xué)組合物。具體而言，胃腸外施用試圖包括但不限于皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射，和腎透析灌輸技術(shù)。
適用于胃腸外施用的制藥學(xué)組合物的配方包含聯(lián)合制藥學(xué)可接受載體諸如水或無菌等滲鹽水的活性成分?？梢詥挝粍┝啃问絹碇苽洹b、或銷售這些配方，諸如含有防腐劑的安瓿或多劑量容器。用于胃腸外施用的配方包括但不限于懸浮液、溶液、水性或油性載體中的乳劑、糊劑、和可植入緩釋或生物可降解配方。這些配方還可包含一種或多種額外成分，包括但不限于懸浮、穩(wěn)定、或分散劑。在用于胃腸外施用的配方的一個實施方案中，提供干燥(即粉狀或粒狀)形式的活性成分用于在胃腸外施用下述重建組合物前與合適載體(如無菌無熱原水)一起進行重建。
可以無菌可注射水性或油性懸浮液或溶液的形式來制備、包裝、或銷售制藥學(xué)組合物?？梢砸勒找阎夹g(shù)來配制這種懸浮液或溶液，而且除了活性成分，還可包含本文所述額外成分，諸如分散劑、潤濕劑、或懸浮劑。可以使用無毒胃腸外可接受稀釋劑或溶劑諸如水或1，3-丁二醇來制備這些無菌可注射配方。其它可接受稀釋劑和溶劑包括但不限于Ringer氏溶液、等滲氯化鈉溶液、和不揮發(fā)性油諸如合成的甘油單酯或二酯。有用的其它胃腸外可施用配方包括那些以微晶形式、在脂質(zhì)體制劑中、或作為生物可降解聚合物系統(tǒng)的成分包含活性成分的配方。用于緩釋或植入的組合物可以包含制藥學(xué)可接受的聚合或疏水物質(zhì)諸如乳劑、離子交換樹脂、弱可溶性聚合物、或弱可溶性鹽。
可以適合于經(jīng)口腔進行肺部施用的配方來制備、包裝、或銷售本發(fā)明的制藥學(xué)組合物。這種配方可以包含干燥顆粒，它包含活性成分，而且直徑范圍為大約0.5-7納米，優(yōu)選大約1-6納米。這些組合物方便地采取干粉的形式，并使用包含干粉儲存器(并向其通入一股推進劑以分散粉劑)的裝置或使用自身推進性溶劑/粉劑分散容器諸如在密封容器中包含溶解或懸浮于低沸推進劑中的活性成分的裝置進行施用。優(yōu)選的是，這些粉劑包含這樣的微粒，其中至少98％(指重量)的微粒的直徑大于0.5納米且至少95％(指數(shù)量)的微粒的直徑小于7納米。更優(yōu)選的是，至少95％(指重量)的微粒的直徑大于1納米且至少90％(指數(shù)量)的微粒的直徑小于6納米。干粉組合物優(yōu)選包含固態(tài)細粉稀釋劑諸如糖，而且方便的以單位劑量形式提供。
低沸推進劑通常包括在大氣壓力下的沸點低于65°F的液態(tài)推進劑。通常，推進劑可以占到組合物的50-99.9％(w/w)，而活性劑可以占到組合物的0.1-20％(w/w)。推進劑還可包含額外成分，諸如液態(tài)非離子或固態(tài)陰離子表面活性劑，或固態(tài)稀釋劑(優(yōu)選微粒大小與包含活性成分的微粒具有相同數(shù)量級)。
配制用于肺部投遞的本發(fā)明制藥學(xué)組合物還可以溶液或懸浮液液滴的形式提供活性成分?？梢宰鳛榘钚猿煞值乃蛳〈既芤夯驊腋∫?任選無菌的)來制備、包裝、或銷售這些配方，而且可以使用任何噴霧裝置而方便的施用。這些配方還可包含一種或多種額外成分，包括但不限于調(diào)味劑諸如糖精鈉、揮發(fā)油、緩沖劑、表面活性劑、或防腐劑諸如甲基羥基苯甲酸。通過這種施用路徑提供的液滴優(yōu)選具有大約0.1-200納米的平均直徑范圍。
可用于肺部施用的本文所述配方還可用于本發(fā)明制藥學(xué)組合物的鼻內(nèi)投遞。
適合于鼻內(nèi)施用的另一種配方是包含活性成分的粗粉，平均顆粒直徑為大約0.2-500微米。以鼻吸的方式施用這種配方，即由湊近鼻孔的粉劑容器經(jīng)過鼻道快速吸入。
適合于鼻施用的配方可以包含例如大約少至0.1％(w/w)和多至100％(w/w)的活性成分，而且還可包含一種或多種本文所述額外成分。
可以適合于口腔施用的配方來制備、包裝、或銷售本發(fā)明的制藥學(xué)組合物。這些配方可以采取例如使用常規(guī)方法制成的片劑或錠劑的形式，而且可以包含例如0.1-20％(w/w)的活性成分，還包含口含可溶解或可降解組合物和任選的一種或多種本文所述額外成分?；蛘撸m合于口腔施用的配方可以包括包含活性成分的粉劑或氣霧化或噴霧化溶液或懸浮液。這些粉狀、氣霧化、或噴霧化微粒或液滴的大小范圍為大約0.1-大約200納米，而且還可包含一種或多種本文所述額外成分。
在用于本文時，“額外成分”包括但不限于一種或多種下列各項賦形劑、表面活性劑、分散劑、惰性稀釋劑、?；捅郎?、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑、生理學(xué)可降解組合物諸如明膠、水性載體和溶劑、油性載體和溶劑、懸浮劑、分散或潤濕劑、乳化劑、緩和劑、緩沖劑、鹽、增稠劑、填充物、乳化劑、抗氧化劑、抗生素、抗真菌劑、穩(wěn)定劑、和制藥學(xué)可接受聚合或疏水物質(zhì)。本發(fā)明制藥學(xué)組合物中可以包含的其它“額外成分”在本領(lǐng)域是知道的，描述于例如Genaro等人，1985，《Remington’s PharmaceuticalSciences》即《雷明頓氏藥物科學(xué)》，Mack出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞，收入本文作為參考。
通常，可以施用于動物(優(yōu)選人)的本發(fā)明化合物的劑量范圍是每千克動物體重1毫克-大約100克。施用的精確劑量將隨任何數(shù)目的因素而變化，包括但不限于待治療的動物類型和疾病狀況類型、動物年齡、和施用路徑。優(yōu)選的是，化合物的劑量將在每千克動物體重大約1毫克-大約10克的范圍內(nèi)變化。更優(yōu)選的是，劑量將在每千克體重大約10毫克-大約1克的范圍內(nèi)變化。
可以每天幾次的頻率對動物施用化合物，或者可以較低頻率進行施用，諸如每天一次、每周一次、兩周一次、每月一次，甚至更低頻率，諸如數(shù)月一次或甚至每年一次或更少。服藥頻率對于熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的，而且將隨任何數(shù)目的因素而變化，諸如但不限于待治療疾病的類型和嚴重性、動物的類型和年齡、等。保藏根據(jù)布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序用途的微生物保藏的國際識別的條款，于2000年6月14日將包含F(xiàn)GF23 DNA的核酸保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物收藏中心(DSMZ)，保藏號DSM 13530。
可以通過依照已知方法對保藏克隆進行測序而容易的測定保藏克隆的核苷酸序列。然后可以由這些保藏物確認氨基酸序列。此外，也可以通過肽測序而直接測定由保藏克隆編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或在包含保藏的FGF23編碼DNA的合適宿主細胞中表達蛋白質(zhì)，收集蛋白質(zhì)，并測定其序列。
申請人的受讓人即高級研究和技術(shù)學(xué)院和慕尼黑路德維格-馬克西米利安大學(xué)聲稱，DSMZ是提供永久保藏和公眾易于獲得(若被授予專利)的存放處。在授予專利后將不可撤消的消除對于公眾獲取如此保藏的材料的所有限制。在專利申請懸而未決期間由根據(jù)37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122授權(quán)的委員們確定的人將容易的獲得材料。保藏材料將得到所有必要的小心維護，使之在最近一次提供保藏材料樣品的請求之后至少五年內(nèi)、而且在任何情況中在保藏日之后至少三十年內(nèi)或?qū)＠麍?zhí)行期內(nèi)(取二者之中較長的)保持存活且不受污染。申請人的受讓人承認其在保藏機構(gòu)因保藏條件而不能應(yīng)請求而提供樣品時更換保藏物的義務(wù)。定義下列每一項術(shù)語在用于本文時具有與它在這部分中相關(guān)的含義。
冠詞“一個”和“一種”在用于本文時指一個/種或多于一個/種(即至少一個/種)冠詞的語法賓語。作為范例，“一種元件”指一種元件或多于一種元件。
在用于本文時，短語“等位基因變體”指位于指定基因座的核苷酸序列或由其編碼的多肽。
在用于本文時，氨基酸表述成它們的全稱、相應(yīng)的三字母代碼、或相應(yīng)的單字母代碼，正如下表所示
在用于本文時，“減輕”由FGF23介導(dǎo)或與其有關(guān)的疾病、紊亂、或狀況。
術(shù)語“抗體”在用于本文時指能夠特異結(jié)合抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子?？贵w可以是由天然來源或重組來源衍生的完整免疫球蛋白，而且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以多種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2、及單鏈抗體和人源化抗體(Harlow等人，1999，《Using AntibodiesA Laboratory Manual》即《使用抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，紐約；Harlow等人，1989，《AntibodiesA Laboratory Manual》即《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883；Bird等人，1988，Science，242423-426)。
術(shù)語“合成抗體”在用于本文時指使用重組DNA技術(shù)而生成的抗體，諸如本文所述由噬菌體表達的抗體。該術(shù)語還可解釋為指通過合成編碼抗體的DNA分子而生成的抗體，該DNA分子表達抗體蛋白質(zhì)，或表示抗體的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列是使用本領(lǐng)域可利用的且眾所周知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得的。
“反義”特別指編碼蛋白質(zhì)的雙鏈DNA分子中非編碼鏈的核酸序列或與非編碼鏈基本同源的序列。根據(jù)本文的定義，反義序列與編碼蛋白質(zhì)的雙鏈DNA分子的序列互補。反義序列不必只是與DNA分子編碼鏈的編碼部分互補。反義序列可以與編碼蛋白質(zhì)的DNA分子中編碼鏈上指定的調(diào)控序列互補，該調(diào)控序列控制編碼序列的表達。
術(shù)語“施用器”在用于本文時指用于對哺乳動物施用本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)、和/或組合物的任何裝置，包括但不限于皮下注射器、移液器、噴霧器、等等。
基因“編碼區(qū)”包含基因編碼鏈的核苷酸殘基和基因非編碼鏈的核苷酸，它們分別與通過轉(zhuǎn)錄基因生成的mRNA分子的編碼區(qū)同源或互補。
mRNA分子“編碼區(qū)”也包含mRNA分子翻譯過程中與tRNA分子反密碼子區(qū)匹配的mRNA分子的核苷酸殘基或編碼終止密碼子的核苷酸殘基。因此，編碼區(qū)可包含對應(yīng)于成熟蛋白質(zhì)中不存在的、由mRNA分子編碼的氨基酸殘基(即蛋白質(zhì)輸出信號序列中的氨基酸殘基)的核苷酸殘基。
“與編碼FGF23的核酸的部分或整個互補”指不編碼FGF23蛋白質(zhì)的核酸序列。相反，與編碼FGF23的核酸分子的非編碼鏈相同的序列不編碼FGF23的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“互補”和“反義”在用于本文時不完全同義?！胺戳x”特別指編碼蛋白質(zhì)的雙鏈DNA分子中非編碼鏈的核酸序列或與非編碼鏈基本同源的序列?！盎パa”在用于本文時指兩種核酸(如兩種DNA分子)之間亞單位序列互補性的廣義概念。當(dāng)兩種分子中的某個核苷酸位置被通常能夠彼此堿基配對的核苷酸占據(jù)時，則認為核酸在該位置彼此互補。因此，當(dāng)每種分子中較大數(shù)目(至少50％)的對應(yīng)位置被通常彼此堿基配對(如A∶T和G∶C核苷酸對)的核苷酸占據(jù)時，則兩種核酸彼此互補。根據(jù)本文定義，反義序列與編碼蛋白質(zhì)的雙鏈DNA分子的序列互補。反義序列不必只與DNA分子編碼鏈的編碼部分互補。反義序列可以與編碼蛋白質(zhì)的DNA分子編碼鏈上指定的調(diào)控序列互補，該調(diào)控序列控制編碼序列的表達。
“同源”指兩種聚合分子之間如兩種核酸分子(如兩種DNA分子或兩種RNA分子)或兩種多肽分子之間的亞單位序列相似性。當(dāng)兩種分子中的某個亞單位位置被相同單體亞單位占據(jù)時，如若兩種DNA分子中的某個位置被腺苷酸占據(jù)，則它們在該位置是同源的。兩種序列之間的同源性是匹配或同源位置數(shù)目的直接函數(shù)，如若兩種復(fù)合序列中的半數(shù)(如長度為十個亞單位的聚合物中的五個位置)位置是同源的，則兩種序列50％同源；若90％的位置(如10個中的9個)是匹配或同源的，則兩種序列共享90％同源性。作為范例，DNA序列3’ATTGCC5’與3’TATGCG5’共享50％同源性。
若兩種寡核苷酸在只有至少大約60％、更優(yōu)選至少大約65％、甚至更優(yōu)選至少大約70％、仍然更優(yōu)選至少大約80％、且優(yōu)選至少大約90％、或更優(yōu)選至少大約95％互補的寡核苷酸才彼此退火的條件下發(fā)生退火，則這兩種寡核苷酸“在高嚴謹度下”發(fā)生退火。用于使兩種寡核苷酸退火的嚴謹條件是溫度、退火介質(zhì)的離子強度、保溫時間、寡核苷酸長度、寡核苷酸的GC含量、和兩種寡核苷酸之間的預(yù)計非同源程度(如果知道的話)等因素的函數(shù)。調(diào)整退火條件的嚴謹度的方法是已知的(參閱例如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningALaboratory Manual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約)。
可以使用數(shù)學(xué)算法來實現(xiàn)兩種核苷酸或氨基酸序列之間的同一性百分比的測定。例如，可用于比較兩種序列的數(shù)學(xué)算法是Karlin和Altschul的算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872264-2268)，并經(jīng)過Karlin和Altschul的修改(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877)。將這種算法摻入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(1990，J.Mol.Biol.，215403-410)，而且可以由例如具有全球資源定位器的美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)環(huán)球網(wǎng)站點“http//www.ncbi.nlm.nih.gov”獲取?？梢允褂萌缦聟?shù)用NBLAST程序(在NCBI站點指派“blastn”)進行BLAST核苷酸搜索缺口罰分＝5；缺口延伸罰分＝2；錯配罰分＝3；匹配得分＝1；期望值10.0；詞長(word size)＝11，以獲得與本文所述核酸同源的核苷酸序列?？梢允褂萌缦聟?shù)用XBLAST程序(在NCBI站點指派“blastx”)或NCBI“blastp”程序進行BLAST蛋白質(zhì)搜索期望值10.0；BLOSUM62評分矩陣，以獲得與本文所述蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。
為了獲得用于比較目的的帶缺口比對，可以如Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)所述利用Gapped BLAST?；蛘?，可以使用PSI-Blast或PHI-Blast來進行迭代搜索，它檢測分子(Id.)之間的遠緣關(guān)系和共享共有模式的分子之間的相互關(guān)系。在利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、和PHI-Blast程序時，可以使用各種程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參閱http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
可以使用與上文所述相似的技術(shù)來測定兩種序列之間的百分比同一性，其中容許或不容許缺口。在計算百分比同一性時，通常對精確匹配進行計數(shù)。
在用于本文時，術(shù)語“基因”和“重組基因”指包含編碼本發(fā)明多肽的開放讀碼框的核酸分子。這些天然等位基因變異通常能夠在指定基因的核苷酸序列中導(dǎo)致1-5％的變異?？梢酝ㄟ^對大量不同個體中的目的基因進行測序來鑒定可變等位基因。這可以通過使用雜交探針鑒定多個個體中的相同遺傳基因座而容易的進行。本發(fā)明的范圍意欲包括任何和所有這些核苷酸變異及生成的氨基酸多態(tài)性或由天然等位基因變異產(chǎn)生的且不改變功能活性的變異。
“編碼”指多核苷酸諸如基因、cDNA、或mRNA中特定核苷酸序列在生物學(xué)過程中擔(dān)當(dāng)合成其它聚合物和高分子的模板的內(nèi)在特性，它們具有確定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA、和mRNA)或確定的氨基酸序列及由其產(chǎn)生的生物學(xué)特性。因此，若對應(yīng)于基因的mRNA在細胞或其它生物學(xué)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄和翻譯生成蛋白質(zhì)，則該基因編碼蛋白質(zhì)。編碼鏈(即通常在序列表中提供的，與mRNA序列相同的核苷酸序列)和非編碼鏈(用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的模板)可以稱為編碼蛋白質(zhì)或該基因或cDNA的其它產(chǎn)物。
除非另有說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互為簡并版本且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可以包含內(nèi)含子。
“表達載體”指包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包含與待表達的核苷酸序列可操作連接的表達控制序列。表達載體包含足夠用于表達的順式作用元件；可以由宿主細胞或在體外表達系統(tǒng)中提供其它表達元件。表達載體包括本領(lǐng)域已知的所有那些表達載體，諸如摻入了重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(如裸露的或包含在脂質(zhì)體中)、和病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、和腺伴隨病毒)。
在用于本文時，術(shù)語“片段”在用于核酸時，核酸片段的長度通?？梢允侵辽俅蠹s10個核苷酸、通常至少大約20個核苷酸、更通常的是大約20-大約50個核苷酸、優(yōu)選至少大約50-大約100個核苷酸甚至更優(yōu)選至少大約100-大約500個核苷酸、仍然甚至更優(yōu)選至少大約500-大約1000個核苷酸、且最優(yōu)選超過大約1500個核苷酸。
在用于本文時，術(shù)語“片段”在用于多肽時，肽片段的長度通?？梢允侵辽俅蠹s7個連續(xù)氨基酸、通常至少大約15個連續(xù)氨基酸、更通常的是至少大約30個連續(xù)氨基酸、通常至少大約40個連續(xù)氨基酸、優(yōu)選至少大約50個氨基酸、甚至更優(yōu)選至少大約60個氨基酸、且最優(yōu)選超過大約70個連續(xù)氨基酸。
在用于本文時，術(shù)語“在嚴謹條件下發(fā)生雜交”意欲描述這樣的雜交和清洗條件，其中彼此至少60％(65％、70％、優(yōu)選75％)同一的核苷酸序列通常保持彼此雜交。這些嚴謹條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是知道的，而且可以在《Current Protocols in Molecular Biology》即《分子生物學(xué)通用方案》，6.3.1-6.3.6，John & Sons，紐約，1989中找到。嚴謹雜交條件的范例是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于45℃進行雜交，隨后在0.2x SSC、0.1％SDS中于50-65℃清洗一次或多次。優(yōu)選的是，在嚴謹條件下與SEQ ID NO1或3或其互補物的序列發(fā)生雜交的本發(fā)明分離核酸分子對應(yīng)于天然存在的核酸分子。在用于本文時，“天然存在的”核酸分子指具有天然發(fā)生的核苷酸序列(如編碼天然蛋白質(zhì))的RNA或DNA分子。
“基因組DNA”指具有與基因同源的核苷酸序列的DNA鏈。作為范例，染色體和通過逆轉(zhuǎn)錄哺乳動物mRNA衍生的cDNA都是基因組DNA。
在用于本文時，“同源性”與“同一性”同義。
另外，當(dāng)術(shù)語“同源性”在用于本文時指核酸和蛋白質(zhì)時，則應(yīng)當(dāng)理解為指核酸和氨基酸兩種水平上的同源性。
在用于本文時，“指導(dǎo)材料”包括可用于傳達本發(fā)明組合物用于其指定用途的有用性的發(fā)表物、記錄、圖表、或任何表達媒體。本發(fā)明試劑盒的指導(dǎo)材料可以例如粘貼在裝有組合物的容器上或與裝有組合物的容器一起運輸?；蛘?，指導(dǎo)材料可以與容器分開運輸，目的是讓接受者合作使用指導(dǎo)材料與組合物。
“分離核酸”指已經(jīng)與天然存在狀態(tài)中的側(cè)翼序列分開的核酸區(qū)段或片段，如已經(jīng)消除了通常與該片段相鄰的序列(如在片段天然存在的基因組中與其相鄰的序列)的DNA片段。該術(shù)語還用于已經(jīng)基本上由天然伴隨核酸的其它成分(如在細胞中天然伴隨核酸的RNA或DNA或蛋白質(zhì))純化的核酸。因此，該術(shù)語包括例如摻入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒、或原核生物或真核生物基因組DNA，或者作為獨立于其它序列的分開分子(如作為cDNA或通過PCR或限制酶消化生成的基因組或cDNA片段)存在的重組DNA。它還包括作為雜合基因的一部分、編碼額外多肽序列的重組DNA。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，使用了下列普遍存在的核酸堿基的縮寫?！癆”指腺苷，“C”指胞苷，“G”指鳥苷，“T”指胸苷，而“U”指尿苷。
本發(fā)明肽(或編碼肽的DNA)的“衍生物”和“變體”指一個或多個氨基酸(或一個或多個堿基對)可能遭到改變使得肽(或DNA)與本文所述序列不同但與本文公開的肽具有相同特性即具有FGF23生物學(xué)活性的肽。
術(shù)語“編碼FGF23的核酸中的突變”指核酸序列中的堿基對變化，它可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能或者沒有影響。有些突變(包括但不限于R176Q、R179Q、R179W、和這兩個精氨酸的任何其它突變)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，因此可能影響在血液中的半衰期或其它生物學(xué)作用。
描述兩種多核苷酸“可操作連接”指單鏈或雙鏈核酸部分包含兩種多核苷酸，它們在核酸部分中的排列方式使得兩種多核苷酸中的至少一種能夠?qū)α硪环N發(fā)揮其特征性的生理學(xué)作用。作為范例，可操作連接基因編碼區(qū)的啟動子能夠促進編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。
優(yōu)選的是，當(dāng)編碼期望蛋白質(zhì)的核酸還包含啟動子/調(diào)控序列時，該啟動子/調(diào)控序列位于期望蛋白質(zhì)編碼序列的5’端使得它驅(qū)動期望蛋白質(zhì)在細胞中的表達。
在用于本文時，術(shù)語“啟動子/調(diào)控序列”指表達與啟動子/調(diào)控序列可操作連接的基因產(chǎn)物所需要的核酸序列。在有些情況中，該序列可以是核心啟動子序列；在其它情況中，該序列還可以包含增強子序列和表達基因產(chǎn)物所需要的其它調(diào)控元件。啟動子/調(diào)控序列可以是例如以組織特異方式表達基因產(chǎn)物的序列。
“組成型”啟動子指可操作連接編碼或確定基因產(chǎn)物的多核苷酸時在細胞的大多數(shù)或所有生理學(xué)條件下引起基因產(chǎn)物生成的核苷酸序列。
“誘導(dǎo)型”啟動子是當(dāng)可操作連接編碼或確定基因產(chǎn)物的多核苷酸時，使基因產(chǎn)物基本上只在細胞內(nèi)存在對應(yīng)于該啟動子的誘導(dǎo)物時方生成基因產(chǎn)物的核苷酸序列。
“組織特異型”啟動子指當(dāng)可操作連接編碼或確定基因產(chǎn)物的多核苷酸時基本上只在細胞是與啟動子對應(yīng)的組織類型的細胞時方在細胞中引起基因產(chǎn)物生成的核苷酸序列。
術(shù)語“核酸的表達”在用于本文時指合成由核酸編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
術(shù)語“編碼……的DNA”應(yīng)當(dāng)解釋為包括編碼期望蛋白質(zhì)的DNA序列和伴隨實際編碼序列的任何必需的5’或3’非翻譯區(qū)。
術(shù)語“位于5’端”在用于本文時指啟動子/調(diào)控序列共價結(jié)合在表達受其調(diào)控的核酸的5’端，而且與該核酸5’轉(zhuǎn)錄起始位點的距離近得足以驅(qū)動它們的表達。
向新生RNA轉(zhuǎn)錄本添加核苷酸的5’-3’方向稱為轉(zhuǎn)錄方向。具有與mRNA相同序列的DNA鏈稱為“編碼鏈”；DNA鏈上位于DNA上參照點5’的序列稱為“上游序列；DNA鏈上位于參照點3’的序列稱為“下游序列”。
“聚腺苷酸化序列“指指導(dǎo)向轉(zhuǎn)錄的mRNA序列上添加聚A尾的多核苷酸序列。
“多核苷酸”指核酸的單鏈或平行和反向平行鏈。因此，多核苷酸可以是單鏈或雙鏈核酸。
術(shù)語“核酸”通常指大型多核苷酸。
術(shù)語“寡核苷酸”通常指小型多核苷酸，通常不超過大約50個核苷酸?？梢岳斫猓趯⒑塑账嵝蛄斜硎龀蒁NA序列(即A、T、G、C)時，這也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。
在本文中使用常規(guī)符號來描述多核苷酸序列單鏈多核苷酸序列的左手端是5’端；雙鏈多核苷酸序列的左手端稱為5’方向。
“引物”指能夠與指定多核苷酸模板特異雜交并提供合成互補多核苷酸的起點的多核苷酸。當(dāng)多核苷酸引物處于誘導(dǎo)合成的條件下時，即存在核苷酸、互補多核苷酸模板、和聚合劑諸如DNA聚合酶，發(fā)生這種合成。引物通常是單鏈的，但是可以是雙鏈的。引物通常是脫氧核糖核苷酸，但是多種合成和天然存在引物可用于許多應(yīng)用。因設(shè)計與模板雜交而與其互補的引物擔(dān)當(dāng)合成的起始位點，但是不必反映模板的精確序列。在這種情況中，引物與模板的特異雜交依賴雜交條件的嚴謹度?？梢杂美顼@色、放射性、或熒光模塊來標記引物，并用作可檢測模塊。
“探針”指能夠與指定的另一種多核苷酸序列特異雜交的多核苷酸。探針可與互補多核苷酸靶發(fā)生特異雜交，但是不必反映模板的精確互補序列。在這種情況中，探針與靶的特異雜交依賴雜交條件的嚴謹度?？梢杂美顼@色、放射性、或熒光模塊來標記探針，并用作可檢測模塊。
“重組多核苷酸”指具有在自然狀況下不連在一起的序列的多核苷酸。可以在合適載體中包含擴增或裝配得到的重組多核苷酸，并且可以將載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。
重組多核苷酸還可以承擔(dān)非編碼功能(如啟動子、復(fù)制起點、核糖體結(jié)合位點、等)。
重組多肽”指通過表達重組多核苷酸而生成的多肽。
在用于本文時，術(shù)語“報道基因”指可以使用已知方法來檢測其表達的基因。作為范例，大腸桿菌lacZ基因可以在培養(yǎng)基中用作報道基因，因為lacZ基因的表達可以使用已知方法來進行檢測，即向培養(yǎng)基中加入顯色底物鄰-硝基苯基-β-半乳糖苷(Gerhardt等人編，1994，《Methods for General and Molecular Bacteriology》即《普通和分子細菌學(xué)方法》，美國微生物學(xué)學(xué)會，華盛頓特區(qū)，第574頁)。
“多肽”指由經(jīng)肽鍵相連的氨基酸殘基、與它們相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體、和合成的非天然存在的類似物構(gòu)成的聚合物、與它們相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體、和合成的非天然存在的類似物?？梢允褂美缱詣踊嚯暮铣蓛x來合成合成多肽。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”通常指大型多肽。
術(shù)語“肽”通常指小型多肽。
在本文中使用常規(guī)符號來描述多肽序列多肽序列的左手端是氨基端；多肽序列的右手端是羧基端。
“限制性位點”指雙鏈核酸中受到限制性內(nèi)切酶識別的部分。
當(dāng)雙鏈核酸與限制性內(nèi)切酶接觸時，若內(nèi)切酶能夠在核酸的某個部分切割核酸的兩條鏈，則該部分受到該內(nèi)切酶的“識別”。
術(shù)語“特異結(jié)合”在用于本文時指化合物如蛋白質(zhì)、核酸、抗體、等等識別并結(jié)合特定分子，但是基本上不識別或結(jié)合樣品中的其它分子。
若兩種寡核苷酸在只有至少大約60％、優(yōu)選至少大約65％、更優(yōu)選至少大約70％、甚至更優(yōu)選至少大約75％、且優(yōu)選至少大約90％、或至少大約95％互補的寡核苷酸才彼此退火的條件下發(fā)生退火，則這兩種寡核苷酸“在高嚴謹度下”發(fā)生退火。用于使兩種寡核苷酸退火的嚴謹條件是溫度、退火介質(zhì)的離子強度、保溫時間、寡核苷酸長度、寡核苷酸的GC含量、和兩種寡核苷酸之間的預(yù)計非同源程度(如果知道的話)等因素的函數(shù)。調(diào)整退火條件的嚴謹度的方法是已知的(參閱例如Sambrook等人，1989，《Molecular CloningA LaboratoryManual》即《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約)。
在用于本文時，術(shù)語“基本純的”指已經(jīng)將化合物如核酸、蛋白質(zhì)、或多肽與天然伴隨它的成分分開。通常，當(dāng)樣品中所有物質(zhì)的至少大約10％、優(yōu)選至少大約20％、更優(yōu)選至少大約50％、仍然更優(yōu)選至少大約75％、甚至更優(yōu)選至少大約90％、且最優(yōu)選至少大約99％(指體積、濕重或干重、或者摩爾百分比或摩爾分數(shù))是目的化合物時，則該化合物是基本純的。可以通過任何適當(dāng)方法如柱層析、凝膠電泳、或HPLC分析來測量純度。
當(dāng)化合物如核酸、蛋白質(zhì)、或多肽基本上不含天然相關(guān)成分或者與在它的天然狀態(tài)下伴隨它的天然污染物分開時，它也是“基本純的”。因此， “基本純的”核酸制劑在用于本文時指已經(jīng)與天然存在狀態(tài)中的側(cè)翼序列純化分開的核酸序列，如已經(jīng)消除了通常在片段天然存在的基因組中與片段相鄰的序列的DNA片段。
相似的，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽制劑在用于本文時指已經(jīng)與其天然存在狀態(tài)中的通常相關(guān)成分純化分開的蛋白質(zhì)或多肽?？梢酝ㄟ^下列用于蛋白質(zhì)純化的已知流程來純化得到基本純的肽，其中使用免疫學(xué)、酶學(xué)、或其它測定法來監(jiān)測流程中每個階段的純化。蛋白質(zhì)純化方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且描述于例如Deutscher等人，1990，《Guide to Protein Purification》即《蛋白質(zhì)純化指南》，HarcourtBrace Jovanovich，圣迭戈。
“標簽”多肽指在經(jīng)肽鍵連接目的蛋白質(zhì)后可用于定位蛋白質(zhì)、由細胞提取物純化蛋白質(zhì)、在結(jié)合測定法中用于固定蛋白質(zhì)、或以其它方式研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性和/或功能的任何蛋白質(zhì)?？梢詫皹撕灐北砦坏那逗?即融合)蛋白固定在可結(jié)合標簽的樹脂上。這些標簽表位和可特異結(jié)合它們的樹脂在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且包括例如包含多個連續(xù)組氨酸殘基的標簽表位(His6)(能夠在鑷-次氮基三乙酸-瓊脂糖上分離包含這種表位的嵌合蛋白)、血凝素(HA)標簽表位(能夠使包含這種表位的嵌合蛋白結(jié)合抗HA單克隆抗體親和基質(zhì))、myc標簽表位(能夠使包含這種表位的嵌合蛋白結(jié)合抗myc單克隆抗體親和基質(zhì))、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標簽表位和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標簽表位(分別能夠誘導(dǎo)包含這種表位的蛋白質(zhì)與谷胱甘肽或麥芽糖-Sepharose柱之間的結(jié)合)。包含這些標簽表位的蛋白質(zhì)的生成在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且描述于標準論文中，諸如Sambrook等人，1989和Ausubel等人，同上。同樣，針對標簽表位的抗體(如抗HA、抗myc抗體9E10、等等)能夠在例如Western印跡、ELISA測定法、和細胞免疫染色中檢測和定位融合蛋白。
在用于本文時，“冶療”指降低患者經(jīng)歷癥狀的頻率。
在用于本文時，“FGF23抑制劑”定義為可降低或消除FGF23蛋白質(zhì)分子或其生物學(xué)活性的任何分子。這些抑制劑可以是反義核酸或核酶、阻斷FGF23與其受體相互作用的分子、或抑制FGF23受體激活的分子。下文討論了具體范例。
術(shù)語“載體”在用于本文時指編碼外源核酸的任何質(zhì)?；虿《尽Ｔ撔g(shù)語還應(yīng)當(dāng)解釋為包括促進核酸轉(zhuǎn)移到病毒粒子或細胞中的非質(zhì)粒和非病毒化合物，諸如聚賴氨酸化合物等等。載體可以是適合作為投遞載體用于向細胞投遞編碼期望蛋白的核酸或其突變體的病毒載體，或者載體可以是適合于相同目的的非病毒載體。用于向細胞或組織投遞DNA的病毒和非病毒載體的范例在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且描述于例如Ma等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412744-12746。病毒載體的范例包括但不限于重組痘苗病毒、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺伴隨病毒、重組禽痘病毒、等等(Cranage等人，1986，EMBO J.，53057-3063；發(fā)表于1994年8月18日的國際專利申請?zhí)朩O94/17810；發(fā)表于1994年10月27日的國際專利申請?zhí)朩O94/23744)。非病毒載體的范例包括但不限于脂質(zhì)體、DNA的聚胺衍生物、等等。
通過參照下列實驗性實施例將進一步詳述本發(fā)明。提供這些實施例只是出于例示目的，而非意欲限制，除非另有說明。因此，絕不能解釋為本發(fā)明限于下列實施例，而是應(yīng)當(dāng)解釋為涵蓋根據(jù)本文提供的傳授而變得明顯的任何和所有變化。
實施例實施例1ADHR家族的連鎖和突變分析本文的資料證實了新基因FGF23的發(fā)現(xiàn)。下文還證實了下列發(fā)現(xiàn)ADHR位于第12號染色體短臂的12p13.3，F(xiàn)GF23位于該區(qū)域，而且FGF23在患有ADHR的個體中發(fā)生突變。
現(xiàn)在描述此實施例所示實驗中使用的材料和方法。家譜分析分析了源自英國(家族2318)、德國(家族329)、和美國(家族1406和1478)的家族的家譜。先前已經(jīng)描述了ADHR+家族1406、1478、和2318(Econs等人，1992，J.Clin.Endocrinol.Metab.，82674-681；Bainchine等人，1971，Birth Defects Orig.Aric.Ser.，7287-295；Rowe等人，1992，Hum.Genet.，89539-542)。該研究得到了印地安那大學(xué)醫(yī)學(xué)院和路德維格-馬克西米利安大學(xué)醫(yī)學(xué)系制度檢查組的批準，而且所有患者都在參與前在知情下表示同意。突變篩選如下評估患者DNA用內(nèi)含子引物(表2)擴增外顯子，并通過直接測序或SSCP分析擴增片段。在含有和不含甘油的情況下，使用標準聚丙烯酰胺或Serdogel SSCP 2x(Serva Electrophoresis GmbH，海德堡，德國)于20℃進行SSCP。通過Tt4cslistraGreen染色和熒光成像儀(Molecular Dynamics，桑尼維爾，加州)檢測，或者通過存在[32P]dCTP的情況中PCR擴增外顯子后的發(fā)射自顯影來顯現(xiàn)樣品。重擴增變體條帶，用于測序。使用Taq DyeDeoxy Terminator Cyclesequencing kit即Taq染料脫氧終止物循環(huán)測序試劑盒(ABI)，或者使用Sequenase Kit即測序酶試劑盒(USB)和[33P]雙脫氧核苷酸摻入來進行使用有義和反義兩種引物的直接測序。使用來自具有男性-男性傳遞和與ADHR相容的臨床特征的四個家族即1406、1478、2318、和329的指示患者的DNA和來自患有低血磷佝僂病、PHEX基因突變呈陰性的18名患者的DNA進行突變分析。另外，還分析了患有低血磷、嚴重顱面異常、和上肢及下肢過短的家族(Cabral等人，1998，80thAnnualEndocrine Society Meeting即第80屆內(nèi)分泌學(xué)會年會)和患有HBD、包含男性-男性傳遞的家族。RT-PCR/RACE使用1-2ng人或小鼠FGF23 cDNA(圖5或6)作為模板進行RT-PCR。使用Marathon cDNA Amplification Kits即馬拉松cDNA擴增試劑盒(ClonTech公司，帕洛阿爾托，加州)進行RACE。使用根據(jù)預(yù)測cDNA序列設(shè)計的引物擴增0.2-3.5kb產(chǎn)物(表2)，提出請求后可以獲得這些引物。如Bonaventure等人，1994，Exp.Cell Res.，21297-104所述制備人胎軟骨細胞培養(yǎng)物，并檢查COL2A1的表達。
現(xiàn)在描述此實施例中呈現(xiàn)的結(jié)果。
大型ADHR家譜即家族1406的連鎖分析證明了標記D12S100與D12S397之間染色體12p13.3上的18cM間隔的顯著LOD得分。標記D12S1624的兩點LOD得分是7.68。第二個較小ADHR家族即家族1478展示D12S1624的LOD得分是1.1。假設(shè)該家族的疾病基因座與相同間隔連鎖，那么在這兩個家族中篩選單一重組事件，并將疾病基因座對標記D12S1585與D12S1594之間的1.5MB區(qū)域進行作圖(圖2)。在家族1406中，個體1306和0142在D12S1685具有近端重組事件，而在D12S397具有遠端重組事件。家族1478分別在個體001和0100中的D12S1050和D12S1594展示重組(圖1A)。
可以由公開的人類基因組成果獲得來自12p13.3的基因組序列。D12S685與D12S1623之間的已完成和未完成序列的分析揭示在該區(qū)域內(nèi)有37個基因，其中13個是新的。通過IMAGE克隆的RT-PCR、RACE、和/或測序獲得新基因的完整編碼序列。
根據(jù)上述連鎖研究，將突變篩選集中于D12S1685與D12S1594之間的1.5MB區(qū)域。該區(qū)域包含7個已知基因、4個新基因、和1個基因片段(表1)。使用基于外顯子-內(nèi)含子邊界的引物通過擴增外顯子對下列基因篩選突變(1)MIBOO3(AJ272206)；(2)DYRK4蛋白激酶(AF263541)；(3)蛋白激酶A結(jié)合蛋白AKAP11O(AF093408)；(4)GalNAc-T8(AJ271385)9。另外，認為該區(qū)域以外的數(shù)個基因是候選者。調(diào)查了其中兩個，即生長分化因子3(GDF3，AF263538)和新的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR46，AJ272207)。檢測到少數(shù)變異，而且對照等位基因的測序揭示了它們都是多態(tài)性(表1)。
還調(diào)查了來自該區(qū)域的新型成纖維細胞生長因子家族成員FGF23。來自上述ADHR家族的FGF23外顯子的直接測序揭示了三個錯義變化，它們影響相隔三個氨基酸的兩個精氨酸。家族1406和1478共享相同變化R176Q(527＞A)，它破壞了AciI位點。在通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析時，對照PCR產(chǎn)物被消化成112、49、和33bp的片段，而突變體基因座只產(chǎn)生112和82bp片段。在家族2318中，找到了突變型FGF23中的R179W(535C＞T)變化，它產(chǎn)生了新的BmpI位點。RFLP分析顯示來自正常等位基因的PCR產(chǎn)物未被消化，保持194bp的原始產(chǎn)物，而突變型等位基因被切割一次，產(chǎn)生118和87bp片段(圖1B)。在家族329中，找到了突變型FGF23中的R179Q(536G＞A)變化，它不產(chǎn)生或破壞限制性位點。
另外，在外顯子3中存在多態(tài)性716/T(239/M)。在214個等位基因的182個中找到蘇氨酸，而在214個等位基因的22個中找到甲硫氨酸。完整編碼區(qū)和起始密碼子上游區(qū)域(450bp)的測序揭示在患有HBD的家族、患有低血磷和多發(fā)性先天性畸形的家族、和患有XLH的18名患者中沒有突變。錯義突變與每個家族中的疾病相分離，而且在214個測序的對照等位基因中沒有找到。另外，分別通過800和752個對照等位基因的RFLP分析排除了家族1406和1478中和家族2318中的突變(圖1B)。具有相同F(xiàn)GF23突變的家族1406和1478來自分開的地理區(qū)域，而且知道是無關(guān)的。證據(jù)之一是兩個家族在分別距離突變基因只有200kb和70kb的基因座D12S1624和D12S1725處具有不同的等位基因?？傊@然FGF23突變R176Q、R179Q、和R179W是ADHR的起因。
FGF23在人類基因組中位于FGF6端粒側(cè)54kb，是由3個外顯子構(gòu)成的，跨越大約10kb基因組序列。獲得的最長的FGF23 RT-PCR產(chǎn)物有1612bp，而且包含251個氨基酸的預(yù)測開放讀碼框(ORF)。5’-UTR由146bp構(gòu)成，其中預(yù)測起始位點上游不含符合讀碼框的終止密碼子。3’-UTR由710bp構(gòu)成，其中預(yù)測聚腺苷酸化信號在終止密碼子下游831bp。通過PFAM數(shù)據(jù)庫的FGF文件(4.6e-14、1.9e-16)鑒定了人和小鼠FGF23。使用CLUSTAL和PRETTYBOX生成了FGF23與其它FGF家族成員之間的氨基酸序列比對(圖3A-3C)。它們與其它FGF家族成員在共有核心序列中共享25％-36％的氨基酸同一性。樹分析指示FGF23與FGF21最密切相關(guān)?？紤]到FGF23具有251個氨基酸的事實，它是迄今最大的FGF特征為該蛋白質(zhì)具大型C端部分。Signal P分析指示FGF23包含信號肽，而且對肽的切割最有可能位于第24位丙氨酸殘基與第25位酪氨酸殘基之間。
對來自小鼠6號染色體的BAC在人染色體12p13.3的同源區(qū)域內(nèi)測序。這些BAC之一(GenBank編號ACO15538)包含F(xiàn)GF23的小鼠同系物。使用由對應(yīng)區(qū)域衍生的引物由17天小鼠胚胎cDNA擴增FGF23。鼠cDNA具有與人蛋白質(zhì)相同長度的預(yù)測ORF，在核苷酸水平具有73％同一性，而在氨基酸水平具有70％同一性。另外，斑點印跡分析指示起始密碼子上游500bp的小鼠與人序列具有顯著的序列保守性。實施例2FGF23的表達本文的資料證實了FGF23在人組織和癌細胞系中的表達。在此實施例中還證實了FGF23特異抗體的生成及其用于檢測在細菌和哺乳動物細胞中生成的FGF23的用途。此實施例中展示的資料還證實了FGF23是分泌性蛋白質(zhì)，而且FGF23在致癌性低血磷骨軟化(OHO)腫瘤中豐富表達。
現(xiàn)在描述在此實施例所述實驗中使用的材料和方法。Northern印跡分折將含2μg polyA+-RNA的來自多種組織的多組織Northern印跡(ClonTech公司，帕洛阿爾托，加州)與全長FGF23(圖5A或6A)探針在雜交緩沖液(270mM NaCl、15mM Na2HPO4、15mM EDTA、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、0.5％脫脂奶粉)中于65℃保溫，并在0.01XSSC中于60℃清洗。在細菌中生成FGF23使用Pfu聚合酶(Gibco-BRL，羅克維爾，馬里蘭州)通過PCR擴增來自人心的RNA(ClonTech公司，帕洛阿爾托，加州)而生成人FGF23 cDNA。使用IV型Qiaexpress試劑盒(Qiagen公司，巴倫西亞，加州)將包含第73-756位核苷酸、編碼不含預(yù)測信號肽的全長FGF23的插入片段定向克隆到pQE30載體中，讀碼框與N端6xHis標簽相同。隨后使用質(zhì)粒FGF23-6xHis pQE轉(zhuǎn)化M15[pREP4]細胞，并加入IPTG達4小時以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。如制造商(Qiagen公司，巴倫西亞，加州)所述，通過鑷層析小量制備純化FGF23-6xHis蛋白質(zhì)。Western印跡分析將蛋白質(zhì)樣品和標準物在15％SDS-PAGE微型凝膠(BioRad)上進行電泳，并電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與2.5μg/ml抗人FGF23抗體或小鼠抗penta His抗體一起保溫，隨后與山羊抗兔或抗小鼠-HRP二抗(1∶1000)(Amersham公司，皮斯卡塔韋，新澤西州)一起保溫，并通過增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)(Amersham公司，皮斯卡塔韋，新澤西州)顯現(xiàn)。在哺乳動物細胞中生成FGF23為了在哺乳動物細胞中生成FGF23，用表達人FGF23的質(zhì)粒(稱為pFGF23)瞬時轉(zhuǎn)染OK-E、COS-7、和HEK293細胞。為了構(gòu)建pFGF23，通過RT-PCR由心總RNA擴增Kozak序列居前的FGF23 ORF(第-3至756位bp)。將得到的cDNA定向插入表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)。通過DNA測序確認了pFGF23的完整性。OHO腫瘤樣品的制備通過來自1)左腿(血管外皮細胞瘤)；2)下顎(混合型結(jié)締組織瘤)；3)左腿(血管發(fā)育不良)；4)足底(血管外皮細胞瘤)；5)鼻(血管外皮細胞瘤)；和6)遠端股骨(成骨細胞骨肉瘤)的手術(shù)切除由OHO患者獲得了6種不同腫瘤(圖8A)。所有患者都展示OHO的特征性生化異常，它們在切除腫瘤后消除。將大約100mg腫瘤樣品重懸于0.5ml冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)(添加了75μg/ml AEBSF蛋白酶抑制劑)。將樣品在冰上勻漿30秒鐘，然后以1500g離心，將澄清的勻漿物用于進一步的實驗。通過Bradford蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad公司，Hercules，加州)測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清清蛋白作為標準。
現(xiàn)在描述這部分中呈現(xiàn)的實驗結(jié)果。
為了評估FGF23在特定人組織及癌細胞系中的表達，依照常規(guī)方法，對由人組織和癌細胞系獲得的RNA進行RT-PCR和雜交分析。顯示FGF23在特定組織諸如人心、肝、和甲狀腺/甲狀旁腺中以低水平轉(zhuǎn)錄(圖4A)。另外，可以由全胎、胎兒軟骨、小腸、睪丸、和骨骼肌擴增到微弱產(chǎn)物。肺、腦、腎、骨肉瘤細胞(SaOS)、和內(nèi)皮細胞(HMEC-1)對FGF23轉(zhuǎn)錄本呈陰性。在小鼠中，嵌套RT-PCR在17天小鼠胚胎中呈陽性，但是在來自顱蓋的原代骨細胞培養(yǎng)物、肢芽細胞、成骨細胞(MC3T3細胞)、和受刺激軟骨細胞細胞系中不是如此。小鼠胚胎不同發(fā)育階段的矢狀切片及各種組織諸如成年肺、卵巢、胰、睪丸、胸腺、腎、腦、和心的石蠟切片和E18.5脛腓骨的冷凍切片的放射性原位雜交對FGF23轉(zhuǎn)錄本呈陰性。來自16種特定器官的多種組織Northern印跡雜交呈陰性。在用FGF23 cDNA進行探查時，由癌細胞系獲得的RNA的Northern印跡分析在慢性骨髓性白血病細胞系K562中展示大約3和1.3kb的陽性信號，而數(shù)種其它腫瘤細胞系只表達3.0或1.3kb轉(zhuǎn)錄本(圖4B)。
為了生成可用于檢測FGF23的免疫學(xué)試劑，使用標準流程生成針對肽CSQELPSAEDNSPMASD-COOH(SEQ ID NO5)的兔抗人FGF23多克隆抗體，該肽對應(yīng)于人FGF23的第206-222位殘基(ZymedLaboratories公司，南圣弗朗西斯科，加州)。針對該肽親和純化抗血清。
為了評估抗FGF23抗體的特異性，如上所述在細菌中生成重組人FGF23。通過Western印跡分析使用親和純化的抗FGF23抗體分析由FGF23-6xHis pQ轉(zhuǎn)化細菌制備的裂解物?？笷GF23抗體識別來自經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細菌的大約27kDa蛋白質(zhì)，而在未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中沒有檢測到蛋白質(zhì)(圖7A)。使用抗His抗體也檢測到相同蛋白質(zhì)，指示兩種抗體可識別相同蛋白質(zhì)。免疫前血清在所有實驗中都未能檢測到蛋白質(zhì)。這些結(jié)果確認了親和純化的抗FGF23抗體能夠識別重組人FGF23蛋白質(zhì)。
為了評估FGF23在轉(zhuǎn)染細胞中的表達，在轉(zhuǎn)染后24小時收獲細胞，提取總RNA，并使用32P標記FGF23 cDNA探針進行Northern印跡分析。在用pFGF23轉(zhuǎn)染的所有三種細胞系中，1.1kb的單一mRNA種類與FGF23探針雜交，而用空pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細胞不表達FGF23轉(zhuǎn)錄本(圖7B)。
為了確定FGF23是否是分泌性蛋白質(zhì)，使用由三種轉(zhuǎn)染細胞系衍生的條件培養(yǎng)基和抗FGF23抗體進行Western印跡分析。在由pFGF23轉(zhuǎn)染細胞獲得的條件培養(yǎng)基中檢測到大約32kDa和12kDa的免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)，但是在pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細胞中沒有檢測到(圖7C)。32kDa條帶是FGF23的成熟形式，而12kDa種類代表FGF23的C端降解產(chǎn)物，因為只是在延長細胞在無血清培養(yǎng)基中的保溫后檢測到該較小條帶。另外，分泌型FGF23比它的預(yù)測大小要大，這最有可能的是由于核心糖基化所致，正如存在胰微粒體時pFGF23的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯所測試的。綜上所述，這些結(jié)果證明了瞬時表達FGF23的哺乳動物細胞能夠生成FGF23轉(zhuǎn)錄本且有效分泌該蛋白質(zhì)。
為了評估OHO腫瘤中的FGF23表達，使用由6種腫瘤中的5種分離的總RNA進行Northern印跡分析。放射性標記的FGF23探針與所有5種腫瘤中的3.0和1.3kb FGF23轉(zhuǎn)錄本及大約2.0kb微弱條帶雜交；相反，來自數(shù)種其它組織的對照RNA不展示雜交條帶(圖8A)。為了確定OHO腫瘤中是否存在FGF23蛋白質(zhì)，通過Western印跡分析使用抗FGF23抗體檢驗來自第6種腫瘤的提取物。FGF23抗體由腫瘤提取物檢測到32kDa蛋白質(zhì)(圖8B)?？傊?，Northern和Western印跡分析指示FGF23是在OHO腫瘤中高度表達的分泌性蛋白質(zhì)。實施例3ADHR突變對FGF23蛋白質(zhì)切割和肝素結(jié)合的影響本文的資料證實了與ADHR有聯(lián)系的FGF23突變導(dǎo)致FGF23的較大蛋白質(zhì)種類的水平升高，這是由于蛋白酶不能在共有SPC位點有效切割FGF23。此實施例中還證實了突變型FGF23以與野生型FGF23可比的水平結(jié)合肝素的能力。
現(xiàn)在描述此實施例所述實驗中使用的材料和方法。FGF23的誘變使用嵌套PCR和定點誘變方法將ADHR錯義突變R176Q、R179W、R179Q導(dǎo)入FGF23 cDNA。在所有PCR反應(yīng)中使用高保真DNA聚合酶Pfu(Promega公司，麥迪遜，威斯康星州)，使用pFGF23(pcDNA3.1主鏈)作為模板。對于PCR的起始輪，將包含適當(dāng)錯義的每種正向誘變引物與反向3’FGF23引物配對，并將每種反向誘變引物與正向5’FGF23引物配對。下文表2列出了誘變引物。分別位于5’FGF23和3’FGF23引物內(nèi)的BamHI和EcoRI位點以斜體和雙下劃線標明。每種引物內(nèi)的突變堿基以下劃線標明。表2 所有實驗的PCR條件是95℃1min，隨后是35個循環(huán)的95℃1min、55℃1min、72℃2min，最后延伸72℃7min。使用Wizard Prep Kit即Wizard制備性試劑盒(Promega公司，麥迪遜，威斯康星州)凝膠純化由第一輪PCR得到的cDNA產(chǎn)物。進行第二輪PCR生成全長突變cDNA。由特定突變體的兩個最初PCR反應(yīng)各取1μl，在一個反應(yīng)管中混合，并用5’FGF23和3’F GF23引物擴增這兩種cDNA的混合物。然后用BamHI和EcoRI消化得到的產(chǎn)物，并定向連接到表達載體pcDNA3.1(+)中，以生成突變克隆pR176Q、pR179w、pR179Q。將每種突變克隆插入片段測序，以確認導(dǎo)入了適當(dāng)突變及評估ORF的完整性。FLAG標記FGF23的構(gòu)建用正向引物(含EcoRI位點，下劃線)5’-GGAATTCATATCCCAATGCCTCCCCA-3’(SEQ ID NO7)和反向引物(含BamHI位點，下劃線)5’-CGGGATCCCTAGATGAACTTGGCGAA-3’(SEQ ID NO6)分開擴增pFGF23和pR176Q。用EcoRI和BamHI消化得到的cDNA，并定向連接到pFLAG-CMV-3表達載體(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)中，以生成表達FLAG-FGF23和FLAG-R176Q的質(zhì)粒。應(yīng)當(dāng)注意，親本pFLAG-CMV-3載體使用前胰蛋白酶原前導(dǎo)序列，從而能夠分泌N端FLAG標記融合蛋白。將克隆的插入片段測序，以確認融合蛋白的正確讀碼框。肝素結(jié)合測定法將由經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細胞獲得的條件培養(yǎng)基(0.5ml)以1∶1與1XPBS pH7.4及50μl 1∶1肝素sepharose1X PBS(Amersham Pharmacia公司，皮斯卡塔韋，新澤西州)懸浮液一起保溫。將混合物置于4℃旋轉(zhuǎn)搖床上達4小時，然后離心1分鐘。除去上清液，并用冰冷的1X PBS清洗sepharose四次。向sepharose中加入50μl Laemmli加樣緩沖液，并將懸浮液簡短漩渦振蕩，然后煮沸5分鐘。將樣品離心1分鐘，并取出上清液。通過Western印跡分析使用抗FGF23抗體分析10μl上清液(結(jié)合肝素sepharose的物質(zhì))。
現(xiàn)在描述此實施例中呈現(xiàn)的實驗結(jié)果。
為了評估ADHR突變型FGF23在哺乳動物細胞中的表達和分泌，如上所述構(gòu)建包含ADHR錯義突變(R176Q、R179W、R179Q)的FGF23表達質(zhì)粒。預(yù)測信號序列和預(yù)測蛋白酶切割位點位于FGF23氨基酸序列內(nèi)(圖9)。通過用表達野生型FGF23、R176Q、R179W、和R179Q的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞來分析突變型FGF23的表達和分泌。使用針對人FGF23的多克隆抗體對由轉(zhuǎn)染細胞衍生的條件培養(yǎng)基和總細胞裂解物進行Western印跡分析。在由pFGF23轉(zhuǎn)染細胞獲得的條件培養(yǎng)基中檢測到大約32kDa的免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)和位于12kDa的雙帶(圖10A)。相反，在由突變型pFGF23轉(zhuǎn)染細胞獲得的條件培養(yǎng)基中只檢測到32kDa條帶，而且野生型與突變型FGF23之間的表達水平?jīng)]有明顯差異(圖10A)。另外，總細胞裂解物對野生型或突變型FGF23蛋白質(zhì)呈陰性，經(jīng)載體對照轉(zhuǎn)染的細胞也如此(圖10A)。圖10B顯示了突變型FGF23蛋白質(zhì)中的氨基酸變化。這些結(jié)果指示瞬時轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞系分泌包含人ADHR突變的FGF23。然而，使用多克隆抗體在來自表達突變型FGF23的細胞的培養(yǎng)基中只能檢測到該較大蛋白質(zhì)種類。應(yīng)當(dāng)注意，抗FGF23抗體識別的表位位于野生型FGF23蛋白質(zhì)中第176-179位殘基即潛在SPC切割位點的C端，因此12kDa條帶可能代表了FGF23 32kDa種類的C端片段。若12kDa種類是32kDa條帶的降解產(chǎn)物，則SPC切割位點上游的抗體應(yīng)可結(jié)合較大蛋白質(zhì)種類及N端蛋白質(zhì)片段。
使用如上所述構(gòu)建的表達N端FLAG表位標記的野生型和突變體(R176Q)FGF23的質(zhì)粒精確測試了這種可能性。為了確定針對該蛋白質(zhì)N端的抗體能否檢測FGF23蛋白質(zhì)種類，用載體對照或表達FLAG-FGF23和FLAG-R176Q的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞。通過Western印跡使用抗FLAG單克隆抗體(M5；Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州)分析由轉(zhuǎn)染細胞獲得的條件培養(yǎng)基。在由FLAG-FGF23轉(zhuǎn)染細胞獲得的條件培養(yǎng)基中，抗FLAG抗體識別36和26kDa兩條帶，而在由FLAG-R176Q轉(zhuǎn)染細胞獲得的培養(yǎng)基中，抗體主要識別36kDa條帶，在26kDa能檢測到很微弱的條帶(圖11A)。載體對照培養(yǎng)物未生成反應(yīng)性條帶，任何細胞裂解物也是如此。在培養(yǎng)基中檢測到的較大FLAG-FGF23蛋白質(zhì)種類遷移至36kDa，與上文觀察到的32kDa相反，這是因為來自FLAG標簽的額外殘基所致。使用檢測36kDa野生型和突變型FLAG標記FGF23的多克隆抗FGF23抗體，通過相同培養(yǎng)基的Western印跡分析確認了這一點。圖11B顯示了FLAG表位、抗FGF23表位、和SPC切割位點的位置。這些結(jié)果指示來自野生型FGF23的Western印跡中的較小條帶確實是FGF23的C和N端片段，而且ADHR突變型FGF23主要是作為較大蛋白質(zhì)種類分泌的。這些結(jié)果指示位于第176位和第179位的ADHR突變穩(wěn)定了32kDa FGF23蛋白質(zhì)種類。根據(jù)與ADHR患者磷酸鹽流失有關(guān)的突變型FGF23的切割不如野生型FGF23有效的觀察結(jié)果，全長FGF23的穩(wěn)定和分泌有可能導(dǎo)致腎磷酸鹽流失，與蛋白水解片段的分泌相反。另外，這些結(jié)果說明ADHR突變有可能增強而非滅活FGF23在磷酸鹽流失作用中的生物學(xué)活性。
為了確定使用HEK293細胞觀察到的FGF23切割是發(fā)生在細胞內(nèi)還是細胞外，將FGF23條件培養(yǎng)基在缺乏細胞或與對照HEK293細胞(不表達FGF23)一起的情況中于37℃在5％CO2中保溫24小時。保溫后，收集培養(yǎng)基，濃縮至相同體積，并使用C端抗FGF23抗體進行Western印跡分析。不管采用哪種處理，32kDa條帶與12kDa條帶的比率沒有變化(圖12A)，指示FGF23切割發(fā)生于細胞內(nèi)，在細胞分泌之前或之中，而不是在HEK293細胞上表達的胞外蛋白酶的作用所致。平行電泳這些樣品的考馬斯藍染色確認了相同凝膠上樣量(圖12B)。
位于R176和R179的ADHR突變鄰近包含F(xiàn)GF肝素結(jié)合基序的β鏈。為了測試ADHR突變是否干擾FGF23結(jié)合肝素的能力，如上所述將由經(jīng)表達野生型或突變型FGF23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細胞獲得的條件培養(yǎng)基與肝素sepharose一起保溫。在野生型和突變型FGF23轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)基的樣品中檢測到32kDa蛋白質(zhì)種類，而空載體轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)基的樣品呈陰性，指示野生型和突變型FGF23都有效結(jié)合肝素(圖13)。在使用由經(jīng)表達FLAG標記FGF23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞獲得的培養(yǎng)基的相似實驗中，36kDa種類即FLAG標記野生型和突變型FGF23也結(jié)合肝素(圖13)。這些結(jié)果證明了FGF23 32kDa種類可特異結(jié)合肝素，并且為FGF23確實是結(jié)合肝素的FGF家族成員提供了生化證據(jù)。另外，突變型FGF23保留了肝素結(jié)合的觀察結(jié)果指示ADHR錯義突變不顯著改變FGF23的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。實施例4小鼠中的FGF23分析本文的資料證實了過度表達FGF23、表達突變型FGF23、或暴露于貧乏或富含磷酸鹽食譜的小鼠的生成和分析。
為了評估FGF23表達與小鼠中磷酸鹽穩(wěn)態(tài)改變之間的相關(guān)性，構(gòu)建了在肝中過度表達鼠FGF23的轉(zhuǎn)基因小鼠，并比較了來自轉(zhuǎn)基因與對照小鼠的血清和尿液樣品中的磷濃度。將小鼠定期稱重并檢查，以確定是否有任何外在的表型差異。與在與腎磷酸鹽流失有關(guān)的人腫瘤中過度表達FGF23一致的是，過度表達FGF23的轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)當(dāng)展示腎磷酸鹽流失及由此引起的低血磷。此外，這些小鼠應(yīng)當(dāng)展示腎中Npt2(主要的依賴鈉的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白)mRNA和蛋白質(zhì)水平降低。在FGF23轉(zhuǎn)基因小鼠、對照小鼠、與通過膳食磷酸鹽貧乏或過量的誘導(dǎo)而具有等同血清磷酸鹽濃度的對照小鼠之間比較血清1，25-二羥基維生素D濃度水平。相似的，注射純化FGF23的小鼠應(yīng)當(dāng)展示腎磷酸鹽流失，并且成為低血磷。
構(gòu)建包含在人ADHR患者中觀察到的相同突變(R176Q、R179Q、R179W、或者第176位或第179位精氨酸的任何其它突變)的轉(zhuǎn)基因小鼠，它們應(yīng)當(dāng)能夠用作人類紊亂的優(yōu)良動物模型。如上所述，檢驗血清和尿液磷及血清1，25-二羥基維生素D濃度。該突變雜合的小鼠應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)與患有ADHR的人一樣的腎磷酸鹽流失和低血磷，而突變純合小鼠應(yīng)當(dāng)具有更嚴重的表型。突變小鼠還應(yīng)當(dāng)展示腎中Npt2 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低。
對小鼠施用貧乏或富含磷酸鹽的食譜改變了血清磷酸鹽濃度，而且應(yīng)當(dāng)改變FGF23在甲狀腺/甲狀旁腺、心、或肝中的表達水平。高血磷應(yīng)當(dāng)升高FGF23 mRNA在這些組織中的表達，而低血磷應(yīng)當(dāng)降低FGF23 mRNA在這些組織中的表達。
將FGF23在雄性和雌性Hyp小鼠中的表達水平與正常同窩幼仔對照或具有磷酸鹽改變食譜的同窩幼仔進行比較，其中所述Hyp小鼠在Phex基因中具有突變，而且是人X連鎖低血磷佝僂病的鼠模型。Hyp小鼠應(yīng)當(dāng)具有升高的FGF23表達和血清濃度。實施例5FGF23在由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化患者中的檢測本文的資料證實了FGF23檢測方案用于診斷患者體內(nèi)由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的用途。
由展示由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的臨床癥狀的患者手術(shù)切除腫瘤。然后將腫瘤細胞在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48小時。使用標準方案由腫瘤細胞分離RNA。使用FGF23特異PCR引物對來自腫瘤的RNA進行RT-PCR。由來自腫瘤的RNA擴增到適當(dāng)大小的cDNA條帶，而從在PCR之前未進行逆轉(zhuǎn)錄的腫瘤細胞RNA(陰性對照)未擴增到這樣的cDNA。因此，在腫瘤樣品中檢測到FGF23 mRNA指示由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化，從而用作這種疾病的有價值的診斷工具。實施例6FGF23對人的安全性本文的資料證實了FGF23對人的安全性。
在患有由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的有些患者中，檢測不到腫瘤。在用高劑量1，25-二羥基維生素D和磷酸鹽進行治療后，這些患者的狀況得到改善。一旦這些患者體內(nèi)的低血磷得到糾正，即不再有癥狀，盡管他們血液中的FGF23濃度仍然很高。在ADHR患者中也是如此，據(jù)推測，他們都具有高FGF23血清濃度，這是他們不能降解突變型FGF23所致。因此，高水平的FGF23對人沒有明顯的有害影響。
本文完整收入文中引用的每一篇專利、專利申請、和發(fā)表物的公開書作為參考。
盡管已經(jīng)通過參考具體實施方案而公開了本發(fā)明，顯然，本領(lǐng)域其它技術(shù)人員可以設(shè)計本發(fā)明的其它實施方案和變化，而不違背本發(fā)明的真實精神和范圍。所附權(quán)利要求書意欲解釋為包括所有這些實施方案和等同的變化。
序列表<110>ADVANCED RESEARCHAND TECHNOLOGY INSTITUTELUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITT，MUNCHEN<120>新型成纖維細胞生長因子(FGF23)及其使用方法<130>053884-5001WO<140>NOT YET ASSIGNED<141>2000-07-10<150>60/219,137<151>2000-07-19<160>34<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1612<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1cggcaaaaag gagggaatcc agtctaggat cctcacacca gctacttgca agggagaagg 60aaaaggccag taaggcctgg gccaggagag tcccgacagg agtgtcaggt ttcaatctca 120gcaccagcca ctcagagcag ggcacgatgt tgggggcccg cctcaggctc tgggtctgtg 180ccttgtgcag cgtctgcagc atgagcgtcc tcagagccta tcccaatgcc tccccactgc 240tcggctccag ctggggtggc ctgatccacc tgtacacagc cacagccagg aacagctacc 300acctgcagat ccacaagaat ggccatgtgg atggcgcacc ccatcagacc atctacagtg 360ccctgatgat cagatcagag gatgctggct ttgtggtgat tacaggtgtg atgagcagaa 420gatacctctg catggatttc agaggcaaca tttttggatc acactatttc gacccggaga 480actgcaggtt ccaacaccag acgctggaaa acgggtacga cgtctaccac tctcctcagt 540atcacttcct ggtcagtctg ggccgggcga agagagcctt cctgccaggc atgaacccac 600ccccgtactc ccagttcctg 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Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Tyr8590 95Lys Tyr Pro Gly Met Phe Ile Ala Leu Ser Lys Asn Gly Lys Thr Lys100 105 110Lys Gly Asn Arg Val Ser Pro Thr Met Lys Val Thr His Phe Leu Pro115 120 125Arg Leu130<210>26<211>130<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile1510 15Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His20 25 30Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly35 40 45Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn50 55 60Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys65 70 7580Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp85 90 95Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys100 105 110Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro115 120 125Arg Ile130<210>27<211>144<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly Ile1 5 10 15Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys 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15Gly Lys His Val Gln Val Thr Gly Arg Arg Ile Ser Ala Thr Ala Glu20 25 30Asp Gly Asn Lys Phe Lys Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly35 40 45Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala Glu Ser Glu Lys Tyr Ile Cys Met50 55 60Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly Lys Pro Ser Gly Lys Ser Lys Asp65 70 75 80Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Phe Gln85 90 95Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe Met Ala Phe Thr Arg Gln Gly Arg100 105 110Pro Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg Gln Asn Gln Arg Glu Ala His Phe115 120 125Ile Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln Leu Pro130 135<210>31<211>135<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>31Gly Trp Gly Lys Ile Thr Arg Leu Gln Tyr Leu Tyr Ser Ala Gly Pro1 510 15Tyr Val Ser Asn Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ser Asp Gly Ser Val Asp20 25 30Cys Glu Glu Asp Gln Asn Glu Arg Asn Leu Leu Glu Phe Arg Ala Val35 40 45Ala Leu Lys Thr Ile Ala Ile Lys Asp Val Ser Ser Val Arg Tyr Leu50 5560Cys Met Ser Ala Asp Gly Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Arg Tyr Ser Glu65 70 75 80Glu Asp Cys Thr Phe Arg Glu Glu Met Asp Cys Leu Gly Tyr Asn Gln85 90 95Tyr Arg Ser Met Lys His His Leu His Ile Ile Phe Ile Gln Ala Lys100 105 110Pro Arg Glu Gln Leu Gln Asp Gln Lys Pro Ser Asn Phe Ile Pro Val115 120 125Phe His Arg Ser Phe Phe Glu130 135<210>32<211>139<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>32Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro1 510 15His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val20 25 30Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala35 40 45Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr50 5560Leu Cys Asn Gly Ala Asp Gly Lys Asn Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser65 70 75 80Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn85 90 95Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala100 105 110Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His115 120 125Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu130 135<210>33<211>136<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>33Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp 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Asp Val Tyr His Ser Pro85 90 95Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala Phe Leu100 105 110Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg Arg Asn115 120 125Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg His Thr130135 140Arg14權(quán)利要求
1.編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)或其突變體、變體、同系物、或片段的分離核酸。
2.編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的分離核酸，其中所述分離核酸與SEQ ID NO1和SEQ ID NO3之至少一項的核酸序列共享至少大約50％的序列同一性。
3.編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的分離核酸，其中所述分離核酸編碼一種多肽，該多肽具有與SEQ ID NO2和SEQID NO4之至少一項的氨基酸序列共享至少40％的序列同一性的氨基酸序列。
4.DSMZ保藏號DSM 13530中包含的分離核酸。
5.權(quán)利要求1的分離核酸，所述核酸還包含與其共價連接的編碼標簽多肽的核酸。
6.權(quán)利要求5的分離核酸，其中所述標簽多肽選自下組myc標簽多肽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標簽多肽、綠色熒光蛋白標簽多肽、myc-丙酮酸激酶標簽多肽、His6標簽多肽、流感病毒血凝素標簽多肽、FLAG標簽多肽、和麥芽糖結(jié)合蛋白標簽多肽。
7.權(quán)利要求1的分離核酸，所述核酸還包含與其可操作連接的表述啟動子/調(diào)控序列的核酸。
8.包含權(quán)利要求1的分離核酸的載體。
9.權(quán)利要求8的載體，所述載體還包含與其可操作連接的表述啟動子/調(diào)控序列的核酸。
10.包含權(quán)利要求1的分離核酸的重組細胞。
11.包含權(quán)利要求8的載體的重組細胞。
12.與編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)或其突變體、變體、同系物、或片段的核酸互補的分離核酸，所述互補核酸處于反義取向。
13.權(quán)利要求12的分離核酸，其中所述互補核酸與具有SEQ IDNO1和SEQ ID NO3之至少一項的核酸序列的核酸的互補核酸共享至少大約50％的序列同一性。
14.包含權(quán)利要求12的分離核酸的載體。
15.權(quán)利要求14的載體，所述載體還包含與其可操作連接的表述啟動子/調(diào)控序列的核酸。
16.包含權(quán)利要求12的分離核酸的重組細胞。
17.包含編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)或其突變體、變體、同系物、或片段的分離核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
18.包含成纖維細胞生長因子-23(FGF23)或其突變體、變體、同系物、或片段的分離多肽。
19.權(quán)利要求18的分離多肽，其中所述FGF23的氨基酸序列與SEQ ID NO2和SEQ ID NO4之至少一項的氨基酸序列共享至少大約40％的序列同一性。
20.特異結(jié)合成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽或其突變體、變體、同系物、或片段的抗體。
21.權(quán)利要求20的抗體，其中所述抗體選自下組多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、和合成抗體。
22.編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的分離核酸，其中所述核酸包含突變。
23.權(quán)利要求22的分離核酸，其中所述突變賦予所述FGF23以升高的穩(wěn)定性。
24.權(quán)利要求22的分離核酸，其中所述突變選自下組核酸中編碼相對于SEQ ID NO2的第176位氨基酸(精氨酸)的突變和核酸中編碼相對于SEQ ID NO2的第179位氨基酸(精氨酸)的突變。
25.分離的成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽，其中所述多肽包含突變。
26.分離的成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽，所述多肽包含賦予所述FGF23以升高的穩(wěn)定性的突變。
27.權(quán)利要求26的分離多肽，其中所述突變選自下組相對于SEQ ID NO2的第176位氨基酸(精氨酸)處的突變和相對于SEQ IDNO2的第179位氨基酸(精氨酸)處的突變。
28.成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的抑制劑，其中所述抑制劑選自下組降低編碼FGF23多肽的mRNA水平的分子、降低FGF23多肽水平的分子、和降低FGF23生物學(xué)活性的分子。
29.權(quán)利要求28的抑制劑，其中所述抑制劑選自下組反義核酸、核酶、抗體、肽、和肽模擬物。
30.權(quán)利要求28的抑制劑，其中所述抑制劑是選自下組的抗體可特異結(jié)合FGF23的抗體和可特異結(jié)合FGF23受體的抗體。
31.權(quán)利要求28的抑制劑，其中所述抑制劑是可通過RNA干擾來降低編碼FGF23多肽的所述mRNA水平的雙鏈RNA。
32.包含權(quán)利要求1的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
33.包含權(quán)利要求12的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
34.包含權(quán)利要求18的分離多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
35.包含權(quán)利要求20的抗體和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
36.包含權(quán)利要求22的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
37.包含權(quán)利要求23的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
38.包含權(quán)利要求24的分離核酸和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
39.包含權(quán)利要求25的分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
40.包含權(quán)利要求26的分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
41.包含權(quán)利要求27的分離FGF23多肽和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
42.包含權(quán)利要求28的抑制劑和制藥學(xué)可接受載體的組合物。
43.生成具有成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的生物學(xué)活性的分離蛋白質(zhì)的方法，包括(1)在所述蛋白質(zhì)得以表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11的重組細胞；并(2)回收所述蛋白質(zhì)。
44.診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括(1)由所述哺乳動物獲得生物學(xué)樣品；并(2)使所述生物學(xué)樣品接觸能夠檢測編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的核酸中是否存在突變的試劑，其中所述突變的存在指示所述哺乳動物患有所述低血磷紊亂，由此診斷所述哺乳動物體內(nèi)的所述低血磷紊亂。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述低血磷紊亂是常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自下組血液和尿液。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述試劑是核酸。
48.權(quán)利要求44的方法，其中所述試劑被可檢測標記。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述試劑被選自下組的標記物可檢測標記放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物、和酶。
50.診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括(1)由所述哺乳動物獲得生物學(xué)樣品；并(2)使所述生物學(xué)樣品接觸能夠檢測是否存在突變型成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽的試劑，其中所述突變型FGF23多肽的存在指示所述哺乳動物患有所述低血磷紊亂，由此診斷所述哺乳動物體內(nèi)的所述低血磷紊亂。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述低血磷紊亂是常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自下組血液和尿液。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述試劑是抗體。
54.診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括(1)由所述哺乳動物獲得生物學(xué)樣品；并(2)使所述生物學(xué)樣品接觸能夠檢測所述樣品中成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽水平的試劑，其中所述樣品中FGF23多肽水平相對于由對照哺乳動物獲得的樣品中FGF23多肽水平的升高指示所述哺乳動物患有所述低血磷紊亂，由此診斷所述哺乳動物體內(nèi)的所述低血磷紊亂。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述低血磷紊亂選自下組X連鎖遺傳性佝僂病(XLH)、遺傳性低血磷佝僂病(HHRH)、低血磷骨病(HBD)、常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)、由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、和腎結(jié)石。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自下組血液和尿液。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所述試劑是FGF23抗體。
58.權(quán)利要求54的方法，其中所述試劑被可檢測標記。
59.權(quán)利要求54的方法，其中所述試劑被選自下組的標記物可檢測標記放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物、和酶。
60.診斷患者體內(nèi)由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化的方法，包括(1)由所述患者獲得腫瘤樣品；并(2)檢測所述腫瘤中FGF23的表達或缺乏，其中FGF23的表達指示所述患者患有由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化。
61.治療哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的方法，包括對患有所述紊亂的哺乳動物施用治療有效量的選自下組的成纖維細胞生長因子-23(FGF23)抑制劑可降低所述哺乳動物體內(nèi)編碼FGF23多肽的mRNA水平的抑制劑、可降低所述哺乳動物體內(nèi)FGF23多肽水平的抑制劑、和可降低所述哺乳動物體內(nèi)FGF23生物學(xué)活性的抑制劑。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述低血磷紊亂選自下組X連鎖遺傳性佝僂病(XLH)、遺傳性低血磷佝僂病(HHRH)、低血磷骨病(HBD)、常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)、由腫瘤誘導(dǎo)的骨軟化、表皮痣綜合癥、纖維性發(fā)育不良、和腎結(jié)石。
63.權(quán)利要求61的方法，其中所述抑制劑選自下組反義核酸、核酶、抗體、肽和肽模擬物。
64.治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有所述紊亂的哺乳動物施用治療有效量的編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的分離核酸。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述分離核酸包含賦予其所編碼的FGF23多肽以升高的穩(wěn)定性的突變。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述高血磷紊亂選自下組輕度腎機能不全和腫瘤性鈣沉積。
67.治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有所述紊亂的哺乳動物施用治療有效量的分離成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述分離FGF23多肽包含賦予該多肽以升高的穩(wěn)定性的突變。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述高血磷紊亂選自下組輕度腎機能不全和腫瘤性鈣沉積。
70.治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有所述紊亂的哺乳動物施用治療有效量的可升高所述哺乳動物中成纖維細胞生長因子-23(FGF23)水平的試劑。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述試劑可抑制所述FGF23多肽的降解。
72.權(quán)利要求70的方法，其中所述高血磷紊亂選自下組輕度腎機能不全和腫瘤性鈣沉積。
73.治療哺乳動物體內(nèi)的高血磷紊亂的方法，包括對患有所述紊亂的哺乳動物施用治療有效量的細胞群，所述細胞群中包含編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的分離核酸。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述分離核酸包含賦予其所編碼的FGF23多肽的升高的穩(wěn)定性的突變。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述高血磷紊亂選自下組輕度腎機能不全和腫瘤性鈣沉積。
76.治療哺乳動物體內(nèi)的骨質(zhì)疏松癥的方法，包括對所述哺乳動物施用治療有效量的成纖維細胞生長因子-23(FGF23)或可升高所述哺乳動物體內(nèi)的FGF23多肽水平的試劑。
77.治療哺乳動物體內(nèi)的涉及鈣和磷酸鹽在動脈或軟組織中沉積的狀況的方法，包括對所述哺乳動物施用治療有效量的成纖維細胞生長因子-23(FGF23)或可升高所述哺乳動物體內(nèi)的FGF23多肽水平的試劑。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述狀況是皮肌炎。
79.治療哺乳動物體內(nèi)的冠狀動脈疾病的方法，包括對患有該疾病的哺乳動物冠狀動脈細胞施用編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)的核酸。
80.一種診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的試劑盒，該試劑盒包含能夠檢測編碼成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽的核酸序列中是否存在突變的試劑，其中所述突變的存在指示該哺乳動物患有低血磷紊亂，該試劑盒中還包含用于使用它們的施用器和指導(dǎo)材料。
81.一種診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的試劑盒，該試劑盒包含能夠檢測成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽水平的試劑，其中所述FGF23多肽水平的升高指示該哺乳動物患有低血磷紊亂，該試劑盒中還包含用于使用它們的施用器和指導(dǎo)材料。
82.一種診斷哺乳動物體內(nèi)的低血磷紊亂的試劑盒，該試劑盒包含能夠檢測是否存在突變型成纖維細胞生長因子-23(FGF23)多肽的試劑，其中所述突變型FGF23的存在指示哺乳動物患有低血磷紊亂，該試劑盒中還包含用于使用它們的施用器和指導(dǎo)材料。
83.權(quán)利要求24的分離核酸，其中所述突變選自下組相對于SEQID NO1的527G＞A，535C＞T和536G＞A。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼成纖維細胞生長因子－23(FGF23)的新型核酸及由其編碼的蛋白質(zhì)，它的突變與常染色體顯性低血磷佝僂病(ADHR)有關(guān)。本發(fā)明還涉及診斷和治療低血磷和高血磷紊亂的方法，包括分別抑制或刺激患者體內(nèi)FGF23的生物學(xué)活性。本發(fā)明還涉及治療骨質(zhì)疏松、皮肌炎、和冠狀動脈疾病的方法，包括刺激患者體內(nèi)FGF23的生物學(xué)活性。
文檔編號C12N15/09GK1446227SQ01814057
公開日2003年10月1日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月19日
發(fā)明者M·艾肯斯, K·懷特, T·M·斯特羅姆, T·梅廷格爾 申請人:先端研究與技術(shù)學(xué)院, 慕尼黑路德維希-馬克西米利安斯大學(xué)遺傳醫(yī)學(xué)部