一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法。本發(fā)明屬于體外檢測診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種人體內(nèi)的Ox?LDL含量測定的試劑盒及制備與應(yīng)用。其包括固相化有特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白新型配體結(jié)構(gòu)的重組蛋白P.rβ2?GPI?DV或E.coli重組蛋白rβ2?GPI?DV的酶標(biāo)板、不同濃度的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照樣品、質(zhì)控品、酶標(biāo)記的抗體、稀釋液、清洗液、顯色液A、顯色液B和終止液。本發(fā)明所使用的酵母重組蛋白P.rβ2?GPI?DV或E.coli重組蛋白rβ2?GPI?DV通過結(jié)合oxLDL新型配體識別位點檢測的Ox?LDL是具有致動脈粥樣硬化、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病炎癥反應(yīng)的致病性O(shè)x?LDL，對于伴有動脈粥樣硬化、脂質(zhì)代謝異常以及炎癥反應(yīng)特質(zhì)的疾病的精準(zhǔn)輔助診斷具有應(yīng)用價值，本發(fā)明所用檢測儀器簡單，檢測成本低，非專業(yè)人員即可實現(xiàn)檢測操作。
【專利說明】
一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于體外檢測診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種人體內(nèi)的氧化低密度脂蛋白 Ox-LDL含量檢測的試劑盒及制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 低密度脂蛋白LDL是一種存在于血漿中的載脂蛋白，核心組分是甘油三酯和膽固 醇脂，表面分布著載脂蛋白aPO-Β、游離膽固醇和磷脂。在體內(nèi)活性氧、細(xì)胞、過渡金屬、銅藍(lán) 蛋白、過氧化物酶、血紅素、葉綠素以及外界一些敏感因素如，吸煙、藥物、糖尿病和高血壓 等的氧化修飾作用下形成Ox-LDL。在ox-LDL氧化衍生物中氧化磷脂、氧化固醇及修飾改變 的apoB抗體是其發(fā)揮致病性的關(guān)鍵因素。
[0003] 眾多研究指向oxLDL是引發(fā)動脈粥樣硬化、心血管疾病、自身免疫性心血管疾病及 非酒精性脂肪肝病肝炎的生物標(biāo)記物。Ox-LDL作為動脈粥樣硬化劑心血管疾病的獨立危險 因子，廣泛存在于疾病病灶及患者血液中，通過引起內(nèi)皮損傷、血管壁增厚、脂質(zhì)沉積、血酸 形成等系列病例改變貫穿于整個疾病的病程;近年研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性疾病中的抗磷脂 綜合癥(APS)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血液中含有大量的Ox-LDL，可與血液中的糖蛋白 02-GPI、抗02-GPI抗體形成免疫三元復(fù)合物，發(fā)揮促泡沫細(xì)胞形成的病理機(jī)制，參與動脈粥 樣硬化灶的形成[1，2]，近年研究更加顯示oxLDL可能是脂肪肝尤其是非酒精性脂肪肝肝病 中引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥后導(dǎo)致肝炎的脂質(zhì)代謝危險因子因此，人血液、血清以及體液等〇x-LDL含量的準(zhǔn)確檢測對心血管疾病及脂代謝障礙性疾病的預(yù)防、監(jiān)測及早期診斷意義重大。
[0004] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)公開了一些相關(guān)的檢測方法，通過半定量或定量的方式實 現(xiàn) Ox-LDL 檢測，如：專利申請?zhí)枮椋?00710202084.7,201210160797.2,201510263037.8， [0005]以上公開的發(fā)明技術(shù)中，檢測所使用的關(guān)鍵包被固相主體是抗氧化低密度脂蛋白 的單克隆抗體。然而氧化低密度脂蛋白o(hù)xLDL在血液和病灶間的流動性及氧化修飾程度、氧 化修飾衍生物成份復(fù)雜的特點，oxLDL在體內(nèi)以成份不均一的復(fù)合物形式存在，其氧化修飾 衍生物是其發(fā)揮致病新的關(guān)鍵因素，如何準(zhǔn)確達(dá)到識別致病oxLDL的氧化衍生物配體，達(dá)到 精準(zhǔn)檢測oxLDL及對動脈粥樣硬化、心血管疾病、自身免疫性APS和SLE以及非酒精性脂肪肝 等疾病發(fā)展進(jìn)程中的輔助應(yīng)用是本發(fā)明的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種可以特異性結(jié)合致巨噬細(xì)胞泡沫化以及產(chǎn)生炎癥 因子的致病性O(shè)x-LDL檢測的新技術(shù)，這項技術(shù)的核心是一種酵母表達(dá)P.rf2-GPI-DV重組蛋 白特異識別致病性oxLDL表面配體，該表面配體具有介導(dǎo)致病性oxLDL激發(fā)巨噬細(xì)胞和肝細(xì) 胞等表面受體和胞內(nèi)受體，引發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)代謝的異常變化導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心血管和脂 質(zhì)代謝等疾病發(fā)生。該發(fā)明技術(shù)檢測原理清晰，操作簡單、涉及的實驗儀器單一、價格低廉 以及具有精準(zhǔn)檢測oxLDL識別位點的特質(zhì)，是臨床心血管疾病、伴發(fā)動脈粥樣硬化自身免疫 性疾病及脂代謝障礙性疾病診斷有價值的輔助診斷檢測試劑盒。
[0007] -種人體氧化低密度脂蛋白o(hù)xLDL的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括固相化有特異性 結(jié)合oxLDL的重組蛋白的酶標(biāo)板、不同濃度的oxLDL標(biāo)準(zhǔn)對照樣品、質(zhì)控品、酶標(biāo)記的抗體、 稀釋液、清洗液、顯色液A、顯色液B和終止液。
[0008] 進(jìn)一步的，所述的酶標(biāo)板為聚苯乙烯的96微孔板;所述的固相化的特異性重組蛋 白為酵母重組表達(dá)的P.rf2-GPI-DV蛋白；所述的酶標(biāo)記的抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊 抗人的抗apoB抗體;所述的稀釋液為磷酸鹽緩沖液;所述的清洗液為含有吐溫20的磷酸鹽 緩沖液;所述的顯色液A為過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液;所述的顯色液B為鄰苯二胺(oro)溶 液;所述的終止液為硫酸溶液。
[0009] 進(jìn)一步的，所述試劑盒微孔板上固相化的重組蛋白的樣品量為50ug/孔;所述的氧 化低密度脂蛋白o(hù)xLDL標(biāo)準(zhǔn)對照品為6支、各2ml;所述的質(zhì)控品5ml、2支;所述的辣根過氧化 物酶標(biāo)記的羊抗人抗apoB抗體1支、10ul;所述稀釋液10ml、1支;所述清洗液50ml，1支;所述 的顯色液A5ml、1支，顯色液B 10ml、1支;所述的終止液10ml、1支。
[0010] 進(jìn)一步的，所述的氧化低密度脂蛋白o(hù)xLDL標(biāo)準(zhǔn)對照品均為氧化低密度脂蛋白的 純品與氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照比例稀釋而成。所述質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)對照品的區(qū) 別只是濃度不同，所述質(zhì)控品的設(shè)立目的是通過質(zhì)控品檢測值是否在質(zhì)控范圍內(nèi)來對標(biāo)準(zhǔn) 品擬合曲線進(jìn)行核準(zhǔn)校對，若質(zhì)控品合格，則可用標(biāo)準(zhǔn)曲線對檢測樣品進(jìn)行擬合計算樣品 中氧化低密度脂蛋白的濃度，若質(zhì)控品不合格，則試劑盒無法準(zhǔn)確進(jìn)行檢測擬合。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是在PH 7.4的磷酸鹽緩沖液 中，分別加入5%的蔗糖及11]、21]、41]、81]、161]的氧化低密度脂蛋白；所述的氧化低密度脂蛋 白質(zhì)控品是0.5U和20U的氧化低密度脂蛋白純品；所述的1U定義為25yg。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的稀釋液是PH7.4的磷酸鹽緩沖液;所述的清洗液是每升含5ml的 吐溫20;所述的顯色液A是在1M的檸檬酸鹽溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的30%的過氧化氫； 顯色液B是每升中含有10ug的(PD水溶液;所述的終止液是2N的濃硫酸溶液。
[0013] 制備如上任意所述的試劑盒方法，包括以下制備方法，不分前后順序：
[0014] 特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白o(hù)xLDL的P. ri32-GPI-DV重組蛋白的制備:將目的基 因重組到X-33的酵母重組表達(dá)菌株中，在甲醇誘導(dǎo)下產(chǎn)生重組表達(dá)蛋白rf 2-GPI-DV，鎳柱 親和層析獲得純化蛋白凍干成粉后于-80°C保存；
[0015] 氧化低密度脂蛋白純品的制備:取低密度脂蛋白，溶解于1M的磷酸鹽緩沖液中，低 密度脂蛋白的濃度為lmg/ml;在此溶液中加入硫酸銅，使其終含量為1%，37°C ;8h。
[0016] 固相化有重組蛋白微孔板的制備:將濃度為lmg/ml的特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋 白的重組蛋白P.rf2-GPI-DV用PH9.6濃度1M碳酸鹽緩沖液稀釋到濃度為50ug/ml，加入到微 孔板中50ul/孔，4°C固相化12h;然后使用清洗液清洗微孔板4次，每次振搖2min;傾去包被 液，甩干板，再向微孔板中加入1 % gelatin溶液，200ul/孔進(jìn)行37°C，lh封閉；傾去封閉液， 等待微孔板干燥后，加入干燥劑的真空袋封裝，既得到固相化有重組蛋白的酶標(biāo)板，置于4 °C保存。
[0017] 氧化低密度脂蛋白對照標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備：
[0018] (1)氧化低密度脂蛋白純品的制備：
[0019] ①.取準(zhǔn)確濃度（100ug/ml)的低密度脂蛋白一定體積數(shù)量(過濾滅菌），加入到滅 菌培養(yǎng)瓶中；
[0020] ②.加入500uMCuS〇4 · 5H20,使其終濃度達(dá)到5uM(過濾滅菌）；
[0021]③.再加入1M的磷酸鹽緩沖液(PBS，過濾滅菌），加入的體積分?jǐn)?shù)為89% ;培養(yǎng)瓶蓋 半松情況下，37°C，孵育8h。在孵育4h后拿出培養(yǎng)瓶搖晃一下后繼續(xù)孵育至8h;
[0022]④.孵育8h后加入硫酸銅體積一半量的EDTA終止氧化；
[0023]⑤.將終止氧化的氧化液裝入準(zhǔn)備好的透析袋中（100°C沸水煮3次，3min/次）； [0024] ⑥.放入透析液中（含有0.5%200mM EDTA的1M磷酸鹽緩沖液）；
[0025]⑦.將透析袋及透析液放入4°C環(huán)境下，每4h更換一次透析液，更換5次；
[0026]⑧.完成透析后將透析袋中的液體經(jīng)超濾管濃縮、TBARS、BCA測定后過濾滅菌4°C 保存；
[0027] (2)氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備：
[0028]標(biāo)準(zhǔn)品1:含有5%的蔗糖；
[0029 ]標(biāo)準(zhǔn)品2:含有5 %的蔗糖，lU/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0030]標(biāo)準(zhǔn)品3:含有5 %的蔗糖，2U/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0031 ]標(biāo)準(zhǔn)品4:含有5 %的蔗糖，4U/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0032]標(biāo)準(zhǔn)品5:含有5 %的蔗糖，8U/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0033]標(biāo)準(zhǔn)品6:含有5 %的蔗糖，16U/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0034] (3)氧化低密度脂蛋白質(zhì)控品：
[0035]質(zhì)控品1:含有5 %的蔗糖，2.5U/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0036]質(zhì)控品2:含有5 %的蔗糖，10U/ml的氧化低密度脂蛋白純品；
[0037]樣本稀釋液的配制：1M的磷酸鹽緩沖液；
[0038]清洗液的配制:含有0.05 %的1M的磷酸緩沖液；
[0039]顯色液A:含有1 %的濃度為30 %的過氧化氫的1M檸檬酸鹽緩沖液；
[0040]顯色液B:每升中含有l(wèi)OugOH)的水溶液；
[0041 ] 終止液:2N硫酸溶液。
[0042] 本發(fā)明提供了前期所述試劑盒的使用方法，它包含以下步驟：
[0043] (1)樣品稀釋:使用稀釋液按照要求將待測樣品以1:10-1:100的比例稀釋；
[0044] (2)溶液配制：
[0045]標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，復(fù)溶；
[0046] 酶標(biāo)記的抗apoB抗體工作液:用稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋1000~5000倍；
[0047]清洗工作液:用超純水將10X的清洗液稀釋到IX的清洗工作液；
[0048] (3)取固相化有特異性的重組蛋白的酶標(biāo)板，室溫平衡30min后，用清洗工作液洗 滌4次，備用；
[0049] (4)加樣:取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、稀釋好的樣品分別加入微孔板，每孔100ul，37°C下孵 育lh，用清洗液洗滌4次；
[0050] (5)加入酶標(biāo)記的抗體:將酶標(biāo)記的抗apoB抗體1:1000稀釋后垂直加入微孔板底 部，50ul/孔，37°C下孵育lh，用清洗液洗滌4次；
[0051] (6)加入顯色劑：顯色液A、顯色液B以1:9的比例分別加入微孔板，共計100ul/孔， 室溫避光孵育15min;
[0052] (7)加入終止液：10〇111/孔；
[0053] (8)測定吸光度：在酶標(biāo)儀下測定492nm下的吸光度值，測定要求在終止反應(yīng)后 30min中內(nèi)完成。
[0054]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明試劑盒提供了與Ox-LDL特異性結(jié)合的重組蛋白，該蛋 白是一種重組人源P.rf2-GPI-DV蛋白，此蛋白能與Ox-LDL新型識別位點oxLig-Ι特異性結(jié) 合。Ox-LDL氧化新型識別位點oxLig-Ι作為巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞表面清道夫受體CD36的親和 配體以及胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子PPARs的配體，介導(dǎo)oxLDL激活下游炎癥因子NF-κΒ的活化、氧化應(yīng) 激及膽固醇的外流調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)疾病發(fā)生和炎癥病灶的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明所使用的重組 蛋白P. rf32-GP I-DV通過結(jié)合新型識別位點檢測的Ox-LDL是具有致動脈硬化及炎癥反應(yīng)的 致病性O(shè)x-LDL;具有精準(zhǔn)檢測的特性，對于伴有動脈粥樣硬化硬化、脂質(zhì)代謝異常及炎癥反 應(yīng)特質(zhì)的心血管疾病和非酒精性脂肪肝等疾病的診斷具有應(yīng)用價值和良好的市場應(yīng)用前 景，同時，本發(fā)明由于所用的檢測儀器較為簡單，均為通常所用儀器，故檢測成本較低，利于 推廣;并且該試劑盒容易操作，不需要專業(yè)的人員即可實現(xiàn)；同時試劑盒內(nèi)配套標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 液和樣本緩沖液配方，有助于提高檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)可靠性和準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0055]圖1是實施例1重組蛋白與oxLDL特異性配體識別位點oxLig-Ι的分子對接圖 [0056]圖2實施例2、實施例4的冷風(fēng)吹干固相化圖
[0057] 圖3是實施例3的微孔板固相化圖
[0058] 圖4是實施例6氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖 [0059]圖5是實施例7的最優(yōu)酶標(biāo)抗體稀釋度檢測樣本圖
[0060]圖6是實施例8發(fā)明試劑盒的臨床應(yīng)用結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0061]實施例1:重組蛋白與特異性識別位點oxLig-Ι的分子對接：
[0062] (1)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中獲得含配體復(fù)合物的晶 體結(jié)構(gòu)(PDB編號分別為30P8)。將配體從復(fù)合物中剝離抽出，將受體導(dǎo)入到AUT0D0CK 4.2.6 軟件包中進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)修改，包括去除水分子、加入氫原子以及加入Gasteiger-Marsili 電荷等；
[0063] (2)利用AutoDock 4.2.6軟件包對受體此-6?1-0￥和(《1^8-1分子進(jìn)行半柔性對 接;分子對接中敗-GPI-DV與oxLig-Ι分子按1:1比例結(jié)合;在進(jìn)行半柔性對接模擬前，使用 AUT0GRID計算網(wǎng)格，每一次對接所用的網(wǎng)格長、寬和高均為100個網(wǎng)格點，網(wǎng)格包含oxLig-1 分子可能作用的所有活性氨基酸殘基；
[0064] (3)模擬對接過程中此-GPI-DV結(jié)構(gòu)視為剛性，oxLig-Ι分子為柔性，oxLig-Ι分子 內(nèi)的旋轉(zhuǎn)鍵由AUT0D0CK程序識別并可以在搜索過程中任意旋轉(zhuǎn)，分子對接在AutoDock軟件 包中進(jìn)行，對接使用Lamarchian遺傳算法與局部能量搜索相結(jié)合(GALS)對02-GPI-DV-〇xLig-l復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行搜索。
[0065] 實施例2:固相化有重組fe-GPI-DV蛋白的微孔板的制備
[0066] (1 )P · rf2-GPI_DV重組蛋白的制備
[0067] P.ri32-GPI_DV重組蛋白是畢赤酵母體系表達(dá)的重組蛋白，重組表達(dá)過程如下：將 保存于-80的x-33菌株取出，以1:10的比例接種于生長培養(yǎng)基(BMGY)中，經(jīng)過29°C，240的搖 菌生長;再以1:50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，相同條件培養(yǎng)24h后;濃縮至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（BMMY)誘導(dǎo) 表達(dá)，每天補(bǔ)加濃縮液的1 %的甲醇，連續(xù)誘導(dǎo)72h后，收取菌液上清;經(jīng)鎳柱親和層析獲得 高純度的fe-GPI-DV蛋白，將P. rf2-GPI-DV制備成凍干粉，-80°C保存。
[0068] (2)P. rf2-GPI-DV微孔板的固相化
[0069] 將濃度為lmg/ml的特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的P.ri32-GPI-DV重組蛋白用 PH9.6濃度1M碳酸鹽緩沖液稀釋到濃度為50ug/ml，加入到微孔板中50ul/孔，4°C固相化 12h;然后使用清洗液清洗微孔板4次，每次振搖2min;傾去包被液，甩干板，再向微孔板中加 入1 % gelatin溶液，200ul/孔進(jìn)行37 °C，lh封閉；傾去封閉液，等待微孔板干燥后，加入干燥 劑的真空袋封裝，既得到固相化有重組蛋白的酶標(biāo)板，置于4°C保存。
[0070] 實施例3:固相化有E. CO 1 i重組rf2-GPI-DV蛋白的微孔板的制備 [0071]該實施例里面的制備步驟與實施例2基本相同，不同的是：
[0072] 步驟（1 )f32-GPI_DV重組蛋白的制備，fe-GPI-DV重組蛋白原核體系表達(dá)的重組蛋 白，重組表達(dá)過程如下：將保存于-80的原核fe-GPI-DV蛋白表達(dá)菌株取出，以1:10的比例接 種于生長培養(yǎng)基LB中，經(jīng)過37°C，4h的搖菌生長;再加入終濃度5mg/ml的IPTG誘導(dǎo)，連續(xù)誘 導(dǎo)5h后，棄上清收取菌體;超聲破碎后，經(jīng)鎳柱親和層析獲得高純度的rf2-GPI-DV蛋白。 [0073]實施例4:固相化有E. co 1 i重組rf2_GPI-DV蛋白的微孔板的制備 [0074]該實施例與實施例2基本相同，不同的是：
[0075]步驟（2)微孔板固相化中的，將rf2-GPI_DV重組蛋白加入到微孔板后，以冷風(fēng)吹 干、凍干的方式進(jìn)行蛋白的固相化。
[0076]實施例5:通過以下方法制備該試劑盒
[0077]固相化重組蛋白fe-GPI-DV的制備:與實施例2相同；
[0078]重組fe-GPI-DV蛋白固相化的微孔板的制備:與實施例2相同；
[0079]樣本稀釋液的制備：1M磷酸鹽緩沖液，PH7.4;將氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，硫酸氫二 鈉1.42g，磷酸二氫鉀0.27g溶解于1L超純水中，配制成濃度1M的磷酸鹽緩沖液；
[0080]清洗液的制備:含有0.05 %吐溫20，濃度為1M的磷酸鹽緩沖液；
[0081 ]顯色液A: 1M梓檬酸緩沖液:每升中含有86. lg的梓檬酸，173.46g的梓檬酸鈉水溶 液;在1M梓檬緩沖液中加入體積分?jǐn)?shù)為1 %的30 %的過氧化氫；
[0082] 顯色液B:將10ug的oro溶解于1L的超純水中；
[0083]終止液:54ml的濃硫酸緩慢倒入946ml的超純水中得到2N硫酸溶液；
[0084]實施例6:不同濃度的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
[0085] (1)按照氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照樣品0U、1U、2U、4U、8U、16U的濃度要求，使用 lmol/L，PH7.4的磷酸鹽緩沖液將氧化低密度脂蛋白純品稀釋待用；
[0086] (2)固相化有特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白重組蛋白的微孔板制備:濃度為lmg/ ml的特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白用PH9.6濃度1M碳酸鹽緩沖液稀釋到濃度為 50ug/ml，加入到微孔板中50ul/孔，4 °C固相化12h;然后使用清洗液清洗微孔板4次，每次振 搖2min;傾去包被液，甩干板，再向微孔板中加入1 % gelatin溶液，200ul/孔進(jìn)行37 °C，lh封 閉;傾去封閉液;使用清洗液清洗微孔板4次，每次振搖2min，傾去清洗液，甩干板；
[0087] (3)點加樣品：將（1)中準(zhǔn)備好的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照品分別加入到（2)中 準(zhǔn)備好的微孔板中，每個濃度三個孔，37°C孵育lh;
[0088] (4)使用清洗液清洗微孔板4次，每次振搖2min;傾去清洗液，甩干板；
[0089] (5)加入酶標(biāo)記的抗apoB抗體，37 °C孵育lh;
[0090] (6)使用清洗液清洗微孔板4次，每次振搖2min;傾去清洗液，甩干板；
[0091] (7)將顯色液A、B以1:9的比例配制，充分混勻，加入到微孔板共lOOul，室溫顯色 15mim；
[0092] (8)加入100ul的2N硫酸終止液；
[0093] (9)酶標(biāo)儀492nm處測定吸光度值；
[0094] (10)6個濃度的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中標(biāo) 準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.987
[0095] 實施例7:通過以下方法進(jìn)行質(zhì)控品和樣本的檢測：
[0096] ( - )檢測前準(zhǔn)備：
[0097] (1)測定前提前30min從4°C取出試劑盒，室溫下平衡后，用清洗工作液洗滌4次，備 用；
[0098] (2)將清洗工作液:用超純水將10X的清洗液稀釋到IX的清洗工作液；
[0099] (3)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，復(fù)溶；
[0100] (4)酶標(biāo)記的抗apoB抗體工作液:用稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋1000倍；
[0101 ] (5)顯色液配制:將顯色液A、B以1:9的比例配制，充分混勾，如lml顯色液A加9ml顯 色液B，臨用前配制。
[0102](二)測定
[0103] (6)樣品稀釋:用稀釋液將樣品稀釋10-100倍；
[0104] (7)加樣:取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、稀釋好的樣品分別加入微孔板，每孔100ul，37°C下孵 育lh;
[0105] 洗板方法：
[0106]自動洗板:要求每次每孔注入洗滌液300ul，注入與吸出時間間隔lmin;
[0107] 手動洗板:傾去孔內(nèi)液體，每孔加入300ul洗滌液，振搖lmin后，甩掉孔內(nèi)液體，在 吸水紙上拍干；
[0108] (8)用稀釋好的清洗液洗板4次；
[0109] (9)加入酶標(biāo)記的抗體:將酶標(biāo)記的抗apoB抗體1:1000~1:5000的比例稀釋后垂 直加入微孔板底部，50ul/孔，37°C下孵育lh;
[0110] (10)用清洗液洗滌板4次；
[0111] (11)加入顯色劑:將配置好的顯色液混合物加入微孔板，共計l〇〇ul/孔，室溫避光 孵育15min;
[0112] (12)加入終止液：100ul/孔；
[0113] (13)測定吸光度：在酶標(biāo)儀下測定492nm下的吸光度值，測定要求在終止反應(yīng)后 30min中內(nèi)完成。
[0114](三)測定結(jié)果計算
[0115] (14)計算標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和檢測樣品的平均吸光度值；
[0116] (15)以O(shè)U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品為空白對照，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控物和樣品的光吸收值應(yīng)減去空白 對照的光吸收值；
[0117] (16)使用對數(shù)線性圖紙，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫軸，光吸收值的對數(shù)為縱軸，繪 制Ox-LDL濃度-光吸收值雙對數(shù)劑量-反應(yīng)曲線；
[0118] (17)根據(jù)稀釋的待測樣品光吸收值從劑量-反應(yīng)曲線上查出稀釋樣品的OxLDL濃 度；
[0119] (18)樣品中Ox-LDL的最終濃度等于稀釋樣品的濃度乘以稀釋倍數(shù)；
[0120] (19)如果樣品的光吸收值高于16U/ml或低于lU/ml標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值，可適當(dāng)延 長曲線進(jìn)行計算，外推因子(Extrapolation Factor)不超過2;
[0121] 表1實施例5樣品檢測結(jié)果
[0122]
[0123]~從表1可以看出，質(zhì)控品1、2的檢測值均在靶值范圍內(nèi)，所以可以確定結(jié)果可信；， 樣品的檢測值標(biāo)準(zhǔn)偏差比較，CV%不高于15%，說明該技術(shù)發(fā)明有很好的重復(fù)性。
[0124] 實施例8:本發(fā)明試劑盒的臨床應(yīng)用
[0125] 采用該發(fā)明技術(shù)的試劑盒，檢測了 100例正常受試者及50例心梗患者血清Ox-LDL， 結(jié)果顯示，100例受試者血清Ox-LDL含量為25.79 ±3.89U/ml，心梗患者血清Ox-LDL含量為 46.58±6.03U/ml，二者有顯著性差異(0.003)，可快速、精準(zhǔn)的診斷冠心病、心梗患者血清 oxLDL水平，同時實驗顯示與心梗患者的征象診斷成正比關(guān)系。
[0126] 以上的實施例為較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，應(yīng)該理解為凡基于本發(fā)明上 述內(nèi)容所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等均屬于本發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，其包括固相化有 特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白的酶標(biāo)板、不同濃度的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對 照樣品、質(zhì)控品、酶標(biāo)記的抗體、稀釋液、清洗液、顯色液A、顯色液B、終止液； 其中，固相化有特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白的酶標(biāo)板中的酶標(biāo)板為聚苯 乙烯的96微孔板、固相化的特異性重組蛋白為酵母重組表達(dá)的重組蛋白P.rf2-GPI-DV或 E. col i重組蛋白rf32-GPI-DV，試劑盒微孔板上固相化的重組蛋白的數(shù)量為50ug/孔； 質(zhì)控品為含有5%蔗糖的0.5U和20U的氧化低密度脂蛋白純品各2支，每支5ml，其中1U 定義為2.5ug; 酶標(biāo)記的抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人抗apoB抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗 apoB抗體為1支、10ul; 不同濃度的氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照樣品為6支、各2ml，氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)對 照品均為氧化低密度脂蛋白的純品與氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照0U、1U、2U、4U、 8U、16U稀釋而成，，氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是在PH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，分別加 入5%的蔗糖及l(fā)U、2U、4U、8U、16U的氧化低密度脂蛋白，lU定義為25μg; 稀釋液為是PH7.4的磷酸鹽緩沖液，10ml、1支； 清洗液為每升含5ml吐溫20的磷酸鹽緩沖液，50ml，1支； 顯色液A是在1M的檸檬酸鹽溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的30 %的過氧化氫，5ml、1支； 顯色液B是每升中含有10ug的0PD水溶液，10ml、l支； 終止液是2N的濃硫酸溶液，10ml、1支。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征 在于，其制備方法為： (1) 氧化低密度脂蛋白純品的制備： ① .取準(zhǔn)確濃度的低密度脂蛋白一定體積數(shù)量，加入到滅菌培養(yǎng)瓶中； ② .加入500uMCuS〇4 · 5H20,使其終濃度達(dá)到5uM; ③ .再加入1M的磷酸鹽緩沖液(PBS)，加入的體積分?jǐn)?shù)為89% ;培養(yǎng)瓶蓋半松情況下，37 °C，孵育8h，在培養(yǎng)4h后拿出培養(yǎng)瓶搖晃一下； ④ .孵育8h后加入硫酸銅體積一半量的EDTA終止氧化； ⑤ .將終止氧化的氧化液裝入準(zhǔn)備好的透析袋中，100 °C沸水煮3次，3min/次； ⑥ .放入透析液中，透析液為含有0.5 % 200mMEDTA的1M磷酸鹽緩沖液； ⑦ .將透析袋及透析液放入4 °C環(huán)境下，每4h更換一次透析液，更換5次； ⑧ .完成透析后將透析袋中的液體經(jīng)超濾管濃縮、TBARS、BCA測定后4°C保存； (2) 氧化低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備： 標(biāo)準(zhǔn)品1:含有5 %的蔗糖； 標(biāo)準(zhǔn)品2:含有5%的庶糖，lU/ml的氧化低密度脂蛋白純品； 標(biāo)準(zhǔn)品3:含有5 %的庶糖，2U/ml的氧化低密度脂蛋白純品； 標(biāo)準(zhǔn)品4:含有5 %的蔗糖，4U/ml的氧化低密度脂蛋白純品； 標(biāo)準(zhǔn)品5:含有5 %的庶糖，8U/ml的氧化低密度脂蛋白純品； 標(biāo)準(zhǔn)品6:含有5 %的庶糖，16U/ml的氧化低密度脂蛋白純品； (3) 氧化低密度脂蛋白質(zhì)控品的制備： 質(zhì)控品1:含有5 %的蔗糖，2.5U/ml的氧化低密度脂蛋白純品； 質(zhì)控品2:含有5 %的蔗糖，10U/ml的氧化低密度脂蛋白純品； (4)固相化有特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白P.rf2-GPI-DV或E.coli重組蛋 白rf2-GPI-DV微孔板的制備:將濃度為lmg/ml的特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白 用PH9.6濃度1M碳酸鹽緩沖液稀釋到濃度為50ug/ml，加入到微孔板中50ul/孔，4°C相化 12h;然后使用清洗液清洗微孔板4次，每次振搖2min;傾去包被液，甩干板，再向微孔板中加 入1 % gelatin溶液，200ul/孔進(jìn)行37 °C，lh封閉；傾去封閉液，等待微孔板干燥后，加入干燥 劑的真空袋封裝，既得到固相化有特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白P.rf2-GPI-DV 或E.coli重組蛋白rf2-GPI-DV的微孔板，置于4°C保存。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特 征在于，試劑盒的使用方法包含以下步驟： (1) 樣品稀釋:使用稀釋液按照要求將待測樣品以1:10-1:100的比例稀釋； (2) 溶液配制： 標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，復(fù)溶； 酶標(biāo)記的抗apoB抗體工作液:用稀釋液將酶標(biāo)的抗體稀釋1000~5000倍； 清洗工作液:用超純水將10X的清洗液稀釋到IX的清洗工作液； (3) 取固相化有特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白的重組蛋白P. rf2-GPI-DV或E. col i重組 蛋白rf2-GPI -DV的微孔板，室溫平衡30min后，用清洗工作液洗滌4次，備用； (4) 加樣：取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、稀釋好的樣品分別加入微孔板，每孔100ul，37°C下孵育 lh，用清洗液洗滌4次，每次振搖lmin; (5) 加入酶標(biāo)記的抗體:將酶標(biāo)記的抗apoB抗體1:1000稀釋后垂直加入微孔板底部， 50ul/孔，37 °C下孵育lh，用清洗液洗滌4次，每次振搖lmin; (6) 加入顯色劑：顯色液A、顯色液B以1:9的比例分別加入微孔板，共計100ul/孔，室溫 避光孵育15min; (7) 加入終止液：10〇111/孔； (8) 測定吸光度:在酶標(biāo)儀下測定492nm下的吸光度值，測定要求在終止反應(yīng)后30min中 內(nèi)完成。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人體氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征 在于，試劑盒在制備抗磷脂綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化、急性心肌梗塞、非酒精 性脂肪性肝病、高脂血癥、糖尿病和高血壓等疾病診斷試劑的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/535GK105974143SQ201610219116
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】劉慶平, 張鶴, 李敬達(dá), 王仁軍
【申請人】劉慶平