背景在本申請中引用若干出版物和專利文獻，以便更充分地描述本公開內(nèi)容所屬的領(lǐng)域的狀態(tài)。這些出版物和文獻中的每個的公開內(nèi)容通過引用并入本文。利用熒光標(biāo)記物的核酸的非放射性檢測是分子生物學(xué)中的重要的技術(shù)。在重組DNA技術(shù)中采用的許多程序先前主要地依賴于用例如32P放射性地標(biāo)記的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允許核酸和其他感興趣的分子的靈敏檢測。然而，在放射性同位素的使用中存在嚴(yán)重的限制，例如它們的費用、有限的儲存期以及更重要的安全考量。排除對放射性標(biāo)記物的需求提高了安全性，同時降低了與例如試劑處置有關(guān)的環(huán)境影響和成本。服從非放射性熒光檢測的方法通過非限制性實例的方式包括自動DNA測序、雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的實時檢測以及免疫測定。對于許多應(yīng)用，合意的是，采用多重光譜可區(qū)別的熒光標(biāo)記物以便實現(xiàn)多個空間上重疊的分析物的獨立檢測。在此類多重方法中，反應(yīng)容器的數(shù)目可以減少，這簡化了實驗方案并且有助于生產(chǎn)特定應(yīng)用的試劑盒。在多色自動DNA測序中，例如，多重?zé)晒鈾z測允許在單電泳泳道中分析多核苷酸堿基，從而使總處理能力(throughput)增加超過單色方法并且降低與泳道之間的電泳遷移率變化有關(guān)的不確定性。然而，多重?zé)晒鈾z測可能是有問題的并且存在限制熒光標(biāo)記物的選擇的許多重要因素。首先，可能難以發(fā)現(xiàn)發(fā)射光譜在給定的應(yīng)用中被合適地光譜地分辨的染料化合物。此外，當(dāng)若干熒光染料被一起使用時，通過同時激發(fā)在可區(qū)別的光譜區(qū)中產(chǎn)生熒光信號可能是困難的，因為對此可以是可用的染料的吸收帶通常寬泛地被分開，所以難以實現(xiàn)幾乎相等的熒光激發(fā)效率(甚至對于兩種染料)。許多激發(fā)方法使用高功率光源，如激光器并且因此染料必須具有充分的光穩(wěn)定性以經(jīng)受這樣的激發(fā)。分子生物學(xué)方法中特別重要的最終考量是熒光染料必須與使用的試劑化學(xué)品例如比如DNA合成溶劑和試劑、緩沖劑、聚合酶以及連接酶相容的程度。隨著測序技術(shù)發(fā)展，對于另外的熒光染料化合物、其核酸軛合物和滿足所有上文限制并且特別服從高通量分子方法例如固相測序及類似方法的染料組需要開發(fā)。具有改進的熒光性質(zhì)例如熒光帶的熒光強度、形狀和波長最大值的熒光染料分子可以改進核酸測序的速度和精確度。當(dāng)在基于水的生物緩沖劑中并且在較高溫度下做出測量時，強熒光信號是尤其重要的，因為大部分染料的熒光強度在此類條件下是明顯地較低的。此外，染料被附接到其的堿基的性質(zhì)也影響熒光最大值、熒光強度和其他光譜染料性質(zhì)。核堿基(mucleobase)和熒光染料之間的序列特定的相互作用可以通過熒光染料的特定設(shè)計來裁制。熒光染料的結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可以改進核苷酸并入的效率、降低測序誤差的水平并且減少核酸測序中試劑的使用，并且因此降低核酸測序的成本。本文描述改進的多次甲基構(gòu)建體和其作為生物分子標(biāo)記物、特別地作為用于在核酸測序中使用的核苷酸的標(biāo)記物的用途。可以看到在使用新的熒光構(gòu)建體可獲得的標(biāo)記的核苷酸并入的效率和測序讀取的長度方面的具體改進。概述根據(jù)第一方面，本公開內(nèi)容提供式(I)的化合物或其內(nèi)消旋形式：其中mCat+或mAn-是有機或無機的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；Rf是OH或O-；Ra1和Ra2中的每個獨立地是H、SO3-、磺酰胺、鹵素、或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)；其中Ra1或Ra2是磺酰胺或SO3-；并且Rc1和Rc2中的每個獨立地是烷基或被取代的烷基。在某些實施方案中，其中Ra1或Ra2是SO3-；Rc1或Rc2能夠是烷基磺酸基。在另一個實施方案中，本公開內(nèi)容的化合物可以與多種底物部分例如比如核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配體、顆粒、細(xì)胞、半固體表面(例如凝膠)以及固體表面軛合。軛合可以經(jīng)由可以轉(zhuǎn)變成酰胺或酯的羧基CORf進行。因此，根據(jù)本公開內(nèi)容的另外的方面，提供包含連接基以使例如共價附接至此類底物部分成為可能的染料化合物。根據(jù)另外的方面，本公開內(nèi)容提供通過式：N-L-染料定義的核苷化合物或核苷酸化合物，其中N是核苷酸，L是任選的連接基部分并且染料是根據(jù)本公開內(nèi)容的熒光化合物。在另外的方面中，本公開內(nèi)容提供使用本公開內(nèi)容的染料化合物測序的方法。根據(jù)另外的方面，本公開內(nèi)容還提供包含染料化合物(游離的或呈軛合物的形式)的試劑盒，所述試劑盒可以被用于各種免疫測定、寡核苷酸與核酸標(biāo)記以及用于通過合成的DNA測序。在又另一方面中，本公開內(nèi)容提供包含染料‘組’的試劑盒，該試劑盒特別適合于在自動儀器平臺上進行通過合成的測序循環(huán)。本公開內(nèi)容的另外的方面是本公開內(nèi)容的化合物的化學(xué)制備。詳述本公開內(nèi)容提供新穎的化合物，其特別地適合于熒光檢測和通過合成的測序的方法。相比于N-烷基類似物，具有吲哚N-苯基部分的化合物在熒光強度、光穩(wěn)定性方面是有利的并且因此改進某些核酸測序應(yīng)用。根據(jù)第一方面，本公開內(nèi)容提供式(I)的化合物或其內(nèi)消旋形式：其中mCat+或mAn-是有機或無機的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；Rf是OH或O-；Ra1和Ra2中的每個獨立地是H、SO3-、磺酰胺、鹵素、或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)；其中Ra1或Ra2是磺酰胺或SO3-；并且Rc1和Rc2中的每個獨立地是烷基或被取代的烷基；其中當(dāng)Ra1或Ra2是SO3-時，i)Rc1或Rc2是烷基磺酸基，或ii)Ra1或Ra2是磺酰胺。本發(fā)明的可選擇的方面提供式(I)的化合物或其內(nèi)消旋形式：其中mCat+或mAn-是有機或無機的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；Rf是OH或O-；Ra1和Ra2中的每個獨立地是H、SO3-、磺酰胺、鹵素、或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)；其中Ra1或Ra2是磺酰胺或SO3-；并且Rc1和Rc2中的每個獨立地是烷基或被取代的烷基；其中當(dāng)Ra1或Ra2是SO3-時，Rc1或Rc2是烷基磺酸基?？蛇x擇的方面，本公開內(nèi)容提供式(I)的化合物或其內(nèi)消旋形式：其中mCat+或mAn-是有機或無機的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；Rf是OH或O-或其酯軛合物或胺軛合物；Ra1和Ra2中的每個獨立地是H、SO3-、磺酰胺、鹵素、或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)；其中Ra1或Ra2是磺酰胺；并且Rc1和Rc2中的每個獨立地是烷基或被取代的烷基。該分子在位置Ra處可以包含一個或更多個磺酰胺部分或SO3-部分。Ra1和/或Ra2可以是磺酰胺。其他Ra(Ra1或Ra2)可以獨立地是H、SO3-、磺酰胺、鹵素、或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)。Ra1或Ra2可以是H。Ra1或Ra2可以是SO3-。Ra1可以不同于Ra2，例如該結(jié)構(gòu)可以在Ra1處具有單個磺酰胺基團，并且H作為Ra2。Ra1和Ra2兩者均可以是磺酰胺?；酋０房梢允荢O2NH2或SO2NHR，其中R是烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。Ra1或Ra2可以是稠合至吲哚環(huán)的相鄰碳的另外的脂肪族環(huán)、芳香族環(huán)或雜環(huán)。例如，在此類情況下，當(dāng)芳香族環(huán)被稠合時，染料端基可以代表以下類型的結(jié)構(gòu)：其中Rd可以是H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、鹵素、羧基、磺酰胺、或磺酸。因此，本公開內(nèi)容的染料可以通過式(1A)或式(IB)來描述：其中m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；Rf是OH或O-；Rd是H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、鹵素、羧基、磺酰胺、或磺酸；并且Rc1和Rc2中的每個獨立地是烷基或被取代的烷基；其中Rc1或Rc2是烷基磺酸基。在式(IA)或式(IB)中，稠合至吲哚環(huán)的相鄰碳原子的另外的環(huán)可以任選地被例如磺酸或磺酰胺取代?；衔锟梢允牵渲谢酋０肥鞘?II)的結(jié)構(gòu)的一部分：其中Rc1是烷基或被取代的烷基。化合物可以是，其中磺酰胺是式(III)的結(jié)構(gòu)的一部分：其中m是整數(shù)0-3，n是整數(shù)1-5，Rf是OH或O-；并且Rc2是烷基或被取代的烷基。CORf羧基或其衍生物通過長度n的烷基鏈附接至吲哚氮原子，其中n是1-5個碳原子或雜原子。鏈可以是(CH2)n，其中n是1-5?；鶊F可以是(CH2)5COOH。該分子在位置Rc處可以包含一個或更多個烷基磺酸鹽部分。Rc1和/或Rc2可以是烷基-SO3-。其他Rc(Rc1或Rc2)可以獨立地是烷基或被取代的烷基。Rc1和Rc2可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或(CH2)qSO3H，其中q是1-6。q可以是1-4。q可以是4。Rc1和Rc2可以是被取代的烷基。Rc1和Rc2可以包含COOH或-SO3H部分或其酯衍生物或酰胺衍生物。在某些實施方案中，當(dāng)Ra1或Ra2中的一個是SO3-并且Ra1或Ra2中的另一個是H或SO3-時，Rc1或Rc2必須是烷基磺酸基。如果需要，可以從某些權(quán)利要求中放棄其中Ra1或Ra2中的一個是SO3-，并且Ra1或Ra2中的另一個是H或SO3-并且Rc1和Rc2是甲基的化合物。出版物WO2013041117公開了某些化合物，其中Ra1是H或SO3-，Ra2是SO3-并且Rc1和Rc2是甲基。此出版物沒有公開其中Rc是烷基磺酸基的分子。此出版物沒有公開其中Ra是磺酰胺的分子。COOH基團可以充當(dāng)用于進一步附接至另外的分子的連接部分或被連接至另外的分子。在已經(jīng)發(fā)生軛合之后，COOH或COO-可以轉(zhuǎn)變成酰胺或酯。化合物的實例包括根據(jù)式(IV)的結(jié)構(gòu)：或其鹽，其中mCat+或mAn-是有機或無機的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；并且Rc1和Rc2中的每個獨立地是烷基或被取代的烷基?；衔锏牧硗獾膶嵗ǜ鶕?jù)式(IVa)至式(IVd)的結(jié)構(gòu)：或其鹽，其中mCat+或mAn-是有機或無機的帶正電荷/帶負(fù)電荷的反離子，并且m是整數(shù)0-3；n是整數(shù)1-5；并且q是從1-6的整數(shù)。特別有用的化合物是用如本文描述的染料標(biāo)記的核苷酸或寡核苷酸。標(biāo)記的核苷酸或寡核苷酸可以具有經(jīng)由烷基羧基附接至吲哚的氮原子以形成酰胺的標(biāo)記物。標(biāo)記的核苷酸或寡核苷酸可以具有通過連接基部分附接至嘧啶堿基的C5位或7-脫氮嘌呤堿基(7-deazapurinebase)的C7位的標(biāo)記物。標(biāo)記的核苷酸或寡核苷酸還可以具有共價地附接至核苷酸的核糖或脫氧核糖的阻斷基團(blockinggroup)。阻斷基團可以在核糖或脫氧核糖的任何位置處被附接。在特定的實施方案中，阻斷基團在核苷酸的核糖或脫氧核糖的3’OH位。本文提供包含兩種或更多種核苷酸的試劑盒，其中至少一種核苷酸是用本公開內(nèi)容的化合物標(biāo)記的核苷酸。試劑盒可以包含兩種或更多種標(biāo)記的核苷酸。核苷酸可以用兩種或更多種熒光標(biāo)記物來標(biāo)記?？梢允褂脝渭ぐl(fā)源激發(fā)標(biāo)記物中的兩種或更多種，所述單激發(fā)源可以是激光器。例如，兩種或更多種標(biāo)記物的激發(fā)帶可以是至少部分重疊的，使得在光譜的重疊區(qū)中的激發(fā)引起兩種標(biāo)記物均發(fā)射熒光。在特定的實施方案中，來自兩種或更多種標(biāo)記物的發(fā)射將在光譜的不同區(qū)域中發(fā)生，使得標(biāo)記物中的至少一種的存在可以通過光學(xué)地區(qū)別該發(fā)射而確定。試劑盒可以包含四種標(biāo)記的核苷酸，其中四種核苷酸中的第一核苷酸用如本文公開的化合物標(biāo)記。在這樣的試劑盒中，第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸可以各自用任選地不同于第一核苷酸上的標(biāo)記物且任選地不同于彼此上的標(biāo)記物的化合物標(biāo)記。因此，化合物中的一種或更多種可以具有有區(qū)別的吸光度最大值和/或發(fā)射最大值，使得該化合物與其他化合物是可區(qū)別的。例如，每種化合物可以具有有區(qū)別的吸光度最大值和/或發(fā)射最大值，使得化合物中的每種與其他三種化合物是可區(qū)別的。將理解的是，除了最大值之外的吸光度光譜和/或發(fā)射光譜的部分可以不同并且這些差異可以被利用以區(qū)別化合物。試劑盒可以為使得化合物中的兩種或更多種具有高于600nm的有區(qū)別的吸光度最大值。本發(fā)明的化合物典型地吸收在高于640nm的區(qū)域中的光。本文陳述的化合物、核苷酸或試劑盒可以被用于檢測、測量或確定生物系統(tǒng)(包括，例如其過程或其組分)。可以采用化合物、核苷酸或試劑盒的示例性技術(shù)包括測序、表達分析、雜交分析、基因分析、RNA分析、細(xì)胞測定(例如，細(xì)胞結(jié)合或細(xì)胞功能分析)或蛋白質(zhì)測定(例如，蛋白質(zhì)結(jié)合測定或蛋白質(zhì)活性測定)。用途可以是在用于進行特定技術(shù)的自動儀器上進行，例如自動測序儀器。測序儀器可以包括在不同的波長下操作的兩種激光器。本文公開合成本公開內(nèi)容的化合物的方法。式(X)和/或式(X1)、式(X2)的化合物或其鹽可以被用作用于合成對稱的或不對稱的多次甲基染料的起始材料：或其鹽，其中Ra是H、SO3-、磺酰胺、鹵素或稠合至相鄰碳原子的另外的環(huán)；R1、R2、R3和R4獨立地是H、烷基或芳基；Rc2是烷基或被取代的烷基；Ar是芳香族基團并且R是烷基。本文公開合成本公開內(nèi)容的化合物的方法。式(X3)、式(X4)或式(X5)的化合物或其鹽可以被用作用于合成對稱的或不對稱的多次甲基染料的起始材料：或其鹽，其中n是整數(shù)1-5；Rc2是烷基或被取代的烷基；Ar是芳香族基團并且R是烷基。如本文所使用的，術(shù)語“烷基”指的是C1-C20烴并且可以包括C3-C10非芳香族的碳環(huán)。在特定的實施方案中，烷基是C1-C6烷基，所述C1-C6烷基指的是分別包含一個和六個之間的碳原子的飽和的、直鏈的或支鏈的烴基。烷基可以包含一個或更多個不飽和的基團，并且因此包括烯基和炔基。如本文所使用的術(shù)語“鹵素”指的是氟-(下文中指定為F)、氯-(下文中指定為Cl)、溴-(下文中指定為Br)或碘-(下文中指定為I)，并且通常涉及有機化合物中氫原子的取代，此取代任選地是氫的完全取代。術(shù)語“被取代的烷基”，指的是如上文定義的烷基、烯基或炔基，其中它們可以任選地被(但不限于)鹵素、氰基、SO3-、SRa、ORa、NRbRc、氧代、CONRbRc、COOH以及COORb進一步取代。Ra、Rb和Rc可以各自獨立地選自：H、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基以及被取代的芳基。另外，所述被取代的烷基、被取代的烯基和被取代的炔基可以任選地通過選自：O、NRb、S(O)t(其中t是0至2)以及類似物的至少一個雜原子或基團來中斷。被取代的烷基還覆蓋比如芐基的基團，其中烷基包含另外的芳基或被取代的芳基部分。根據(jù)本公開內(nèi)容的染料可以從包括N-苯基吲哚的多種不同的起始材料合成。染料可以被對稱地制備，使得相同的吲哚在三次甲基鏈的兩端；或被不對稱地制備，使得不同的吲哚在發(fā)色團的任一端。用于制備多次甲基染料的方法是本領(lǐng)域熟知的。根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供適合于附接至底物部分的染料化合物，所述染料化合物特別地包含能夠附接至底物部分的連接基。實際上，底物部分可以是本公開內(nèi)容的染料可以被軛合至的任何分子或物質(zhì)，并且通過非限制性實例的方式，底物部分可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配體、顆粒、固體表面、有機的和無機的聚合物、染色體、細(xì)胞核、活細(xì)胞以及其組合或集合物。染料可以通過包括疏水吸引力、離子吸引力和共價附接的多種手段被任選的連接基軛合。特別地，染料通過共價附接被軛合至底物。更特別地，共價附接借助于連接基。染料化合物至底物的軛合可以經(jīng)由可以轉(zhuǎn)變成酰胺或酯的羧基CORf進行。根據(jù)本公開內(nèi)容的染料可以在取代位置中的一個處包含反應(yīng)性連接基，用于染料至另一個分子的共價附接。反應(yīng)性連接基是能夠形成鍵(例如，共價鍵或非共價鍵)的部分。在特定的實施方案中，連接基可以是可裂解的連接基。術(shù)語“可裂解的連接基”的使用不意指意味著整個連接基需要被除去。裂解位點可以位于導(dǎo)致連接基的一部分在裂解之后保持附接至染料和/或底物部分的連接基上的位置處。通過非限制性實例的方式，可裂解的連接基可以是親電性可裂解的連接基、酶促可裂解的連接基、親核性可裂解的連接基、光可裂解的連接基、在還原條件(例如包含二硫化物或疊氮化物的連接基)、氧化條件下可裂解的、經(jīng)由保險栓(safety-catch)連接基的使用可裂解的以及通過消除機制可裂解的。使用可裂解的連接基以將染料化合物附接至底物部分提供除去標(biāo)記物的選擇，例如在檢測之后，從而避免下游步驟中的任何干擾信號。可以在PCT公布號WO2004/018493(通過引用并入本文)中發(fā)現(xiàn)有用的連接基，所述連接基的實例包括可以使用水溶性膦或由過渡金屬和至少部分地水溶性配體形成的水溶性過渡金屬催化劑裂解的連接基。在水溶液中，后者形成至少部分地水溶性的過渡金屬絡(luò)合物。此類可裂解的連接基可以被用于將核苷酸的堿基連接至標(biāo)記物，例如本文陳述的染料?？梢栽赑CT公布號WO2004/018493(通過引用并入本文)中發(fā)現(xiàn)特別的連接基，例如包含下式的部分的那些連接基：(其中X選自包括O、S、NH和NQ的基團，其中Q是C1-10被取代的或未被取代的烷基，Y選自包括O、S、NH和N(烯丙基)的基團，T是氫或C1-C10被取代的或未被取代的烷基并且*指示該部分被連接至核苷酸或核苷的剩余部分)。在特定的實施方案中，相比于通過本領(lǐng)域已知的其他連接附接至鳥嘌呤堿基的相同的熒光團，熒光染料(熒光團)和鳥嘌呤堿基之間的連接基的長度可以例如通過引入聚乙二醇間隔基來改變，從而增加熒光強度。示例性連接基和其性質(zhì)被陳述在公布為WO07020457的英國專利申請第0517097.2號(通過引用并入本文)中。連接基的設(shè)計以及尤其其增加的長度可以允許附接至鳥苷核苷酸的鳥嘌呤堿基的熒光團在被并入多核苷酸例如DNA中時的亮度的改進。因此，當(dāng)染料用于在采用附接至包含鳥嘌呤的核苷酸的熒光染料標(biāo)記物的檢測的任何分析方法中時，使用具有式-((CH2)2O)n-的間隔基的連接基可以是有利的，其中n是2和50之間的整數(shù)，例如，如在WO07020457中所描述。本公開內(nèi)容還提供用本文陳述的染料中的一種或更多種標(biāo)記的核苷和核苷酸的軛合物(改性的核苷酸)。標(biāo)記的核苷和核苷酸對于標(biāo)記通過酶促合成形成的多核苷酸是有用的，例如，通過非限制性實例的方式，在PCR擴增、等溫擴增、固相擴增、多核苷酸測序(例如固相測序)、切口平移反應(yīng)及類似過程中。核苷和核苷酸可以在糖或核堿基上的位點處被標(biāo)記。如本領(lǐng)域已知的，“核苷酸”由含氮堿基、糖和一個或更多個磷酸酯基組成。在RNA中，糖是核糖并且在DNA中糖是脫氧核糖，即缺少存在于核糖中的羥基的糖。含氮堿基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤可以是腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，并且嘧啶可以是胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)，或在RNA的情形下是尿嘧啶(U)。脫氧核糖的C-1原子與嘧啶的N-1或嘌呤的N-9結(jié)合。核苷酸還是核苷的磷酸酯，在附接至糖的C-3或C-5的羥基上發(fā)生酯化。核苷酸通常是一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯?！昂塑铡痹诮Y(jié)構(gòu)上與核苷酸類似但沒有磷酸酯部分。核苷類似物的實例將是其中標(biāo)記物被連接至堿基并且不存在附接至糖分子的磷酸酯基的核苷。雖然堿基通常被稱為嘌呤或嘧啶，但技術(shù)人員將理解，不改變核苷酸或核苷經(jīng)歷沃森-克里克堿基配對(Watson-Crickbasepairing)的能力的衍生物和類似物是可用的?！把苌铩被颉邦愃莆铩币庵感窘Y(jié)構(gòu)與母體化合物的芯結(jié)構(gòu)相同或非常相似但具有化學(xué)改性或物理改性(例如比如允許衍生的核苷酸或核苷被連接至另一個分子的不同的或另外的側(cè)基)的化合物或分子。例如，堿基可以是脫氮嘌呤。在特定的實施方案中，衍生物能夠經(jīng)歷沃森-克里克配對。“衍生物”和“類似物”還包括例如具有改性的堿基部分和/或改性的糖部分的合成的核苷酸衍生物或核苷衍生物。此類衍生物和類似物在例如Scheit,Nucleotideanalogs(JohnWiley&Son,1980)和Uhlman等人ChemicalReviews90:543-584,1990中被討論。核苷酸類似物還可以具有改性的磷酸二酯鍵，包括硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、磷苯酰胺鍵(phosphoranilidatelinkage)、磷酰胺鍵及類似鍵。染料可以例如通過連接基附接至核苷酸堿基上的任何位置。在特定的實施方案中，對于所產(chǎn)生的類似物，沃森-克里克堿基配對仍然可以進行。特別的核堿基標(biāo)記位點包括嘧啶堿基的C5位或7-脫氮嘌呤堿基的C7位。如上文所描述的，連接基可以被用于將染料共價地附接至核苷或核苷酸。在特定的實施方案中，標(biāo)記的核苷或核苷酸可以是酶促地可并入的和酶促地可延伸的。因此，連接基部分可以具有充分的長度以將核苷酸連接至化合物，使得該化合物不明顯地干擾核苷酸通過核酸復(fù)制酶的總結(jié)合和識別。因此，連接基還可以包含間隔基單元。例如，間隔基使核苷酸堿基遠(yuǎn)離裂解位點或標(biāo)記物。用本公開內(nèi)容的染料標(biāo)記的核苷或核苷酸可以具有下式：其中染料是根據(jù)本公開內(nèi)容的染料化合物，B是核堿基，例如比如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤及類似物，并且L是可以存在或可以不存在的任選的連接基。R’可以是H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯類似物、附接至反應(yīng)性含磷基團的-O-或被阻斷基團保護的-O-。R”可以是H、OH、亞磷酰胺或3'OH阻斷基團并且R”’是H或OH。在R”是亞磷酰胺的情況下，R’是酸可裂解的羥基保護基，所述酸可裂解的羥基保護基允許在自動合成條件下的隨后的單體偶聯(lián)。在特定的實施方案中，阻斷基團是單獨的并且獨立于染料化合物，即不直接附接至染料化合物。在可選擇的實施方案中，染料可以包含3'OH阻斷基團的全部或一部分。因此，R”可以是可以包含或可以不包含本文公開的染料化合物的3'OH阻斷基團。在還另一可選擇的實施方案中，在戊糖的3'碳上不存在阻斷基團，并且例如，附接至堿基的染料(或染料構(gòu)建體和連接基構(gòu)建體)可以具有足以充當(dāng)另外的核苷酸的并入的阻斷物的大小或結(jié)構(gòu)。因此，阻斷可以是由于立體位阻或可以是由于大小、電荷和結(jié)構(gòu)的組合，無論染料是否被附接至糖的3'位。在還另一可選擇的實施方案中，阻斷基團存在于戊糖的2'碳或4'碳上并且可以具有足以充當(dāng)另外的核苷酸的并入的阻斷物的大小或結(jié)構(gòu)。當(dāng)改性的核苷酸被并入時，阻斷基團的使用允許聚合例如通過終止延伸來控制。如果阻斷作用例如通過非限制性實例的方式通過改變化學(xué)條件或通過除去化學(xué)阻斷物是可逆的，那么延伸可以在某些點停止并且然后允許繼續(xù)。在另一個特定的實施方案中，3'OH阻斷基團將包含WO2004/018497(通過引用并入本文)中公開的部分。例如，阻斷基團可以是疊氮甲基(CH2N3)或烯丙基。在特定的實施方案中，連接基(染料和核苷酸之間)和阻斷基團兩者均存在并且是單獨的部分。在特定的實施方案中，連接基和阻斷基團兩者在大體上類似的條件下是可裂解的。因此，脫保護和脫阻斷過程可以是更有效的，因為將僅需要單次處理來除去染料化合物和阻斷物兩者。然而，在某些實施方案中，連接基和阻斷基團不需要是在類似的條件下可裂解的，而在有區(qū)別的條件下是單獨地可裂解的。本公開內(nèi)容還涵蓋并入染料化合物的多核苷酸。此類多核苷酸可以是分別包含以磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的DNA或RNA。根據(jù)本公開內(nèi)容的多核苷酸可以包括與本文陳述的至少一種改性的核苷酸(例如用染料化合物標(biāo)記的)組合的天然存在的核苷酸、不同于本公開內(nèi)容的改性的核苷酸的非天然存在的(或改性的)核苷酸或其任何組合。根據(jù)本公開內(nèi)容的多核苷酸還可以包括非天然骨架連接和/或非核苷酸化學(xué)改性。還預(yù)期包括包含根據(jù)本公開內(nèi)容的至少一種改性的核苷酸的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的混合物的嵌合結(jié)構(gòu)。包含根據(jù)本公開內(nèi)容的染料化合物的改性的核苷酸(或核苷)可以在任何分析方法中被使用，例如包括檢測附接至核苷酸或核苷的熒光標(biāo)記物(無論以其自身或并入較大分子結(jié)構(gòu)或軛合物中或與較大分子結(jié)構(gòu)或軛合物締合)的方法。在本上下文中，術(shù)語“并入多核苷酸中”可以意指，5'磷酸酯以磷酸二酯鍵連接至自身可以形成較長多核苷酸鏈的一部分的第二(改性的或未改性的)核苷酸的3'羥基。本文陳述的改性的核苷酸的3'末端可以或可以不以磷酸二酯鍵連接至另外的(改性的或未改性的)核苷酸的5'磷酸酯。因此，在一個非限制性實施方案中，本公開內(nèi)容提供檢測并入到多核苷酸中的改性的核苷酸的方法，所述方法包括：(a)將本公開內(nèi)容的至少一種改性的核苷酸并入到多核苷酸中，以及(b)通過檢測來自附接至所述改性的核苷酸的染料化合物的熒光信號而檢測并入到多核苷酸中的改性的核苷酸。此方法可以包括：合成步驟(a)，其中將根據(jù)本公開內(nèi)容的一種或更多種改性的核苷酸并入到多核苷酸中；以及檢測步驟(b)，其中并入到多核苷酸中的一種或更多種改性的核苷酸通過檢測或定量地測量它們的熒光來檢測。在本公開內(nèi)容的一個實施方案中，至少一種改性的核苷酸在合成步驟中通過聚合酶的作用并入到多核苷酸中。然而，可以使用將改性的核苷酸連接至多核苷酸的其他方法，例如比如，化學(xué)寡核苷酸合成或標(biāo)記的寡核苷酸與未標(biāo)記的寡核苷酸的連接。因此，當(dāng)關(guān)于核苷酸和多核苷酸使用時，術(shù)語“并入”可以涵蓋通過化學(xué)方法以及酶促方法的多核苷酸合成。在特定的實施方案中，合成步驟被進行并且可以任選地包括用包含本公開內(nèi)容的熒光標(biāo)記的改性的核苷酸的反應(yīng)混合物溫育模板多核苷酸鏈。還可以在以下條件下提供聚合酶，所述條件允許在退火為模板多核苷酸鏈的多核苷酸鏈上的游離3'羥基和改性的核苷酸上的5'磷酸酯基之間形成磷酸二酯鍵。因此，合成步驟可以包括如通過核苷酸與模板鏈的互補的堿基配對引導(dǎo)的多核苷酸鏈的形成。在本方法的所有實施方案中，在將改性的核苷酸并入到其中的多核苷酸鏈被退火成模板鏈的同時，或在其中使兩種鏈分開的變性步驟之后，可以進行檢測步驟。另外的步驟，例如化學(xué)反應(yīng)步驟或酶促反應(yīng)步驟或純化步驟可以被包括在合成步驟和檢測步驟之間。特別地，并入改性的核苷酸的靶鏈(targetstrand)可以被分離或純化并且然后被進一步加工或在隨后的分析中被使用。通過實例的方式，在合成步驟中用改性的核苷酸標(biāo)記的靶多核苷酸可以隨后被用作標(biāo)記的探針或引物。在其他實施方案中，本文陳述的合成步驟的產(chǎn)物可以經(jīng)受另外的反應(yīng)步驟，并且如果需要，這些隨后步驟的產(chǎn)物可以被純化或分離。用于合成步驟的合適的條件對于熟悉標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的人員將是熟知的。在一個實施方案中，合成步驟可以類似于標(biāo)準(zhǔn)引物延伸反應(yīng)，使用包括本文陳述的改性的核苷酸的核苷酸前體，以在合適的聚合酶的存在下形成與模板鏈互補的延伸的靶鏈。在其他實施方案中，合成步驟本身可以形成產(chǎn)生標(biāo)記的雙鏈的擴增產(chǎn)物的擴增反應(yīng)的一部分，所述標(biāo)記的雙鏈的擴增產(chǎn)物包括源自靶多核苷酸鏈和模板多核苷酸鏈的復(fù)制的退火的互補鏈。其他示例性合成步驟包括切口平移、鏈置換聚合、隨機引導(dǎo)的DNA標(biāo)記(randomprimedDNAlabelling)等等。用于合成步驟的特別有用的聚合酶是能夠催化本文陳述的改性的核苷酸中的一種或更多種的并入的聚合酶。可以使用多種天然存在的或改性的聚合酶。通過實例的方式，熱穩(wěn)定聚合酶可以被用于使用熱循環(huán)條件進行的合成反應(yīng)，然而熱穩(wěn)定聚合酶對于等溫引物延伸反應(yīng)可能不是期望的。能夠并入根據(jù)本公開內(nèi)容的改性的核苷酸中的合適的熱穩(wěn)定聚合酶包括在WO2005/024010或WO06120433(其各自通過引用并入本文)中描述的那些。在于較低溫度例如37℃下進行的合成反應(yīng)中，聚合酶不一定需要是熱穩(wěn)定聚合酶，因此聚合酶的選擇將取決于許多因素，例如反應(yīng)溫度、pH、鏈置換活性以及類似因素。在特定的非限制性實施方案中，本公開內(nèi)容涵蓋核酸測序、再測序、全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性評分的方法、或包括當(dāng)并入到多核苷酸中時檢測用本文陳述的染料標(biāo)記的改性的核苷酸或核苷的任何其他應(yīng)用。受益于用包含熒光染料的改性的核苷酸標(biāo)記的多核苷酸的使用的多種其他應(yīng)用中的任一種可以使用用本文陳述的染料標(biāo)記的改性的核苷酸或核苷。在特定的實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含根據(jù)本公開內(nèi)容的染料化合物的改性的核苷酸在通過合成反應(yīng)的多核苷酸測序中的用途。通過合成測序一般包括使用聚合酶或連接酶在5’至3’方向上將一種或更多種核苷酸或寡核苷酸相繼添加至生長的多核苷酸鏈，以便形成與待被測序的模板核酸互補的延伸的多核苷酸鏈。存在于添加的核苷酸中的一種或更多種中的堿基的同一性可以在檢測步驟或“成像”步驟中被確定。添加的堿基的同一性可以在每個核苷酸并入步驟之后被確定。然后，模板的序列可以使用常規(guī)的沃森-克里克堿基配對法則來推論。例如，在單核苷酸多態(tài)性的評分中，使用用本文陳述的染料標(biāo)記的改性的核苷酸用于確定單堿基的同一性可以是有用的，并且此類單堿基延伸反應(yīng)在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。在本公開內(nèi)容的實施方案中，通過經(jīng)由檢測附接至并入的核苷酸的熒光標(biāo)記物來檢測將一種或更多種核苷酸并入到與待被測序的模板多核苷酸互補的新生鏈中，從而確定模板多核苷酸的序列。模板多核苷酸的測序可以用合適的引物來引發(fā)(或被制備為將包含作為發(fā)夾的部分的引物的發(fā)夾構(gòu)建體)，并且新生鏈通過在聚合酶催化的反應(yīng)中將核苷酸添加至引物的3'末端以逐步方式延伸。在特定的實施方案中，不同的核苷酸三磷酸酯(A、T、G和C)中的每個可以用獨特的熒光團來標(biāo)記并且還包含在3’位的阻斷基團以阻止不受控制的聚合?？蛇x擇地，四種核苷酸中的一種可以是未被標(biāo)記(深色的)。聚合酶使核苷酸并入與模板多核苷酸互補的新生鏈中，并且阻斷基團阻止核苷酸的進一步并入。任何未并入的核苷酸可以被洗去，并且來自每個并入的核苷酸的熒光信號可以通過合適的手段例如使用激光器激發(fā)和合適的發(fā)射濾光器的電荷耦合裝置被光學(xué)地“讀取”。然后，可以除去(脫保護)3'阻斷基團和熒光染料化合物(同時地或相繼地)，以暴露新生鏈用于進一步的核苷酸并入。通常，并入的核苷酸的同一性將在每個并入步驟之后被確定，但這不是嚴(yán)格地必要的。類似地，美國專利第5,302,509號(其通過引用并入本文)公開測序固定在固體支撐體上的多核苷酸的方法。如上文所示例，該方法利用在DNA聚合酶的存在下將熒光標(biāo)記的、3'阻斷的核苷酸A、G、C和T并入到與固定的多核苷酸互補的生長的鏈中。聚合酶并入與靶多核苷酸互補的堿基，但通過3’-阻斷基團來阻止進一步的添加。然后，并入的核苷酸的標(biāo)記物可以被確定并且阻斷基團通過化學(xué)裂解除去以允許進一步的聚合發(fā)生。在通過合成反應(yīng)的測序中待被測序的核酸模板可以是期望測序的任何多核苷酸。用于測序反應(yīng)的核酸模板將典型地包含具有游離的3’羥基的雙鏈區(qū)，所述游離的3’羥基在測序反應(yīng)中充當(dāng)用于另外的核苷酸的添加的引物或起始點。待被測序的模板的區(qū)域?qū)⑹勾擞坞x的3’羥基懸垂于互補鏈上。待被測序的模板的懸垂區(qū)域可以是單鏈的，但可以是雙鏈的，條件是，“切口存在”于與待被測序的模板鏈互補的鏈上以提供用于引發(fā)測序反應(yīng)的游離的3’OH基團。在此類實施方案中，測序可以通過鏈置換進行。在某些實施方案中，具有游離的3’羥基的引物可以作為與待被測序的模板的單鏈區(qū)雜交的單獨組分(例如，短寡核苷酸)被添加?？蛇x擇地，引物和待被測序的模板鏈可以各自形成能夠形成分子內(nèi)雙鏈體(duplex)例如比如發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的部分地自補的核酸鏈的一部分。發(fā)夾多核苷酸和發(fā)夾多核苷酸可以通過其附接至固體支撐體的方法在國際申請公布第WO0157248號和第WO2005/047301號(其各自通過引用并入本文)中被公開。核苷酸可以連續(xù)地添加至生長的引物，導(dǎo)致多核苷酸鏈在5'至3'方向上的合成。已經(jīng)被添加的堿基的性質(zhì)可以特別地但不一定地在每次核苷酸添加之后被確定，因此為核酸模板提供序列信息。因此，通過經(jīng)由與核苷酸的5'磷酸酯基形成磷酸二酯鍵而將核苷酸連接至核酸鏈的游離3'羥基，將核苷酸并入到核酸鏈(或多核苷酸)中。待被測序的核酸模板可以是DNA或RNA，或甚至是包括脫氧核苷酸和核糖核苷酸的雜交分子。核酸模板可以包含天然存在的和/或非天然存在的核苷酸以及天然的或非天然的骨架連接，條件是這些不阻止測序反應(yīng)中的模板的復(fù)制。在某些實施方案中，待被測序的核酸模板可以經(jīng)由本領(lǐng)域已知的任何合適的連接方法例如經(jīng)由共價附接附接至固體支撐體。在某些實施方案中，模板多核苷酸可以直接地附接至固體支撐體(例如基于二氧化硅的支撐體)。然而，在本公開內(nèi)容的其他實施方案中，固體支撐體的表面可以以某種方式來改性，以便允許模板多核苷酸的直接共價附接，或以便通過自身可以非共價地附接至固體支撐體的水凝膠或聚合電解質(zhì)多層固定模板多核苷酸。其中多核苷酸已經(jīng)被直接地附接至基于二氧化硅的支撐體的陣列是例如在WO00006770(通過引用并入本文)中公開的陣列，其中多核苷酸通過玻璃上的下垂環(huán)氧基與多核苷酸上的內(nèi)部氨基之間的反應(yīng)來固定在玻璃支撐體上。此外，多核苷酸可以通過基于硫的親核試劑與固體支撐體的反應(yīng)來附接至固體支撐體，例如，如在WO2005/047301(通過引用并入本文)中描述的。固體支撐的模板多核苷酸的還另外的實例是其中模板多核苷酸被附接至被支撐在基于二氧化硅的或其他的固體支撐體上的水凝膠，例如，如在WO00/31148、WO01/01143、WO02/12566、WO03/014392、美國專利第6,465,178號和第WO00/53812號中描述的，這些專利中的每個通過引用并入本文。模板多核苷酸可以被固定至的特定的表面是聚丙烯酰胺水凝膠。聚丙烯酰胺水凝膠在上文引用的參考文獻中和在WO2005/065814(其通過引用并入本文)中被描述。DNA模板分子可以被附接至珠或微顆粒，例如，如在美國專利第6,172,218號(其通過引用并入本文)中描述的。附接至珠或微顆粒對于測序應(yīng)用可以是有用的。珠庫可以被制備，其中每個珠包含不同的DNA序列。示例性庫和用于其產(chǎn)生的方法在Nature.437,376-380(2005)；Science.309,5741,1728-1732(2005)(其各自通用引用并入本文)中被描述。使用本文陳述的核苷酸的此類珠的陣列的測序在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。待被測序的模板可以形成在固體支撐體上的“陣列”的一部分，在此情況下，陣列可以采取任何便利的形式。因此，本公開內(nèi)容的方法對于所有類型的高密度陣列，包括單分子陣列、成簇的陣列和珠陣列是可應(yīng)用。用本公開內(nèi)容的染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸可以被用于測序在本質(zhì)上任何類型的陣列(包括但不限于通過使核酸分子固定在固體支撐體上形成的陣列)上的模板。然而，用本公開內(nèi)容的染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸在測序成簇的陣列的上下文中是特別有利的。在成簇的陣列中，陣列上有區(qū)別的區(qū)域(常稱為位點或特征)包含多個多核苷酸模板分子。通常，多個多核苷酸分子通過光學(xué)手段單獨地不是可分辨的并且代替地作為總體被檢測。取決于陣列如何形成，陣列上的每個位點可以包含一個單獨的多核苷酸分子的多個拷貝(例如，位點對于特別的單鏈核酸物種或雙鏈核酸物種是同質(zhì)的)或甚至小數(shù)目的不同的多核苷酸分子的多個拷貝(例如，兩個不同的核酸物種的多個拷貝)。核酸分子的成簇的陣列可以使用本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)來產(chǎn)生。通過實例的方式，WO98/44151和WO00/18957(其各自被并入本文)描述了核酸擴增的方法，其中模板和擴增產(chǎn)物兩者均保持固定在固體支撐體上，以便形成包括固定的核酸分子的簇或“集群”的陣列。存在于根據(jù)這些方法制備的成簇的陣列上的核酸分子是用于使用用本公開內(nèi)容的染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸測序的合適的模板。用本公開內(nèi)容的染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸在測序單分子陣列上的模板中也是有用的。如本文所使用的術(shù)語“單分子陣列”或“SMA”指的是分布(或排列)在固體支撐體上的多核苷酸分子的群體，其中任何單獨的多核苷酸與群體中的所有其他多核苷酸的間距是這樣的：使得單獨地分辨單獨的多核苷酸分子是可能的。因此，在某些實施方案中，固定至固體支撐體的表面上的靶核酸分子可以能夠通過光學(xué)手段來分辨。這意指一個或更多個有區(qū)別的信號(各自代表一種多核苷酸)將出現(xiàn)在所使用的特定成像裝置的可分辨區(qū)域內(nèi)?？梢詫崿F(xiàn)單分子檢測，其中陣列上相鄰的多核苷酸分子之間的間距是至少100nm，更特別地至少250nm，還更特別地至少300nm，甚至更特別地至少350nm。因此，每個分子作為單分子熒光點是單獨地可分辨的且可檢測的，并且來自所述單分子熒光點的熒光還呈現(xiàn)單步光漂白。本文使用術(shù)語“單獨地分辨(individuallyresolved)”和“單獨分辨(individualresolution)”來說明，當(dāng)可視化時，使陣列上的一個分子與其鄰近的分子相區(qū)別是可能的。陣列上的單獨分子之間的分離將部分地通過用于分辨單獨分子的特別的技術(shù)來確定。單分子陣列的一般特征將通過參考公布的申請WO00/06770和WO01/57248來理解，其各自通過引用并入本文。雖然本公開內(nèi)容的改性的核苷酸的一種用途是在通過合成反應(yīng)測序中，但改性的核苷酸的用途不限于此類方法。事實上，核苷酸可以有利地用于需要檢測附接至并入到多核苷酸中的核苷酸的熒光標(biāo)記物的任何測序方法中。特別地，用本公開內(nèi)容的染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸可以被用于自動熒光測序方案，特別是基于Sanger和合作者的鏈終止測序方法的熒光染料終止子循環(huán)測序。這類方法通常使用酶和循環(huán)測序以將熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸并入引物延伸測序反應(yīng)中。所謂的Sanger測序方法以及有關(guān)的方案(Sanger型)利用以標(biāo)記的雙脫氧核苷酸的隨機化鏈終止。因此，本公開內(nèi)容還涵蓋用染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸，所述改性的核苷酸是在3'位和2'位兩處均缺少羥基的雙脫氧核苷酸，此類改性的雙脫氧核苷酸適合用于Sanger型測序方法以及類似方法中。將認(rèn)識到的是，并入3'阻斷基團的用本公開內(nèi)容的染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸還可以在Sanger法和有關(guān)的方案中具有用途，因為通過使用改性的雙脫氧核苷酸實現(xiàn)的相同的效果可以通過使用具有3'-OH阻斷基團的改性的核苷酸來實現(xiàn)：兩者均阻止隨后核苷酸的并入。在根據(jù)本公開內(nèi)容的且具有3'阻斷基團的核苷酸將被用于Sanger型測序方法的情況下，將理解的是，附接至核苷酸的染料化合物或可檢測的標(biāo)記物不需要經(jīng)由可裂解的連接基來連接，因為在本公開內(nèi)容的標(biāo)記的核苷酸被并入的每種情形下；核苷酸不需要被隨后并入并且因此標(biāo)記物不需要從核苷酸中被除去。本公開內(nèi)容還提供包含用染料標(biāo)記的改性的核苷和/或核苷酸的試劑盒。此類試劑盒將通常包含用本文陳述的染料標(biāo)記的至少一種改性的核苷酸或核苷連同至少一種另外的組分。另外的組分可以是在上文陳述的方法中或在下文實施例部分中確定的組分中的一種或更多種。下文陳述可以被組合到本公開內(nèi)容的試劑盒中的組分的某些非限制性實例。在特定的實施方案中，試劑盒可以包含用本文陳述的染料標(biāo)記的至少一種改性的核苷酸或核苷連同改性的或未改性的核苷酸或核苷。例如，用根據(jù)本公開內(nèi)容的染料標(biāo)記的改性的核苷酸可以與未標(biāo)記的或天然的核苷酸組合和/或與熒光標(biāo)記的核苷酸組合或其任何組合被供應(yīng)。因此，試劑盒可以包含用根據(jù)本公開內(nèi)容的染料標(biāo)記的改性的核苷酸和用其他例如現(xiàn)有技術(shù)染料化合物標(biāo)記的改性的核苷酸。核苷酸的組合可以作為分開的單獨組分(例如，每容器或管一種核苷酸類型)或作為核苷酸混合物(例如，在相同的容器或管中混合的兩種或更多種核苷酸)被提供。在試劑盒包含用染料化合物標(biāo)記的多種、特別地兩種、更特別地四種改性的核苷酸的情況下，不同的核苷酸可以用不同的染料化合物來標(biāo)記，或一種核苷酸可以是深色的，不具有染料化合物。在用不同的染料化合物標(biāo)記不同的核苷酸的情況下，試劑盒的特征是，所述染料化合物是光譜上可區(qū)別的熒光染料。如本文所使用，術(shù)語“光譜上可區(qū)別的熒光染料”指的是，當(dāng)兩種或更多種此類染料存在于一種樣品中時，在可以通過熒光檢測設(shè)備(例如，基于商用毛細(xì)管的DNA測序平臺)區(qū)別的波長下發(fā)射熒光能量的熒光染料。當(dāng)用熒光染料化合物標(biāo)記的兩種改性的核苷酸以試劑盒形式被供應(yīng)時，某些實施方案的特征是，光譜上可區(qū)別的熒光染料可以在相同的波長下(例如比如通過相同的激光器)來激發(fā)。當(dāng)用熒光染料化合物標(biāo)記的四種改性的核苷酸以試劑盒形式被供應(yīng)時，某些實施方案的特征是，光譜上可區(qū)別的熒光染料中的兩種可以兩者均在一個波長下被激發(fā)，并且另兩種光譜上可區(qū)別的染料可以兩者均在另一波長下被激發(fā)。特定的激發(fā)波長是532nm、630nm至700nm，特別地660nm。在一個實施方案中，試劑盒包含用本公開內(nèi)容的化合物標(biāo)記的改性的核苷酸和用第二染料標(biāo)記的第二改性的核苷酸，其中染料在吸光度最大值上具有至少10nm、特別地20nm至50nm的差異。更特別地，兩種染料化合物具有15-40nm之間的斯托克斯位移，其中“斯托克斯位移”是峰值吸收波長和峰值發(fā)射波長之間的距離。在另外的實施方案中，試劑盒還可以包含用熒光染料標(biāo)記的兩種其他改性的核苷酸，其中染料通過相同的激光器在488nm至550nm、特別地532nm下被激發(fā)。染料在吸光度最大值上可以具有至少10nm、特別地20nm至50nm的差異。更特別地，兩種染料化合物可以具有在20-40nm之間的斯托克斯位移。還更特別地，兩種染料化合物可以具有低于640nm、特別地低于600nm的不同的吸光度最大值。光譜上可區(qū)別于本公開內(nèi)容的多次甲基染料并且滿足上文標(biāo)準(zhǔn)的特別的染料是如在美國專利第5,268,486號(例如Cy3)或WO0226891(Alexa532；MolecularProbesA20106)中描述的多次甲基類似物或如在美國專利第6,924,372號中公開的不對稱的多次甲基，其各自通過引用并入本文?？蛇x擇的染料包括若丹明類似物，例如四甲基若丹明及其類似物。在可選擇的實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒可以包含其中相同的堿基被兩種不同的化合物標(biāo)記的核苷酸。第一核苷酸可以用本公開內(nèi)容的化合物來標(biāo)記。第二核苷酸可以用光譜上有區(qū)別的化合物(例如在小于600nm處吸收的‘綠色’染料)來標(biāo)記。第三核苷酸可以被標(biāo)記為本公開內(nèi)容的化合物和光譜上有區(qū)別的化合物的混合物，并且第四核苷酸可以是‘深色的’并且不包含標(biāo)記物。因此，簡言之，核苷酸1-4可以被標(biāo)記為‘綠色’、‘紅色’、‘紅色/綠色’以及深色。為進一步簡化儀器，四種核苷酸可以用由單激光器激發(fā)的兩種染料來標(biāo)記，并且因此核苷酸1-4的標(biāo)記可以是‘紅色1’、‘紅色2’、‘紅色1/紅色2’和深色。核苷酸可以包含本公開內(nèi)容的兩種染料。其中Ra1或Ra2是稠合至吲哚環(huán)的相鄰的碳的另外的芳香族環(huán)的染料，相比于在染料不具有另外的芳香族軛合的情況在較長的波長下吸收。試劑盒可以包含用本公開內(nèi)容的染料標(biāo)記的兩種或更多種核苷酸。試劑盒可以包含：用本公開內(nèi)容的化合物標(biāo)記的核苷酸，在該化合物中，Ra1和Ra2中的每個獨立地是H、SO3-、磺酰胺或鹵素；以及用本公開內(nèi)容的化合物標(biāo)記的一種核苷酸，在該化合物中，Ra1和Ra2一個或兩者是稠合至相鄰的碳原子的另外的環(huán)。試劑盒可以包含另外的核苷酸，其中該核苷酸用在520nm至560nm的區(qū)域內(nèi)吸收的染料來標(biāo)記。試劑盒還可以包含未標(biāo)記的核苷酸。雖然上文關(guān)于具有不同核苷酸的配置來示例試劑盒，該不同核苷酸被不同的染料化合物標(biāo)記，但將理解的是，試劑盒可以包含具有相同染料化合物的2種、3種、4種或更多種不同的核苷酸。在特定的實施方案中，試劑盒可以包含能夠催化將改性的核苷酸并入到多核苷酸中的聚合酶。待被包含在此類試劑盒中的其他組分可以包括緩沖劑及類似物。用根據(jù)本公開內(nèi)容的染料標(biāo)記的改性的核苷酸和包括不同核苷酸的混合物的其他任何核苷酸組分，可以以待在使用之前被稀釋的濃縮的形式被提供在試劑盒中。在此類實施方案中，還可以包括合適的稀釋緩沖劑。再次，在本文陳述的方法中確定的組分中的一種或更多種可以被包含在本公開內(nèi)容的試劑盒中。應(yīng)注意，如在本說明書和所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非清楚地且明確地受限于一個指示物。對本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的是，可以對本文描述的各種實施方案作出各種修改和變型而不偏離本教導(dǎo)的精神或范圍。因此，意圖的是，本文描述的各種實施方案覆蓋在所附權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的其他修改和變型。實驗細(xì)節(jié)2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸鹽(1)將2-亞甲基-3,3-三甲基-1-苯基-2,3-二氫-1H-吲哚(1g,4.25mmol)在溫度<5℃下溶解在1ml的硫酸中，并且在攪拌下添加1ml發(fā)煙硫酸(20％)。將溶液在室溫下攪拌1h，然后在60℃下加熱持續(xù)3h。將用二乙醚沉淀的產(chǎn)物用丙酮和乙醇洗滌。收率0.7g(52％)。結(jié)構(gòu)通過NMR來確證。2-(4-苯胺基丁間二烯基-1)-3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸鹽(2-1)反應(yīng)方案：將2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸鹽(0.63g)、苯胺(0.2g)和1,1,3,3-四乙氧基丙烷(0.35ml)的混合物在70℃下加熱持續(xù)90分鐘。形成紅色熔化物。產(chǎn)物用乙醚磨碎并且濾出。收率0.6g(68％)。2-(4-乙酰苯胺基丁間二烯基-1)-3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸鹽(2-2)反應(yīng)方案：將2,3,3-三甲基-1-苯基-3H-吲哚鎓-5-磺酸鹽(0.315g)、丙二酸二醛二苯胺鹽酸鹽(0.25g)、乙酸(1ml)和乙酸酐(2ml)的混合物在60℃下加熱持續(xù)3小時并且然后在50℃下過夜。形成橙色溶液。將產(chǎn)物濾出并且用二乙醚洗滌。收率0.24g(49％)。1,2-二甲基-1-(4-磺丁基)-3-苯基-1H-苯并[e]吲哚鎓(3)反應(yīng)方案：將在絕對乙醇(30ml)中的N-(2-萘基),N-苯基肼鹽酸鹽(19.51mmol,5.28g)、5-甲基-6-氧代庚烷磺酸(17.18mmol,3.70g)和無水ZnCl2(17.18mmol,2.34g)在室溫下攪拌持續(xù)30分鐘，然后在80℃下攪拌持續(xù)2h。通過TLC(在CH3CN中的10％H2O)檢查反應(yīng)進程。在完成之后，將反應(yīng)冷卻下來并且將溶劑在真空下除去。將殘余物溶解在DCM中并且通過硅膠快速柱純化。收率：3.06g，42％。質(zhì)子NMR:(MeOH-D4):8.28(0.5H,d,J＝8Hz)；8.05-8.02(1H,m)；7.89(0.5H,d,J＝8Hz)；7.75-7.66(3H,m)；7.65-7.60(1H,m)；1.49-1.43(1.5H,m)；7.31-7.25(2H,m)；7.16(.5H,d,J＝9Hz)；7.07(.5H,appt,J＝7.4Hz)；6.61(0.5H,d,J＝8Hz)；2.85-2.35(4H,m)；1.88(3H,appd,J＝9Hz)；1.75-1.4(5H,m)；1.35-1.25(0.5H,m)；1.1-0.95(0.5H,m)；0.8-0.65(0.5H,m)；0.58-0.45(0.5H,m)。1,2-二甲基-1-(3-磺丙基)-3-苯基-1H-苯并[e]吲哚鎓(4)反應(yīng)方案：將標(biāo)題化合物如先前化合物從N-(2-萘基)-N-苯基肼鹽酸鹽和4-甲基-5-氧代戊烷磺酸來制備。產(chǎn)物通過硅膠快速柱純化。收率：40％。結(jié)構(gòu)通過NMR光譜確證。2,3-二甲基-3-(4-磺丁基)-1-苯基-3H-吲哚鎓(5)反應(yīng)方案：將在冰乙酸(20ml)中的N,N-二苯基肼鹽酸鹽(0.01mol,2.2g)、5-甲基-6-氧代庚烷磺酸(0.017mol,3.0g)在室溫(～20℃)下攪拌持續(xù)一小時，然后在100℃下攪拌持續(xù)3小時(TLC檢查)。將反應(yīng)混合物冷卻下來并且將溶劑在真空下除去。將殘余物用二乙醚洗滌并且通過硅膠快速柱純化。收率：2g(56％)。結(jié)構(gòu)通過NMR光譜確證。產(chǎn)物名稱：NR650C5產(chǎn)物合成方案：染料合成程序：將2,3-二甲基-3-(4-磺丁基)-1-苯基-3H-吲哚鎓(5)(70mg)和丙二醛二苯胺鹽酸鹽(II,51mg)在乙酸酐和乙酸(4ml/1ml)的混合物中在90℃下攪拌持續(xù)2h(通過在MeCN中的15％H2O的TLC控制反應(yīng))。將反應(yīng)混合物留在RT下過夜。將溶劑在真空中除去，將黃色殘余物用二乙醚洗滌并且溶解在乙酸(5ml)中。將吲哚鎓鹽(III,85mg)添加至在先前步驟中制備的中間體的溶液，隨后是吡啶(0.5ml)。將反應(yīng)混合物在80℃下攪拌持續(xù)3h并且留在室溫下過夜。將溶劑在真空下除去。將深藍(lán)色殘余物用二乙醚洗滌，溶解在水-乙腈(～5％)混合物中，過濾并且通過制備型HPLC純化。收集藍(lán)顏色(吸光度最大值～650nm)的級分，并且在真空中除去溶劑。使用合適的起始材料類似地制備染料D1-D7。在表1中，與已知結(jié)構(gòu)類似物染料Std(EP1810998A2)的類似的參數(shù)相比較的以此方式制備的某些染料(在水中的溶液)的光譜性質(zhì)。表1染料D4核苷酸軛合物(FFA4)制備：將無水DMA(5mL)和Hunig’s堿(0.06mL)添加至染料D4的干燥樣品(88mg)。然后，將TSTU(25mg)在5mL的干燥DMA中的溶液添加至此。形成藍(lán)色的活化酯。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌持續(xù)1h。根據(jù)TLC(在CH3CN中的20％H2O)，完成活化。在活化完成之后，將此溶液添加至pppT-LN3作為三乙銨鹽(47mg)在水(7mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下在氮氣氣氛下攪拌持續(xù)3h。通過TLC(在乙腈中的20％H2O)檢查偶聯(lián)進程。將反應(yīng)混合物用冰浴冷卻至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液并且將混合物在室溫下攪拌持續(xù)10分鐘。將反應(yīng)混合物應(yīng)用于具有～50g的在0.05MTEAB水溶液中的DEAE葡聚糖凝膠樹脂懸浮液的柱并且用TEAB(濃度梯度從0.1M多達0.5M)洗滌。收集有色級分并且蒸發(fā)，然后再次與水共蒸發(fā)以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，將殘余物重新溶解在TEAB0.1M中。將此溶液通過0.2nm孔大小的注射器式過濾器過濾到康寧燒瓶中并且儲存在冰箱中。將產(chǎn)物通過使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC純化。收率76％(基于使用消光系數(shù)評估的溶液的光密度)。染料D7核苷酸軛合物(FFA7)制備：將無水DMA(5mL)和Hunig’s堿(0.06mL)添加至染料D7的干燥樣品(100mg)。然后，將TSTU(25mg)在5mL的干燥DMA中的溶液添加至此。形成藍(lán)色的活化酯。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌持續(xù)1h。根據(jù)TLC(在CH3CN中的20％H2O)，完成活化。在活化完成之后，將此溶液添加至pppT-LN3作為三乙銨鹽(47mg)在水(7mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下在氮氣氣氛下攪拌持續(xù)3h。通過TLC(在乙腈中的20％H2O)檢查偶聯(lián)進程。將反應(yīng)混合物用冰浴冷卻至～4℃，然后添加0.1MTEAB(5mL)在水中的溶液并且將混合物在室溫下攪拌持續(xù)10分鐘。將反應(yīng)混合物應(yīng)用于具有～50g的在0.05MTEAB水溶液中的DEAE葡聚糖凝膠樹脂懸浮液的柱并且用TEAB(濃度梯度從0.1M多達0.5M)洗滌。收集有色級分并且蒸發(fā)，然后再次與水共蒸發(fā)以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，將殘余物重新溶解在TEAB0.1M中。將此溶液通過0.2nm孔大小的注射器式過濾器過濾到康寧燒瓶中并且儲存在冰箱中。將產(chǎn)物通過使用C18反相柱用乙腈-0.1MTEAB的HPLC純化。收率57％(基于使用消光系數(shù)評估的溶液的光密度)。使用合適的起始材料類似地制備具有染料D1-D7的軛合物。在表2中，與基于已知染料Std(US7109314B2,EP1810998A2)的已知結(jié)構(gòu)類似物的類似的參數(shù)相比較的用以此方式制備的新的染料標(biāo)記的某些軛合物的熒光性質(zhì)。表2核苷酸染料20℃的熒光強度(％)60℃的熒光強度(％)FFA1D1493(175)294(167)FFA4D4365(130)225(128)FFA5D5517(184)330(188)FFAStdstd281(100)176(100)從這些數(shù)據(jù)，可以看到，與用已知現(xiàn)有結(jié)構(gòu)類似物(std)(其中R1不是苯基)標(biāo)記的核苷酸比較，用新的染料(其中R1是苯基)標(biāo)記的核苷酸的熒光強度明顯地是較高的。用新的染料標(biāo)記的核苷酸中的某些已經(jīng)在Illumina測序系統(tǒng)中被測試并且數(shù)據(jù)(在下文表3中示出)揭示，與已知結(jié)構(gòu)類似物(其中R1不是苯基)比較，使用新的化合物對于核酸測序應(yīng)用提供較低的誤差率。表3當(dāng)前第1頁1 2 3