該申請基于2014年3月23日提交的61/969,215，并要求其優(yōu)先權(quán)。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明：不適用。
技術(shù)領(lǐng)域：
自二十世紀(jì)八十年代以來，已通過基于分批方法或灌注的細(xì)胞培養(yǎng)制得重組蛋白。本發(fā)明提供通過銅添加劑的使用而提高的特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞表達(dá)。該發(fā)明適于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，例如CHO、BHK和人細(xì)胞系，特別是CHO，其還適于許多重組蛋白的表達(dá)，例如重組因子VIII(rFVIII)、B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII以及重組因子VII/因子VIIa(rFVII/rFVIIa)。
背景技術(shù)：
：銅對于細(xì)胞生長和存活來說是必不可少的。因?yàn)殂~的不可或缺的營養(yǎng)價(jià)值、用作氧化應(yīng)激催化劑的化學(xué)作用以及其沉淀習(xí)性，所以至為重要的是了解、監(jiān)測并配制銅以用于特定的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和應(yīng)用中。銅為在體外平衡狀態(tài)下以還原態(tài)(亞銅的)Cu(I)以及氧化態(tài)(二價(jià)銅的)Cu(II)、銅存在的過渡金屬。在其游離形式和某些螯合物中，銅可積極參與氧化還原循環(huán)。它氧化大量的重要培養(yǎng)基成分例如半胱氨酸和抗壞血酸鹽，以使細(xì)胞培養(yǎng)過程最優(yōu)化。在體外，Cu(I)將與還原態(tài)半胱氨酸、谷胱甘肽以及可能的有機(jī)巰基物自發(fā)地形成復(fù)合物。除了形成二價(jià)銅-胱氨酸復(fù)合物外，Cu(II)還將與其它氨基酸通過它們的α-氨基氮和羧基-氧基團(tuán)的配位而形成復(fù)合物。Cu(II)結(jié)合到組氨酸很重要，因?yàn)檫@似乎是涉及Cu(II)從清蛋白遷移到細(xì)胞的媒介。在銅可以穿過細(xì)胞膜之前，其必須還原為Cu(I)。銅能夠通過氧化和沉淀引起半胱氨酸和胱氨酸從細(xì)胞培養(yǎng)基中耗損。在體外，半胱氨酸是易溶解的，其幾乎僅作為中性氨基酸而存在。半胱氨酸不穩(wěn)定，在二分子氧存在下經(jīng)受非酶促自氧化而形成胱氨酸。二價(jià)銅的銅促進(jìn)半胱氨酸到胱氨酸的自氧化。二價(jià)銅的銅可以與胱氨酸形成螯合沉淀物。半胱氨酸從細(xì)胞培養(yǎng)中的消耗將停止蛋白和谷胱甘肽(重要的還原劑)的合成。還原態(tài)谷胱甘肽能夠與Cu(I)復(fù)合，從而抑制其參與羥基自由基的形成。該相互作用涉及半胱氨酸硫原子。在體內(nèi)，Cu(I):谷胱甘肽復(fù)合物可能通過銅轉(zhuǎn)運(yùn)體1通道介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Cu(I)安全遷移至細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白例如金屬硫蛋白。Cu(I):谷胱甘肽復(fù)合物的形成是自發(fā)非酶促的[Dierick,P.J.(1986),Invitrointeractionoforganiccopper(II)compoundswithsolubleglutathioneS-transferasesfromratliver.Res.Commun.ChemPathol.Pharmacol.51,285-288]。附圖說明圖1A和圖2A示出高銅水平在培養(yǎng)中對重組蛋白表達(dá)的影響。在兩幅圖中，Y-軸表示關(guān)于所獲得的重組蛋白滴度的歸一化數(shù)據(jù)。虛線表示使用不含額外添加的銅，即僅以基礎(chǔ)水平0.087微摩爾的銅自然存在于培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基所獲得的數(shù)據(jù)。X-軸表示生物反應(yīng)器天數(shù)。實(shí)線表示當(dāng)添加額外的銅時(shí)所獲得的蛋白滴度。圖1B和圖2B示出高銅水平對重組蛋白比產(chǎn)率(specificproductivity)的影響。在兩幅圖中，Y-軸表示關(guān)于重組蛋白比產(chǎn)率的歸一化數(shù)據(jù)，其相對于在X-軸上的生物反應(yīng)器天數(shù)。虛線再次表示使用不含額外添加的銅，即僅以基礎(chǔ)水平0.087微摩爾的銅自然存在于培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基所獲得的數(shù)據(jù)。實(shí)線表示當(dāng)添加額外的銅時(shí)所獲得的蛋白比產(chǎn)率。圖3A和圖3B分別示出對于在培養(yǎng)基中所查出的基礎(chǔ)水平的銅和所添加的各種水平的銅(0.315、0.629和1.259微摩爾)來說，相對于生物反應(yīng)器天數(shù)的重組蛋白滴度和重組蛋白比產(chǎn)率。圖4是歸一化的比產(chǎn)率(qp)相對于滲透克分子濃度和銅濃度的曲面圖。詳細(xì)說明該數(shù)據(jù)產(chǎn)生于2013年，當(dāng)時(shí)使用基于膜的外部細(xì)胞截留裝置并使用沒有銅增補(bǔ)的培養(yǎng)基來操作過程。用在普通培養(yǎng)基中所查出的16-160納摩爾的銅水平來進(jìn)行以(-)銅表示的基礎(chǔ)培養(yǎng)。當(dāng)兩個(gè)生物反應(yīng)器收到增補(bǔ)銅的培養(yǎng)基時(shí)獲得有關(guān)銅添加的益處的第一實(shí)驗(yàn)證據(jù)。銅的添加發(fā)生在第十天，并顯示出對重組蛋白表達(dá)的即刻影響，如在示出蛋白表達(dá)急劇增加的圖中所證明的那樣。但是，可在添加細(xì)胞之前將二價(jià)銅離子源例如硫酸銅或氯化銅或其它具有相似性質(zhì)的二價(jià)銅鹽添加至培養(yǎng)基，其具有相似的結(jié)果。圖1示出將40.9微摩爾銅添加至培養(yǎng)基的影響。通過在與基礎(chǔ)運(yùn)行相同的條件下重復(fù)的生物反應(yīng)器操作來表明蛋白表達(dá)增加4至5倍。約40微摩爾銅以二價(jià)銅離子形式的添加似乎給出最優(yōu)化的結(jié)果，但是其它在0.5微摩爾至約10.0微摩爾范圍內(nèi)的添加濃度似乎給出相似的結(jié)果。為了更好地了解高水平的銅在初始實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中的影響，使用量減少的銅來進(jìn)行附加運(yùn)行。圖2表示使用7.87微摩爾的銅添加所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)表明在使用與基礎(chǔ)生物反應(yīng)器都等同的所有其它因素下，7.87微摩爾的添加引起蛋白表達(dá)增加3至4倍。進(jìn)行進(jìn)一步的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)以說明更合理的銅水平對蛋白表達(dá)的影響。圖3表示通過重復(fù)的生物反應(yīng)器所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，在通過生物反應(yīng)器運(yùn)行的過程中改變銅濃度的水平下操作所述重復(fù)的生物反應(yīng)器。維持所有其它參數(shù)都等同于基礎(chǔ)運(yùn)行。該數(shù)據(jù)表明當(dāng)與圖2中所詳細(xì)描述的7.87微摩爾銅添加相較而言，0.315、0.63和1.26微摩爾的銅濃度將引起與7.87微摩爾等同的3至4倍增加。圖4示出在Z(垂直的)軸上的比產(chǎn)率以及分別在X和Y-軸上的銅濃度和滲透克分子濃度。使用6天、250mL搖瓶、分批細(xì)胞培養(yǎng)的模型來產(chǎn)生該數(shù)據(jù)以確定/說明所添加的銅的效果。比產(chǎn)率還可隨著培養(yǎng)基滲透克分子濃度的增加而增加，但是所看到的最好的效果是伴隨著銅離子的添加。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，其中培養(yǎng)是以0.5e6細(xì)胞/mL接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基增補(bǔ)有氯化銅和或任選的氯化鈉以分別將銅水平調(diào)節(jié)為0.087至3.78微摩爾之間，將滲透克分子濃度調(diào)節(jié)為270至380毫滲透克分子數(shù)(mOsmo)之間。每個(gè)因子選定五種不同的水平(0.087、0.787、1.495、2.927和3.78微摩爾銅，以及270、310、350、360、380毫滲透克分子數(shù))。然后每日對培養(yǎng)物取樣以測定活細(xì)胞濃度，進(jìn)行6天。在第4-6天進(jìn)行產(chǎn)物濃度評價(jià)。比產(chǎn)率表示為平均化在研究中中心點(diǎn)的比產(chǎn)率(310毫滲透克分子數(shù)，1.49微摩爾銅)而被歸一化的在分批培養(yǎng)第4和6天之間的平均比產(chǎn)率。如在圖4中所示，比產(chǎn)率隨著滲透克分子濃度的增加和銅濃度的增加而存在明顯的增加。從來自響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析來看，銅和滲透克分子濃度兩者都顯示出對比產(chǎn)率高度顯著的效果，P＝0.000(任何P＜0.05都視為是顯著的)，但是也在這兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相互作用P＝0.003，見表1。根據(jù)為模型化該數(shù)據(jù)而開發(fā)的方程，比產(chǎn)率在滲透克分子濃度270下隨著銅濃度從0.087到3.78微摩爾的增加而從0.134增加到0.355，而在滲透克分子濃度380下從1.2增加到2.15。同樣地，比產(chǎn)率在0.087微摩爾銅下隨著滲透克分子濃度從270到380的增加而從0.143明顯增加到1.22，而在3.78微摩爾銅下從0.355明顯增加到2.158。表1項(xiàng)CoefSECoefTP常數(shù)1.285620.0305342.1070.000Osmo0.716340.0337221.2450.000Cuppb0.288430.034928.2600.000Osmo*Osmo0.102100.048822.0910.063Cuppb*Cuppb-0.313750.05114-6.1350.0000Osmo*Cuppb0.182230.045534.0020.003表1給出回歸模型方程的系數(shù)，所述回歸模型方程適于作為滲透克分子濃度和銅濃度的函數(shù)所收集的比產(chǎn)率數(shù)據(jù)。如在表1中第一欄所示，方程由一個(gè)常數(shù)、兩個(gè)線性項(xiàng)(Osmo，Cuppb)、三個(gè)非線性項(xiàng)(Osmo*Osmo，Cuppb*Cuppb，Osmo*Cuppb)組成。“Osmo”項(xiàng)表示培養(yǎng)的滲透克分子濃度，而“Cuppb”表示銅濃度。用于每一項(xiàng)的系數(shù)列在第二列(Coef)中，以及那些系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差列在第三列(SECoef)中。第四列是系數(shù)的T統(tǒng)計(jì)量，為系數(shù)除以系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差的商。T值的量級越大，系數(shù)的顯著性也越大。第五欄表示用于每一項(xiàng)的p-值，其小于0.05的值被認(rèn)為表明統(tǒng)計(jì)顯著性。如可在表1中所見，除了Osmo*Osmo項(xiàng)之外的所有項(xiàng)都具有小于0.05的p-值，因此它們都被認(rèn)為是顯著的。以下示出最終的回歸方程。Qp＝1.28562+0.71634*Osmo+0.28843*Cuppb+0.10210*Osmo*Osmo-3.1375*Cuppb*Cuppb+0.18223*Osmo*Cuppb發(fā)明概括在本文中提供增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表達(dá)方法，其包括將銅添加劑用于細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu)選將約0.5微摩爾至約10.0微摩爾的銅添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。0.5微摩爾銅至約10.0微摩爾銅的類似添加提供增加的細(xì)胞比產(chǎn)率。特別優(yōu)選二價(jià)銅離子用作銅添加劑。制備系統(tǒng)由增強(qiáng)的細(xì)胞培養(yǎng)基和哺乳動(dòng)物細(xì)胞組成。在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為CHO、BHK或人哺乳細(xì)胞。不穩(wěn)定的重組蛋白是用于利用基于膜的細(xì)胞截留系統(tǒng)以及銅添加劑進(jìn)行表達(dá)的特別好的候選蛋白。該系統(tǒng)利用灌注細(xì)胞培養(yǎng)對制備凝固性蛋白是有用的，所述凝固性蛋白選自重組因子VIII、B結(jié)構(gòu)域缺失的重組因子VIII、重組因子IX以及rFVII或rFVIIa。添加增加培養(yǎng)基滲透克分子濃度的其它主體離子如鈉和鉀進(jìn)一步增強(qiáng)蛋白表達(dá)。優(yōu)選將所述方法與基于膜的細(xì)胞截留系統(tǒng)和灌注細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合使用。最優(yōu)選的是將該提高的重組蛋白表達(dá)方法應(yīng)用于增加B-結(jié)構(gòu)域缺失的重組FVIII在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，其中將約0.5至約10.0微摩爾二價(jià)銅離子添加至與制備系統(tǒng)一起使用的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述制備系統(tǒng)由與基于膜的外部細(xì)胞截留系統(tǒng)結(jié)合使用的灌注細(xì)胞培養(yǎng)組成。當(dāng)前第1頁1 2 3